CN110423822B

CN110423822B - 一种荧光标记的多态性遗传标记复合扩增体系及其试剂盒和应用

Info

Publication number: CN110423822B
Application number: CN201910647057.3A
Authority: CN
Inventors: 张素华; 李成涛; 张家硕; 张静怡; 陶瑞旸
Original assignee: Academy Of Forensic Science
Current assignee: Academy Of Forensic Science
Priority date: 2019-07-17
Filing date: 2019-07-17
Publication date: 2022-06-24
Anticipated expiration: 2039-07-17
Also published as: CN110423822A

Abstract

本发明涉及一种荧光标记的多态性遗传标记复合扩增体系及其试剂盒，用于扩增18个非CODIS‑STR基因座，1个CODIS‑STR基因座D2S1338，以及2个性别基因座；该扩增体系及其试剂盒中采用的扩增引物包含SEQ ID NO.1～42所述序列。本发明所述的复合扩增体系可以一次性同时扩增得到19个具有良好多态性和高个体识别力的STR基因座和2个性别基因座信息。本发明所述的试剂盒适用于人类生物样本，具有准确性高、灵敏度高、重复性好及抗抑制性强等特点，其为个体识别、亲缘关系鉴定、突变事件等司法鉴定提供了有效的补充检测手段。

Description

一种荧光标记的多态性遗传标记复合扩增体系及其试剂盒和应用

技术领域

本发明属于生物技术与遗传学技术领域，尤其涉及一种荧光标记的多态性遗传标记复合扩增体系及其试剂盒和应用，该扩增体系用于扩增18个非CODIS-STR基因座、1个CODIS-STR基因座以及2个性别基因座。

背景技术

短串联重复序列(short tandem repeats，STR)是存在于人类基因组DNA中的一类具有长度多态性的DNA序列，由2-6个碱基的重复单位串联构成，是目前法医物证鉴定中应用最广泛的遗传标记。STR约占人类基因组的5％，估计有20-50万个，平均每6-10kb就出现一个，约50％具有遗传多态性，其多态性主要源自核心序列重复次数在个体间的差异，并且这种差异在遗传过程中遵循孟德尔遗传规律。因此，STR基因座被广泛应用于司法鉴定领域的个体识别、亲缘鉴定和群体调查等。

其中，常染色体STR基因座是司法鉴定中应用最为广泛的一类基因座，常用STR基因座分布在人类22对常染色体上，多态性较好。目前，各国的核心STR基因座有所差别。1995年4月，英国将SMG Plus试剂盒中的STR基因座(FGA、TH01、vWA、D2S1338、D3S1358、D8S1179、D16S539、D18S51、D19S433、D21S11)作为核心基因座开始建立国家罪犯DNA数据库。鉴于英国建立国家罪犯DNA数据库的成功和STR分型的广阔应用前景，1997年11月，美国联邦调查局确立了联合DNA索引系统(Combined DNA Index System，CODIS)，开始筹建美国国家罪犯DNA数据库。该系统由13个核心STR基因座组成，包含CSF1PO、FGA、TH01、TPOX、vWA、D3S1358、D5S818、D7S820、D8S1179、D13S317、D16S539、D18S51和D21S11。2017年，CODIS系统增加了7个STR基因座(D1S1656、D2S441、D2S1338、D10S1248、D12S391、D19S433和D22S1045)，作为拓展的核心STR基因座。欧洲针对STR基因座的特点及人群分布情况确定了12个STR基因座为欧洲标准体系(European Standard Set，ESS)，包括FGA、TH01、VWA、D1S1656、D2S441、D3S1358、D8S1179、D10S1248、D12S391、D18S51、D21S11、D22S1045；之后，又增加了4个STR基因座(D2S1338、D16S539、D19S433和SE33)。德国核心STR基因座较少，仅包括FGA、TH01、SE33、VWA、D3S1358、D8S1179、D18S51和D21S11。

国内外多家公司及实验室基于上述STR基因座开发了PCR复合扩增试剂盒(或检测体系)，其中部分STR基因座在中国人群中多态性较差。在一般的法医学鉴定中，现有商品化试剂盒的STR基因座往往足够，不需要额外增加其他基因座。但在发生突变的亲权鉴定案件中，当累积亲权指数介于0.0001～10000之间时，常常需要补充检测STR基因座，方能得到明确的鉴定结论；对于复杂的亲缘关系鉴定，如全同胞、半同胞、祖孙鉴定等也需要更多的STR基因座参与，方能提供更为全面的遗传信息，帮助判断亲缘关系。

