CN110437307B - 一类具抗血栓和脑神经细胞保护作用的水蛭多肽及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一类具抗血栓和脑神经细胞保护作用的水蛭多肽及其应用，涉及中药、天然药物和保健品领域。该水蛭多肽的结构如式I所示，其在较低浓度下即可显著降低人脐静脉内皮细胞表达血管性血友病因子(vWF)和纤溶酶原激活物抑制剂‑1(PAI‑1)，提高氧糖剥夺后神经细胞的存活率，抑制体外血小板聚集，延长血浆复钙时间并减少体内血栓的形成，改善大鼠脑梗死后神经行为、减轻脑水肿和减少脑梗死面积，并且毒性低，具有良好的应用前景，可用于制备治疗或辅助治疗动脉粥样硬化、血栓以及脑卒中后神经功能损伤等心脑血管疾病的药物或保健品。NH₂‑Leu‑_D‑Leu‑Ser‑Gly‑Val‑Rwhitmantide A：R＝_D‑Leu‑Gly‑COOHwhitmantide B：R＝_D‑Leu‑Gly‑Gly‑COOHwhitmantide C：R＝COOH式I。

Description

一类具抗血栓和脑神经细胞保护作用的水蛭多肽及其应用

技术领域

本发明涉及中药、天然药物和保健品领域，具体涉及一类具抗血栓和脑神经细胞保护作用的水蛭多肽及其应用。

背景技术

据世界卫生组织统计，心脑血管疾病是全球的头号死因。动脉粥样硬化、脑卒中、心肌梗死、半身不遂等是常见的心脑血管类疾病。心血管疾病的临床治疗药物存在药物抵抗、出血性风险高等诸多不良反应，且目前缺乏有效的中风后神经功能修复药物。多肽具有良好的生物相容性，特异性强，毒性低，在体内不易产生蓄积，与其他成分的相互作用较少，但存在易酶解失活的缺陷，限制了多肽类药物在临床的应用。

水蛭为环节动物门蛭纲，在我国分布广泛，作为一种传统中药，水蛭具有悠久的入药历史，《神农本草经》谓其“主逐恶血，淤血，月闭，破血瘕积聚”。临床用于治疗血瘀经闭、癥瘕痞块、中风偏瘫以及跌打损伤。目前市场上含有水蛭提取物的中药制剂有脑血康片、脑血康胶囊、脑血康颗粒、脑血康滴丸以及疏血通注射液等。上述药物临床上主要用于治疗心脑血管疾病，疗效确切。水蛭作为上述制剂的主要组成药物，具有确切的临床疗效，但其保护血管和神经的活性成分尚不明确。已有文献报道水蛭提取物具有抗血栓、调节内皮细胞表达凝血相关因子(中国动脉硬化杂志,2017,25:1184-1188)和促进脑缺血损伤后神经功能恢复的作用[南昌大学学报(医学版),2015,55:23-26]，但并未明确其有效成分。

发明内容

本发明的目的在于为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一类具抗血栓和脑神经细胞保护作用的水蛭多肽。

本发明的另一目的在于提供一种含有上述水蛭多肽的组合物。

本发明的再一目的在于提供上述水蛭多肽或组合物在制备治疗或辅助治疗心脑血管疾病的产品中的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一类具抗血栓和脑神经细胞保护作用的水蛭多肽，命名为whitmantide A、whitmantide B或whitmantide C，其结构如式I所示：

NH₂-Leu-_D-Leu-Ser-Gly-Val-R

whitmantide A：R＝_D-Leu-Gly-COOH

whitmantide B：R＝_D-Leu-Gly-Gly-COOH

whitmantide C：R＝COOH

式I；所述的水蛭多肽whitmantidesA、B或C的制备，可采用现有技术中的公知方法进行，也可用多肽自动合成仪按常规固相合成方法进行化学合成，还可通过将短肽序列推导出核苷酸序列，然后克隆到表达载体中进行生物合成；

