CN110382543B - 用于治疗衰老细胞的蛋白治疗剂 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了产生条件活性蛋白的方法，该蛋白靶向衰老细胞并且在衰老细胞的细胞外环境中具有条件活性。该方法包括使用演变的蛋白的文库的发现方法和使用生理浓度的体液组分的测试。本发明还公开了用于杀死或去除衰老细胞的条件活性蛋白，使用这些条件活性蛋白的药物组合物和使用该药物组合物治疗与年龄相关的疾病、病症或障碍的方法。条件活性蛋白可以进一步演变，与其他分子缀合，被掩蔽，通过连接可切割部分而降低活性。

Description

用于治疗衰老细胞的蛋白治疗剂
技术领域
本发明涉及治疗或清除衰老细胞和/或治疗与衰老细胞相关的疾病或病症的领域。特别地，本发明涉及靶向衰老细胞的条件活性蛋白和产生这种条件活性蛋白的方法。
背景技术
衰老细胞具有代谢活性，但停滞在细胞生长周期的G1期，其寿命由多个显性基因控制(Stanulis-Praeger,Mech.Ageing Dev.,vol.38,pp.1-48,1987)。衰老细胞在几个重要方面不同于静止期细胞和终末分化的细胞，其具有特征性形态变化，例如变大、变扁平和颗粒度增加(Dimri et al.,Proc.Nat.Acad.Sci.USA,vol.92,pp.9363-9367,1995)。即使被有丝分裂原刺激，衰老细胞也不会分裂(Campisi,Trends Cell Biol.,vol.11,pp.S27-S31,2001)。衰老涉及p53和/或Rb及其调节剂如p16INK4a、p21和ARF的活化。除非p53或Rb失活，否则衰老通常是不可逆的。
衰老细胞表达增加的纤溶酶原激活物抑制剂(PAI)水平并且在pH6下表现出β-半乳糖苷酶活性的染色(Sharpless et al.,J.Clin.Invest.,vol.113,pp.160-168,2004)。不可逆的G1停滞是通过使Rb磷酸化的细白胞周期蛋依赖性激酶(CdK)复合物失活来介导的。P21在衰老细胞中积累，抑制CdK4-CdK6。P16也抑制CdK4-CdK6并在衰老细胞中以与β-半乳糖苷酶活性和细胞体积成比例方式积累(Stein et al.,Mol.Cell.Biol.,vol.19,pp.2109-2117,1999)。有证据表明p21在衰老开始时表达，但不是维持衰老所必需的，而p16表达一旦开始就有助于维持衰老。
由于在某些情况下，衰老与每个细胞分裂时端粒的逐渐缩短有关，当某些染色体端粒达到临界长度时就会触发衰老(Mathon and Lloyd,Nat.Rev.Cancer,vol.3,pp.203-213,2001；Martins,U.M.Exp Cell Res.,vol.256,pp.291-299,2000)。通过延长端粒的端粒酶的表达可以消除衰老。例如，当成纤维细胞被转染以表达端粒酶时，人成纤维细胞无限地进行复制。大多数癌细胞表达端粒酶以维持端粒长度并无限地复制。不表达端粒酶的少数癌细胞具有端粒延长替代机制(ALT)。
还存在衰老的其他原因。总的来说，这些其他原因通常被称为应激诱导的早衰(SIPS)。氧化应激可缩短端粒，从而诱导衰老(von Zglinicki,Trends Biochem.Sci.,vol.27,pp.339-344,2002)。已证明高氧(hyperoxia)可诱导衰老。在G1期早期至中期γ射线照射人成纤维细胞以p53依赖性方式引起衰老(Di Leonardo et al.,Genes Dev.,vol.8,pp.2540-2551,1994)。紫外线辐射也会引起衰老。可以诱导衰老的其他试剂包括过氧化氢(Krtolica et al.,Proc.Nat.Acad.Sci.USA,vol.98,pp.12072-12077,2001)、丁酸钠、5-氮杂胞苷，以及用Ras癌基因转染(Tominaga,Mech.Ageing Dev.,vol.123,pp.927-936,2002)。已证明化学治疗剂(包括多柔比星、顺铂和许多其它化合物)在癌细胞中诱导衰老(Roninson,Cancer Res.,vol.63,pp.2705-2715,2003)。5-溴脱氧尿苷治疗会导致正常细胞和恶性细胞的衰老(Michishita et al.,J.Biochem.,vol.126,pp.1052-1059,1999)。一般而言，破坏DNA的药剂能够导致衰老。
证据表明衰老(senescence)与老化(aging)之间存在关系。与来自年轻供体的细胞相比，来自年老供体的培养细胞在较少的生长周期后表现出衰老(Martin et al.,Lab.Invest.,vol.23,pp.86-92,1970；Schneider et al.,Proc.Nat.Acad.Sci.USA,vol.73,pp.3584-3588,1976)。与来自长寿物种的细胞相比，来自短寿命物种的细胞在较少的生长周期后开始衰老(Rohme,D.,Proc.Nat.Acad.Sci.USA,vol.78,pp.5009-3320,1981)。与来自年龄匹配的对照组的细胞相比，来自具有遗传性早衰综合征(例如Werner综合征)的供体的培养细胞在较少的生长周期后表现出衰老。
衰老赋予衰老细胞功能性变化，所述衰老细胞与各种与年龄相关的疾病和病症有关(Chang et al.,Proc.Nat.Acad.Sci.USA,vol.97,pp.4291-4296,2000)。随着年龄的增长，衰老细胞在个体的组织和器官中积累，并在与年龄相关的病理部位处被发现。鉴于衰老细胞和与年龄相关的健康下降的某些方面存在因果关系，并且衰老细胞可能导致某些疾病，并且由于必要的维持生命的化学治疗和放射治疗会诱导衰老细胞，因此衰老细胞的存在可能对全世界数百万患者产生有害影响。人们普遍认为，选择性消除衰老细胞可预防和治疗与年龄相关的疾病和病症。
衰老细胞也会促进肿瘤发生。衰老的基质细胞表达肿瘤促进因子，其对邻近的上皮细胞产生旁分泌作用。这些作用包括促有丝分裂和抗细胞凋亡(Chang et al.,Proc.Nat.Acad.Sci.USA,vol.97,pp.4291-4296,2000)。已证明衰老的成纤维细胞刺激癌前和恶性上皮细胞，但不刺激正常上皮细胞在小鼠体内形成肿瘤。当少至10％的成纤维细胞衰老时发生这种情况(Krtolica et al.,Proc.Nat.Acad.Sci.USA,vol.98,pp.12072-12077,2001)。衰老细胞分泌的肿瘤促进因子部分由p21waf1/cip1/sdi1介导(Roninson,Cancer Res.,vol.63,pp.2705-2715,2003)。衰老的基质细胞的阈值似乎提供了允许相邻的癌前上皮细胞存活、迁移和分裂的环境(Campisi,Nat.Rev.Cancer,vol.3,pp.339-349,2003)。
因此，靶向衰老细胞的疗法是衰老相关的疾病和病症的有希望的治疗选择。US2016/0038576公开了一种用于诱导特异性针对衰老细胞的适应性免疫应答的免疫原性组合物，用于治疗和预防与年龄相关的疾病和病症，以及与衰老细胞的存在相关或因衰老细胞的存在而加重的其他疾病和病症。免疫原性组合物包括衰老细胞相关的抗原、编码衰老细胞相关的抗原的多核苷酸和用于给予个体的包含该多核苷酸的重组表达载体中的至少一种或多种。
WO2015116740公开了一种施用治疗有效量的小分子衰老细胞溶解剂(senolyticagent)的方法，所述小分子衰老细胞溶解剂选择性地杀死衰老细胞而不会杀死非衰老细胞，用于治疗衰老细胞相关的疾病和病症。可通过该方法治疗的衰老细胞相关的疾病和病症包括与动脉硬化相关或由动脉硬化引起的心血管疾病和病症，例如动脉粥样硬化、特发性肺纤维化、慢性阻塞性肺病、骨关节炎、衰老相关的眼科疾病和病症以及衰老相关的皮肤病和病症。
US 2015/0064137公开了一种多肽和包含可用于选择性消除衰老细胞的多肽的病毒。该多肽和病毒可以在衰老细胞中诱导细胞凋亡。该多肽选自促凋亡基因的产物。该病毒包含促凋亡基因，其表达由p16启动子调控。p16启动子可以是典型p16启动子或非典型p16启动子。
这些疗法靶向衰老细胞的一种或多种蛋白以杀死或去除衰老细胞。然而，这些衰老细胞的靶向蛋白也可能存在于其他类型的细胞上，这可能导致不希望的副作用。因此，开发一类治疗性蛋白是有利的，所述治疗性蛋白优选地和/或特异性地结合衰老细胞上的靶标，同时最小化或消除对其他类型细胞上的相同靶标的结合。因此，开发一类优先和/或特异性地结合衰老细胞上的靶标的治疗性蛋白是有利的，同时尽量减少或消除与其他类型细胞上的相同靶标的结合。
