CN110437309A - 一种具有dpp-ⅳ抑制功能的藻蛋白肽及其制备方法 - Google Patents

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刘怀高
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Abstract

本发明涉及一种具有DPP‑Ⅳ抑制功能的藻蛋白肽及其制备方法，所述藻蛋白肽的成分包括：氨基酸序列为HGERVVI、TPDVSIS、YPLIDVK的多肽，且所述多肽的含量为52～58％。一种具有DPP‑Ⅳ抑制功能的藻蛋白肽的制备方法的制备方法，包括以下步骤：Step1：制备节旋藻蛋白液；Step2：蛋白变构；Step3：分步酶解；Step4：二次超滤；Step5：多次洗脱；Step6：成分测定。

Description

一种具有DPP-Ⅳ抑制功能的藻蛋白肽及其制备方法
技术领域
本发明涉及海洋食品加工技术领域，具体是一种具有DPP-Ⅳ抑制功能的藻蛋白肽及其制备方法。
背景技术
降血糖功能因子是指能降低糖尿病患者血糖浓度以及改善其症状的生物活性成分。目前研究较多的天然产物类降糖因子、矿物质类降糖因子、维生素类降糖因子，其作用机理各不相同。天然产物类降糖因子按化学结构可分为黄酮类、活性多糖类、生物碱类、皂甙类、萜类、共轭亚油酸、多肽类等。自人工合成胰岛素以来，磺脲类药物、双胍类、胰岛素增敏剂、糖抑制剂等各种口服或注射的药物相继问世，然而化学药物常产生一定的毒副作用，天然降血糖成分具有作用温和而持久，性质稳定，几乎无毒性反应，还可多种降糖成分并存综合起作用等优点，备受患者以及和医学界的青睐，也成为了降血糖功能因子的主要研究方向。
目前关于降血糖功能肽开发的专利申请和授权情况来看，主要有
(1)专利CN201410129977.3本发明公开了一种利用蚕蛹制备降血糖肽的方法。
(2)专利CN201610134873.0公开了一种牡丹籽降血糖肽。
(3)专利CN201310290233.5一种利用带鱼制备二肽基肽酶IV抑制肽的方法。
(4)专利CN201410498361.3公开了一种源于鹿蛋白的DPP-IV抑制肽GPGSPGGPL，其氨基酸序列为Gly-Pro-Gly-Ser-Pro-Gly-Gly-Pro-Leu。多肽GPGSPGGPL具有DPP-IV抑制活性及降血糖活性。
专利CN201410455009.1公开一种豆渣蛋白质的提取方法及其用于制备DPP-IV抑制肽的方法。
但目前关于酶解获得的藻蛋白来源的活性肽在DPP-Ⅳ抑制活性评价方面鲜有报道。DPP-Ⅳ，是一种细胞表面的丝氨酸蛋白酶，又被称为T细胞表面抗原CD26，亦称ADABP，ADCP2，DPPIV，TP103，二肽基肽酶4，二肽基肽酶IV，T细胞活化抗原CD26，腺苷脱氨酶络合蛋白2。本发明提供一种具有DPP-Ⅳ抑制功能的藻蛋白肽及其制备方法。
发明内容
本发明正是针对现有技术存在的不足，提供一种具有DPP-Ⅳ抑制功能的藻蛋白肽及一种具有DPP-Ⅳ抑制功能的藻蛋白肽的制备方法。
为解决上述问题，本发明所采取的技术方案如下：
一种具有DPP-Ⅳ抑制功能的藻蛋白肽，所述藻蛋白肽的成分包括：氨基酸序列为HGERVVI、TPDVSIS、YPLIDVK的多肽，且所述多肽的含量为52～58％。
一种具有DPP-Ⅳ抑制功能的藻蛋白肽的制备方法的制备方法，包括以下步骤：
Step1：制备节旋藻蛋白液；选用节旋藻粉溶解于符合饮用水卫生标准的水中，待其完全溶解，采用高速剪切机处理2-3min，得到节旋藻蛋白液；