一种含有水蛭多肽的组合物，该组合物含有上述水蛭多肽成分whitmantide A、B和C中的至少一种；

所述的含有水蛭多肽的组合物含有有效剂量的whitmantides A-C，包含其中的一种、两种或者三种，还可含有辅料和/或其他与水蛭多肽可配伍的药物。

所述的辅料为溶剂、崩解剂、矫味剂、防腐剂或黏附剂。

所述的其他可配伍的药物，是指其他化学药品、中药、天然药物或生物药物。

所述的具抗血栓和脑神经细胞保护作用的水蛭多肽在制备治疗或辅助治疗心脑血管疾病的产品中的应用；

所述的含有水蛭多肽的组合物在制备治疗或辅助治疗心脑血管疾病的产品中的应用；

优选的，所述的具抗血栓和脑神经细胞保护作用的水蛭多肽或含有水蛭多肽的组合物在制备治疗或辅助治疗动脉粥样硬化、血栓以及脑卒中后神经功能损伤的产品中的应用；

所述的产品为药物或保健品，其剂型选自注射剂、片剂、粉针剂、控释胶囊剂、脂质体纳米粒、颗粒剂或滴丸剂。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)Whitmantides A-C是从水蛭中分离鉴定的一类含D型氨基酸的新结构多肽类化合物，其结构如式I所示。

(2)本发明的水蛭多肽whitmantides A-C具有较好的血浆稳定性。

(3)本发明的水蛭多肽whitmantides A-C的毒性低，在50～150μM浓度，未观察到细胞毒性，具有良好的应用前景。

(4)本发明的水蛭多肽在较低浓度下即可显著降低人脐静脉内皮细胞表达血管性血友病因子(vWF)和纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)，提示具有抗动脉粥样硬化和血栓性疾病的作用。

(5)本发明的水蛭多肽可显著提高氧糖剥夺后Neuro-2a神经细胞的存活率，提示具有神经功能保护作用；

(6)本发明的水蛭多肽可抑制体外血小板聚集，延长血浆复钙时间并减少体内血栓的形成，提示具有抗血栓的作用。

(7)本发明的水蛭多肽可改善大鼠脑梗死后神经行为，减轻脑水肿并减少脑梗死面积，提示水蛭多肽可用于治疗脑梗死。

(8)本发明的水蛭多肽whitmantides A-C容易合成，易于大量制备。

附图说明

图1是whitmantide A的氨基酸测序图。

图2是whitmantide A的高分辨质谱图。

图3是whitmantide A的二级质谱图。

图4是whitmantide A的Marfey法测试结果图。

图5是whitmantide A绝对构型分析测定图。

图6是whitmantide B的氨基酸测序图。

图7是whitmantide B的高分辨质谱图。

图8是whitmantide B二级质谱图。

图9是whitmantide B的Marfey法测试结果图。

图10是whitmantide B绝对构型分析测定图。

图11是whitmantide C的氨基酸测序图。

图12是whitmantide C的高分辨质谱图。

图13是whitmantide C的二级质谱图。

图14是whitmantide C的Marfey法测试结果图。

图15是whitmantide C绝对构型分析测定图。

图16是whitmantides A-C的血浆稳定性的结果分析图。

图17是whitmantides A-C细胞毒性测试结果分析图。

图18是whitmantides A-C对人脐静脉内皮细胞促凝因子表达水平影响的结果分析图。

图19是whitmantides A-C对氧糖剥夺后Neuro-2a神经细胞存活率影响的结果分析图，其中，OGD表示氧糖剥夺模型。

图20是whitmantides A-C对大鼠实验性血栓形成影响的结果分析图，其中，Vehicle表示空白溶剂组。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为从商业途径得到的试剂和材料。

以下的实施方式采用的超高效液相-质谱(UPLC-MS)分析条件如下：

试验仪器为Waters Acquity UPLC-Xevo-G2Q/TOF；色谱柱为ACQUITY

CSH TM C18色谱柱(2.1mm×100mm,1.7μm)；流动相：A，0.1％甲酸水；B，乙腈；洗脱程序：0–10min(5-15％B)，10–15min(15–50％B)，15–17min(50–95％B)，17–18min(95–5％B)；流速：0.3mL/min；柱温：30℃；进样量：1～10μL；采集时间：18min；离子源为ESI模式：正离子；扫描范围：100～2000Da；样品锥孔电压：35V；萃取锥孔电压：4V；毛细管电压：2.5kV；脱溶剂气温度：350℃；离子源温度：100℃；脱溶剂气流速：800L/h；锥孔气流速：氮气，50L/h；扫描方式：全扫描一级质谱。

实施例1多肽whitmantides A-C的分离

(1)水蛭干燥全体3kg，使用生理盐水清洗浸泡粉碎匀浆，匀浆液经冻融法得提取液。所得的提取液经截留分子量为50KDa的超滤膜进行处理，收集分子量小于50KDa的超滤液部分，所得超滤液经固相除盐后，减压浓缩或冷冻干燥得总提取物(13g)。在4～8℃条件下，总提取物经凝胶Sephadex G25分离。采用超高效液相色谱-质谱(UPLC-MS)方法分析跟踪检测，收集含多肽化合物的流分，减压浓缩或真空干燥，得到多肽富集部位(10g)。