发明内容
在一个实施方案中，本发明提供了一种由结合与衰老细胞相关的靶标的亲本蛋白制备结合所述与衰老细胞相关的靶标的条件活性蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)使用一种或多种演变技术来演变编码所述亲本蛋白的DNA以产生突变DNA；
(ii)表达所述突变DNA以获得突变蛋白；
(iii)使所述突变蛋白在所述衰老细胞的细胞外条件下进行测试，并在正常生理条件下进行测试；和
(iv)从所述突变蛋白中选择条件活性蛋白，其表现出以下至少一种特性：
(a)在所述正常生理条件下的测试中的活性与相同测试中的所述亲本蛋白的相同活性相比降低，而在所述衰老细胞的细胞外条件下的测试中的活性与在所述正常生理条件下的测试中的所述条件活性蛋白的相同活性相比增加；和
(b)在所述正常生理条件下的测试中的活性与相同测试中的所述亲本蛋白的相同活性相比降低，而在所述衰老细胞的细胞外条件下的测试中的活性与所述衰老细胞的细胞外条件下的测试中的所述亲本蛋白的相同活性相比增加。
在一些实施方案中，亲本蛋白可以选自酶、抗体、受体、配体、酶的片段、抗体的片段、受体的片段和配体的片段。。
在每个前述实施方案中，活性可以是对靶标的结合活性。
在每个前述实施方案中，亲本蛋白可以是酶，并且活性是使用衰老细胞的至少一部分作为底物的酶活性。
在每个前述实施方案中，条件活性蛋白可以是环状肽。环状肽的长度可为约5至约500个氨基酸，或约10至约50个氨基酸。
在每个前述实施方案中，靶标可以是位于衰老细胞外表面上的表面分子。在每个前述实施方案中，表面分子可以是衰老细胞的细胞膜蛋白。在每个前述实施方案中，靶标可选自APC、ARHGAP1、ARMCX-3、AXL、B2MG、BCL2L1、CAPNS2、CD261、CD39、CD54、CD73、CD95、CDC42、CDKN2C、CLYBL、COPG1、CRKL、DCR1、DCR2、DCR3、DEP1、DGKA、EBP、EBP50、FASL、FGF1、GBA3、GIT2、ICAM1、ICAM3、IGF1、ISG20、ITGAV、KITLG、LaminB1、LANCL1、LCMT2、LPHN1、MADCAM1、MAG、MAP3K14、MAPK、MEF2C、miR22、MMP3、MTHFD2、NAIP、NAPG、NCKAP1、连接素4、NNMT、NOTCH3、NTAL、OPG、OSBPL3、p16、p16INK4a、p19、p21、p53、PAI1、PARK2、PFN1、PGM、PLD3、PMS2、POU5F1、PPP1A、PPP1CB、PRKRA、PRPF19、PRTG、RAC1、RAPGEF1、RET、Smurf2、STX4、VAMP3、VIT、VPS26A、WEE1、YAP1、YH2AX和YWHAE。另外，应该认识到靶标可以是前述的任何组合。
在每个前述实施方案中，在所述衰老细胞的细胞外条件下的测试中的所述条件活性蛋白的活性，与在所述正常生理条件下的测试中的所述条件活性蛋白的活性的比为至少约1.3:1，或至少约2:1，或至少约3:1，或至少约4:1，或至少约5:1，或至少约6:1，或至少约7:1，或至少约8:1，或至少约9:1，或至少约10:1，或至少约11:1，或至少约12:1，或至少约13:1，或至少约14:1，或至少约15:1，或至少约16:1，或至少约17:1，或至少约18:1，或至少约19:1，或至少约20:1，或至少约30:1，或至少约40:1，或至少约50:1，或至少约60:1，或至少约70:1，或至少约80:1，或至少约90:1，或至少约100:1。
在每个实施方案中，衰老细胞的细胞外条件可以是pH范围为约5.5至约7.0，或约6.0至约7.0，或约6.2至约6.8。
在每个前述实施方案中，正常生理条件可以是pH范围为约7.2至约7.8，或约7.2至约7.6，或约7.4至约7.6。
在每个前述实施方案中，衰老细胞的细胞外条件可以是脱氧核苷酸的浓度低于相同脱氧核苷酸的正常生理浓度。
在每个前述实施方案中，衰老细胞的细胞外条件可以是氧的浓度低于氧的正常生理浓度。
在每个前述实施方案中，衰老细胞的细胞外条件可以是NAD+/NADH的比低于NAD+/NADH的正常生理比。
在每个前述实施方案中，衰老细胞的细胞外条件可以是选自亚牛磺酸、半胱氨酸亚磺酸、半胱氨酸-谷胱甘肽二硫化物、γ-谷氨酰基丙氨酸、γ-谷氨酰基蛋氨酸、吡哆酸(pyridoxate)、γ-谷氨酰基谷氨酰胺和丙氨酸的至少一种的氧化还原内稳态代谢物的浓度，相对于所述相同的氧化还原内稳态代谢物的正常生理浓度增加。
在每个前述实施方案中，衰老细胞的细胞外条件是选自3-脲基丙酸、尿酸、7-甲基鸟嘌呤和次黄嘌呤的至少一种的核苷酸代谢物的浓度，相对于所述相同的核苷酸代谢物的正常生理浓度增加。
在每个前述实施方案中，衰老细胞的细胞外条件可以是胸苷的浓度相对于胸苷的正常生理浓度降低。
在每个前述实施方案中，衰老细胞的细胞外条件是选自甘氨酰异亮氨酸、甘氨酰缬氨酸、甘氨酰亮氨酸、异亮氨酰甘氨酸和缬氨酰甘氨酸的至少一种的二肽的浓度，相对于所述相同的二肽的正常生理浓度降低。
在每个前述实施方案中，衰老细胞的细胞外条件是选自亚油酸、二高-亚油酸和10-十七碳烯酸的至少一种的脂肪酸的浓度，相对于所述脂肪酸的正常生理浓度降低。
在每个前述实施方案中，衰老细胞的细胞外条件可以是选自2-羟基棕榈酸、2-羟基硬脂酸、3-羟基癸酸、3-羟基辛酸和甘油磷酸胆碱的至少一种的磷脂代谢物的浓度，相对于所述磷脂代谢物的正常生理浓度增加。
在每个前述实施方案中，衰老细胞的细胞外条件可以是选自丙氨酸、C-糖基色氨酸、犬尿氨酸、二甲基精氨酸和鸟氨酸(orthithine)的至少一种的氨基酸代谢物的浓度，相对于所述氨基酸代谢物的正常生理浓度增加。
在每个前述实施方案中，衰老细胞的细胞外条件可以是苯丙酮酸的浓度，相对于所述苯丙酮酸的正常生理浓度降低。
在每个前述实施方案中，衰老细胞的细胞外条件可以是选自富马酸、丙二酸、二十碳五烯酸和柠檬酸的至少一种的代谢物的浓度，相对于所述代谢物的正常生理浓度增加。
在每个前述实施方案中，衰老细胞的细胞外条件可以是甘油磷酸胆碱与磷酸胆碱的比，相对于甘油磷酸胆碱与磷酸胆碱的正常生理比增加。
在每个前述实施方案中，衰老细胞的细胞外条件可以是所述衰老细胞分泌的蛋白的浓度，与所述蛋白的正常生理浓度相比增加，并且所述衰老细胞分泌的所述蛋白选自GM-CSF、GROa、GRC-α、GRC-β、GRC-γ、IGFBP-7、IL-1α、IL-6、IL-7、IL-8、MCP-1、MCP-2、MIP-1a、MMP-1、MMP-2、MMP-10、MMP-3、双调蛋白、ENA-78、嗜酸细胞活化趋化因子-3、GCP-2、GITR、HGF、ICAM-1、IGFBP-1、IGFBP-2、IGFBP-3、IGFBP-4、IGFBP-5、IGFBP-6、IL-13、IL-Iβ、MCP-4、MIF、MIP-3a、MMP-12、MMP-13、MMP-14、NAP2、制瘤素M、骨保护素、PIGF、RANTES、sgp130、TIMP-2、TRAIL-R3、Acrp30、血管生成素、AXL、bFGF、BLC、BTC、CTACK、EGF-R、Fas、FGF-7、G-CSF、GDNF、HCC-4、I-309、IFN-γ、IL-1R1、IL-11、IL-15、IL-2R-a、IL-6R、I-TAC、瘦蛋白、LIF、MSP-a、PAI-1、PAI-2、PDGF-BB、SCF、SDF-1、sTNF RI、sTNF RII、血小板生成素、TIMP-1、tPA、uPA、uPAR、VEGF、MCP-3、IGF-1、TGF-β3、MIP-1-delta、IL-4、IL-16、BMP-4、MDC、IL-10、Fit-3配体、CNTF、EGF和BMP-6中的至少一种及它们的任意组合。
