CN110420256A - 一种具有抗肿瘤活性的发酵组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种具有抗肿瘤活性的山楂和山楂叶的发酵组合物，属于微生物发酵领域。本发明挑选成熟山楂和新鲜的山楂叶，打浆、酶解、加入益生元、使用保加利亚乳杆菌、莱氏曼氏乳杆菌、裂褶菌进行微生物发酵,发酵时间10天得到山楂和山楂叶的发酵组合物。本发明首次将莱氏曼氏乳杆菌和裂褶菌应用于山楂和山楂叶的发酵制备，两者配合保加利亚乳杆菌发酵还具有显著的协同作用，能够大大增加抗食管癌细胞系(EC‑109)和人宫颈癌细胞系‑HeLa细胞增殖的作用。

Description

一种具有抗肿瘤活性的发酵组合物
技术领域
本发明涉及一种具有抗肿瘤活性的山楂和山楂叶的发酵组合物，属于微生物发酵领域。
背景技术
山楂树为落叶乔木，其叶片宽卵形或三角状卵形，长5-10厘米，宽4-7.5厘米，两侧各有3-5羽状深裂片，裂片卵状披针形或带形，山楂树有花期，一般花期5-6月，然后在9-10月结果。中国的山楂树资源丰富，山楂树生长容易，在我国的内蒙古、河北、河南、山东、山西、陕西、江苏等地常见，多生于山坡林边或灌木丛中。山楂叶可做中药，一般泡茶饮。具有活血化瘀，理气通脉，化浊降脂的功效；山楂干制后可入药，是中国特有的药果兼用树种，其具有降血脂、血压、强心、抗心律不齐等作用，同时也是健脾开胃、消食化滞、活血化痰的良药。山楂和山楂叶含有多种对人体有益的功能成分，例如山楂酸、总黄酮、多种微量元素等有效成分。
微生物发酵是在我国具有几千年的悠久历史。《本草纲目》记载：“古人用麴，多是造酒之麴。后医乃造神麴，专以供药，力更胜之”。传统的中药生产中的中药炮制就利用了微生物进行中药发酵，以提高药效、消除副作用、改变药性等等方面。例如：六神曲、半夏曲等传统中药均由天然微生物发酵而成。微生物发酵并越来越受人们重视。
目前我国山楂加工多是传统工艺，产品附加值低。山楂叶除开入传统药外，多无其他的用处而废弃。对山楂和山楂叶的微生物发酵研究还是空白。微生物发酵本身非常复杂多变，不同的菌株，不同的发酵条件都会导致结果差别很大。
本发明为了充分利用山楂和山楂叶中的的活性物质，发挥山楂和山楂叶独特的保健作用。提供一种利用山楂叶和山楂进行微生物发酵的发酵组合物。本发明的发酵方法工艺简单，可以提高免疫功能，在细胞学实验层面观察到一定的抗肿瘤活性，具有良好的保健效果和很好的市场前景。
发明内容
本发明为了充分利用山楂和山楂叶中的的活性物质，发挥山楂和山楂叶独特的保健作用，提供一种利用山楂叶和山楂进行微生物发酵的发酵组合物。本发明的发酵方法工艺简单，可以提高免疫功能，在细胞学实验层面观察到一定的抗肿瘤活性，具有良好的保健效果和很好的市场前景。
本发明用到保加利亚乳杆菌，拉丁名称：Lactobacillus delbrueckiisubsp.Bularicus，可购自广东省微生物研究所专利菌种保藏中心，菌种编号为GIM1.155，革兰氏阳性杆菌，可用于具体用途：生产酸奶。
本发明用到裂褶菌，拉丁名称：Schizophyllum commune Fr，可购自广东省微生物研究所专利菌种保藏中心，菌种编号为GIM5.44，真菌，可用于具体用途：产L-苹果酸。
本发明用到莱氏曼氏乳杆菌，拉丁名称：Lactobacillus leichmannii，可购自广东省微生物研究所专利菌种保藏中心，菌种编号为GIM1.823，革兰氏阳性杆菌，可用于具体用途：用于维生素B12钴胺素。
