CN110452915B

CN110452915B - 葡萄VlKNOX基因促进细胞分裂素合成调控果实坐果的应用

Info

Publication number: CN110452915B
Application number: CN201910872929.6A
Authority: CN
Inventors: 余义和; 郭大龙; 杨盛迪; 李旭飞; 孟祥轩; 杨英军; 张国海
Original assignee: Henan University of Science and Technology
Current assignee: Henan University of Science and Technology
Priority date: 2019-09-16
Filing date: 2019-09-16
Publication date: 2022-03-18
Anticipated expiration: 2039-09-16
Also published as: CN110452915A

Abstract

本发明涉及葡萄VlKNOX基因促进细胞分裂素合成调控果实坐果的应用，属于植物基因工程技术领域。本发明中利用强启动子（花椰菜花叶病毒35S启动子）驱动原理的转基因技术，将VlKNOX基因的超量表达载体转入拟南芥中，从而获得转基因拟南芥植株；实验证明，相对于转化空载体的拟南芥植株，超量表达VlKNOX基因导致转基因拟南芥中细胞分裂素大量积累，果实坐果率显著提高。因此，葡萄VlKNOX基因及其重组表达载体能够用于植物高产品种育种。

Description

葡萄VlKNOX基因促进细胞分裂素合成调控果实坐果的应用

技术领域

本发明涉及葡萄VlKNOX基因促进细胞分裂素合成调控果实坐果的应用，属于植物基因工程技术领域。

背景技术

葡萄是世界上广泛栽培的重要经济类果树之一，其果实主要用于酿酒、鲜食、制汁和制干。葡萄和葡萄酒中富含有益于人体的矿物质、维生素和多种必需氨基酸等物质。其中，白藜芦醇具有防癌抗炎、延缓衰老和提高免疫力等功效而引起了全世界的关注，也促进了世界葡萄产业的发展。美洲葡萄或欧美葡萄杂交种的果实品质优良且抗逆性强，在鲜食葡萄产业中占据主导地位。但是，美洲葡萄或欧美杂交种葡萄表现出坐果率低的特点，在生产过程中需要大量使用植物生长调节剂来促进葡萄果实坐果。植物生长调节剂的使用一方面增加了果农的生产成本和劳动时间，同时也降低了葡萄果实品质，且增加了环境污染的风险。因此，通过生物技术培育坐果率高、品质优良且抗逆性强的转基因葡萄对于生产实践具有重要意义。

KNOX基因家族是植物5个同源异型盒基因家族之一，几乎存在于所有的单子叶和双子叶植物中，在植物形态建成中起到多重作用（李方正, 杨素欣, 吴春霞, 魏海超, 曲瑞莲, 冯献忠 (2012). 大豆KNOX基因家族的结构和表达分析. 植物学报, 47 (3): 236~247）。KNOX基因通过多种方式来调控植物的生长发育，例如与生长素、赤霉素和细胞分裂素介导的激素途径相互作用，整合内源和外源因子，激活植物体内的信号通路（Bharathan G,Goliber TE, Moore C, Kessler S, Pham T, Sinha NR (2002). Homologies in leafform inferred from KNOXI gene expression during development. Science, 296(5574): 18 58~1860）。在分析KNOX同源域中氨基酸序列相似性的基础上，根据内含子的位置、表达模式和系统分析，通常将KNOX基因家族分为两个子类：I类KNOX亚家族和II类KNOX亚家族。玉米（Zea mays）中Knotted1 (Kn1)基因是第1个从植物中发现的KNOX1亚家族基因，通过转座子标签技术从kn1突变体中被分离出来，从而揭示了Kn1基因的功能（Vollbrecht E, Veit B, Sinha N, Hake S (1991). The developmental geneKnotted-1 is a member of a maize homeobox gene family. Nature, 350 (6315):241~243）。玉米Kn1基因维持顶端分生组织分化成不同功能的细胞群，它的出现标志着由顶端分生组织分化的侧生器官开始生长发育（Smith LG, Greene B, Veit B, Hake S(1992). A dominant mutation in the maize homeobox gene, Knotted-1, causes itsectopic expression in leaf cells with altered fates. Development, 116 (1): 21~30）。顶端分生组织在发育过程中逐渐建立极性，边界分化出一系列干细胞群，继续维持侧生器官的生长发育。在模式植物拟南芥基因组中包含4个KNOX1家族基因：SHOOTMERISTEMLESS(STM)、BREVIPEDICELLUS(BP)、Knotted1-like2 (KNAT2)和Knotted1-like6(KNAT6)。这些基因参与拟南芥生命周期的生长发育进程，它们在顶端分生组织特定的区域表达，以维持顶端分生组织的分裂活性以及侧生器官的持续发育。