近年来，随着DNA鉴定的应用越来越广泛，特别是在司法鉴定领域涉及的复杂亲缘关系鉴定中，由于参照样本的缺失，客观上要求检测更多的、多态性更好的STR基因座以提供更多的遗传信息。目前，可提供非CODIS-STR基因座检测的试剂盒仅有两款，分别为Goldeneye 22NC试剂盒(基点认知公司，中国)和AGCU 21+1检测试剂盒(中德美联，中国)，其中部分STR基因座在中国人群中多态性差，可提供的遗传信息有限。

因此，司法鉴定领域急需开发更多的适用于法医学应用的多态性非CODIS-STR基因座，以满足司法鉴定的需求具有重要意义。

发明内容

本发明针对现有STR检测试剂盒无法满足复杂亲缘关系鉴定等司法鉴定需求，开发并建立了一个单次可同时检测18个非CODIS-STR基因座、1个CODIS-STR基因座以及2个性别鉴定位点的复合扩增体系。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一个目的是提供一种荧光标记的多态性遗传标记复合扩增体系，其包括18个非CODIS-STR基因座的扩增引物、1个CODIS-STR基因座的扩增引物以及2个性别基因座的扩增引物；

其中，所述18个非CODIS-STR基因座为SHGC-145653、D3S2457、D1S1616、D6S1010、D1S1608、CHLC.GATA142D12、CHLC.GATA42F05、D14S586、D2S437、D5S2843、D8S1039、D5S2501、HUMUT7148、D15S815、CHLC.GATA84D07、D4S2406、D4S3249、D12S1301；所述1个CODIS-STR基因座为D2S1338；所述2个性别基因座为Amelogenin和DYS391。

为了进一步优化上述复合扩增体系，本发明采取的技术措施还包括：

进一步地，所述扩增引物序列如下：SHGC-145653、SEQ ID NO.1-2；D3S2457、SEQID NO.3-4；D1S1616、SEQ ID NO.5-6；D6S1010、SEQ ID NO.7-8；D1S1608、SEQ ID NO.9-10；CHLC.GATA142D12、SEQ ID NO.11-12；CHLC.GATA42F05、SEQ ID NO.13-14；D14S586、SEQ IDNO.15-16；D2S437、SEQ ID NO.17-18；D5S2843、SEQ ID NO.19-20；D8S1039、SEQ ID NO.21-22；D5S2501、SEQ ID NO.23-24；HUMUT7148、SEQ ID NO.25-26；D15S815、SEQ ID NO.27-28；CHLC.GATA84D07、SEQ ID NO.29-30；DYS391、SEQ ID NO.31-32；Amelogenin、SEQ IDNO.33-34；D4S2406、SEQ ID NO.35-36；D2S1338、SEQ ID NO.37-38；D4S3249、SEQ IDNO.39-40；D12S1301、SEQ ID NO.41-42。

进一步地，每对扩增引物中至少一条引物采用荧光染料标记，所述荧光染料选自FAM、HEX、TRMRA、ROX。

进一步地，扩增引物SHGC-145653、D3S2457、D1S1616、D6S1010、D1S1608、CHLC.GATA142D12采用FAM标记；扩增引物CHLC.GATA42F05、D14S586、D2S437、D5S2843、D8S1039采用HEX标记；D5S2501、HUMUT7148、D15S815、CHLC.GATA84D07、DYS391采用TRMRA标记；Amelogenin、D4S2406、D2S1338、D4S3249、D12S1301采用ROX标记。

进一步地，所述扩增引物的反应终浓度为：SHGC-145653、0.03μM；D3S2457、0.05μM；D1S1616、0.05μM；D6S1010、0.14μM；D1S1608、0.08μM；CHLC.GATA142D12、0.13μM；CHLC.GATA42F05、0.14μM；D14S586、0.04μM；D2S437、0.16μM；D5S2843、0.11μM；D8S1039、0.05μM；D5S2501、0.18μM；HUMUT7148、0.05μM；D15S815、0.09μM；CHLC.GATA84D07、0.12μM；DYS391、0.22μM；Amelogenin、0.15μM；D4S2406、0.14μM；D2S1338、0.20μM；D4S3249、0.22μM；D12S1301、0.23μM。