本发明首次将保加利亚乳杆菌、裂褶菌、莱氏曼氏乳杆菌应用于山楂和山楂叶的发酵产物制备。本发明发现，使用普通的保加利亚乳杆菌对山楂和山楂叶的发酵并没有相应的抗食管癌细胞系(EC-109)和人宫颈癌细胞系-HeLa细胞增殖的作用，裂褶菌是一种常见的真菌，其本身有一定的抗肿瘤的作用，本次试验发现单添加裂褶菌能够对HeLa细胞有一定抑制作用，但是对食管癌细胞系(EC-109)抑制作用弱。而单添加莱氏曼氏乳杆菌对食管癌细胞系(EC-109)和HeLa细胞抑制作用均弱。但是同时添加莱氏曼氏乳杆菌和裂褶菌能够大大增加抗食管癌细胞系(EC-109)和抗人宫颈癌细胞系-HeLa细胞增殖的作用。
本发明的技术方案如下：
菌种的活化培养
保加利亚乳杆菌：取乳酸菌接种到MRS固体培养基中划线，37℃培养24h。挑取平板中长势较好的单菌落接种至MRS液体培养基中活化，培养24h后即可作为5*107(CFU/ml)保加利亚乳杆菌种子液，培养条件：30℃，200r/min。即可各作为保加利亚乳杆菌种子液。
莱氏曼氏乳杆菌：取乳酸菌接种到MRS固体培养基中划线，37℃培养24h。挑取平板中长势较好的单菌落接种至MRS液体培养基中活化，培养24h后即可作为5*107(CFU/ml)莱氏曼氏乳杆菌种子液，培养条件：30℃，200r/min。即可各作为莱氏曼氏乳杆菌种子液。
裂褶菌：取裂褶菌在裂褶菌综合固体培养基，27℃培养30天。使用接种铲从裂褶菌的培养基上挖取菌块(5mm)接种10％(质量分数)至裂褶菌液体培养基中(20％马铃薯汁1L、葡萄糖20g/L、KH2PO43g/L、MgSO41.5g/L、琼脂15g pH 6)；裂褶菌液体培养基：葡萄糖20g/L、玉米粉50g/L、KH2PO43g/L、MgSO41.5g/L、培养条件：27℃，120r/min。培养10天后即可作为1*107(CFU/ml)裂褶菌种子液。
用上述的复合菌剂发酵山楂和山楂叶的方法，其步骤如下：
(1)挑选成熟山楂，要求无霉烂果实，清洗洗净山楂果表面的污物，沥干水分。将洗好的块备用。
(2)挑选新鲜的山楂叶，要求无烂叶。将新鲜的山楂叶洗净烘干粉粹成山楂叶粉备用。
(3)将纯净水：山楂果按1:1混合打浆制备山楂果浆。在山楂果浆加入山楂叶粉(10％质量分数)，混匀，再使用0.1％果胶酶52℃酶解2小时。得到山楂和山楂叶的混悬液。
(4)将山楂和山楂叶的混悬液加入葡萄糖1％(质量分数),低聚木糖1-2％(质量分数)，保加利亚乳杆菌5％(体积比)、莱氏曼氏乳杆菌液3-5％(体积比)、裂褶菌液5-8％(体积比)进行微生物发酵,发酵时间10天、发酵温度30℃，100-120r/min。
(5)得到山楂和山楂叶的发酵组合物进行絮凝沉淀物过滤，杀菌，在4℃条件下密封保存。
本发明的优点：
本发明创新性的提出一种新型山楂和山楂叶的发酵组合物，首次将莱氏曼氏乳杆菌和裂褶菌应用于山楂和山楂叶的发酵制备，两者配合保加利亚乳杆菌发酵还具有显著的协同作用，能够大大增加抗食管癌细胞系(EC-109)和人宫颈癌细胞系-HeLa细胞增殖的作用。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
本发明的具体实施例如以下说明。