在每个前述实施方案中，在所述正常生理条件下的测试和在所述衰老细胞的细胞外条件下的测试可以在含有选自无机化合物、离子和有机分子的至少一种组分的测试溶液中进行。在该实施方案中，所述至少一种组分在用于所述正常生理条件下的测试和用于所述衰老细胞的细胞外条件下的测试的测试溶液中可以具有基本相同的浓度。在这些实施方案中，所述至少一种组分可以是无机化合物，并且选自硼酸、氯化钙、硝酸钙、磷酸二铵、硫酸镁、磷酸一铵、磷酸一钾、氯化钾、硫酸钾、硫酸铜、硫酸铁、硫酸锰、硫酸锌、硫酸镁、硝酸钙、钙螯合物、铜螯合物、铁螯合物、铁螯合物、锰螯合物、锌螯合物、钼酸铵、硫酸铵、碳酸钙、磷酸镁、碳酸氢钾、硝酸钾、盐酸、二氧化碳、硫酸、磷酸、碳酸、尿酸、氯化氢和尿素。在这些实施方案中，所述至少一种组分可以是离子，并且选自磷离子、硫离子、氯离子、镁离子、钠离子、钾离子、铵离子、铁离子、锌离子和铜离子。在这些实施方案中，所述至少一种组分可选自浓度范围为2-7.0mg/dL的尿酸、浓度范围为8.2-11.6mg/dL的钙离子、浓度范围为355-381mg/dL的氯离子、浓度范围为0.028-0.210mg/dL的铁离子、浓度范围为12.1-25.4mg/dL的钾离子、浓度范围为300-330mg/dL的钠离子和浓度范围为15-30mM的碳酸中的一种或多种。在这些实施方案中，所述至少一种组分可以是有机分子，并且是选自组氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、精氨酸、亮氨酸、天冬酰胺、赖氨酸、天冬氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、色氨酸、甘氨酸、缬氨酸、吡咯赖氨酸、脯氨酸、硒代半胱氨酸、丝氨酸和酪氨酸的氨基酸。在这些实施方案中，所述至少一种组分可以是选自柠檬酸、α-酮戊二酸、琥珀酸、苹果酸、富马酸、乙酰乙酸、β-羟基丁酸、乳酸、丙酮酸、α-酮酸、乙酸和挥发性脂肪酸的有机酸。在这些实施方案中，所述至少一种组分可以是选自葡萄糖、戊糖、己糖、木糖、核糖、甘露糖、半乳糖、乳糖、GlcNAcβ1-3Gal、Galα1-4Gal、Manα1-2Man、GalNAcβ1-3Gal、O-糖苷、N-糖苷、C-糖苷和S-糖苷的糖。在这些实施方案中，所述至少一种组分可选自镁离子、硫酸根离子、硫酸氢根离子、碳酸根离子、碳酸氢根离子、硝酸根离子、亚硝酸根离子、磷酸根离子、磷酸氢根离子、磷酸二氢根离子、过硫酸根离子、单过硫酸根离子、硼酸根离子和铵离子。
在每个前述实施方案中，衰老细胞的细胞外条件可以是在约5.5至约7.0范围内的第一pH，正常生理条件可以是在约7.2至约7.8范围内的第二pH，并且在含有至少一种分子量小于900a.m.u且pKa与所述第一pH相差至多0.5、1、2、3或4个pH单位的物质的测试溶液中进行所述一种或多种测试。
在每个前述实施方案中，衰老细胞的细胞外条件可以是在约5.5至约7.0范围内的第一pH，正常生理条件可以是在约7.2至约7.8范围内的第二pH，可以在含有至少一种分子量小于900a.m.u的物质的测试溶液中进行所述一种或多种测试，并且所述物质可以具有在所述第一pH和所述第二pH之间的pKa。
在每个前述实施方案中，衰老细胞的细胞外条件可以是在约5.5至约7.0范围内的第一pH，正常生理条件可以是在约7.2至约7.8范围内的第二pH，可以在含有选自组氨酸、组胺、氢化腺苷二磷酸、氢化腺苷三磷酸、柠檬酸盐、碳酸氢盐、乙酸盐、乳酸盐、二硫化物、硫化氢、铵和磷酸二氢盐的至少一种物质的测试溶液中进行所述一种或多种测试。
在每个前述实施方案中，选择步骤(iv)可包括选择表现出以下性质的条件活性蛋白：(a)在所述正常生理条件下的测试中的活性与相同测试中的所述亲本蛋白的相同活性相比降低，而在所述衰老细胞的细胞外条件下的测试中的活性与在所述正常生理条件下的测试中的所述条件活性蛋白的相同活性相比增加。
在每个前述实施方案中，选择步骤(iv)可包括选择表现出以下性质的条件活性蛋白：(b)在所述正常生理条件下的测试中的所述活性与相同测试中的所述亲本蛋白的相同活性相比降低，而在所述衰老细胞的细胞外条件下的测试中的活性与所述衰老细胞的细胞外条件下的测试中的所述亲本蛋白的相同活性相比增加。
在另一个实施方案中，本发明提供了通过任何前述方法制备的条件活性蛋白。条件活性蛋白可以是抗体。抗体可以是单链抗体或抗体片段。抗体可能适合被工程化为T细胞的嵌合抗原受体的一部分进行。抗体可以是人源化抗体、双特异性抗体或多特异性抗体。
在每个前述实施方案中，条件活性蛋白可选自受体、调节蛋白、可溶性蛋白、细胞因子、受体的片段、调节蛋白的片段、可溶性蛋白的片段和细胞因子的片段。
在每个前述实施方案中，条件活性蛋白可以是条件活性抗体，条件活性抗体可以通过接头与掩蔽部分缀合。掩蔽部分将条件活性抗体与靶标的结合活性降低至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或甚至100％。
在每个前述实施方案中，接头可以与条件活性抗体的可变区共价键合。
在每个前述实施方案中，掩蔽部分可以特异性结合条件活性抗体的可变区。
在每个前述实施方案中，接头可包含柔性区和切割位点。
在每个前述实施方案中，切割位点可以在衰老细胞的细胞外环境中被蛋白酶切割。
在每个前述实施方案中，条件活性蛋白可以通过接头与细胞毒性药物、细胞抑制药物或抗增殖药物缀合。
在每个前述实施方案中，接头可以包含衰老细胞的细胞外环境中的至少一种蛋白酶的切割位点。所述至少一种蛋白酶选自ADAM10、ADAM12、ADAM17、ADAMTS、ADAMTS5、BACE、半胱天冬酶1-14、组织蛋白酶A、组织蛋白酶B、组织蛋白酶D、组织蛋白酶E、组织蛋白酶K、组织蛋白酶S、FAP、MT1-MMP、颗粒酶B、胍基苯甲酸酶(Guanidinobenzoatae)、丝氨酸蛋白酶、人中性粒细胞弹性蛋白酶、豆荚蛋白酶、蛋白裂解酶2、穿膜肽酶、MMP1-17、MT-SP1、脑啡肽酶、NS3/4A、纤溶酶、PSA、PSMA、TRACE、TMPRSS 3、TMPRSS 4和uPA。
在另一个实施方案中，本发明提供了药物组合物，其包含有效量的任何前述条件活性蛋白和药学上可接受的载体。
在另一个实施方案中，本发明提供了治疗衰老或与衰老细胞相关的疾病或病症的方法，其包括施用任何前述条件活性蛋白或任何前述药物组合物的步骤。在前述实施方案中，与衰老细胞相关的疾病或病症可选自认知疾病、心血管疾病、代谢疾病和病症、运动功能疾病和病症、脑血管病、肺气肿、骨关节炎、肺病、炎症/自身免疫疾病和病症、眼科疾病或病症、转移(metastasis)、化学疗法或放射疗法副作用、与老化相关的疾病和病症、纤维化疾病和病症。
在另一个实施方案中，本发明提供了用于由母体有机化合物产生分子量小于约3000a.m.u的条件活性分子的方法。该方法包括以下步骤：通过将一个或多个部分带电的或带电的基团引入母体有机化合物中来修饰母体有机化合物，以产生一种或多种经修饰的有机化合物；以及选择在异常条件下的测试中的活性与在正常生理条件下的测试中的相同活性相比，表现出更高的活性的经修饰的有机化合物。
在另一个实施方案中，本发明提供了用于由母体有机化合物产生分子量小于约3000a.m.u的条件活性分子的方法，其包括以下步骤：通过从所述母体有机化合物中去除一个或多个部分带电的或带电的基团来修饰所述母体有机化合物，以产生一种或多种经修饰的有机化合物；以及选择在异常条件下的测试中的活性与在正常生理条件下的测试中的相同活性相比，表现出更高的活性的经修饰的有机化合物。
在另一个实施方案中，本发明提供了用于由母体有机化合物产生分子量小于约3000a.m.u的条件活性分子的方法，其包括以下步骤：通过用一个或多个部分带电的或带电的基团取代所述母体有机化合物的一个或多个基团来修饰所述母体有机化合物，以产生一种或多种经修饰的有机化合物；以及选择在异常条件下的测试中的活性与在正常生理条件下的测试中的相同活性相比，表现出更高的活性的经修饰的有机化合物。
在每种前述方法中，母体有机化合物的分子量的范围可以为约100a.m.u.至约3000a.m.u.，或约100a.m.u.至约1500a.m.u.，或约150a.m.u.至约1250a.m.u.，或约300a.m.u.至约1100a.m.u.，或约400a.m.u.至约1000a.m.u.。
在每种前述方法中，异常条件可以是衰老细胞的细胞外条件的值，并且正常生理条件是正常细胞的相同细胞外条件的不同值。
在每种前述方法中，异常条件可以是pH范围为约5.0至约7.0，或约5.5至约7.0，或约6.0至约7.0，或约自6.2至约6.8，并且正常生理条件是pH范围为约7.0至约7.8，或约7.2至约7.8，或约7.2至约7.6。
在每种前述方法中，条件活性蛋白可以与选自毒性剂、放射性剂或D-反向-翻转肽的药剂缀合。
在每个前述实施方案中，D-反向-翻转肽可包含LTLRKEPASE IAQSILEAYSQNGWANRRSG GKRP(SEQ ID NO：5)、LTLRKEPASE IAQSILEAYS QNGWANRRSG GKRPPPRRRQRRKKRG(SEQ ID NO：6)或SEIAQSILEAYSQNGW(SEQ ID NO：7)。