Step2：蛋白变构；将step1中得到的节旋藻蛋白液用超声波发生器经频率为60-90kHz的超声波处理20-30分钟，再使用压力为200～260Mpa的超高压微射流处理1-3次，改变其节旋藻蛋白的组织结构，得到变构后的节旋藻蛋白液；
Step3：分步酶解；将step2中得到的节旋藻蛋白液中蛋白含量调节为7-10％，再依次加入复合蛋白酶和风味蛋白酶进行酶解，得到酶解液；
Step4：二次超滤；将step3得到的酶解液在95℃下保温10分钟，冷却至室温，往step3中的酶解液中加入酶解液0.1％重量的活性炭，再通过硅藻土进行分离，收集分离液；对得到的分离液使用二次超滤法进行过滤，分离得到分子量小于2000的蛋白肽；
Step5：多次洗脱；取step4中得到的分子量小于2000的蛋白肽，加入Sephadex G-15凝胶分离洗脱，再用RP-HPLC进行1次分离，收集分离后的肽溶液；
Step6：成分测定；将step5中得到的肽溶液通过浓缩、冷冻干燥，得到节旋藻蛋白肽粉；通过LC-MS/MS对蛋白肽的主要成分进行测定，确定其氨基酸序列为HGERVVI、TPDVSIS、YPLIDVK的肽的含量为52～58％。
作为上述技术方案的改进，在所述step1中，节旋藻粉和溶剂水的质量比为5:1-8:1；节旋藻粉加入水中，在95-100℃条件下溶解并搅拌30-60min，再冷却到65-75℃，放入高速剪切机中处理。
作为上述技术方案的改进，在所述step2中，在超声波处理之前，将step1中得到的节旋藻蛋白液调整到70-75℃；在超高压微射流之前要经过20MPa的均质机预均质处理一次。
作为上述技术方案的改进，在所述step3中，分步酶解按照节旋藻蛋白液中蛋白重量0.6～1.0％的重量百分比加入蛋白酶进行分步酶解，包括：第一步酶解，利用0.5～0.8％复合蛋白酶，在45～60℃条件下进行酶解反应1.0～2.5h。
作为上述技术方案的改进，所述复合蛋白酶包括：碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶和中性蛋白酶，所述碱性蛋白酶、所述木瓜蛋白酶和所述中性蛋白酶的质量比为(1-2)：1：(1-2)。
作为上述技术方案的改进，在step3中，所述分步酶解还包括：第二步酶解，往第一步酶解后的酶解液中添加0.1～0.2％风味蛋白酶，在50～60℃条件下进行酶解反应0.5～1.0h，得到最终的酶解液。
作为上述技术方案的改进，在所述step4中，所述二次超滤法的具体步骤为，利用孔径为5000道尔顿的陶瓷膜超滤，先将分子量小于5000道尔顿的蛋白和多肽分离出来，再用孔径为2000道尔顿的膜将分子量小于2000道尔顿的蛋白肽分离出来，得到分子量小于2000的蛋白肽。
作为上述技术方案的改进，在所述step5中，多次洗脱包括：第一次洗脱；往分子量小于2000的蛋白肽中加入Sephadex G-15凝胶，在280nm光谱下检测洗脱峰，收集第2个洗脱峰下的蛋白肽液，将得到的蛋白肽液浓缩、冷冻干燥，得到节旋藻蛋白肽。
作为上述技术方案的改进，在step5中，多次洗脱还包括：第二次洗脱；用RP-HPLC反相高效液相色谱进行1次分离，反相HPLC的分离条件是以5～90％乙腈溶液作为洗脱液，并取14-15min收集的肽溶液。
本发明与现有技术相比较，本发明的有益效果如下：