(2)取步骤(1)中的多肽富集部位进行反相硅胶柱层析，以乙腈-水为洗脱剂，按照乙腈和水体积比为5:95、10:90、15:85、20:80、30:70、50:50、90:10的洗脱梯度进行洗脱，得到7个主流份Fr.A～Fr.G；

(3)对步骤(2)中得到的流份Fr.E(1.1g)使用制备液相进行分离，以酸水(A)(0.1％三氟乙酸)-乙腈(B)为流动相，洗脱程序：0～40min(10-40％B)，40～60min(40-70％B)；流速为6mL/min进行洗脱，得到8个亚流份Fr.E1～Fr.E8。

(4)对步骤(3)得到的亚流份Fr.E4浓缩后用水溶解，使用分析型HPLC分离纯化，使用酸水(0.1％甲酸)(A)-乙腈(B)为流动相，洗脱程序：0～30min(10-30％B)，30～40min(30-50％B)，40～45min(50-10％B)，45～55min(10％B)；流速为1mL/min进行洗脱，收集保留时间为15.8min和14.5min的色谱峰，得到whitmantide A和whitmantide B。

(5)对步骤(3)得到的亚流份Fr.E3浓缩后用水溶解，使用与步骤(4)相同的色谱方法，收集保留时间为10.4min的色谱峰，得到whitmantide C。

实施例2多肽whitmantide A的结构表征

实施例1制得的多肽whitmantide A为无定形粉末，UV(H₂O)λ_max(logε):195(3.20)。IR(KBr)ν_max:3275.5,2960.2,1657.52,1541.81cm^-1。HR-ESI-MS m/z 658.4155[M+H]⁺(calcd forC₃₀H₅₆N₇O₉:658.4140)。采用Edman降解法对whitmantide A进行N端测序，确定氨基酸序列为NH₂-Leu-Leu-Ser-Gly-Val-Leu-Gly-COOH。MS/MS二级质谱图显示，该化合物的a、b和y离子碎片与其氨基酸序列相符，以上结果进一步验证了whitmantide A的氨基酸连接顺序。Marfey法分析结果显示，whitmantide A中含有两个D型亮氨酸和一个L型亮氨酸，其它手性氨基酸构型均为L型。采用固相合成法确定whitmantide A的绝对构型，whitmantide A中D型和L型亮氨酸的位置有3种排列方式，固相合成法完成了以上3种多肽的合成(1a、1b和1c)；在相同的色谱条件下将上述3种合成多肽与天然多肽whitmantide A进行比对，结果显示whitmantide A与1c的出峰时间基本一致；whitmantide A与1c等量混合进样，HPLC分析结果显示为单峰，确定whitmantide A与1c具有相同的结构。氨基酸测序图见图1，高分辨质谱图见图2，二级质谱图见图3，Marfey法测试结果图见图4，绝对构型分析测定图见图5。根据上述理化、光谱和色谱数据，鉴定出whitmantide A的化学结构，如式Ⅰ所示。

实施例3多肽whitmantide B的结构表征

实施例1制得的多肽whitmantide B为无定形粉末，UV(H₂O)λ_max(logε):196(3.18)。IR(KBr)ν_max:3275.5,2957.3,1640.16,1544.7,1132.97cm^-1；HR-ESI-MS m/z715.4331[M+H]⁺(calcd for C₃₂H₅₉N₈O₁₀:715.4354)。采用Edman降解法对whitmantide B进行N端测序，确定氨基酸序列为NH₂-Leu-Leu-Ser-Gly-Val-Leu-Gly-Gly-COOH。MS/MS二级质谱图显示，该化合物的a、b和y离子碎片与其氨基酸序列相符，以上结果进一步验证了whitmantide B的氨基酸连接顺序。Marfey法分析结果显示，whitmantide B中含有两个D型亮氨酸和一个L型亮氨酸，其它手性氨基酸构型均为L型。采用固相合成法确定whitmantideB的绝对构型，whitmantide B中D型和L型亮氨酸的位置有3种排列方式，固相合成法完成了以上3种多肽的合成(2a、2b和2c)；在相同的色谱条件下将上述3种合成多肽与天然多肽whitmantide B进行比对，结果显示whitmantide B与2a的出峰时间基本一致；whitmantideB与2a等量混合进样，HPLC分析结果显示为单峰，确定whitmantide B与2a具有相同的结构。氨基酸测序图见图6，高分辨质谱图见图7，二级质谱图见图8，Marfey法测试结果图见图9，绝对构型分析测定图见图10。根据上述理化、光谱和色谱数据，鉴定出whitmantide B的化学结构，如式Ⅰ所示。