附图说明
图1为示出实施例9中选择的条件活性抗体在pH6.0相对于pH7.4的选择性的图。
图2为示出在脱氧血红蛋白中形成盐桥的图，其中三个氨基酸残基形成稳定脱氧血红蛋白的T四级结构的两个盐桥，导致对氧的较低亲和力。
图3为示出嵌合抗原受体(CAR)的结构的图。
图4示出了在不同的缓冲溶液中测定的条件活性抗体与抗原的结合活性。
图5示出了改变Krebs缓冲液的组成对条件活性抗体的结合活性的影响。
图6示出了三种不同的条件活性抗体的结合活性取决于pH7.4下碳酸氢盐的存在及其浓度，如实施例12中所述。
图7示出了天然或野生型肽的D反向翻转(DRI)肽的设计原理。
图8示出了调控FOXO家族(包括FOXO4)的信号传导途径。“+p”表示磷酸化，“-p”表示去磷酸化，“+m”表示甲基化，箭头表示活化，末端有横杠的线表示抑制，每一个都与靶基因有关。
图9A示出了未经处理的MCF-7细胞。
图9B示出了用1μM的帕波西比羟乙基磺酸盐(Palbociclib Isethionate)处理过的MCF-7细胞。
图9C示出了通过荧光激活细胞分选(FACS)分离未经处理和经处理的MCF-7细胞。
图9D示出了未经处理的MCF-7细胞和用帕波西比羟乙基磺酸盐处理过的MCF-7细胞的靶表达谱。
图10A示出了未经处理的MDA-MB231细胞。
图10B示出了用1μM的帕波西比羟乙基磺酸盐处理过的MDA-MB231细胞。
图10C示出了通过FACS分离未经处理的MDA-MB231细胞和用帕波西比羟乙基磺酸盐处理过的MDA-MB231细胞。
图10D示出了未经处理的MDA-MB231细胞和用帕波西比羟乙基磺酸盐处理过的MDA-MB231细胞的靶表达水平。
图11A示出了未经处理的MDA-MB468细胞。
图11B示出了用1μM的帕波西比羟乙基磺酸盐处理过的MDA-MB468细胞。
图11C示出了未经处理的MDA-MB468细胞和用帕波西比羟乙基磺酸盐处理过的MDA-MB468细胞没有通过FACS而分离。
图11D示出了未经处理的MDA-MB468细胞和用帕波西比羟乙基磺酸盐处理过的MDA-MB468细胞的相似的靶表达水平。
图12A示出了未经处理的MDA-MB231细胞。
图12B示出了用帕波西比羟乙基磺酸盐处理过的MDA-MB231细胞。
图13A示出了未经处理的MDA-MB468细胞。
图13B示出了用帕波西比羟乙基磺酸盐处理过的MDA-MB468细胞。
图14A示出了未经处理的、B-gal染色阴性的MDA-MB231细胞的FACS细胞分选。
图14B示出了B-gal染色阴性的用帕波西比羟乙基磺酸盐处理过的MDA-MB231细胞的FACS细胞分选。
图14C示出了B-gal染色阳性的未经处理的MDA-MB231细胞的FACS细胞分选。
图14D示出了B-gal染色阳性的用帕波西比羟乙基磺酸盐处理过的MDA-MB231细胞的FACS细胞分选。
图15A示出了未经处理的MDA-MB231细胞的FACS分选。
图15B示出了用帕波西比羟乙基磺酸盐处理过的MDA-MB231细胞的FACS分选。
图16A示出了B-gal染色阴性的未经处理的MDA-MB468细胞的FACS细胞分选。
图16B示出了B-gal染色阴性的用帕波西比羟乙基磺酸盐处理过的MDA-MB468细胞的FACS细胞分选。
图16C示出了B-gal染色阳性的未经处理的MDA-MB468细胞的FACS细胞分选。
图16D示出了B-gal染色阳性的用帕波西比羟乙基磺酸盐处理过的MDA-MB468细胞的FACS细胞分选。
图17A示出了未经处理的MDA-MB468细胞的FACS分选。
图17B示出了用帕波西比羟乙基磺酸盐处理过的MDA-MB468细胞的FACS分选。
图18A示出了在帕波西比羟乙基磺酸盐处理之前和处理之后MDA-MB231细胞和MDA-MB468细胞中的CD73表达水平。
图18B示出了抗CD73条件活性抗体对衰老细胞的杀伤作用。
定义
为了便于理解本文提供的实施例，将对一些频繁出现的方法和/或术语在本文中进行定义。
以下术语的定义与WO 2016/138071中的相同：“约”、“活性”、“试剂”、“多义碱基要求(ambiguous base requirement)”、“氨基酸”、“扩增”、“嵌合特性”、“同源(cognate)”、“比较窗口”、“保守氨基酸替换”、“对应于”、“降解有效”、“确定的序列框架”、“消化”、“定向连接”、“DNA改组(shuffling)”、“药物”或“药物分子”、“有效量”、“电解质”、“抗原表位”、“酶”、“演变(evolution或evoling)、“片段”、“衍生物”、“类似物”、“单个氨基酸全范围替换”、“基因”、“遗传不稳定”、“异源”、“同源(homologous)”或“部分同源(homeologous)”、“工业应用”、“相同”或“同一性(identity)”、“同一性区”、“分离的”、“分离的核酸”、“配体”、“连接”、“接头”或“间隔子”、“微环境”、“要被演变的分子特性”、“突变(mutation)”、“天然存在”、“正常生理条件”或“野生型工作条件”、“核酸分子”、“核酸分子”、“用于……的核酸序列编码”或“……的DNA编码序列”或“核苷酸序列编码”、“启动子序列”、“编码酶(蛋白)的核酸”或“编码酶(蛋白)的DNA”或“编码酶(蛋白)的多核苷酸”、“特定的核酸分子种类”、“将工作的核酸样品组装至核酸库中”、“核酸库”、“核酸构建体”或“核苷酸构建体”或“DNA构建体”、“构建体”、“寡核苷酸”或“寡”、“同源的”、“可操作连接的”、“可操作连接至”、“亲本多核苷酸组合”、“患者”或“受试体”、“生理条件”、“群(population)”、“前体形式(pro-form)”、“原前体形式(pre-pro-form)”、“伪随机”、“准重复单元(quasi-repeatedunit)”、“随机肽库”、“随机肽序列”、“受体”、“重组”、“合成”、“相关的多核苷酸”、“减少重排(reductive reassortment)”、“参考序列”、“比较窗口”、“序列同一性”、“序列同一性百分数”、“实质同一性”、“参考序列”、“重复指数(RI)”、“限制位点”、“可选择的多核苷酸”、“序列同一性”、“相似性”、“特异性结合”、“特异性杂交”、“特定的多核苷酸”、“严格杂交条件”、“基本上相同”、“基本上纯的酶”、“基本上纯的”、“治疗”、“可变区段”、“变体”、“野生型”、“野生型蛋白”或“野生型生物蛋白、“亲本分子”或“靶蛋白”、“工作”、“条件活性抗体”、“抗体依赖性的细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”、“癌症”和“癌的”、“多特异性抗体”、“全长抗体”、“文库”、“重组抗体”和“个体”或“受试者”。
本文中使用的术语“抗体”是指能够结合抗原表位的完整的免疫球蛋白分子以及免疫球蛋白分子的片段，如Fab、Fab'、(Fab')2、Fv和SCA片段。这些抗体片段保留了选择性地与衍生出其的抗体的抗原(例如多肽抗原)结合的一些能力，可以使用本领域熟知的方法制备这些抗体片段(参见，例如Harlow和Lane，同上)，并如下进一步描述这些抗体。可用于实施要求保护的发明的抗体可以是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、sIgA、IgD或IgE。抗体可用于通过免疫亲和层析分离制备量的抗原。这类抗体的各种其它用途是诊断疾病和/或对疾病(例如，瘤形成)进行分期和用于治疗应用以治疗疾病，例如：瘤形成、自身免疫疾病、AIDS、心血管疾病、感染等。嵌合的、人样的、人源化的或全人的抗体对于施用于人类患者是特别有用的。
Fab片段由抗体分子的单价抗原结合片段组成，并且可通过用为木瓜蛋白酶的酶消化完整的抗体分子来产生Fab片段，以产生由完整轻链和部分重链组成的片段。
抗体分子的Fab'片段可通过以下步骤获得：用胃蛋白酶处理完整的抗体分子，接着还原以产生由完整轻链和部分重链组成的分子。以这种方式处理每个抗体分子获得两个Fab'片段。
抗体的(Fab')2片段可通过用胃蛋白酶酶处理完整的抗体分子而不进行随后的还原来获得。(Fab')2片段是两个Fab'片段通过两个二硫键结合在一起的二聚体。。
Fv片段被定义为含有轻链可变区和重链可变区的基因工程片段，表示为两条链。
单链抗体(“SCA”或scFv)是含有轻链可变区和重链可变区的基因工程单链分子，其通过合适的柔性多肽接头连接，并且可以在氨基-和/或羧基-末端包含额外的氨基酸序列。例如，单链抗体可以包括用于连接编码多核苷酸的系链段(tether segment)。功能性单链抗体通常包含足够部分的轻链可变区和足够区域的重链可变区以便保留全长抗体与特定靶分子或表位结合的性质。