本发明用到保加利亚乳杆菌，拉丁名称：Lactobacillus delbrueckiisubsp.Bularicus，可购自广东省微生物研究所专利菌种保藏中心，菌种编号为GIM1.155，革兰氏阳性杆菌，可用于具体用途：生产酸奶。
本发明用到裂褶菌，拉丁名称：Schizophyllum commune Fr，可购自广东省微生物研究所专利菌种保藏中心，菌种编号为GIM5.44，真菌，可用于具体用途：产L-苹果酸。
本发明用到莱氏曼氏乳杆菌，拉丁名称：Lactobacillus leichmannii，可购自广东省微生物研究所专利菌种保藏中心，菌种编号为GIM1.823，革兰氏阳性杆菌，可用于具体用途：用于维生素B12钴胺素。
实施例1：
菌种的活化培养：
保加利亚乳杆菌：取乳酸菌接种到MRS固体培养基中划线，37℃培养24h。挑取平板中长势较好的单菌落接种至MRS液体培养基中活化，培养24h后即可作为5*107(CFU/ml)保加利亚乳杆菌种子液，培养条件：30℃，200r/min。即可各作为保加利亚乳杆菌种子液。
莱氏曼氏乳杆菌：取乳酸菌接种到MRS固体培养基中划线，37℃培养24h。挑取平板中长势较好的单菌落接种至MRS液体培养基中活化，培养24h后即可作为5*107(CFU/ml)莱氏曼氏乳杆菌种子液，培养条件：30℃，200r/min。即可各作为莱氏曼氏乳杆菌种子液。
裂褶菌：取裂褶菌在裂褶菌综合固体培养基，27℃培养30天。使用接种铲从裂褶菌的培养基上挖取菌块(5mm)接种10％(质量分数)至裂褶菌液体培养基中(20％马铃薯汁1L、葡萄糖20g/L、KH2PO43g/L、MgSO41.5g/L、琼脂15g pH 6)；裂褶菌液体培养基：葡萄糖20g/L、玉米粉50g/L、KH2PO43g/L、MgSO41.5g/L、培养条件：27℃，120r/min。培养10天后即可作为1*107(CFU/ml)裂褶菌种子液。
一种山楂和山楂叶发酵组合物的制备方法，其步骤如下：
(1)挑选成熟山楂，要求无霉烂果实，清洗洗净山楂果表面的污物，沥干水分。将洗好的块备用。
(2)挑选新鲜的山楂叶，要求无烂叶。将新鲜的山楂叶洗净烘干粉粹成山楂叶粉备用。
(3)将水：山楂果按1:1混合打浆制备山楂果浆。在山楂果浆加入山楂叶粉(10％质量分数)，混匀，再使用0.1％果胶酶52℃酶解2小时。得到山楂和山楂叶的混悬液。
(4)将山楂和山楂叶的混悬液加入葡萄糖1％(质量分数),低聚木糖1％(质量分数)，保加利亚乳杆菌5％(体积比)、莱氏曼氏乳杆菌液3％(体积比)、裂褶菌液5％(体积比)进行微生物发酵,发酵时间10天、发酵温度30℃，100r/min。
(5)得到山楂和山楂叶的发酵液进行絮凝沉淀物过滤，杀菌，在4℃条件下密封保存。
实施例2：
菌种的活化培养同实施例1。
一种山楂和山楂叶发酵组合物的制备方法，其步骤如下：
(1)挑选成熟山楂，要求无霉烂果实，清洗洗净山楂果表面的污物，沥干水分。将洗好的块备用。
(2)挑选新鲜的山楂叶，要求无烂叶。将新鲜的山楂叶洗净烘干粉粹成山楂叶粉备用。
(3)将水：山楂果按1:1混合打浆制备山楂果浆。在山楂果浆加入山楂叶粉(10％质量分数)，混匀，再使用0.1％果胶酶52℃酶解2小时。得到山楂和山楂叶的混悬液。
(4)将山楂和山楂叶的混悬液加入葡萄糖1％(质量分数),低聚木糖2％(质量分数)，保加利亚乳杆菌5％(体积比)、莱氏曼氏乳杆菌液5％(体积比)、裂褶菌液8％(体积比)进行微生物发酵,发酵时间10天、发酵温度30℃，120r/min。