虽然，现有技术中已经有了一些物种中KNOX基因的报道，但是葡萄中的KNOX基因尚未有人报道，人们对于葡萄KNOX基因的具体功能也缺乏认识。

发明内容

本发明的目的是提供一种葡萄VlKNOX基因，其能够增加转基因植株中细胞分裂素的合成，促进果实坐果，从而提高果实产量。

本发明还提供了葡萄VlKNOX蛋白，该蛋白能够提高植物果实坐果率，导致转基因植株高产性增强。

本发明还提供了包含葡萄VlKNOX基因的重组表达载体，该载体携带葡萄VlKNOX基因，因此能够超表达VlKNOX基因，进而增强植物高产性能。

本发明还提供了上述的包含葡萄VlKNOX基因的重组表达载体的制备方法，能够制得该载体。

本发明还提供了上述的葡萄VlKNOX基因和重组表达载体在植物品种育种中的应用，能够获得高产植物品种。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

葡萄VlKNOX基因，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明中利用强启动子（花椰菜花叶病毒35S启动子）驱动原理的转基因技术，将VlKNOX基因的超量表达载体转入拟南芥中，从而获得转基因拟南芥植株；实验证明，相对于转化空载体的拟南芥植株，超量表达VlKNOX基因导致转基因拟南芥中细胞分裂素大量积累，果实坐果率显著提高。

葡萄VlKNOX基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1中的181-1509位所示。

上述的核苷酸序列为葡萄中天然存在的序列，也可以根据该序列进行密码子优化，得到的优化序列也具有同样的效果。

葡萄VlKNOX蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

葡萄VlKNOX蛋白是一个含442个氨基酸的蛋白，该蛋白能够促进转基因植株中积累抗逆相关物质导致转基因植株高产性增强。

重组表达载体，所述重组表达载体包含葡萄VlKNOX基因，所述葡萄VlKNOX基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1中的181-1509位所示。

本发明中的重组表达载体为植物过量表达载体，能够在植物中超表达目的基因。

重组表达载体的制备方法，包括：根据如SEQ ID NO.1中的181-1509位所示的序列设计引物，克隆所述葡萄VlKNOX基因，然后将所述葡萄VlKNOX基因连接到pCAMBIA2300植物表达载体上，即得。

本发明中将葡萄VlKNOX基因开放阅读框连接至植物过量表达载体pCAMBIA2300上，能够形成重组表达载体pCAMBIA2300-VlKNOX。

上述的葡萄VlKNOX基因在植物品种育种中的应用；具体的，在植物高产品种育种中的应用；更为具体的，在拟南芥高产品种育种中的应用。上述的的重组表达载体在植物品种育种中的应用；具体的，在植物高产品种育种中的应用；更为具体的，在拟南芥高产品种育种中的应用。

本发明通过植物基因工程技术，从‘巨峰’葡萄幼果中分离克隆出与果实坐果相关基因完整编码区段的DNA片段，并验证了该基因的功能，发现超量表达之后转基因拟南芥中细胞分裂素含量增加，果实坐果率显著提高。因此，葡萄VlKNOX基因及其重组表达载体能够用于植物高产品种育种。

附图说明

图1为本发明中葡萄VlKNOX基因超量表达载体的鉴定图；

图2为本发明中转VlKNOX基因拟南芥植株的PCR检测图；

图3为本发明中转VlKNOX基因拟南芥植株中细胞分裂素含量的测定图；

图4为本发明中转VlKNOX基因拟南芥植株坐果率统计图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明。除特殊说明的之外，各实施例及试验例中所用的设备和试剂均可从商业途径得到。

葡萄VlKNOX基因的实施例1

本实施例中葡萄VlKNOX基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1中的181-1509位所示。

葡萄VlKNOX蛋白的实施例1

本实施例中葡萄VlKNOX蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

重组表达载体的实施例1

本实施例中重组表达载体包含葡萄VlKNOX基因，所述葡萄VlKNOX基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1中的181-1509位所示。