进一步地，所述复合扩增体系包括：2.5×PCR反应预混液Ⅳ、引物混合液、去离子水以及基因组DNA。

进一步地，所述扩增反应体系的总体积为20μL，2.5×PCR反应预混液Ⅳ为10μL，引物混合液为4μL，基因组DNA的终浓度为0.5ng～2ng，其余用去离子水补足。

进一步地，所述基因组DNA需从人体样本，如血液(血斑)、精液(精斑)、唾液(唾液斑)、骨骼、毛发、人体组织等采集，采用磁珠法、酚氯仿法、树脂纯化等方法进行提取及定量。

进一步地，所述2.5×PCR反应预混液Ⅳ包括50mM KCl、10mM Tris-HCl、2.0mMMgCl₂、0.2mg/ml牛血清白蛋白和0.2mM dNTP。

进一步地，所述复合扩增体系的扩增程序为：95℃，预变性3分钟；94℃，10秒，58℃，1分钟，循环30次；60℃，保温20分钟；4℃，保温。

进一步地，所述复合扩增反应在在各种反应热循环仪上进行，所述反应热循环仪包括但不限于：ABI 9700、ABI 9600、ABI2720、Bio-Rad iCycler、Bio-Rad C1000等。

进一步地，所述复合扩增体系还包括：分型检测分子量内标ORG-500SizeStandard，所述分子量内标采用LIZ荧光标记，荧光校正采用5-Dye Matrix Standards。

本发明的第二个目的是提供一种含有任一上述的荧光标记的多态性遗传标记复合扩增体系的试剂盒。

本发明的第三个目的是提供一种任一上述的荧光标记的多态性遗传标记复合扩增体系或试剂盒在个体识别、亲缘关系鉴定、突变事件鉴定中的应用。

进一步地，所述应用的检测方法包括：采用SEQ ID No.1-42所示序列的扩增引物对基因组DNA样本进行PCR复合扩增；取PCR扩增产物，与适量的分子量内标试剂、甲酰胺混匀；混合物在95℃变性3min，随后置冰上冷却3min；采用遗传分析仪进行分型检测。

进一步地，所述PCR扩增产物、分子量内标试剂、甲酰胺的用量如下：1μL PCR扩增产物、8.5μL甲酰胺、0.5μL分子量内标。

进一步地，所述遗传分析仪包括但不限于：3100系列、3130系列、3500系列遗传分析仪。

与现有技术相比，本发明采用上述技术方案具有以下有益效果：

本发明开发了适用于法医学应用的多态性非CODIS-STR基因座，并建立一个灵敏度高、特异性好、适用性强的法医学检测试剂盒，为亲子鉴定、复杂亲缘关系鉴定、突变事件等提供有效的补充检测工具，其对满足司法鉴定的需求具有重要意义。

附图说明

图1为本发明一实施例中包含18个非CODIS-STR基因座、1个CODIS-STR基因座以及2个性别基因座的复合扩增试剂盒的Ladder分型图谱。

图2为本发明一实施例中包含18个非CODIS-STR基因座、1个CODIS-STR基因座以及2个性别基因座的复合扩增试剂盒对标准品DNA 2800M的分型图谱。

图3为本发明一实施例中包含18个非CODIS-STR基因座、1个CODIS-STR基因座以及2个性别基因座的复合扩增试剂盒对指甲样本DNA的分型图谱。

具体实施方式

本发明涉及一种荧光标记的多态性遗传标记复合扩增体系及其试剂盒和应用，该复合扩增体系包括18个非CODIS-STR基因座的扩增引物、1个CODIS-STR基因座的扩增引物以及2个性别基因座的扩增引物；其中，所述18个非CODIS-STR基因座为SHGC-145653、D3S2457、D1S1616、D6S1010、D1S1608、CHLC.GATA142D12、CHLC.GATA42F05、D14S586、D2S437、D5S2843、D8S1039、D5S2501、HUMUT7148、D15S815、CHLC.GATA84D07、D4S2406、D4S3249、D12S1301；所述1个CODIS-STR基因座为D2S1338；所述2个性别基因座为Amelogenin和DYS391。