(1)本发明开发的节旋藻蛋白肽整个加工过程中没有添加酸或碱进行pH的调整，产品保持较好的功能特性，产品灰分含量低，小于0.5％；(2)本发明开发的产品具有较好的DPP-Ⅳ活性抑制的功能，IC50值均小于0.23mg/mL，能广泛应用于特需食品和营养食品；(3)本发明利用特定频率超声波技术和超高压微射流处理的节旋藻蛋白液，可以明显改善节旋藻蛋白对酶的敏感性，降低酶的使用量；(4)开发的产品安全，本发明采用多种食品级复合蛋白酶即碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和风味蛋白酶，经温和条件下的适度酶解获得特定分子量和肽组成的节旋藻蛋白肽，不加任何添加剂，为100％的节旋藻蛋白肽；(5)本发明开发的蛋白肽，通过活性炭过滤具有良好的风味和色泽，能广泛应用于特需食品和营养食品；(6)本发明开发节旋藻蛋白肽中分子量小于1000的肽的比例为90％以上，具有较明确的肽的组成，其中HGERVVI、TPDVSIS、YPLIDVK的肽的含量为52％以上。
附图说明
图1为本发明蛋白肽的DPP-IV抑制实验结果；
图2为HGERVVI肽段的质谱图；
图3为TPDVSIS肽段的质谱图；
图4为YPLIDVK肽段的质谱图。
具体实施方式
下面将结合具体的实施例来说明本发明的内容。
本发明所述蛋白肽的成分包括：氨基酸序列为HGERVVI、TPDVSIS、YPLIDVK的多肽，且所述多肽的含量为52～58％。
关于本发明所述蛋白肽的制备方法，包括以下步骤：
Step1：制备节旋藻蛋白液；选用节旋藻粉溶解于符合饮用水卫生标准的水中，待其完全溶解，采用高速剪切机处理2-3min，得到节旋藻蛋白液。
Step2：蛋白变构；将step1中得到的节旋藻蛋白液用超声波发生器经频率为60-90kHz的超声波处理20-30分钟，再使用压力为200～260Mpa的超高压微射流处理1-3次，改变其节旋藻蛋白的组织结构，得到变构后的节旋藻蛋白液。
Step3：分步酶解；将step2中得到的节旋藻蛋白液中蛋白含量调节为7-10％，再依次加入复合蛋白酶和风味蛋白酶进行酶解，得到酶解液。
Step4：二次超滤；将step3得到的酶解液在95℃下保温10分钟，冷却至室温，往step3中的酶解液中加入酶解液0.1％重量的活性炭，再通过硅藻土进行分离，收集分离液。对得到的分离液使用二次超滤法进行过滤，分离得到分子量小于2000的蛋白肽。
Step5：多次洗脱；取step4中得到的分子量小于2000的蛋白肽，加入Sephadex G-15凝胶分离洗脱，再用RP-HPLC进行1次分离，收集分离后的肽溶液。
Step6：成分测定；将step5中得到的肽溶液通过浓缩、冷冻干燥，得到节旋藻蛋白肽粉。通过LC-MS/MS对蛋白肽的主要成分进行测定，确定其氨基酸序列为HGERVVI、TPDVSIS、YPLIDVK的肽的含量为52～58％。
其中，Sephadex G-15凝胶即为葡聚糖凝胶G-15。RP-HPLC为反相高效液相色谱。LC-MS/MS为液相二级质谱，是一种将经过第一次质谱检测的离子以某种方式碎裂后再进行质谱检测的检测方式。
在step1中，节旋藻粉和溶剂水的质量比为5:1-8:1。节旋藻粉加入水中，在95-100℃条件下溶解并搅拌30-60min，再冷却到65-75℃，放入高速剪切机中处理。
在step2中，在超声波处理之前，将step1中得到的节旋藻蛋白液调整到70-75℃。在超高压微射流之前要经过20MPa的均质机预均质处理一次。
在step3中，分步酶解按照节旋藻蛋白液中蛋白重量0.6～1.0％的重量百分比加入蛋白酶进行分步酶解，包括：第一步酶解，利用0.5～0.8％复合蛋白酶，在45～60℃条件下进行酶解反应1.0～2.5h。
在step3中，所述分步酶解还包括：第二步酶解，往第一步酶解后的酶解液中添加0.1～0.2％风味蛋白酶，在50～60℃条件下进行酶解反应0.5～1.0h，得到最终的酶解液。