实施例4多肽whitmantide C的结构表征

实施例1制得的多肽whitmantide C为无定形粉末，UV(H₂O)λ_max(logε):194(3.26)。IR(KBr)ν_max:3288.04,2963.09,1654.62,1529.27,1398.14cm^-1。HR-ESI-MS m/z488.3094[M+H]⁺(calcd for C₂₂H₄₂N₅O₇:488.3084)。采用Edman降解法对whitmantide C进行N端测序，确定氨基酸序列为NH₂-Leu-Leu-Ser-Gly-Val-COOH。MS/MS二级质谱图显示，该化合物的a、b和y离子碎片与其氨基酸序列相符，以上结果进一步验证了whitmantide C的氨基酸连接顺序。Marfey法分析结果显示，whitmantide C中含有一个D型亮氨酸和一个L型亮氨酸，其它手性氨基酸构型均为L型。采用固相合成法确定whitmantide C的绝对构型，whitmantide C中D型和L型亮氨酸的位置有两种排列方式，固相合成法完成了以上两种多肽的合成(3a和3b)；在相同的色谱条件下将上述两种合成多肽与天然多肽whitmantide C进行比对，结果显示whitmantide C与3a的出峰时间基本一致；whitmantide C与3a等量混合进样，HPLC分析结果显示为单峰，确定whitmantide C与3a具有相同的结构。氨基酸测序图见图11，高分辨质谱图见图12，二级质谱图见图13，Marfey法测试结果图见图14，绝对构型分析测定图见图15。根据上述理化、光谱和色谱数据，鉴定出whitmantide C的化学结构，如式Ⅰ所示。

实施例5多肽whitmantides A-C的合成

采用全自动多肽合成仪Fmoc法固相合成多肽whitmantides A-C。选用带有N-Fmoc保护基的氨基酸原料，缩合剂为苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)或2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐(HATU)，脱保护剂为1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯(DBU)(1％～3％)和哌啶(2％～20％)，反应溶剂为N,N-二甲基甲酰胺。反应完毕后，使用二氯甲烷淋洗树脂，干燥，将树脂放入裂解液中进行裂解(三氟乙酸：水：三异丙基硅烷＝95:2.5：2.5,v/v/v)。收集裂解液，使用乙醚或叔丁基甲基醚作为沉淀试剂。离心得到多肽粗品。液相制备纯化多肽，所得的纯品经冷冻干燥后，放入-80℃保存。

实施例6多肽whitmantides A-C的血浆稳定性研究

(1)线性关系考察

精密称取多肽样品2.00mg，1mL去离子水溶解，配制成储备液，对半稀释5个测试浓度，HPLC分析。色谱条件如下：色谱柱为Agilent Eclipse XDB-C18(4.6×250mm,5μm)；柱温，30℃；检测波长，214nm；流动相A，H₂O(0.1％TFA)，流动相B，乙腈(0.1％TFA)；梯度设置：0～30min，15-35％B；流速，1mL/min；进样量，20μL。以所测样品在214nm波长处的吸收峰面积对浓度C(mg/mL)进行线性回归，得到标准方程。

线性关系考察试验结果表明，在0.0625mg/mL～1.0mg/mL范围内，所测多肽样品的浓度与其在214nm波长处的吸收峰面积具有良好的线性关系。

(2)样品室温稳定性试验

取whitmantides A-C及其全L型氨基酸异构体L-A～C适量，使用超纯水溶解，0.22μm滤膜过滤。室温条件下，分别于第0、2、4、6、8、12和24h进行测定，记录峰面积，考察样品于自动进样器中放置24h之内的稳定性。

稳定性试验结果表明，所测多肽在不同时间点的峰面积的RSD值均小于2.0％，说明样品溶液在室温下24h内稳定。

(3)回收率试验

精密称取whitmantides A-C及其全L型氨基酸异构体L-A～C各1.00mg、0.50mg和0.12mg，分别溶解于1mL的超纯水中，HPLC进样，计算峰面积。将等量上述多肽样品溶解于0.5mL超纯水中，加入等体积大鼠血清混匀，零时刻取100μL，加入500μL甲醇-乙腈混合溶液(甲醇：乙腈＝1:2，v/v)，涡旋40s，4℃条件下静置30min。13000rpm离心10min，取上清液，HPLC等量进样分析，比较峰面积，计算回收率。