重组表达载体的制备方法的实施例1

本实施例中重组表达载体的制备方法，包括：根据如SEQ ID NO.1中的181-1509位所示的序列设计引物，克隆所述葡萄VlKNOX基因，然后将所述葡萄VlKNOX基因连接到pCAMBIA2300植物表达载体上，即得。

葡萄VlKNOX基因在植物品种育种中的应用的实施例1

本实施例中葡萄VlKNOX基因能够增加转基因植株中抗逆相关物质的积累和高产相关基因的表达，促进转基因植株高产性增强，因此可以用于植物高产品种育种中的应用，具体的可以用于拟南芥高产品种的育种。

重组表达载体在植物品种育种中的应用的实施例1

本实施例中重组表达载体包含葡萄VlKNOX基因，因此可以将其转化入植物中，以得到高产的植物品种。

试验例1 葡萄VlKNOX基因过量表达载体的构建

为研究葡萄VlKNOX基因的功能，将包含有VlKNOX基因编码区在内的共1329bp的ORF片段正确插入植物过量表达载体pCAMBIA2300- GFP上。

根据前期克隆到的VlKNOX基因ORF序列，设计可以扩增VlKNOX基因ORF的上下游引物VlKNOX-ORF-F和VlKNOX-ORF-R；根据pCAMBIA2300-GFP载体上的酶切位点，在引物VlKNOX-ORF-F的5’端加上酶切位点XbaI，具体序列为：

VlKNOX-ORF-XbaI-F：5’-GGGTCTAGAATGGCGTTTCACAACCAGCTCTCC-3’（如SEQ IDNO.3所示）；

在引物VlKNOX-ORF-R的5’端加上酶切位点KpnI，具体序列为：

VlKNOX-ORF-KpnI-R：5’- GGGAAGCTTTTACAAAAAGTGATCATTGTTGA-3’（如SEQ IDNO.4所示）。

以pMD18-T-VlKNOX质粒为模板，用VlKNOX-ORF-XbaI-F与VlKNOX-ORF-KpnI-R进行扩增，回收目的条带后连接到pMD19-T克隆载体，转化TOP10感受态细胞，在附加Amp的LB培养基上进行蓝白斑筛选，分别经过菌液PCR与质粒酶切检测，pMD19-T-VlKNOX阳性克隆送公司测序。用XbaI、KpnI双酶切重组克隆载体pMD19-T-VlKNOX与植物表达载体pCAMBIA2300-GFP，回收线性化载体与目标片段，连接并转化TOP10，经Kan抗生素筛选，挑取单克隆摇菌，菌液检测后提质粒酶切检测。检测结果如图1所示，M：DNA分子质量标准；泳道1：VlKNOX基因过量表达载体的双酶切鉴定；泳道2：VlKNOX基因过量表达载体；结果表明本试验例中构建成功植物表达载体pCAMBIA2300-VlKNOX。将其转化入农杆菌中，用于转染植物。

试验例2 过量表达VlKNOX的转基因植株的获得

将含有目的基因的农杆菌菌液于超低温冰箱取出后，在冰上溶化，取200 μL接种于液体LB培养基中（含60 mg·L^-1Kan和60 mg·L^-1 Gent），28℃ 180rpm培养20 h后取30 μL该菌液接种于20mL 液体LB培养基中，相同条件下，进行二次活化，培养20 h左右至菌液浑浊；将菌液转移到灭菌的50ml离心管中，6000rpm 8 min ，去上清，再用液体MS培养基（含200 μM AS和3%的蔗糖）重悬菌液，28℃、180rpm培养3-4 h，在紫外可见分光光度计上检测菌液浓度，可用重悬液稀释，使菌液浓度达到试验所确定的最佳浓度（OD₆₀₀=0.4-0.6），备用；4500 r/min离心20 min以收集农杆菌，将上清液尽量倒干净，保留沉淀；配制400 mL含5%蔗糖的MS基本培养液（pH 5.8），加0.02%～0.03%Silwet L-77混匀，将农杆菌（沉淀）悬浮在上述MS培养液中，混匀，即为浸花液；浸花前一天将拟南芥浇水浇透，将小盆倒置，让植株花序浸入农杆菌液中30 s，用透明塑料袋套着整个小盆，放置在培养架上1 d～2 d；正常继续培养，所收获的种子培养在含50 mg/L Kan的1/2 MS固体培养基上，筛选Kan抗性植株。