所述复合蛋白酶包括：碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶和中性蛋白酶，所述碱性蛋白酶、所述木瓜蛋白酶和所述中性蛋白酶的质量比为(1-2)：1：(1-2)。
在step4中，所述二次超滤法的具体步骤为，利用孔径为5000道尔顿的陶瓷膜超滤，先将分子量小于5000道尔顿的蛋白和多肽分离出来，再用孔径为2000道尔顿的膜将分子量小于2000道尔顿的蛋白肽分离出来，得到分子量小于2000的蛋白肽。
在step5中，多次洗脱包括：第一次洗脱。往分子量小于2000的蛋白肽中加入Sephadex G-15凝胶，在280nm光谱下检测洗脱峰，收集第2个洗脱峰下的蛋白肽液，将得到的蛋白肽液浓缩、冷冻干燥，得到节旋藻蛋白肽。
在step5中，多次洗脱还包括：第二次洗脱。用RP-HPLC反相高效液相色谱进行1次分离，反相HPLC的分离条件是以5～90％乙腈溶液作为洗脱液，并取14-15min收集的肽溶液。
对于以步骤，本发明给出以下几个实施例。
实施例一
Step1：制备节旋藻蛋白液；选用节旋藻粉溶解于符合饮用水卫生标准的水中，待其完全溶解，采用高速剪切机处理2min，得到节旋藻蛋白液。
Step2：蛋白变构；将step1中得到的节旋藻蛋白液用超声波发生器经频率为60kHz的超声波处理20分钟，再使用压力为200Mpa的超高压微射流处理1次，改变其节旋藻蛋白的组织结构，得到变构后的节旋藻蛋白液。
Step3：分步酶解；将step2中得到的节旋藻蛋白液中蛋白含量调节为7％，再依次加入复合蛋白酶和风味蛋白酶进行酶解，得到酶解液。
Step4：二次超滤；将step3得到的酶解液在95℃下保温10分钟，冷却至室温，往step3中的酶解液中加入酶解液0.1％重量的活性炭，再通过硅藻土进行分离，收集分离液。对得到的分离液使用二次超滤法进行过滤，分离得到分子量小于2000的蛋白肽。
Step5：多次洗脱；取step4中得到的分子量小于2000的蛋白肽，加入Sephadex G-15凝胶分离洗脱，再用RP-HPLC进行1次分离，收集分离后的肽溶液。
Step6：成分测定；将step5中得到的肽溶液通过浓缩、冷冻干燥，得到节旋藻蛋白肽粉。通过LC-MS/MS对蛋白肽的主要成分进行测定，得到其氨基酸序列为HGERVVI、TPDVSIS、YPLIDVK的肽的含量为52.5％。
其中，Sephadex G-15凝胶即为葡聚糖凝胶G-15。RP-HPLC为反相高效液相色谱。LC-MS/MS为液相二级质谱，是一种将经过第一次质谱检测的离子以某种方式碎裂后再进行质谱检测的检测方式。
在step1中，节旋藻粉和溶剂水的质量比为5:1。节旋藻粉加入水中，在95℃条件下溶解并搅拌30min，再冷却到65℃，放入高速剪切机中处理。
在step2中，在超声波处理之前，将step1中得到的节旋藻蛋白液调整到70℃。在超高压微射流之前要经过20MPa的均质机预均质处理一次。
在step3中，分步酶解按照节旋藻蛋白液中蛋白重量0.6％的重量百分比加入蛋白酶进行分步酶解，包括：第一步酶解，利用0.5％复合蛋白酶，在45℃条件下进行酶解反应1.0h。
在step3中，所述分步酶解还包括：第二步酶解，往第一步酶解后的酶解液中添加0.1％风味蛋白酶，在50℃条件下进行酶解反应0.5h，得到最终的酶解液。
所述复合蛋白酶包括：碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶和中性蛋白酶，所述碱性蛋白酶、所述木瓜蛋白酶和所述中性蛋白酶的质量比为2：1：1。
在step4中，所述二次超滤法的具体步骤为，利用孔径为5000道尔顿的陶瓷膜超滤，先将分子量小于5000道尔顿的蛋白和多肽分离出来，再用孔径为2000道尔顿的膜将分子量小于2000道尔顿的蛋白肽分离出来，得到分子量小于2000的蛋白肽。