回收率试验结果表明，whitmantides A-C及其全L型氨基酸异构体L-A～C的回收率均在95％～105％之间，说明样品与血浆蛋白的结合率较低，对待测样品残留浓度的测定无明显的影响。

(4)血浆稳定性试验

精密称取whitmantides A-C及其全L型氨基酸异构体L-A～C各1.5mg，溶解于37℃的2mL含有50％大鼠血清的水溶液中，置于37℃恒温水浴，分别于0min、5min、10min、15min、30min、1h、2h、4h、8h、10h以及24h取液100μL，加入500μL甲醇-乙腈混合溶液(甲醇：乙腈＝1：2，v/v)，涡旋40s，4℃下放置30min，13000rpm离心10min，取上清，采用与线性关系考察试验相同的色谱分析方法进行测定。利用多肽的HPLC标准曲线计算血浆中多肽的残余浓度，绘制多肽稳定性随时间的变化曲线，每个样品进行3个平行操作。

血浆稳定性试验结果表明(图16)，在血浆孵育24h之后，whitmantides A-C残留量达到初始量的65％以上，而其全L型氨基酸异构体L-A～C在两小时之内完全降解，以上结果说明含有D型氨基酸多肽whitmantides A-C具有较好的抗酶解能力。

实施例7多肽whitmantides A-C对内皮细胞促凝因子表达水平的影响

(1)细胞毒性测试：研究化合物对内皮细胞促凝因子表达水平的影响，首先要先评价化合物的细胞毒性，筛选出细胞无毒剂量，再进行下一步的试验。取对数生长期的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)，接种于96孔板中，每孔接种0.6×10³个细胞，过夜孵育，细胞培养条件：10％FBS的DMEM培养液，37℃，5％CO₂。设置空白组、不同浓度的样品组和阳性对照组。每组3个复孔，加入100μL含待测样品的培养基，样品测试浓度为0、50、75、100、150μM，培养条件为37℃、5％CO₂。24h之后每孔加入40μL MTT(5mg/mL)和30μL空白培养基，相同条件下继续孵育4h。弃去上清液，再加入100μL DMSO。使用酶标仪检测各孔在595nm波长处的吸光度值(oplical density,OD)，计算细胞存活率，重复实验至少3次以上。

细胞毒性测试结果如图17所示，在所测试的浓度范围，whitmantidesA-C对细胞的生存率无抑制作用，细胞存活率均可达到对照组的100％以上。

(2)多肽whitmantides A-C对内皮细胞促凝因子表达水平影响的测试

a.细胞给药处理：取对数生长期的HUVEC细胞，接种于96孔板中，每孔接种0.6×10³个细胞，过夜孵育。设置空白组和样品组；每组3个复孔，加入100μL含待测样品的培养基，样品测试浓度为75μM，孵育24h，细胞培养条件为37℃、5％CO₂。

b.HUVEC总RNA的提取：将细胞用PBS清洗，加入350μLTrizol裂解液；细胞裂解充分之后用刮板刮下细胞，并将混合物吸入spin column中。将spin column放入2mL离心管中，10000rpm/min离心1min，收集液体，弃去spin column。向上一步所得的离心管中加入350μL70％乙醇，混匀后再吸入至mini column中，10000rpm/min离心30s，弃去下层液体；向minicolumn中加入500μL wash bufferⅠ洗脱，10000rpm/min离心30s，弃去液体后，加入500μLwash bufferⅡ洗脱，10000rpm/min离心1min，重复两次；弃去洗液后，继续离心空管，10000rpm/min离心2min，除去残留的液体；打开mini column的盖子，加入提前预热70℃的DEPC水，室温放置5min，将mini column放置于干净的1.5mL离心管中，13000rpm/min离心2min，收集离心管中的液体，弃去mini column；测定RNA浓度以及纯度，OD 260/280值在1.9～2.0之间；将上述所提取的RNA放置于-80℃保存。

c.反转录体系见表1。

表1

PCR管中加入的试剂	加入量
		Template RNA	2μg
All-in-one cDNA Synthesis SuperMix	4μL
		DEPC水	补至20μL
总体积	20μL