(5)得到山楂和山楂叶的发酵液进行絮凝沉淀物过滤，杀菌，在4℃条件下密封保存。
实施例3：
菌种的活化培养同实施例1。
单添加裂褶菌液(不添加莱氏曼氏乳杆菌组)
一种山楂和山楂叶发酵组合物的制备方法，其步骤如下：
(1)挑选成熟山楂，要求无霉烂果实，清洗洗净山楂果表面的污物，沥干水分。将洗好的块备用。
(2)挑选新鲜的山楂叶，要求无烂叶。将新鲜的山楂叶洗净烘干粉粹成山楂叶粉备用。
(3)将水：山楂果按1:1混合打浆制备山楂果浆。在山楂果浆加入山楂叶粉(10％质量分数)，混匀，再使用0.1％果胶酶52℃酶解2小时。得到山楂和山楂叶的混悬液。
(4)将山楂和山楂叶的混悬液加入葡萄糖1％(质量分数),低聚木糖1％(质量分数)，保加利亚乳杆菌5％(体积比)、裂褶菌液5％(体积比)进行微生物发酵,发酵时间10天、发酵温度30℃，120r/min。
(5)得到山楂和山楂叶的发酵液进行絮凝沉淀物过滤，杀菌，在4℃条件下密封保存。
实施例4
菌种的活化培养同实施例1。
单添加莱氏曼氏乳杆菌液(不添加裂褶菌组)
一种山楂和山楂叶发酵组合物的制备方法，其步骤如下：
(1)挑选成熟山楂，要求无霉烂果实，清洗洗净山楂果表面的污物，沥干水分。将洗好的块备用。
(2)挑选新鲜的山楂叶，要求无烂叶。将新鲜的山楂叶洗净烘干粉粹成山楂叶粉备用。
(3)将水：山楂果按1:1混合打浆制备山楂果浆。在山楂果浆加入山楂叶粉(10％质量分数)，混匀，再使用0.1％果胶酶52℃酶解2小时。得到山楂和山楂叶的混悬液。
(4)将山楂和山楂叶的混悬液加入葡萄糖1％(质量分数),低聚木糖1％(质量分数)，保加利亚乳杆菌5％(体积比)、莱氏曼氏乳杆菌液5％(体积比)进行微生物发酵,发酵时间10天、发酵温度30℃，120r/min。
(5)得到山楂和山楂叶的发酵液进行絮凝沉淀物过滤，杀菌，在4℃条件下密封保存。
实施例5
菌种的活化培养同实施例1。
单用裂褶菌+维生素B12(不添加莱氏曼氏乳杆菌液)
一种山楂和山楂叶发酵组合物的制备方法，其步骤如下：
(1)挑选成熟山楂，要求无霉烂果实，清洗洗净山楂果表面的污物，沥干水分。将洗好的块备用。
(2)挑选新鲜的山楂叶，要求无烂叶。将新鲜的山楂叶洗净烘干粉粹成山楂叶粉备用。
(3)将水：山楂果按1:1混合打浆制备山楂果浆。在山楂果浆加入山楂叶粉(10％质量分数)，混匀，再使用0.1％果胶酶52℃酶解2小时。得到山楂和山楂叶的混悬液。
(4)将山楂和山楂叶的混悬液加入葡萄糖1％(质量分数),低聚木糖1％(质量分数)，保加利亚乳杆菌5％(体积比)、裂褶菌液5％(体积比)、维生素B120.1％、进行微生物发酵,发酵时间10天、发酵温度30℃，120r/min。
(5)得到山楂和山楂叶的发酵液进行絮凝沉淀物过滤，杀菌，在4℃条件下密封保存。
实施例6
菌种的活化培养同实施例1。
不添加莱氏曼氏乳杆菌和裂褶菌组
一种山楂和山楂叶发酵组合物的制备方法，其步骤如下：
(1)挑选成熟山楂，要求无霉烂果实，清洗洗净山楂果表面的污物，沥干水分。将洗好的块备用。
(2)挑选新鲜的山楂叶，要求无烂叶。将新鲜的山楂叶洗净烘干粉粹成山楂叶粉备用。
(3)将水：山楂果按1:1混合打浆制备山楂果浆。在山楂果浆加入山楂叶粉(10％质量分数)，混匀，再使用0.1％果胶酶52℃酶解2小时。得到山楂和山楂叶的混悬液。