在step5中，多次洗脱包括：第一次洗脱。往分子量小于2000的蛋白肽中加入Sephadex G-15凝胶，在280nm光谱下检测洗脱峰，收集第2个洗脱峰下的蛋白肽液，将得到的蛋白肽液浓缩、冷冻干燥，得到节旋藻蛋白肽。
在step5中，多次洗脱还包括：第二次洗脱。用RP-HPLC反相高效液相色谱进行1次分离，反相HPLC的分离条件是以5％乙腈溶液作为洗脱液，并取14min收集的肽溶液。
经过以上步骤得到节旋藻蛋白肽粉的成品一。
实施例二
Step1：制备节旋藻蛋白液；选用节旋藻粉50g溶解于符合饮用水卫生标准的水中，待其完全溶解，采用高速剪切机处理3min，得到节旋藻蛋白液。
Step2：蛋白变构；将step1中得到的节旋藻蛋白液用超声波发生器经频率为90kHz的超声波处理30分钟，再使用压力为260Mpa的超高压微射流处理3次，改变其节旋藻蛋白的组织结构，得到变构后的节旋藻蛋白液。
Step3：分步酶解；将step2中得到的节旋藻蛋白液中蛋白含量调节为10％，再依次加入复合蛋白酶和风味蛋白酶进行酶解，得到酶解液。
Step4：二次超滤；将step3得到的酶解液在95℃下保温10分钟，冷却至室温，往step3中的酶解液中加入酶解液0.1％重量的活性炭，再通过硅藻土进行分离，收集分离液。对得到的分离液使用二次超滤法进行过滤，分离得到分子量小于2000的蛋白肽。
Step5：多次洗脱；取step4中得到的分子量小于2000的蛋白肽，加入Sephadex G-15凝胶分离洗脱，再用RP-HPLC进行1次分离，收集分离后的肽溶液。
Step6：成分测定；将step5中得到的肽溶液通过浓缩、冷冻干燥，得到节旋藻蛋白肽粉。通过LC-MS/MS对蛋白肽的主要成分进行测定，得到其氨基酸序列为HGERVVI、TPDVSIS、YPLIDVK的肽的含量为54.6％。
其中，Sephadex G-15凝胶即为葡聚糖凝胶G-15。RP-HPLC为反相高效液相色谱。LC-MS/MS为液相二级质谱，是一种将经过第一次质谱检测的离子以某种方式碎裂后再进行质谱检测的检测方式。
在step1中，节旋藻粉和溶剂水的质量比为8:1。节旋藻粉加入水中，在100℃条件下溶解并搅拌60min，再冷却到75℃，放入高速剪切机中处理。
在step2中，在超声波处理之前，确定step1中得到的节旋藻蛋白液为75℃。在超高压微射流之前要经过20MPa的均质机预均质处理一次。
在step3中，分步酶解按照节旋藻蛋白液中蛋白重量1.0％的重量百分比加入蛋白酶进行分步酶解，包括：第一步酶解，利用0.8％复合蛋白酶，在60℃条件下进行酶解反应2.5h。
在step3中，所述分步酶解还包括：第二步酶解，往第一步酶解后的酶解液中添加0.2％风味蛋白酶，在60℃条件下进行酶解反应1.0h，得到最终的酶解液。
所述复合蛋白酶包括：碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶和中性蛋白酶，所述碱性蛋白酶、所述木瓜蛋白酶和所述中性蛋白酶的质量比为2：1：2。
在step4中，所述二次超滤法的具体步骤为，利用孔径为5000道尔顿的陶瓷膜超滤，先将分子量小于5000道尔顿的蛋白和多肽分离出来，再用孔径为2000道尔顿的膜将分子量小于2000道尔顿的蛋白肽分离出来，得到分子量小于2000的蛋白肽。
在step5中，多次洗脱包括：第一次洗脱。往分子量小于2000的蛋白肽中加入Sephadex G-15凝胶，在280nm光谱下检测洗脱峰，收集第2个洗脱峰下的蛋白肽液，将得到的蛋白肽液浓缩、冷冻干燥，得到节旋藻蛋白肽。