本文中使用的术语“抗原”或“Ag”被定义为能够引发免疫反应的分子。这种免疫反应可能涉及抗体产生，或特异性免疫活性细胞的活化，或这两者。本领域技术人员将会理解，任何大分子(包括几乎所有的蛋白或肽)都可以用作抗原。显而易见的是，抗原可以从生物样品中产生、合成或衍生。这样的生物样品可以包括但不限于组织样品、肿瘤样品、细胞或生物流体。
本文中使用的术语“细胞凋亡”是指影响单个细胞的细胞死亡机制，其特征是细胞的收缩、染色质凝聚以及细胞碎裂成膜结合体(membrane-bound body)，这些膜结合体通过吞噬作用消除。术语“细胞凋亡”通常与术语“程序性细胞死亡”同义使用。
本文中使用的术语“诱导细胞凋亡的活性”是指由于内部或外部刺激，化合物在(i)特定细胞类型和/或(ii)特定发育或分化阶段的细胞中选择性地引发细胞凋亡的内在特性。技术人员知道存在用于测定细胞培养物中化合物的细胞凋亡诱导活性的体外标准测定法，例如评估细胞质细胞色素C(凋亡标记物)水平和TUNEL(凋亡标记物)水平的测试。使用这些标准测定法，技术人员可以容易地评估和比较不同的化合物对不同的细胞类型或在不同发育阶段的细胞(例如衰老细胞与非衰老细胞)的细胞凋亡诱导活性。其他标准细胞凋亡测定法是膜联蛋白V测定法和切割的半胱天冬酶-3染色。
术语“生物仿制药”或“后续生物制剂”的使用方式与美国食品和药物管理局(FDA)颁布的工作定义一致，该定义将生物仿制药定义为与参考产品“非常相似”(尽管临床上在非活性组分方面存在细微差异)。在实践中，参考产品与生物仿制药产品在安全性、纯度和效力方面在临床上不存在有意义的差异(公共卫生署(PHS)第262条)。生物仿制药也可以是满足欧洲药品管理局人用药品委员会(CHMP)2012年5月30日通过并由欧盟出版为“含有单克隆抗体的类似生物药品指南-非临床和临床问题”(文档引用EMA/CHMP/BMWP/403543/2010)的一项或多项指南的一种生物仿制药。例如，“抗体生物仿制药”是指通常由不同公司制造的创新者抗体(参考抗体)的后续版本。抗体生物仿制药与参考抗体之间的差异可以包括翻译后修饰，例如，通过将其它生化基团如磷酸酯、各种脂质和碳水化合物连接到抗体上进行修饰；通过翻译后的蛋白水解酶切割进行修饰；通过改变氨基酸的化学性质(例如，甲酰化)进行修饰；或通过许多其它机制进行修饰。其它翻译后修饰可能是制造过程操作的结果-例如，糖基化可随着产品暴露于还原糖而发生。在一些情况下，储存条件可能允许某些降解途径发生，如氧化、脱酰胺作用或聚集。因为所有这些产品相关的变体都可能包含在抗体生物仿制药中。
术语“癌症”和“癌性”是指或描述哺乳动物中通常以不受调节的细胞生长/增殖为特征的生理状况。“肿瘤”包含一种或多种癌细胞。癌症的实例包括但不限于癌、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤和白血病或淋巴恶性肿瘤。这样的癌症的更具体的实例包括鳞状细胞癌(例如，上皮鳞状细胞癌)、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌(“NSCLC”)、肺腺癌和肺鳞状细胞癌)、腹膜癌、肝细胞癌、胃部癌症(gastric cancer)或胃癌(stomach cancer)(包括胃肠癌)、胰腺癌、成胶质细胞瘤、子宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝瘤、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾脏癌症(kidney cancer)或肾癌(renalcancer)、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌、肛门癌、阴茎癌以及头颈癌。
术语“条件活性蛋白”是指亲本蛋白的变体或突变体，其在一种或多种异常条件下的活性较对照品或在正常生理条件下的相同活性更高或更低。这种条件活性蛋白还在身体的选定区域表现出活性，和/或在异常或允许的生理条件下表现出增加的或下降的活性。正常生理条件是指在个体某一部位处(例如给药部位或在个体作用部位的组织或器官处)被认为是在正常范围内的生理条件。异常条件是指偏离了该部位处的正常可接受范围的条件。在一个方面，条件活性蛋白在正常生理条件下实际上是无活性的，但在异常或允许条件下是有活性的。例如，在一个方面，演变的条件活性蛋白在体温下实际上是无活性的，但在较低或较高温度下是有活性的。在另一方面，在正常生理条件或对照条件下，条件活性蛋白可以可逆或不可逆地失活。在另一方面，条件活性蛋白是治疗性蛋白。在另一方面，条件活性蛋白用作药物或治疗剂。在另一方面，条件活性蛋白在高含氧血液(例如，在流过肺部后的血液)或在肾脏中发现的较低pH环境中，或多或少有活性。条件活性蛋白可以是条件活性生物蛋白。
如本文所用的术语“环状肽”是指自身的氨基末端和羧基末端(即，在一个残基的α羧基和另一个残基的α氨基之间)通过肽键连接在一起形成环状链的多肽链。出于本申请的目的，环状肽还可以包括除肽键之外的键，例如非α酰胺键，以及Trp残基和Cys残基之间的硫醚键。环状肽的长度可以为约5至约500个氨基酸，或约8至约300个氨基酸，或约8至约200个氨基酸，或约10至约100个氨基酸，或约10至约50个氨基酸。此外，环状肽中可包含除天然存在的氨基酸之外的氨基酸，例如β-丙氨酸、苯基甘氨酸和高精氨酸。
如本文所用的缩写“DRI”是指L-肽的D反向翻转同种型(D retro inversoisoform)，其中与天然或野生型蛋白的片段或全长相比，氨基酸序列的顺序被颠倒，并且DRI肽中的至少一部分氨基酸残基是D氨基酸残基，而不是天然或野生型蛋白中的L氨基酸残基(图7)。D-反向-翻转肽可以通过以下所述来制备：鉴定天然蛋白的片段或全长的氨基酸序列，逆转该序列并使用已知方法合成D-反向-翻转肽，以提供这样一种肽，其具有与天然蛋白的片段或全长的氨基酸序列相反的序列并且在D-反向-翻转肽中包含足够数量的D氨基酸以提供所需的功能。
术语“衰老细胞的去除对其是有益的疾病或病症”，“与衰老细胞的存在相关的疾病或病症”和“衰老细胞的去除对其是有益的失调(disorder)”可互换使用，指哺乳动物(例如人)的任何疾病或病症，其中衰老细胞的去除或清除或活力降低对患有所述疾病或病症的个体有益。该术语包括衰老细胞是疾病的一个或唯一原因或促使疾病进展的情况。该术语还涉及衰老细胞将来可能成为所述个体中疾病或病症的原因的情况。例如，衰老细胞的去除对其是有益的疾病或病症的治疗是通过去除衰老细胞来预防、防止或缓解疾病或病症。例如，已知化学治疗剂和放射疗法诱导细胞衰老。去除这些衰老细胞有利于预防与细胞衰老相关的疾病或病症的发作。该术语还包括这样的疾病或病症，其中衰老细胞的去除会缓解或减轻疾病或病症的症状。
如果尤其疾病或病症可以被治愈、预防或者如果疾病或病症的症状可以被缓解或减轻，则衰老细胞的去除是有益的。可以通过诱导衰老细胞中的细胞凋亡来实现衰老细胞的去除。例如，该衰老细胞的去除对其是有益的疾病或病症选自动脉粥样硬化、慢性炎性疾病(如关节炎或关节病)、癌症、骨关节炎、糖尿病、糖尿病溃疡、驼背、硬化症(sclerosis)、肝功能不全、肝硬化、早年衰老综合症(Hutchinson-Gilford progeria syndrome,HGPS)、核纤层蛋白病(laminopathies)、骨质疏松症、痴呆、心血管疾病、肥胖、代谢综合征、急性心肌梗死、肺气肿、胰岛素敏感、南欧斑疹热、肌肉减少症、神经退行性疾病(如阿尔茨海默氏症、亨廷顿氏症或帕金森病)、白内障、贫血、高血压、纤维化、年龄相关性黄斑变性、COPD、哮喘、肾功能不全、尿失禁、听力丧失(如耳聋)、视力丧失(如失明)、睡眠障碍、疼痛(关节疼痛或腿痛)、失衡、恐惧、抑郁、呼吸困难、体重减轻、脱发、肌肉流失、骨密度损失、虚弱和/或健康状况下降。衰老细胞的去除对其是有益的疾病或病症是与哺乳动物(例如人)个体中的炎症(特别是慢性炎症)相关或有关的疾病或病症，其中所述炎症由衰老细胞引起或介导。在一些实施方案中，引起或介导所述炎症的所述衰老细胞至少部分地共定位于与受所述疾病或病症影响的器官或组织相同的器官，更优选相同的组织中。