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。

实施例1

本实施例为含有荧光标记的多态性遗传标记复合扩增体系的试剂盒及其相应的检测方法。其包括：

1.适用于法医学应用的非CODIS-STR基因座筛选；

依托Ensembl基因组数据库和UCSC人类基因组浏览器，对22条常染色体进行扫描，筛选多态性STR基因座，其中以四核苷酸重复为主，兼顾三核苷酸和五核苷酸重复，其中剔除外显子区域内基因座，并确保筛选STR基因座与已开发STR基因座的物理距离大于10厘摩。之后，应用QIAxcel全自动核酸分析仪对筛选基因座进行多态性检测。选择18个多态性最优的非CODIS-STR基因座进行试剂盒开发，所述的基因座为SHGC-145653、D3S2457、D1S1616、D6S1010、D1S1608、CHLC.GATA142D12、CHLC.GATA42F05、D14S586、D2S437、D5S2843、D8S1039、D5S2501、HUMUT7148、D15S815、CHLC.GATA84D07、D4S2406、D4S3249、D12S1301。

2.设计扩增引物组分；

建立包含五色荧光标记(FAM、HEX、TAMRA、ROX和LIZ)的复合扩增检测试剂盒，分子量内标采用LIZ荧光标记(ORG-500)。

试剂盒中同时包含上述筛选的18个多态性最优的非CODIS-STR基因座；1个CODIS-STR基因座D2S1338，用于与其它在用商业化试剂盒的数据验证及交流；2个性别鉴定位点(Amelogenin和DYS391)用于对样本性别进行检测分析。

本实施例所述的遗传标记及其对应的扩增引物序列、标记荧光和反应终浓度如表1所示。

表1-复合扩增检测试剂盒中遗传标记的引物序列、反应终浓度和标记荧光

3.多重PCR扩增体系的构建与优化；

对构建的复合扩增分型体系进行包括引物配比浓度、DNA模板量、退火温度等PCR反应条件的调整优化，得到均衡稳定的PCR产物分型结果，实现21个遗传标记的复合扩增。

本实施例所述的包含18个非CODIS-STR基因座、1个CODIS-STR基因座以及2个性别基因座的复合扩增试剂盒检测体系如表2所示，其中2.5×PCR反应预混液Ⅳ包括50mM KCl、10mM Tris-HCl(pH 8.3，25℃)、2.0mM MgCl₂、0.2mg/ml BSA(牛血清白蛋白)和0.2mM的dNTP。DNA需从人体样本，如血液(血斑)、精液(精斑)、唾液(唾液斑)、骨骼、毛发、人体组织等采集，采用磁珠法、酚氯仿法、树脂纯化等方法进行提取及定量。

表2-包含18个非CODIS-STR基因座、1个CODIS-STR基因座以及2个性别基因座的复合扩增试剂盒的反应体系

反应体系在各种反应热循环仪上(如ABI 9700、ABI 9600、ABI2720、Bio-RadiCycler、Bio-Rad C1000等)采用以下的程序可以得到良好的结果：95℃，预变性3分钟；94℃，10秒，58℃，1分钟，循环30次；60℃，保温20分钟；4℃，保温。

4.分析方法的建立与复合扩增产物的检测；

建立3100系列、3130系列、3500系列遗传分析仪光谱校正(Matrix)文件。毛细管电泳加样时，1μL PCR产物与8.5μL甲酰胺、0.5μL分子量内标(ORG-500)混合；混合物在95℃变性3min，随后置冰上冷却3min；采用上述型号遗传分析仪对21个遗传标记进行分型检测。通过毛细管电泳获得各标记不同等位基因的电泳迁移参数，并以此为基础，分别根据GeneMapper ID v3.2.1和

ID-X v1.5软件的格式要求编写相应的Bin文件和Panel文件，创建电泳分析方法。

其中，上述复合扩增试剂盒的Ladder分型图谱如图1所示，上述复合扩增试剂盒对标准品DNA 2800M的分型图谱如图2所示。

实施例2

本实施例为采用实施例1构建的试剂盒对人源性DNA进行检测。

采集9种常见案件检材(肌肉组织、毛发、指甲、石蜡组织、精斑、口腔拭子、阴道分泌物、月经血和血斑)，进行DNA提取和定量。

对上述9种检材的DNA进行18个非CODIS-STR基因座、1个CODIS-STR基因座以及2个性别基因座的复合扩增。样本均可以得到有效扩增。指甲样本的分型图谱见图3。