在step5中，多次洗脱还包括：第二次洗脱。用RP-HPLC反相高效液相色谱进行1次分离，反相HPLC的分离条件是以90％乙腈溶液作为洗脱液，并取15min收集的肽溶液。
经过以上步骤，得到节旋藻蛋白肽粉的成品二。
实施例三
Step1：制备节旋藻蛋白液；选用节旋藻粉溶解于符合饮用水卫生标准的水中，待其完全溶解，采用高速剪切机处理2min30s，得到节旋藻蛋白液。
Step2：蛋白变构；将step1中得到的节旋藻蛋白液用超声波发生器经频率为75kHz的超声波处理25分钟，再使用压力为230Mpa的超高压微射流处理2次，改变其节旋藻蛋白的组织结构，得到变构后的节旋藻蛋白液。
Step3：分步酶解；将step2中得到的节旋藻蛋白液中蛋白含量调节为8％，再依次加入复合蛋白酶和风味蛋白酶进行酶解，得到酶解液。
Step4：二次超滤；将step3得到的酶解液在95℃下保温10分钟，冷却至室温，往step3中的酶解液中加入酶解液0.1％重量的活性炭，再通过硅藻土进行分离，收集分离液。对得到的分离液使用二次超滤法进行过滤，分离得到分子量小于2000的蛋白肽。
Step5：多次洗脱；取step4中得到的分子量小于2000的蛋白肽，加入Sephadex G-15凝胶分离洗脱，再用RP-HPLC进行1次分离，收集分离后的肽溶液。
Step6：成分测定；将step5中得到的肽溶液通过浓缩、冷冻干燥，得到节旋藻蛋白肽粉。通过LC-MS/MS对蛋白肽的主要成分进行测定，得到其氨基酸序列为HGERVVI、TPDVSIS、YPLIDVK的肽的含量为63％。
其中，Sephadex G-15凝胶即为葡聚糖凝胶G-15。RP-HPLC为反相高效液相色谱。LC-MS/MS为液相二级质谱，是一种将经过第一次质谱检测的离子以某种方式碎裂后再进行质谱检测的检测方式。
在step1中，节旋藻粉和溶剂水的质量比为7:1。节旋藻粉加入水中，在98℃条件下溶解并搅拌45min，再冷却到70℃，放入高速剪切机中处理。
在step2中，在超声波处理之前，将step1中得到的节旋藻蛋白液调整到70-75℃。在超高压微射流之前要经过20MPa的均质机预均质处理一次。
在step3中，分步酶解按照节旋藻蛋白液中蛋白重量0.8％的重量百分比加入蛋白酶进行分步酶解，包括：第一步酶解，利用0.6％复合蛋白酶，在50℃条件下进行酶解反应2h。
在step3中，所述分步酶解还包括：第二步酶解，往第一步酶解后的酶解液中添加0.2％风味蛋白酶，在55℃条件下进行酶解反应0.8h，得到最终的酶解液。
所述复合蛋白酶包括：碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶和中性蛋白酶，所述碱性蛋白酶、所述木瓜蛋白酶和所述中性蛋白酶的质量比为1：1：1。
在step4中，所述二次超滤法的具体步骤为，利用孔径为5000道尔顿的陶瓷膜超滤，先将分子量小于5000道尔顿的蛋白和多肽分离出来，再用孔径为2000道尔顿的膜将分子量小于2000道尔顿的蛋白肽分离出来，得到分子量小于2000的蛋白肽。
在step5中，多次洗脱包括：第一次洗脱。往分子量小于2000的蛋白肽中加入Sephadex G-15凝胶，在280nm光谱下检测洗脱峰，收集第2个洗脱峰下的蛋白肽液，将得到的蛋白肽液浓缩、冷冻干燥，得到节旋藻蛋白肽。
在step5中，多次洗脱还包括：第二次洗脱。用RP-HPLC反相高效液相色谱进行1次分离，反相HPLC的分离条件是以75％乙腈溶液作为洗脱液，并取14min30s收集的肽溶液。
经过以上步骤得到节旋藻蛋白肽粉的成品三。