(4)将山楂和山楂叶的混悬液加入葡萄糖1％(质量分数),低聚木糖1％(质量分数)，保加利亚乳杆菌5％(体积比)进行微生物发酵,发酵时间10天、发酵温度30℃，120r/min。
(5)得到山楂和山楂叶的发酵液进行絮凝沉淀物过滤，杀菌，在4℃条件下密封保存。
实施例7
将实施例1-6制得的山楂和山楂叶的发酵液进行抗肿瘤活性的测定。空白对照选用生理盐水代替发酵液。
本发明采用的肿瘤细胞为：食管癌细胞系(EC-109)和人宫颈癌细胞系-HeLa细胞，检测本发明上述滤液对这些肿瘤细胞株生长的影响作用。
食管癌细胞系(EC-109)用含10％胎牛血清(FBS)、青/链霉素各100U/ml的DMEM培养基，Hela细胞用10％胎牛血清(FBS)、青/链霉素各100U/ml的RPMI1640进行培养。所有细胞培养成对数生长后，进行以下试验。
采用MTT法进行细胞增殖-毒性检测，肿瘤抑制作用越强，细胞增殖越少，选取对数生长期细胞，用0.25％胰蛋白酶进行消化，重悬，调整细胞密度约为1×104个/mL，以每孔100μL接种于96孔板中；在37℃，5％CO2培养箱中培养过夜。贴壁后，弃去上清液。次日将加入滤液50μL/孔，并加入相对应的细胞培养液100μL/孔，各个试验浓度为5复孔(结果取平均值)；同时以生理盐水为空白对照组；在37℃，5％CO2培养箱中继续培养48小时。每孔加20μLMTT溶液(25mg MTT溶于5mL MTT溶液中)，细胞培养箱中静置培养4h，弃去培养液，每孔加150μL Formazan溶解液，摇床上振摇15min，于37℃下、570nm波长处，以酶标仪测定每孔吸光度(A)。抑制率(％)＝(1－A试验/A对照)×100％。
测定实施例1-6的发酵液对各类肿瘤细胞的抑制作用如表1所示。
表1发酵液对各类肿瘤细胞的抑制作用
使用普通的保加利亚乳杆菌对山楂和山楂叶的发酵并没有相应的抗食管癌细胞系(EC-109)和人宫颈癌细胞系-HeLa细胞增殖的作用，裂褶菌是一种常见的真菌，其本身有一定的抗肿瘤的作用，本次试验发现单添加裂褶菌能够对HeLa细胞有一定抑制作用，但是对食管癌细胞系(EC-109)抑制作用弱。而单添加莱氏曼氏乳杆菌对食管癌细胞系(EC-109)和HeLa细胞抑制作用均弱。但是同时添加莱氏曼氏乳杆菌和裂褶菌能够大大增加抗食管癌细胞系(EC-109)和人宫颈癌细胞系-HeLa细胞增殖的作用。
莱氏曼氏乳杆菌产乳酸作用弱，主要用作维生素B12钴胺素的生产。维生素B12是体内重要的酶辅因子，能够参与体内多种物质合成，本发明考虑是否因为维生素B12的作用，导致了裂褶菌对发酵液抗肿瘤细胞增殖作用增强，特设计了裂褶菌+维生素B12组，但是该组合并没有明显增强抗食管癌细胞系(EC-109)和人宫颈癌细胞系-HeLa细胞增殖的作用，考虑莱氏曼氏乳杆菌还具有其他作用，可以和裂褶菌一起协同作用，对抗肿瘤细胞增殖作用起到协同促进作用。
需要说明的是，以上所述仅为本发明的优选具体的实施例。
若依本发明的构想所作变动，其产生的功能作用，仍未超出说明书所涵盖的精神时，均应在本发明的范围内。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

Claims (6)

1.一种具有抗肿瘤活性的发酵组合物，其特征在于，其制备过程如下
(1)挑选成熟山楂果洗好的块备用；