实施例3

本实施例为将实施例1构建的试剂盒与商业化试剂盒的系统效能进行比较。

目前，国内外针对非CODIS-STR基因座开发的商业化检测试剂盒仅有两款，分别为Goldeneye 22NC试剂盒(基点认知公司，中国)和AGCU 21+1检测试剂盒(中德美联，中国)。根据《亲权鉴定技术规范GB/T37223-2018》要求，对实施例1构建的试剂盒的二联体累积非父排除率和三联体累积非父排除率进行检测评估；根据《个体识别技术规范SF/ZJD0105012-2018》要求，对实施例1构建的试剂盒的累积个体识别能力进行计算。与参考文献1～2中两个商业化试剂盒的系统效能相比较，结果见表3。结果显示实施例1构建的试剂盒的系统效能显著超过AGCU 21+1检测试剂盒(中德美联，中国)，与Goldeneye 22NC试剂盒(基点认知公司，中国)效能相当，可以互为补充，为司法鉴定案件提供有效检测工具。

表3-实施例1构建的试剂盒及两个商业化试剂盒的系统效能评估

参考：[1]付永,刘浩.GoldeneyeTM DNA身份鉴定系统22NC在回族人群的法医学调查[J].法医学杂志,2017(3).

[2]邵伟波,张素华,李莉.21个非CODIS STR基因座的遗传多态性[J].法医学杂志,2011,27(1):36-38.

实施例4

本实施例为实施例1构建的试剂盒的法医学验证工作。

按照DNA分析方法科学工作组(Scientific Working Group for DNA AnalysisMethods,SWGDAM)要求对实施例1构建的试剂盒进行灵敏度、特异性、准确性、适用性以及法医学参数计算。结果显示实施例1构建的试剂盒具有高灵敏度，在DNA模板量低至0.125ng时可以获得遗传标记的完整基因分型；具有种属特异性，仅对人源性DNA进行有效扩增；准确性高；适用于多种类型检材的DNA分型；18个非CODIS-STR基因座平均杂合度达到0.7254，多态性信息含量(除D1S1616、D3S2457、D8S1039外)均大于0.60，平均个体识别概率达到0.8862，二联体累积非父排除率和三联体累积非父排除率分别为1-2.9×10^-7和1-1.9×10^-8。Y染色体上的两个遗传标记在检测样本中均能达到性别判断的要求，在所有男性样本中检测到单一峰，在女性样本中均未检见。

由上述实施例可知，本发明所述的含有荧光标记的多态性遗传标记复合扩增体系的试剂盒为我国法医学研究中个体识别、亲子鉴定、祖孙鉴定、同胞鉴定等法医学实际工作提供了新的补充检测手段。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

序列表

<110> 司法鉴定科学研究院

<120> 一种荧光标记的多态性遗传标记复合扩增体系及其试剂盒和应用

<130> IPI192539

<160> 42

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 扩增SHGC-145653的引物(Artificial Sequence)

<400> 1

ggtgggaatc agctactctt cc 22

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 扩增SHGC-145653的引物(Artificial Sequence)

<400> 2

tgggaacaga ctaactcctg t 21

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 扩增D3S2457的引物(Artificial Sequence)

<400> 3

agtcacagat tgttctcatt gttg 24

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 扩增D3S2457的引物(Artificial Sequence)

<400> 4

cttctcccta accctctggc 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 扩增D1S1616的引物(Artificial Sequence)

<400> 5

aaacaagact cacacccctg 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 扩增D1S1616的引物(Artificial Sequence)

<400> 6

caaacactcc tctcacacaa 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 扩增D6S1010的引物(Artificial Sequence)

<400> 7

caaacactcc tctcacacaa 20

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 扩增D6S1010的引物(Artificial Sequence)

<400> 8

ttcattgggt tctctacatc tg 22

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 扩增D1S1608的引物(Artificial Sequence)

<400> 9

tttgtctaca ggctggtgga 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 扩增D1S1608的引物(Artificial Sequence)

<400> 10

ccttgagtgt gatggggatt 20

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 扩增CHLC.GATA142D12的引物(Artificial Sequence)

<400> 11

tttggtatta tctgcggttt t 21

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 扩增CHLC.GATA142D12的引物(Artificial Sequence)

<400> 12

cctaggtggt gttattgctt g 21

<210> 13

<211> 24

<212> DNA

<213> 扩增CHLC.GATA42F05的引物(Artificial Sequence)

<400> 13

caaaagtcat tgtatcagtt ggta 24

<210> 14

<211> 24

<212> DNA

<213> 扩增CHLC.GATA42F05的引物(Artificial Sequence)