反转录反应条件：PCR仪设定25℃10min；42℃30min；85℃5min；4℃forever。

d.引物序列见表2。

表2

e.引物的特异性检测，反应体系见表3。

表3

PCR管中加入的试剂	加入量
		Template DNA	1μL
PCR SuperMix for PAGE	10μL
		Forward primer	1μL
Reverse primer	1μL
		Nuclease-Free Water	7μL
总体积	20μL

PCR反应条件设置：PCR仪设定94℃5min；(95℃30s；60℃30s，72℃30s)×34cycles；72℃5min；12℃forever。

f.琼脂糖凝胶检测PCR产物

制备琼脂糖凝胶，方法如下所述。将凝胶托盘放置在制胶盒中，插好加样梳，配置2％琼脂糖TEA溶液，微波炉中火加热4min，倒入凝胶托盘中，室温下凝固。放置30min后，将制好的凝胶放入电泳槽中，依次加入样品和核酸Marker，电泳条件为120V、30min。电泳结束后，将凝胶放置于凝胶成像仪上进行拍照。每个样品都出现明显的单一条带，说明引物的特异性良好，可用作下一步试验使用。

g.q-PCR测试，反应体系见表4。

表4

PCR96孔板中加入的试剂	加入量
		Template DNA	10ng
2×SYBR qPCR Master Mix，Biomake	10μL
		DEPC水	补至20μL
Forward primer(5μM)	1μL
		Reverse primer(5μM)	1μL

q-PCR使用三步法，PCR程序设定为：95℃5min；(95℃15s，60℃30s，72℃30s)×40cycles；熔解曲线条件设定为：(95℃15s，65℃30s，95℃315s)×1。

多肽whitmantides A-C对内皮细胞促凝因子表达水平影响的测试结果表明(图18)，所测定的单体化合物可显著降低促凝因子vWF和PAI-1RNA的表达。

实施例8多肽whitmantides A-C对氧糖剥夺(OGD)后Neuro-2a神经细胞存活率的影响

试验方法：氧糖剥夺试验(OGD)可通过制造缺糖缺氧环境从而诱导神经细胞损伤。试验设置正常实验组(Control)，模型对照组(OGD)、阳性对照组(OGD+Edaravone)和不同浓度的样品组(OGD+不同浓度药物1.56μM～50μM)。其中Control组为正常条件下生长的细胞。OGD组为空白溶剂作用下的氧糖剥夺处理组，阳性对照组和样品组分别为阳性药和不同浓度药物作用下的氧糖剥夺处理组。OGD试验方法如下：取对数生长期的细胞Neuro-2a，将细胞以8×10³cells/孔的密度接种于96孔板中，每组设3个复孔，正常条件下培养24h后，换用含有空白溶剂或药物的无糖培养基，通入95％CO₂+5％N₂，使细胞处于无氧环境。细胞缺糖缺氧4h后换成生长培养基，复氧24h。用MTT法检测细胞活力。加入MTT反应4h，除去MTT，再加入DMSO，充分溶解甲瓒后，采用酶标仪在595nm处检测其光密度值(oplical density，OD)，并按如下公式计算细胞生长存活率：生长存活率％＝(实验组平均OD值-空白组OD值)/(对照组平均OD值-空白组OD值)×100％。

试验结果表明(图19)，多肽whitmantides A-C在较低浓度下(3.125～50μM)下即可显著提高氧糖剥夺后Neuro-2a神经细胞的存活率。

实施例9多肽whitmantides A-C对体外血浆复钙时间的影响

取20μL兔血浆与10μL的样品混合于Hepes缓冲液中(150Mm NaCl,ph 7.5)，体积为70μL；在37℃的恒温培育箱中孵育10min；之后加入50μL、37℃的CaCl₂(25mM)引发反应。使用酶标仪测定凝血反应动力学，检测波长为650nm，20min，间隔40s。吸光值OD_650nm达到恒定的时间记为血液凝固时间，每次试验设置3个复孔，重复两次。结果见表5。

表5血浆复钙时间统计结果

试验结果表明，多肽whitmantides A-C可以延长血浆复钙时间，且呈剂量依赖性。

实施例10多肽whitmantides A-C对体外血小板聚集的影响

取SD大鼠250g若干只，麻醉后腹腔主动脉取血，室温条件下，1200r/min离心10min，取上清，得富血小板血浆(platelet rich plasma,PRP)；取完上清的血液，继续离心10min，3000r/min，取上清，得到贫血小板血浆(platelet poor plasma,PPP)；吸取250μLPPP调零。吸取200μL PRP和25μL待测样品，混合后，37℃孵育5min，以ADP(二磷酸腺苷)和花生四烯酸(AA)为血小板聚集诱导剂，测定5min内血小板的聚集率，按公式计算血小板聚集抑制率：抑制率(％)＝(空白组血小板聚集率-样品组血小板聚集率)/空白组聚集率×100％。结果见表6和表7。