用无液氮DNA快速提取法提取拟南芥叶片DNA，作为模板，设计特异引物一对，用于检测基因是否转入拟南芥中。

检测上游引物：5'-GAATTCGGATTCGACGTCCT-3' （如SEQ ID NO.5所示）；

检测下游引物：5'-GCTCATGCTTCAACTCTTGCC-3' （如SEQ ID NO.6所示）。检测体系：模板：2 µL；正向引物1 µL；反向引物1 µL；rTaq酶0.25 µL；dNTP2 µL；Buffer 2.5 µL；水16.25 µL。PCR扩增程序：94℃，3 min；94℃，30 s；57℃，60 s；72℃，2 min，29个循环；72℃，5 min；4℃保存。PCR产物进行0.8%琼脂糖凝胶电泳，以DNA Mark DL 2000为标样，检测PCR产物。分别以质粒DNA和未转化的植株DNA PCR产物为阳性和阴性对照。

检测结果如图2所示，（A）为转VlKNOX基因的拟南芥植株。其中EV为转化空载体的拟南芥植株；OE#1-3：转化VlKNOX基因的拟南芥株系#1-3；（B）PCR检测转基因植株。其中M：DNA分子质量标准；泳道1：以ddH₂O为模板进行PCR；泳道2：以转化空载体的拟南芥DNA为模板进行PCR；泳道3：以pCAMBIA2300-VlKNOX质粒DNA为模板进行PCR；泳道4-6：以转化VlKNOX基因的转基因拟南芥DNA为模板进行PCR。从图中可以看出，本试验例成功获得了转VyGOLS基因拟南芥植株。

试验例3转基因植株中激素含量的测定

采集生长42天的EV植株和OE#1-3植株的果实作为样品，检测细胞分裂素含量含量。

具体为，取标准品d6-iP、d5-tZ（Olchemim Ltd, Olomouc, Czech Republic），用甲醇水溶液稀释为系列浓度的标准工作溶液，用同位素内标法建立标准曲线。

将样品液氮研磨，取80±3 mg样品于2 mL离心管中，加入50 μL内标溶液，加入1mL乙腈水溶液（1%FA），震荡混匀2 min；4℃避光抽提12 h，14000 g离心10 min，取上清液 800μL，氮气吹干，用100 μL乙腈水（1:1，v/v）复溶，14000 g离心10 min，取上清进样分析。

样品采用Waters I-Class LC超高效液相色谱系统进行分离。流动相：A液为0.05%FA水溶液，B液为0.05%FA乙腈。样品置于 4℃自动进样器中，柱温45℃，流速为400 μL/min，进样量2 μL。相关液相梯度如下：0-10 min，B液从2%线性变化到98%；10-10.1 min，B液从98%线性变化至2%；11.1-13 min，B液维持在2%。

样本队列中每间隔一定数量的实验样本设置一个QC样本，用于检测和评价系统的稳定性及重复性；样本队列中每间隔一定数量的实验样本设置一个QC样本，用于检测和评价系统的稳定性及重复性。采用5500 QTRAP质谱仪（AB SCIEX）在正/负离子模式下进行质谱分析。5500 QTRAP ESI 源条件如下：source temperature 500℃，ion Source Gas1（Gas1）：45，Ion Source Gas2（Gas2）：45，Curtain gas （CUR）：30，ionSapary VoltageFloating（ISVF）-4500 V；采用MRM模式检测待测离子对。采用Multiquant软件提取色谱峰面积及保留时间。根据标准曲线，计算样品中测得植物激素的含量。

检测结果如图3所示，反玉米素（tZ）和反玉米素核苷(tZR)是植物体内目前可以测定检测到的细胞分裂素；（A）为转基因植物果实中反玉米素（tZ）含量分析，（B）为转基因植物果实中反玉米素核苷(tZR)含量分析。从图中可以看出，超量表达VlKNOX基因之后转基因拟南芥中细胞分裂素含量增加。

试验例4转基因植株的坐果率统计

花后16d，观察EV植株和OE#1-3植株的坐果情况，统计EV植株和OE#1-3植株的坐果率，坐果率统计方法：坐果率＝坐果数／开花总数×100%。统计结果如图4所示，可以明显看出与转化空载体的EV拟南芥植株相比，转基因型拟南芥植株OE#1-3的坐果率大大提高。