(2)挑选新鲜的山楂叶洗净烘干粉粹成山楂叶粉备用；
(3)将纯净水，山楂果，山楂叶粉芬混匀，使用0.1％果胶酶52℃酶解2小时，得到山楂和山楂叶的混悬液；
(4)将山楂和山楂叶的混悬液加入葡萄糖,低聚木糖，保加利亚乳杆菌5％、莱氏曼氏乳杆菌液、裂褶菌液5-8％进行微生物发酵；
(5)得到山楂和山楂叶的发酵组合物进行絮凝沉淀物过滤，杀菌，在4℃条件下密封保存。
2.权利要求1所述的发酵组合物，其特征在于：
(1)挑选成熟山楂，要求无霉烂果实，清洗洗净山楂果表面的污物，沥干水分；将洗好的块备用；
(2)挑选新鲜的山楂叶，要求无烂叶；将新鲜的山楂叶洗净烘干粉粹成山楂叶粉备用；
(3)将纯净水：山楂果按1:1混合打浆制备山楂果浆；在山楂果浆加入山楂叶粉(10％质量分数)，混匀，再使用0.1％果胶酶52℃酶解2小时；得到山楂和山楂叶的混悬液；
(4)将山楂和山楂叶的混悬液加入葡萄糖1％(质量分数),低聚木糖1-2％(质量分数)，保加利亚乳杆菌5％(体积比)、莱氏曼氏乳杆菌液3-5％(体积比)、裂褶菌液5-8％(体积比)进行微生物发酵,发酵时间10天、发酵温度30℃，100-120r/min；
(5)得到山楂和山楂叶的发酵组合物进行絮凝沉淀物过滤，杀菌，在4℃条件下密封保存。
3.权利要求1或2所述的发酵组合物，其特征在于：
菌种的活化过程为：
保加利亚乳杆菌：取乳酸菌接种到MRS固体培养基中划线，37℃培养24h；挑取平板中长势较好的单菌落接种至MRS液体培养基中活化，培养24h后即可作为5*107(CFU/ml)保加利亚乳杆菌种子液，培养条件：30℃，200r/min；即可各作为保加利亚乳杆菌种子液；
莱氏曼氏乳杆菌：取乳酸菌接种到MRS固体培养基中划线，37℃培养24h；挑取平板中长势较好的单菌落接种至MRS液体培养基中活化，培养24h后即可作为5*107(CFU/ml)莱氏曼氏乳杆菌种子液，培养条件：30℃，200r/min；即可各作为莱氏曼氏乳杆菌种子液；
裂褶菌：取裂褶菌在裂褶菌综合固体培养基，27℃培养30天；使用接种铲从裂褶菌的培养基上挖取菌块(5mm)接种10％(质量分数)至裂褶菌液体培养基中(20％马铃薯汁1L、葡萄糖20g/L、KH2PO43g/L、MgSO41.5g/L、琼脂15g pH 6)；裂褶菌液体培养基：葡萄糖20g/L、玉米粉50g/L、KH2PO43g/L、MgSO41.5g/L、培养条件：27℃，120r/min；培养10天后即可作为1*107(CFU/ml)裂褶菌种子液。
4.权利要求1-3任一项所述的的发酵组合物，其特征在于：
所述保加利亚乳杆菌，拉丁名称：Lactobacillus delbrueckiisubsp.Bularicus，可购自广东省微生物研究所专利菌种保藏中心，菌种编号为GIM1.155，革兰氏阳性杆菌；
所述裂褶菌，拉丁名称：Schizophyllum commune Fr，可购自广东省微生物研究所专利菌种保藏中心，菌种编号为GIM5.44；
所述莱氏曼氏乳杆菌，拉丁名称：Lactobacillus leichmannii，可购自广东省微生物研究所专利菌种保藏中心，菌种编号为GIM1.823。
5.制备权利要求1-4任一项所述发酵组合物的方法。
6.权利要求1-4任一项所述发酵组合物的应用。
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