表6血小板聚集抑制率统计结果(ADP诱导)

表7血小板聚集抑制率统计结果(花生四烯酸诱导)

试验结果表明，多肽whitmantides A-C可以抑制ADP和AA诱导的血小板聚集，且呈剂量依赖性。

实施例11多肽whitmantides A-C对大鼠实验性血栓形成的影响

雄性SD大鼠，体重在250～300g之间，随机分组，每组8只，尾静脉给药组：Aspirin、whitmantideA、whitmantideB和whitmantideC(剂量分别为5、10、20mg/kg)和同体积的生理盐水。给药1h后用血栓旁路法进行试验。使用10％水合氯醛麻醉大鼠，取内径0.9mm、长约12cm的三段聚乙烯管(内置6cm长的丝线)，连接右颈总动脉和左颈外静脉，开放血流15min后中断血流，取出丝线称重，丝线湿重减去原丝线干重，即为所形成血栓的湿重。

试验结果表明(图20)，多肽whitmantides A-C可显著地抑制血栓的形成，与阳性药Aspirin的抗血栓效果相当，且成剂量依赖性。

实施例12多肽whitmantides A-C对大鼠急性脑梗死的治疗作用

雄性SD大鼠，体重在250～300g之间，随机分组，每组20只，采用自体血栓大脑中动脉闭塞局灶脑缺血模型，分为模型组、假手术组和治疗组，造模后6h经尾静脉给药(5mg/kg)，每日1次连续5日；进行神经功能缺损评分、脑含水量测定以及脑梗死体积测定。神经功能缺损评分参考改良的Bederson评分方法；神经功能缺损评分后，每组取10只大鼠，断头取脑，称取病灶侧半球的重量(湿重)，干燥至恒重后再次称重(干重)，按公式计算脑含水量：脑含水量＝(湿重-干重)/湿重×100％；神经功能缺损评分后，每组取10只大鼠，断头取脑，去掉嗅球、小脑和低位脑干，采用TTC染色法测定脑梗死体积，按公式计算脑梗死体积：V＝Σ[(S1+S2)÷2×h](V：总容积；S1,S2：每一片上下两面病灶面积；h：层面厚度)。统计结果如表8所示。

表8大鼠神经行为评分、脑含水量和脑梗死体积的变化

^▲P<0.01与模型组比较；*P<0.01与假手术组比较。

给药前后一般行为改变、神经功能缺失评分的观察结果表明，多肽whitmantidesA-C可显著改善大鼠神经行为，对神经功能恢复具有明显的促进作用；脑含水量和脑梗死体积测定结果表明，多肽whitmantides A-C可显著减轻脑水肿并减少脑梗死体积；上述试验结果提示多肽whitmantides A-C可用于治疗脑梗死。

实施例13注射剂的制备

取多肽50mg，包含whitmantides A-C中的一种、两种或三种，使用注射用水溶解后，加入氯化钠9g，溶解后再加入注射用水至1000mL，过滤、罐装、灭菌后即得1000支注射用针剂。

实施例14片剂的制备

取多肽50mg，包含whitmantides A-C中的一种、两种或三种，淀粉浆60g，硬脂酸镁0.2g，乳糖40g，混合、过筛、干燥后压片。

实施例15粉针剂的制备

取多肽样品，包含whitmantides A-C中的一种、两种或三种，添加药学上可接受的辅料冷冻干燥剂制成。冷冻干燥步骤如下：第一预冻温度为-40℃～-20℃，控温时间为1～2h；第二预冻温度为-60℃～-50℃，控温时间为2～3h；第三预冻为2～3h内升温至-20℃～-15℃，控温时间为1～2h；抽真空所得的真空度为0～25Pa；第一干燥温度为-20℃～-15℃，干燥时间为15～25h；第二干燥温度为-15℃～-10℃，干燥时间为10～20h；第三干燥温度为-5℃～5℃，干燥时间为8～10h；第四干燥温度为10℃～15℃，干燥时间为8～10h。