对以上实施例得到的成品仍需要进行性能测试，其实验过程如下：
Step1：确定实验样品；样品一、样品二、样品三分别对应成品一、成品二、成品三，样品四为由实施例一的step1所得的节旋藻蛋白液直接经过冷冻干燥得到的节旋藻蛋白粉，样品五为实施例二step5第一次洗脱得到的节旋藻蛋白肽粉，样品六为实施例三步骤五第一次洗脱得到的节旋藻蛋白肽粉，对照样品HGERVVI、TPDVSIS、YPLIDVK分别为根据氨基酸序列HGERVVI、TPDVSIS、YPLIDVK人工合成的多肽。
Step2：测定DPP-Ⅳ抑制能力。
将step1中的样品分别用100mmol/L的pH为8.0的Tris-HCL缓冲液稀释至合适的浓度，吸取25μL样品稀释液与25μL浓度为1.6mmol/L的底物混合，加入到96孔酶标板中。在37℃下孵育10min后，加入50μL酶活力为8U/L DPP-IV酶液，混匀后在37℃下精确孵育60min，再立即加入100μL 1mol/L的醋酸-醋酸钠(pH 4.0)缓冲液终止反应，于405nm光谱下测吸光值A，并根据下列公式计算样品的DPP-IV抑制率。
其中，Tris-HCL缓冲液的中文别名为三(羟甲基)氨基甲烷；Tris，英文名称为Tris(hydroxymethyl)aminomethane。
DPP-IV抑制率(％)＝{1-(A1样品-A2样品空白对照)/(A3阴性对照-A4阴性空白对照)}×100
A1样品：为样品反应液在405nm处的吸光值A1；
A2样品空白对照：以Tris-HCL缓冲液代替DPP-IV酶液作为样品空白对照的吸光值A2；
A3阴性对照：以Tris-HCL缓冲液代替样品作为阴性对照的吸光值A3；
A4阴性空白对照：以Tris-HCL缓冲液代替DPP-IV酶液和样品作为阴性空白对照的吸光值A4；
Step3：DPP-IV抑制的IC50值测定：
测定样品在不同浓度下的DPP-IV抑制率，以多肽浓度的对数值与抑制率做回归曲线，得到回归方程，由此计算IC50，即50％的DPP-IV酶活性抑制是肽的浓度。
图1为本发明蛋白肽的DPP-IV抑制实验结果。如图1所示，本发明的产品具有非常好的DPP-IV抑制活性，IC50小于0.23mg/mL。分子量低于1000的肽的百分比大于90％。
本发明针对节旋藻蛋白粉的原料特点，通过对节旋藻的高频超声波、超高压微射流等预处理，在不添加任何酸和碱条件下，利用多种蛋白复合酶进行分步酶解，通过膜分离、凝胶分离及反相HPLC分离技术，开发了具有特定氨基酸多肽序列(HGERVVI、TPDVSIS、YPLIDVK)的具有DPP-Ⅳ抑制功能的藻蛋白肽，建立一套简单高效的多功能藻蛋白肽的制备方法。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (10)

1.一种具有DPP-Ⅳ抑制功能的藻蛋白肽，其特征在于，所述藻蛋白肽的成分包括：氨基酸序列为HGERVVI、TPDVSIS、YPLIDVK的多肽，且所述多肽的含量为52～58％。
2.一种具有DPP-Ⅳ抑制功能的藻蛋白肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
Step1：制备节旋藻蛋白液；选用节旋藻粉溶解于符合饮用水卫生标准的水中，待其完全溶解，采用高速剪切机处理2-3min，得到节旋藻蛋白液；
Step2：蛋白变构；将step1中得到的节旋藻蛋白液用超声波发生器经频率为60-90kHz的超声波处理20-30分钟，再使用压力为200～260Mpa的超高压微射流处理1-3次，改变其节旋藻蛋白的组织结构，得到变构后的节旋藻蛋白液；