如本文所用的术语“与衰老细胞的存在相关的疾病或病症”是指哺乳动物(例如人)个体的任何下述疾病或病症：在哺乳动物(例如人)个体中衰老细胞的存在或细胞衰老的存在与所述个体中的所述疾病或病症有关。在本文中，“与...有关”尤其可以是指衰老细胞或细胞衰老(i)是疾病或病症的至少部分原因，(ii)或至少是症状的部分原因。在一些实施方案中，与衰老细胞的存在相关的疾病或病症选自动脉粥样硬化、慢性炎性疾病(如关节炎或关节病)、癌症、骨关节炎、糖尿病、糖尿病溃疡、驼背、硬化症(sclerosis)、肝功能不全、肝硬化、早年衰老综合症(Hutchinson-Gilford progeria syndrome,HGPS)、核纤层蛋白病(laminopathies)、骨质疏松症、痴呆、心血管疾病、肥胖、代谢综合征、急性心肌梗死、肺气肿、胰岛素敏感、南欧斑疹热、肌肉减少症、神经退行性疾病(如阿尔茨海默氏症、亨廷顿氏症或帕金森病)、白内障、贫血、高血压、纤维化、年龄相关性黄斑变性、COPD、哮喘、肾功能不全、尿失禁、听力丧失(如耳聋)、视力丧失(如失明)、睡眠障碍、疼痛(关节疼痛或腿痛)、失衡、恐惧、抑郁、呼吸困难、体重减轻、脱发、肌肉流失、骨密度损失、虚弱和/或健康状况下降。特定的衰老细胞的去除对其是有益的疾病或病症是与例如哺乳动物(例如人)个体中的炎症，通常是慢性炎症相关或有关的疾病或病症，其中所述炎症由衰老细胞引起或介导。在一些实施方案中，引起或介导所述炎症的所述衰老细胞至少部分地共定位于与受所述疾病或病症影响的器官或组织相同的器官，例如相同的组织中。
如本文所用的术语“衰老细胞的细胞外条件”是指直接包围一个或多个衰老细胞的细胞外环境中的条件，其不同于非衰老细胞周围的相同条件。衰老细胞的细胞外环境可包括例如与衰老细胞相邻的任何细胞外基质或流体。
如本文所用的术语“FOXO4肽”和“FOXO4蛋白”是指由叉头框蛋白O4(FOXO4)基因的转录物翻译而来的蛋白。FOXO4具有两种变体(SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2)。术语“FOXO4DRI肽”是指一种D-反向-翻转肽，其具有FOXO4蛋白的至少一个片段的反向氨基酸序列，并含有某些，例如所有的D氨基酸残基。
术语“全长抗体”是指包含抗原结合可变区(VH或VL)以及轻链恒定结构域(CL)和重链恒定结构域CHI、CH2和CH3的抗体。恒定结构域可以是天然序列恒定结构域(例如人天然序列恒定结构域)或其氨基酸序列变体。根据其重链的恒定结构域的氨基酸序列，可以将全长抗体归属为不同的“类别”。全长抗体有五种主要类型：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中几种可进一步分为“亚类”(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgA2。对应于不同类别抗体的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。。
“个体”或“受试体”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯养的动物(例如，牛、羊、猫、狗和马)、灵长类动物(例如人和非人灵长类动物如猴)、兔子和啮齿动物(例如，小鼠和大鼠)。
本文中使用的术语“文库”是指在单个库中的蛋白的集合。可以使用DNA重组技术产生文库。例如，可以将cDNA或任何其它蛋白质编码DNA的集合插入到表达载体中以产生蛋白文库。也可以将cDNA或蛋白质编码DNA的集合插入到噬菌体基因组中以产生野生型蛋白的噬菌体展示文库。可以从选择的细胞群或组织样品中产生cDNA的集合，例如通过Sambrook等人(Molecular Cloning,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)公开的方法产生。由所选细胞类型产生的cDNA集合也可从诸如的供应商商购获得。本文中使用的野生型蛋白文库不是生物样品的集合。
本文中使用的术语“配体”是指被特定受体识别并且在一个或多个结合位点特异性地结合受体的分子。配体的实例包括但不限于细胞膜受体的激动剂和拮抗剂、毒素和毒液、病毒表位、激素、激素受体肽、酶、酶底物、辅因子、药物(例如阿片制剂、类固醇等)、凝集素、糖、多核苷酸、核酸、低聚糖、蛋白质和单克隆抗体。通常，配体包含两个结构部分：参与配体与其受体结合的第一部分和不参与此类结合的第二部分。
本文中使用的术语“多特异性抗体”是对至少两种不同表位具有结合特异性的抗体。示例性的多特异性抗体可以结合BBB-R和脑抗原两者。可以将多特异性抗体制备为全长抗体或抗体片段(例如F(ab')2双特异性抗体)。还考虑了具有两个、三个或更多个(例如四个)功能性抗原结合位点的工程化抗体(参见例如US 2002/0004587A1)。
如本文所用的术语“非天然存在的氨基酸”是指在自然界中未发现的任何氨基酸。非天然氨基酸包括任何D-氨基酸、在自然界中未发现的具有侧链的氨基酸以及肽模拟物。肽模拟物的实例包括但不限于b-肽、g-肽和d-肽；具有可采用螺旋形或片状构象的骨架的低聚物，例如具有利用联吡啶链段的骨架的化合物、具有利用疏溶剂相互作用的骨架的化合物、具有利用侧链相互作用的骨架的化合物、具有利用氢键相互作用的骨架的化合物以及具有利用金属配位的骨架的化合物。非天然存在的氨基酸还包括具有被设计用于增强抗微生物肽在生物流体中的呈递(presentation)的抵抗非特异性蛋白吸附的侧链的残基，和/或能够利用肽内的非天然氨基酸残基作为单体单元合成聚合物刷的可聚合侧链。
如本文所用的术语“亲本蛋白”是指可以使用本发明的方法进行演变以产生条件活性多肽或蛋白的多肽或蛋白。亲本蛋白可以是野生型蛋白或非天然存在的蛋白。例如，治疗性多肽或蛋白或突变体或变体多肽或蛋白可用作亲本多肽或蛋白。亲本蛋白也可以是另一种天然存在的蛋白、野生型蛋白、治疗性蛋白或突变蛋白的片段。亲本蛋白的实例包括抗体、抗体片段、酶、酶片段、细胞因子及其片段、激素及其片段、配体及其片段、受体及其片段、调节蛋白及其片段和生长因子及其片段。
本文中使用的术语“多肽”是指其中单体为氨基酸且单体通过肽或二硫键连接在一起的聚合物。“多肽”可以是全长天然存在的氨基酸链或其片段、突变体或变体，例如关注结合相互作用的氨基酸链的选定区域。多肽还可以是合成氨基酸链，或者是天然存在的氨基酸链或其片段与合成氨基酸链的组合。片段是指作为全长蛋白的一部分的氨基酸序列，其长度通常为约8个氨基酸至约500个氨基酸，优选约8个氨基酸至约300个氨基酸，更优选约8个氨基酸至约200个氨基酸的氨基酸序列，更加优选约10个氨基酸至约50或100个氨基酸。此外，除天然存在的氨基酸之外的氨基酸(例如β-丙氨酸、苯基甘氨酸和高精氨酸)可以包含在多肽中。通常遇到的非基因编码的氨基酸也可以包括在多肽中。氨基酸可以是D-旋光异构体或L-旋光异构体。D-异构体优选用于如下进一步描述的特定情形。此外，其它肽模拟物也是有用的，例如用于多肽的接头序列中(参见Spatola,1983,in Chemistry andBiochemistry of Amino Acids.Peptides and Proteins,Weinstein,ed.,MarcelDekker,New York,p.267)。通常，除了包括通过共价键或非共价键保持在一起的两个或多个多肽链的结构外，术语“蛋白”不旨在表达与术语“多肽”的任何其他显著差异。
如本文所用的术语“蛋白”是指其中单体为氨基酸且通过肽或二硫键连接在一起的聚合物。蛋白可以是全长天然存在的氨基酸链或其片段、突变体或变体，例如关注结合相互作用的氨基酸链的选定区域。蛋白可以是环状肽，其中氨基酸聚合物使用全部或部分聚合物形成环状结构。蛋白还可以是合成氨基酸链，含有非天然氨基酸的氨基酸链或者是天然存在的氨基酸链或其片段与合成氨基酸链的组合。片段是指作为全长蛋白的一部分的氨基酸序列，其长度通常为约8个氨基酸至约500个氨基酸，优选约8个氨基酸至约300个氨基酸，更优选约8个氨基酸至约200个氨基酸的氨基酸序列，更加优选约10个氨基酸至约50或100个氨基酸。此外，除天然存在的氨基酸之外的氨基酸(例如β-丙氨酸、苯基甘氨酸和高精氨酸)可以包含在多肽中。通常遇到的非基因编码的氨基酸也可以包括在多肽中。氨基酸可以是D-旋光异构体或L-旋光异构体。D-异构体优选用于如下进一步描述的特定情形。此外，其它肽模拟物也是有用的，例如用于多肽的接头序列中(参见Spatola,1983,in Chemistryand Biochemistry of Amino Acids.Peptides and Proteins,Weinstein,ed.,MarcelDekker,New York,p.267)。通常，除了包括通过共价键或非共价键保持在一起的两个或多个多肽链的结构外，术语“蛋白”不旨在表达与术语“多肽”的任何其他显著差异。