实施例16控释胶囊剂的制备

取多肽50mg，包含whitmantides A-C中的一种、两种或三种，淀粉浆10g，乳糖40g，混合，使用旋转制粒机/包衣器制备颗粒，将稀释到质量分数为15％固体的塑化乙基纤维素包衣剂悬浮喷雾到多肽颗粒得旋转床上。用泊洛沙姆188制成得分散体载体膜包衣颗粒，形成平均颗粒度大约为450μm的持续释放的颗粒，混匀装入胶囊。

实施例17脂质体纳米粒的制备

取多肽50mg，包含whitmantides A-C中的一种、两种或三种，大豆卵磷脂0.5g，溶于25mL乙醇中；取硬脂酸镁0.2g和大豆卵磷脂0.5g溶于25mL环己烷中，混合搅拌均匀；37℃减压旋转蒸发除去有机溶剂，使药物及辅料在烧瓶壁形成均匀脂质薄膜，于真空干燥器中放置过夜，除尽有机溶剂；取聚乙二醇单硬脂酸酯0.3～0.4g，搅拌溶解在150～200mL水中，加入上述薄膜中，超声10min，定容至250mL，得淡黄色透明溶液；将此溶液冷冻干燥可得冻干粉。用球磨机研磨24h，制得粒径均匀的纳米粒，混匀并分装。

实施例18颗粒剂的制备

多肽whitmantides A-C，选择其中的一种、两种或三种；使用可溶性淀粉、蔗糖或糊精为辅料；物料比为1：2～1：4；润湿剂选用70％～90％乙醇；混合均匀，选择挤压方式过14目筛网，取过完筛网的颗粒置托盘中，于电热恒温鼓风干燥箱60℃干燥10min而得。

实施例19滴丸剂的制备

多肽whitmantides A-C，选择其中的一种、两种或三种；配伍组分选择泊洛沙姆和聚乙二醇；各组分的重量配比为多肽：泊洛沙姆：聚乙二醇＝1：(0.5～2)：(2.5～6)；将各个组分置于水浴上加热，熔融之后，混合均匀；预热滴丸机，使贮液室恒温为药液温度；冷却剂大豆油预冷10～12℃，以25～30滴/分的滴速滴制；在阀门口收集滴丸，滤除冷却剂，并吸除表面油渍，晾干，即得成型滴丸。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 暨南大学

<120> 一类具抗血栓和脑神经细胞保护作用的水蛭多肽及其应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> PAI-1上游引物

<400> 1

agtggacttt tcagaggtgg agaga 25

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> PAI-1下游引物

<400> 2

cgggcgtggt gaactcagta t 21

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> vWF上游引物

<400> 3

agtgtctggc tgagggaggt aaa 23

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> vWF下游引物

<400> 4

acaacagagc cattggtgca gt 22

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> GAPDH上游引物

<400> 5

tgacttcaac agcgacaccc a 21

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> GAPDH下游引物

<400> 6

gcaactgtga ggaggggaga tt 22

Claims (9)

1.一类具有抗血栓和脑神经细胞保护作用的水蛭多肽，其特征在于：命名为whitmantide A、whitmantide B或whitmantide C，其结构如下所示：

NH₂-Leu-_D-Leu-Ser-Gly-Val-R

whitmantide A：R＝_D-Leu-Gly-COOH

whitmantide B：R＝_D-Leu-Gly-Gly-COOH

whitmantide C∶R＝COOH。

2.一种含有水蛭多肽的组合物，其特征在于：含有权利要求1所述的水蛭多肽whitmantide A、whitmantide B和whitmantide C中的至少一种。

3.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于：

所述的组合物还含有辅料和/或与水蛭多肽可配伍的药物。

4.根据权利要求3所述的组合物，其特征在于：

所述的辅料为溶剂、崩解剂、矫味剂、防腐剂或黏附剂。

5.根据权利要求3所述的组合物，其特征在于：

所述的与水蛭多肽可配伍的药物是指化学药品、中药、天然药物或生物药物。

6.权利要求1所述的具有抗血栓和脑神经细胞保护作用的水蛭多肽或权利要求2～5任一项所述的含有水蛭多肽的组合物在制备治疗或辅助治疗心脑血管疾病的产品中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：

所述的具有抗血栓和脑神经细胞保护作用的水蛭多肽或含有水蛭多肽的组合物在制备治疗或辅助治疗动脉粥样硬化、血栓以及脑卒中后神经功能损伤的产品中的应用。

8.根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于：

所述的产品为药物或保健品。

9.根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于：

所述的产品的剂型选自注射剂、片剂、粉针剂、控释胶囊剂、脂质体纳米粒、颗粒剂或滴丸剂。

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