Step3：分步酶解；将step2中得到的节旋藻蛋白液中蛋白含量调节为7-10％，再依次加入复合蛋白酶和风味蛋白酶进行酶解，得到酶解液；
Step4：二次超滤；将step3得到的酶解液在95℃下保温10分钟，冷却至室温，往step3中的酶解液中加入酶解液0.1％重量的活性炭，再通过硅藻土进行分离，收集分离液；对得到的分离液使用二次超滤法进行过滤，分离得到分子量小于2000的蛋白肽；
Step5：多次洗脱；取step4中得到的分子量小于2000的蛋白肽，加入Sephadex G-15凝胶分离洗脱，再用RP-HPLC进行1次分离，收集分离后的肽溶液；
Step6：成分测定；将step5中得到的肽溶液通过浓缩、冷冻干燥，得到节旋藻蛋白肽粉；通过LC-MS/MS对蛋白肽的主要成分进行测定，确定其氨基酸序列为HGERVVI、TPDVSIS、YPLIDVK的肽的含量为52～58％。
3.根据权利要求2所述的一种具有DPP-Ⅳ抑制功能的藻蛋白肽的制备方法，其特征在于，在所述step1中，节旋藻粉和溶剂水的质量比为5:1-8:1；节旋藻粉加入水中，在95-100℃条件下溶解并搅拌30-60min，再冷却到65-75℃，放入高速剪切机中处理。
4.根据权利要求2所述的一种具有DPP-Ⅳ抑制功能的藻蛋白肽的制备方法，其特征在于，在所述step2中，在超声波处理之前，将step1中得到的节旋藻蛋白液调整到70-75℃；在超高压微射流之前要经过20MPa的均质机预均质处理一次。
5.根据权利要求2所述的一种具有DPP-Ⅳ抑制功能的藻蛋白肽的制备方法，其特征在于，在所述step3中，分步酶解按照节旋藻蛋白液中蛋白重量0.6～1.0％的重量百分比加入蛋白酶进行分步酶解，包括：第一步酶解，利用0.5～0.8％复合蛋白酶，在45～60℃条件下进行酶解反应1.0～2.5h。
6.根据权利要求5所述的一种具有DPP-Ⅳ抑制功能的藻蛋白肽的制备方法，其特征在于，所述复合蛋白酶包括：碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶和中性蛋白酶，所述碱性蛋白酶、所述木瓜蛋白酶和所述中性蛋白酶的质量比为(1-2)：1：(1-2)。
7.根据权利要求5所述的一种具有DPP-Ⅳ抑制功能的藻蛋白肽的制备方法，其特征在于，在step3中，所述分步酶解还包括：第二步酶解，往第一步酶解后的酶解液中添加0.1～0.2％风味蛋白酶，在50～60℃条件下进行酶解反应0.5～1.0h，得到最终的酶解液。
8.根据权利要求2所述的一种具有DPP-Ⅳ抑制功能的藻蛋白肽的制备方法，其特征在于，在所述step4中，所述二次超滤法的具体步骤为，利用孔径为5000道尔顿的陶瓷膜超滤，先将分子量小于5000道尔顿的蛋白和多肽分离出来，再用孔径为2000道尔顿的膜将分子量小于2000道尔顿的蛋白肽分离出来，得到分子量小于2000的蛋白肽。
9.根据权利要求2所述的一种具有DPP-Ⅳ抑制功能的藻蛋白肽的制备方法，其特征在于，在所述step5中，多次洗脱包括：第一次洗脱；往分子量小于2000的蛋白肽中加入Sephadex G-15凝胶，在280nm光谱下检测洗脱峰，收集第2个洗脱峰下的蛋白肽液，将得到的蛋白肽液浓缩、冷冻干燥，得到节旋藻蛋白肽。
10.根据权利要求9所述的一种具有DPP-Ⅳ抑制功能的藻蛋白肽的制备方法，其特征在于，在step5中，多次洗脱还包括：第二次洗脱；用RP-HPLC反相高效液相色谱进行1次分离，反相HPLC的分离条件是以5～90％乙腈溶液作为洗脱液，并取14-15min收集的肽溶液。
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