<400> 14

attacattag ccattttcca caat 24

<210> 15

<211> 21

<212> DNA

<213> 扩增D14S586的引物(Artificial Sequence)

<400> 15

ggaagccctt agtttgcaac a 21

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 扩增D14S586的引物(Artificial Sequence)

<400> 16

aaccaccatg gcacgtgtat 20

<210> 17

<211> 22

<212> DNA

<213> 扩增D2S437的引物(Artificial Sequence)

<400> 17

atcaggaaat caaaagaggt tt 22

<210> 18

<211> 22

<212> DNA

<213> 扩增D2S437的引物(Artificial Sequence)

<400> 18

aaaaataatc caaggaaaca ag 22

<210> 19

<211> 26

<212> DNA

<213> 扩增D5S2843的引物(Artificial Sequence)

<400> 19

ccaaactttc taagtttgtg gtagct 26

<210> 20

<211> 27

<212> DNA

<213> 扩增D5S2843的引物(Artificial Sequence)

<400> 20

ttgtagcagt tagaaggaac ccactag 27

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 扩增D8S1039的引物(Artificial Sequence)

<400> 21

ggtcagtgca aatagagaac 20

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 扩增D8S1039的引物(Artificial Sequence)

<400> 22

ggaggctaag tcaggagaat 20

<210> 23

<211> 28

<212> DNA

<213> 扩增D5S2501的引物(Artificial Sequence)

<400> 23

gggaagtgaa gatagataaa taggtaga 28

<210> 24

<211> 24

<212> DNA

<213> 扩增D5S2501的引物(Artificial Sequence)

<400> 24

ggtagctctt gtgtcaatta atgc 24

<210> 25

<211> 22

<212> DNA

<213> 扩增HUMUT7148的引物(Artificial Sequence)

<400> 25

atccagaaac acatcattta cc 22

<210> 26

<211> 19

<212> DNA

<213> 扩增HUMUT7148的引物(Artificial Sequence)

<400> 26

gtgacagagt gagattcca 19

<210> 27

<211> 20

<212> DNA

<213> 扩增D15S815的引物(Artificial Sequence)

<400> 27

attcaagtaa gagaaggcaa 20

<210> 28

<211> 20

<212> DNA

<213> 扩增D15S815的引物(Artificial Sequence)

<400> 28

gcagaggtag aagaagatcc 20

<210> 29

<211> 26

<212> DNA

<213> 扩增CHLC.GATA84D07的引物(Artificial Sequence)

<400> 29

ctgatcttct tagtcttttc ttacca 26

<210> 30

<211> 26

<212> DNA

<213> 扩增CHLC.GATA84D07的引物(Artificial Sequence)

<400> 30

gaacatagtt ttatatcctg tgcctt 26

<210> 31

<211> 29

<212> DNA

<213> 扩增DYS391的引物(Artificial Sequence)

<400> 31

attcattcaa tcatacaccc atatctgtc 29

<210> 32

<211> 26

<212> DNA

<213> 扩增DYS391的引物(Artificial Sequence)

<400> 32

gagatgggtg gatggatgaa tagatg 26

<210> 33

<211> 22

<212> DNA

<213> 扩增Amelogenin的引物(Artificial Sequence)

<400> 33

ccctgggctc tgtaaagaat ag 22

<210> 34

<211> 24

<212> DNA

<213> 扩增Amelogenin的引物(Artificial Sequence)

<400> 34

atcagagctt aaactgggaa gctg 24

<210> 35

<211> 27

<212> DNA

<213> 扩增D4S2406的引物(Artificial Sequence)

<400> 35

cctggacttc atttttaaca ttcttcc 27

<210> 36

<211> 28

<212> DNA

<213> 扩增D4S2406的引物(Artificial Sequence)

<400> 36

gaagtccagt aaggtcatag aaaatata 28

<210> 37

<211> 18

<212> DNA

<213> 扩增D2S1338的引物(Artificial Sequence)

<400> 37

agggagccag tggatttg 18

<210> 38

<211> 19

<212> DNA

<213> 扩增D2S1338的引物(Artificial Sequence)

<400> 38

agaggccctt gtcagtgtt 19

<210> 39

<211> 20

<212> DNA

<213> 扩增D4S3249的引物(Artificial Sequence)