如本文所用的术语“受体”是指对给定配体具有亲和力的分子。受体可以是天然存在的分子或合成的分子。受体可以以未改变的状态使用或以与其他物质的聚集体的形式使用。受体可以直接或通过特异性结合物质，共价或非共价地连接至结合成员。受体的实例包括但不限于抗体，包括与特定抗原决定簇(例如病毒、细胞或其他物质)反应的单克隆抗体和抗血清、细胞膜受体、复合碳水化合物和糖蛋白、酶和激素受体。配体与其受体的结合是指配体与其受体分子通过特异性分子识别而组合形成复合物，该复合物可通过技术人员已知的各种配体受体结合测定法检测。
本文所用的术语“衰老”或“细胞衰老”意指从分裂活跃的细胞发展为代谢活跃的非分裂细胞。术语“衰老”还指在多轮分裂后细胞进入的状态，在这种状态下，即使细胞仍保持代谢活跃，未来的细胞分裂也不会发生。
本文所用的术语“衰老细胞”是指代谢活跃但永久地从细胞周期退出的细胞(参见，例如，Campisi,Cell,vol.120,pp.513-522,2005)。衰老细胞不复制并具有一种或多种归属于衰老细胞的以下其他特征：细胞周期停滞在G1期；扩大的、扁平的形态；粒度增加；在pH6下染色β-半乳糖苷酶活性；衰老相关的异染色质灶(heterochromatic foci)；特征基因表达部分地受p16和p21调控。衰老细胞的实例包括衰老的前脂肪细胞、衰老的内皮细胞、衰老的成纤维细胞、衰老的神经元、衰老的上皮细胞、衰老的间充质细胞、衰老的平滑肌细胞、衰老的巨噬细胞和衰老的软骨细胞。
如本文所用的术语“衰老细胞溶解剂”是指选择性地(优先地或在更大程度上)破坏、杀死、去除或促进衰老细胞的选择性破坏的药剂。换句话说，与其破坏或杀死非衰老细胞的能力相比，该衰老细胞溶解剂以生物学、临床和/或统计学上显著的方式破坏或杀死衰老细胞。衰老细胞溶解剂可以是小的化合物或生物分子，例如蛋白质、多核苷酸。衰老细胞溶解剂的使用量和使用时间足以选择性地杀死已成熟的衰老细胞，但不足以杀死(破坏、导致死亡)临床上显著数量的或生物学上显著数量的非衰老细胞。在某些实施方案中，本文所述的衰老细胞溶解剂以诱导(启动、刺激、触发、激活、促进)和导致(即，引起、造成)衰老细胞死亡的方式改变至少一种信号传导途径。例如，通过对抗衰老细胞中细胞存活和/或炎症途径内的蛋白质，衰老细胞溶解剂可改变细胞存活信号传导途径(例如，Akt途径)或炎症途径中的一种或两种。
如本文所用的术语“小分子”是指分子量小于900a.m.u，或更优选小于500a.m.u，或更优选小于200a.m.u，或还更优选小于100.am.u的分子或离子。在本发明的测试和环境中，小分子通常可以作为分子和分子的去质子化离子的混合物而存在，主要取决于测试或环境的pH。
如本文所用的术语“与衰老细胞相关的靶标”是指位于衰老细胞表面(例如，细胞膜蛋白)或存在于衰老细胞中或由衰老细胞分泌到衰老细胞的细胞外环境中的分子，例如蛋白质。
本文中使用的术语“治疗性蛋白”是指由例如研究人员或临床医师施用于哺乳动物以引起所追求的组织、系统、动物或人的生物学或医学响应的任何蛋白和/或多肽。治疗性蛋白可引起多于一种的生物学或医学响应。治疗性蛋白的实例包括抗体、酶、激素、细胞因子、调节蛋白及它们的片段。
本文中使用的术语“治疗有效量”是指任何这样的量：与未接受该量的相应个体相比，该量导致但不限于疾病、病症或副作用的治愈、预防或改善，或者疾病或病症的发展速度的降低。该术语在其范围内还包括有效增强正常生理功能的量以及有效引起患者中增强或有助于第二药剂的治疗效果的生理功能的量。
本文所用的术语“治疗”是指个体(即患者)的疾病、疾患或病症的医学管理(参见例如Stedman's Medical Dictionary)。通常，合适的剂量和治疗方案规定的衰老细胞溶解剂的量足以提供治疗和/或预防益处。施用本文所述的衰老细胞溶解剂对个体的治疗益处包括例如改善的临床结果，其中目的是预防或减缓或延缓(减轻)与疾病相关的不希望的生理变化，或预防或减缓或延缓(减轻)此类疾病的扩散或严重程度。
本文中使用的术语“肿瘤微环境”是指支持肿瘤细胞的生长和转移的实体瘤中的微环境和实体瘤周围的微环境。肿瘤微环境包括可促进致瘤性转化、支持肿瘤生长和浸润、保护肿瘤不被宿主免疫攻击、促进治疗抗性并为休眠的转移瘤提供龛(niche)以大量生长的周围血管、免疫细胞、成纤维细胞、其它细胞、可溶性因子、信号传导分子、细胞外基质以及机械信号。肿瘤与其周围的微环境密切相关，并不断相互作用。肿瘤可通过释放细胞外信号、促进肿瘤血管生成并诱导外周免疫耐受来影响其微环境，而微环境中的免疫细胞可影响癌细胞的生长和演变。参见Swarts et al.“Tumor Microenvironment Complexity:Emerging Roles in Cancer Therapy,”Cancer Res,vol.,72,pp.2473-2480,2012；Weberet al.,“The tumor microenvironment,”Surgical Oncology,vol.21,pp.172-177,2012；Blagosklonny,“Antiangiogenic therapy and tumor progression,”Cancer Cell,vol.5,pp.13-17,2004；Siemann,“Tumor microenvironment,”Wiley,2010；and Bagley,“The tumor microenvironment,”Springer,2010。
具体实施方式
必须注意，如本文和所附权利要求中所使用的，单数形式“一种(a、an)”、“该(the)”包括复数指代，除非上下文另有明确规定。此外，术语“一种(a、an)”、“一个或多个”和“至少一个”在本文中可以互换使用。术语“包含”、“包括”、“具有”和“由…构成”也可以互换使用。
除非另有说明，在说明书和权利要求书中使用的、表示成分的量、性质(如分子量、百分比、比值、反应条件等)的所有数字应理解为在所有情况下由术语“约”修饰，无论术语“约”是否存在。因此，除非指出为相反，否则说明书和权利要求书中阐述的数值参数为近似值，其可以根据本发明寻求获得的期望性质而变化。至少，并且不试图将等同原理的应用限制在权利要求的范围内，每个数值参数应当至少根据所报告的有效数字的位数并通过应用普通的舍入技术来解释。尽管阐述本发明的宽范围的数值范围和参数是近似值，但是在具体实施例中我们尽可能精确地报告列出的数值。然而，任何数值必然固有地包含某些误差，该误差是由在这些数值的各自的测试测量中发现的标准偏差导致的。
应当理解，本文公开的每种组分、化合物、取代基或参数应被解释为公开为单独使用或与一种或多种本文公开的每种其它组分、化合物、取代基或参数组合使用。
还应理解，本文公开的每种组分、化合物、取代基或参数的每个量/值或量/值的范围被解释为也与本文公开的任何其它组分、化合物、取代基或参数的每个量/值或量/值的范围相组合公开，并且理解，为了本说明书的目的，本文公开的两种或多种组分、化合物、取代基或参数的量/值或量/值范围的任何组合也彼此组合地公开。
还应当理解，本文公开的每个范围应被解释为对具有相同位数的有效数字的公开范围内的每个具体值的公开。因此，1-4的范围应被解释为对值1、2、3和4的明确公开。还应当理解，本文公开的每个范围的每个下限应解释为公开了与针对相同的组分、化合物、取代基或参数本文公开的每个范围的每个上限和每个范围内的每个具体值的组合。因此，本发明被解释为对通过将每个范围的每个下限与每个范围的每个上限或每个范围内的每个具体值组合或通过将每个范围的每个上限与每个范围的每个特定值结合而得到的所有范围的公开。
此外，在说明书或实施例中公开的组分、化合物、取代基或参数的具体量/值应解释为对一个范围的下限或上限的公开，因此可以与在本申请其它地方公开的针对相同组分、化合物、取代基或参数的范围的任何其它下限或上限或具体量/值组合以形成针对该组分、化合物、取代基或参数的范围。
本发明提供了一种由结合与衰老细胞相关的靶标的亲本蛋白制备对衰老细胞具有活性的条件活性蛋白的方法。该方法包括以下步骤：
(i)使用一种或多种演变技术来演变编码所述亲本蛋白的DNA以产生突变DNA；
(ii)表达所述突变DNA以获得突变蛋白；
(iii)使所述突变蛋白在所述衰老细胞的细胞外条件下进行测试，并在正常生理条件下进行测试；和