<110> 河南科技大学

<120> 葡萄VlKNOX基因促进细胞分裂素合成调控果实坐果的应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<211> 1681

<212> DNA

<213> 葡萄

<221> VlKNOX基因

<400> 1

gtagccacca ccactaaacc actagcgttt ttgaaaaacc acttctctct ctaggctacg 60

tttgtagcga agagtgacac attctctctc cctatggcta cgttttcttc gtataagggt 120

gtgtgtatat atataaagcg gagcgtgatg agttagtggc cgtgaaaccg cttttatttg 180

atggcgtttc acaaccagct ctcccacgat atggctctcc agcatttcac ggactcgcac 240

ttgactgaga acacggccgt tttgcgggga atattgccgg agcagctagg ccagtcgtct 300

tccgatggtg ccggaaaacc gcctagtcac cagcagctgg gaggaggagg cggcggcggc 360

ggcccgacgt ggctcaacaa cgcaattctg cggcagcaga gtcaatacgc cgatgggagc 420

ttcctccact tgcagacgaa ttcggattcg acgtcctctc cggcgacggc cacgacgacg 480

accaaccagt ggctctcgcg atcgatgagc aacgtgggcg cccaaaacga cgacgttccg 540

gtgtctagcg ggtccgtgat tgctgctata tcggcggatt tgaacggtaa tcaggagaag 600

agaaacggag ggaacaatca gaaccggggc gataacaatg gtgaggacat gctggattgt 660

gattctggag ggaattggga aaatgcgagg tacaaagccg atatcttggc ccatcctttg 720

tatgaacagt tgctttccgc tcacgtttca tgcctccgaa tcgcgacgcc tgtcgaccag 780

ttgccgagga tcgatgcgca gctggcgcaa tctcagggcg ttgtaaccaa gtattcggtc 840

cttgcaaatc agcctttgga tgataaggag ctcgatcagt tcatgacaca ttatgttcta 900

ttgctgtgtt catttaaaga acaattgcaa caacacgtcc gtgttcatgc tatggaagcc 960

gtaatggctt gttgggagct tgagcaatct ctacaaagtt taacaggtgt atcaccaggt 1020

gaaggcactg gtgcaacaat gtctgatgat gaagatgacc aggcagatag tgagaccaac 1080

ttgtttgatg gaagtctgga tgggccagac agcatggggt ttggccctct tgttccaact 1140

gaaaccgaaa ggtccttgat ggagcgtgtc aggcaagagt tgaagcatga gctcaaacag 1200

ggatacaagg aaaagattgt ggacattaga gaggaaattc ttcgtaagag aagagctgga 1260

aaactacctg gtgacactac ctccctcttg aaagcctggt ggcaatcaca ttccaagtgg 1320

ccttatccaa cagaggaaga caaagcacga ctggtgcagg aaacaggctt gcatttaaag 1380

cagatcaata actggttcat caaccaaagg aaacggaatt ggcacagcaa tccttcatct 1440

tctgcagttt tgaagaccaa gcgaaagaga agtaatgcag gtgaaatcaa caatgatcac 1500

tttttgtaaa tggacaaatt caaatgtcaa gccccttgta accctcttct tgtgcccaat 1560

accggtggga catgcagcat caacatgcac gtggagagcc actataacag tcaagaattg 1620

ggttgcttgg gaagttttgt gaagactctt tggcaaatct tattttgctc atacagaaaa 1680

a 1681

<211> 442

<212> PRT

<213> 葡萄

<221> VlKNOX蛋白

<400> 2

MET Ala Phe His Asn Gln Leu Ser His Asp MET Ala Leu Gln His

1 5 10 15

Phe Thr Asp Ser His Leu Thr Glu Asn Thr Ala Val Leu Arg Gly

20 25 30

Ile Leu Pro Glu Gln Leu Gly Gln Ser Ser Ser Asp Gly Ala Gly

35 40 45

Lys Pro Pro Ser His Gln Gln Leu Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly

50 55 60

Gly Pro Thr Trp Leu Asn Asn Ala Ile Leu Arg Gln Gln Ser Gln

65 70 75

Tyr Ala Asp Gly Ser Phe Leu His Leu Gln Thr Asn Ser Asp Ser

80 85 90

Thr Ser Ser Pro Ala Thr Ala Thr Thr Thr Thr Asn Gln Trp Leu

95 100 105

Ser Arg Ser MET Ser Asn Val Gly Ala Gln Asn Asp Asp Val Pro

110 115 120

Val Ser Ser Gly Ser Val Ile Ala Ala Ile Ser Ala Asp Leu Asn

125 130 135

Gly Asn Gln Glu Lys Arg Asn Gly Gly Asn Asn Gln Asn Arg Gly

140 145 150

Asp Asn Asn Gly Glu Asp MET Leu Asp Cys Asp Ser Gly Gly Asn

155 160 165

Trp Glu Asn Ala Arg Tyr Lys Ala Asp Ile Leu Ala His Pro Leu

170 175 180

Tyr Glu Gln Leu Leu Ser Ala His Val Ser Cys Leu Arg Ile Ala

185 190 195

Thr Pro Val Asp Gln Leu Pro Arg Ile Asp Ala Gln Leu Ala Gln

200 205 210

Ser Gln Gly Val Val Thr Lys Tyr Ser Val Leu Ala Asn Gln Pro

215 220 225

Leu Asp Asp Lys Glu Leu Asp Gln Phe MET Thr His Tyr Val Leu

230 235 240

Leu Leu Cys Ser Phe Lys Glu Gln Leu Gln Gln His Val Arg Val

245 250 255

His Ala MET Glu Ala Val MET Ala Cys Trp Glu Leu Glu Gln Ser

260 265 270

Leu Gln Ser Leu Thr Gly Val Ser Pro Gly Glu Gly Thr Gly Ala

275 280 285

Thr MET Ser Asp Asp Glu Asp Asp Gln Ala Asp Ser Glu Thr Asn

290 295 300

Leu Phe Asp Gly Ser Leu Asp Gly Pro Asp Ser MET Gly Phe Gly

305 310 315

Pro Leu Val Pro Thr Glu Thr Glu Arg Ser Leu MET Glu Arg Val

320 325 330

Arg Gln Glu Leu Lys His Glu Leu Lys Gln Gly Tyr Lys Glu Lys

335 340 345

Ile Val Asp Ile Arg Glu Glu Ile Leu Arg Lys Arg Arg Ala Gly

350 355 360

Lys Leu Pro Gly Asp Thr Thr Ser Leu Leu Lys Ala Trp Trp Gln

365 370 375

Ser His Ser Lys Trp Pro Tyr Pro Thr Glu Glu Asp Lys Ala Arg

380 385 390

Leu Val Gln Glu Thr Gly Leu His Leu Lys Gln Ile Asn Asn Trp

395 400 405

Phe Ile Asn Gln Arg Lys Arg Asn Trp His Ser Asn Pro Ser Ser

410 415 420

Ser Ala Val Leu Lys Thr Lys Arg Lys Arg Ser Asn Ala Gly Glu

425 430 435

Ile Asn Asn Asp His Phe Leu

440 442

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> VlKNOX-ORF-XbaI-F

<400> 3

gggtctagaa tggcgtttca caaccagctc tcc 33

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> VlKNOX-ORF-KpnI-R

<400> 4

gggaagcttt tacaaaaagt gatcattgtt ga 32

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 检测上游引物

<400> 5

gaattcggat tcgacgtcct 20

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 检测下游引物

<400> 6

gctcatgctt caactcttgc c 21

Claims

1.葡萄VlKNOX基因的应用，其特征在于：在植物高产品种育种中的应用；所述葡萄VlKNOX基因所编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述葡萄VlKNOX基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1中的181-1509位所示。

2.重组表达载体的应用，其特征在于：在植物高产品种育种中的应用；所述重组表达载体包含葡萄VlKNOX基因，所述葡萄VlKNOX基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1中的181-1509位所示。

3.根据权利要求2所述的重组表达载体的应用，其特征在于：所述重组表达载体的制备方法包括：根据如SEQ ID NO.1中的181-1509位所示的序列设计引物，克隆所述葡萄VlKNOX基因，然后将所述葡萄VlKNOX基因连接到pCAMBIA2300植物表达载体上，即得。

4.根据权利要求1所述的葡萄VlKNOX基因的应用或者权利要求2所述的重组表达载体的应用，其特征在于：在拟南芥高产品种育种中的应用。