<400> 39

tttagaaacc gtgtgccagg 20

<210> 40

<211> 20

<212> DNA

<213> 扩增D4S3249的引物(Artificial Sequence)

<400> 40

ccagtgttca tgggcaagag 20

<210> 41

<211> 28

<212> DNA

<213> 扩增D12S1301的引物(Artificial Sequence)

<400> 41

attcctgtaa ggtgataaag agagaccc 28

<210> 42

<211> 32

<212> DNA

<213> 扩增D12S1301的引物(Artificial Sequence)

<400> 42

gagatcacca tcatctttat agtttgccat cc 32

Claims

1.一种荧光标记的多态性遗传标记复合扩增体系，其特征在于，所述复合扩增体系包括18个非CODIS-STR基因座的扩增引物、1个CODIS-STR基因座的扩增引物以及2个性别基因座的扩增引物；

其中，所述18个非CODIS-STR基因座为SHGC-145653、D3S2457、D1S1616、D6S1010、D1S1608、CHLC.GATA142D12、CHLC.GATA42F05、D14S586、D2S437、D5S2843、D8S1039、D5S2501、HUMUT7148、D15S815、CHLC.GATA84D07、D4S2406、D4S3249、D12S1301；所述1个CODIS-STR基因座为D2S1338；所述2个性别基因座为Amelogenin和DYS391；

所述扩增引物序列如下：SHGC-145653 SEQ ID NO.1-2；D3S2457 SEQ ID NO.3-4；D1S1616 SEQ ID NO.5-6；D6S1010 SEQ ID NO.7-8；D1S1608 SEQ ID NO.9-10；CHLC.GATA142D12 SEQ ID NO.11-12；CHLC.GATA42F05 SEQ ID NO.13-14；D14S586 SEQ IDNO.15-16；D2S437 SEQ ID NO.17-18；D5S2843 SEQ ID NO.19-20；D8S1039 SEQ ID NO.21-22；D5S2501 SEQ ID NO.23-24；HUMUT7148 SEQ ID NO.25-26；D15S815 SEQ ID NO.27-28；CHLC.GATA84D07 SEQ ID NO.29-30；DYS391 SEQ ID NO.31-32；Amelogenin SEQ IDNO.33-34；D4S2406 SEQ ID NO.35-36；D2S1338 SEQ ID NO.37-38；D4S3249 SEQ IDNO.39-40；D12S1301 SEQ ID NO.41-42；

所述扩增引物的反应终浓度为：SHGC-145653 0.03μM；D3S2457 0.05μM；D1S1616 0.05μM；D6S1010 0.14μM；D1S1608 0.08μM；CHLC.GATA142D12 0.13μM；CHLC.GATA42F05 0.14μM；D14S586 0.04μM；D2S437 0.16μM；D5S2843 0.11μM；D8S1039 0.05μM；D5S2501 0.18μM；HUMUT7148 0.05μM；D15S815 0.09μM；CHLC.GATA84D07 0.12μM；DYS391 0.22μM；Amelogenin 0.15μM；D4S2406 0.14μM；D2S1338 0.20μM；D4S3249 0.22μM；D12S1301 0.23μM；

所述复合扩增体系的总体积为20μL，2.5×PCR反应预混液Ⅳ为10μL，引物混合液为4μL，基因组DNA的终浓度为0.5ng～2ng，其余用去离子水补足；

所述复合扩增体系的扩增程序为：95℃，预变性3分钟；94℃，10秒，58℃，1分钟，循环30次；60℃，保温20分钟；4℃，保温。

2.根据权利要求1所述的一种荧光标记的多态性遗传标记复合扩增体系，其特征在于，每对扩增引物中至少一条引物采用荧光染料标记，所述荧光染料选自FAM、HEX、TRMRA、ROX。

3.一种含有如权利要求1～2中任一项所述的荧光标记的多态性遗传标记复合扩增体系的试剂盒。

4.一种如权利要求1～2中任一项所述的荧光标记的多态性遗传标记复合扩增体系或如权利要求3所述的试剂盒在个体识别、亲缘关系鉴定、突变事件中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述应用的检测方法包括：采用SEQ IDNo.1-42所示序列的扩增引物对基因组DNA样本进行PCR复合扩增；取PCR扩增产物，与适量的分子量内标试剂、甲酰胺混匀；混合物在95℃变性3min，随后置冰上冷却3min；采用遗传分析仪进行分型检测。