(iv)从所述突变蛋白中选择表现出以下至少一种特性的条件活性蛋白：
(a)在所述正常生理条件下的测试中的活性与相同测试中的所述亲本蛋白的相同活性相比降低，而在所述衰老细胞的细胞外条件下的测试中的活性与在所述正常生理条件下的测试中的所述条件活性蛋白的相同活性相比增加；和
(b)在所述正常生理条件下的测试中的活性与相同测试中的所述亲本蛋白的相同活性相比降低，而在所述衰老细胞的细胞外条件下的测试中的活性与所述衰老细胞的细胞外条件下的测试中的所述亲本蛋白的相同活性相比增加。
亲本蛋白可以是抗体、配体、受体或酶或任何前述物质的片段。配体的实例包括细胞因子及其片段、激素及其片段、调节蛋白及其片段和生长因子及其片段。
在抗体、配体或受体的情况下，亲本蛋白和与衰老细胞相关的靶标结合，并且活性可以是对靶标的结合活性。对于酶，亲本蛋白可以使用衰老细胞的至少一部分作为其底物，并且活性是使用衰老细胞的至少一部分作为底物的酶活性。
在一些实施方案中，亲本蛋白可以是治疗性蛋白或生物仿制药。
与衰老细胞相关的靶标通常是衰老细胞的蛋白。在一些实例中，靶标是衰老细胞的细胞膜上的蛋白。在一些实施方案中，靶标选自DEP-1、NTAL、EBP50、STX4、VAMP3、ARMCX-3、LANCL1、B2MG、PLD3和VPS26A。如WO 2015/181526中所述，这些蛋白被认为是衰老细胞的生物标志物。在一些实施方案中，靶标选自ITGAV、RAC1、ARHGAP1、RAPGEF1、CRKL、NCKAP1、CDC42、CAPNS2、EBP、FGF1、ISG20、KITLG、LPHN1、MAG、MEF2C、OSBPL3、PFN1、POU5F1、PPP1CB、p16INK4a、PRKRA、APC、AXL、BCL2L1、CDKN2C、CLYBL、COPG1、DGKA、GBA3、GIT2、IGF1、LCMT2、MADCAM1、MAP3K14、MTHFD2、NAIP、NAPG、NNMT、PARK2、PMS2、PRPF19、PRTG、RAPGEF1、RET、VIT、WEE1、YAP1和YWHAE。
在一些实施方案中，靶标是Fas蛋白或死亡受体(DR)。Fas有时也被称为肿瘤坏死因子受体超家族成员6A(TNFSF6)。这是一种易于从衰老细胞外部获得的膜受体。DR是TNF相关的凋亡诱导配体(TRAIL)，参见Guicciardi等，“Life and death by death receptors,”FASEB J.vol.23,pp.1625–1637,2009。DR的实例包括DR4和DR5。
在一些实施方案中，与衰老细胞相关的靶选自MDM2、AKT(AKT1、AKT2和AKT3)、NOTCH3、DcR2(TNFRSF10D)和BCL-2抗凋亡蛋白家族的蛋白。该家族中的蛋白具有BH1-BH4结构域(BCL-2(即BCL-2抗凋亡蛋白家族的BCL-2蛋白成员)、BCL-xL、BCL-w、Al、MCL-1和BCL-B)；或BH1、BH2和BH3结构域(BAX、BAK和BOK)；或仅BH3结构域(BIK、BAD、BID、BIM、BMF、HRK、NOXA和PUMA)(参见，例如，Cory等，Nature Reviews Cancer,vol.2,pp.647-56,2002；Coryet al.,Cancer Cell,vol.8,pp.5-6,2005；Adams et al,Oncogene,vol.26,pp.1324-1337,2007)。适用于本发明的与衰老细胞相关的更多靶标描述于Althubiti et al,CellDeath and Disease,vol.5,p.el528,2014。
在一些实施方案中，与衰老细胞相关的靶选自错误折叠形式的蛋白，所述蛋白选自朊病毒蛋白(PrP)、CD38、Notch-1、CD44、CD59、Fas配体、TNF受体和EGF受体，如US 2016/0115237中所述。靶标也可以是p16INK4a，或选自US 2016/0038576的表1-3的蛋白。
在一些实施方案中，一旦选择了与衰老细胞相关的靶标，则可以选择与靶标结合的亲本蛋白，该亲本蛋白是与所选择的靶标结合并使用衰老细胞的至少一部分作为底物的酶，或与该靶标结合的抗体、配体或受体。用于本发明的合适的亲本蛋白的一些实例描述于WO 2016/138071的“Target Wild-type Proteins”部分中。
如WO 2016/138071中所述，亲本蛋白可选自文库。在一些实施方案中，例如通过使用pH低于7.0(例如，在5.0至低于7.0，或5.5至低于7.0，或6.0至低于7.0，或6.2至6.8的pH范围内)的条件下的测试从文库中选择亲本蛋白。
在一些其他实施方案中，例如，使用筛选溶液来从文库中选择亲本蛋白，该筛选溶液不含pKa为6至7.5、优选6至7、更优选6.2至6.8的小分子。在本申请中描述了这种小分子的实例。
在一些实施方案中，亲本蛋白是抗体。在一些实施方案中，亲本抗体具有一种或多种有利特征，基于该有利特征选择其用作亲本抗体。例如，在某些实施方案中，可以基于在衰老细胞的一种或多种细胞外条件(例如在5.0至小于7.0的pH范围内)下具有良好的结合活性来选择亲本抗体。
在一些实施方案中，基于对特定表位的结合活性来选择亲本抗体。基于对特定表位的结合活性进行的选择可以与一种或多种其他选择标准组合，例如基于在衰老细胞的一种或多种细胞外条件下的良好的结合活性进行的选择。
在其他实施方案中，基于内化效率(internalization efficiency)来选择亲本抗体。基于内化效率进行的选择可以与一种或多种其他选择标准(例如对特定表位的结合活性或在衰老细胞的一种或多种细胞外条件下的良好的结合活性)组合。
在其他实施方案中，亲本抗体在衰老细胞的正常生理条件和细胞外条件下均可具有相似的结合活性和/或特征。在此类实施方案中，基于在衰老细胞的正常生理条件和细胞外条件下具有最相似的结合活性和/或最相似的一种或多种特征的组合来选择亲本抗体。例如，如果衰老细胞的正常生理条件和细胞外条件分别为pH7.4和pH6.4，则在pH7.4和pH6.4下具有最相似结合活性的抗体可被选为亲本抗体，而不选择在pH7.4和pH6.4下具有不太相似的结合活性的抗体。
在一些实施方案中，亲本蛋白可以是天然存在的蛋白的片段。例如，亲本蛋白可以是酶的催化结构域、配体或受体的结合结构域，或抗体的可变区。在一些实施方案中，亲本蛋白可以是少至八个氨基酸单元的肽或环状肽。
选择亲本蛋白后，使用合适的演变技术演变编码亲本蛋白的DNA以产生突变DNA，然后可以表达该突变DNA以产生用于筛选的突变蛋白以鉴定条件活性蛋白。在WO 2016/138071中描述了用于演变编码亲本蛋白的DNA、表达突变DNA以产生突变蛋白和筛选突变蛋白的合适技术。
一旦被选择，条件活性蛋白可任选以“模拟物(mimetic)”和“肽模拟物(peptidomimetic)”形式合成，如WO 2016/138071中所述。
还可以使用多肽表达细胞生产宿主或生物体来产生所选择的条件活性蛋白。为了使生产过程更有效，可以对编码条件活性蛋白的DNA进行细胞生产宿主或生物体的密码子优化。先前已经描述了密码子优化，例如Narum et al.,"Codon optimization of genefragments encoding Plasmodium falciparum merzoite proteins enhances DNAvaccine protein expression and immunogenicity in mice,"Infect.Immun.,vol.69,pp,7250-3,2001，其描述了小鼠系统中的密码子优化；Outchkourov et al.,"Optimization of the expression of Equistatin in Pichia pastoris,proteinexpression and purification,"Protein Expr.Purif.,vol.24,pp.18-24,2002，其描述了酵母系统中的密码子优化；Feng et al.,"High level expression and mutagenesisof recombinant human phosphatidylcholine transfer protein using a syntheticgene:evidence for a C-terminal membrane binding domain"Biochemistry,vol.39,pp.15399-409,2000，其描述了大肠杆菌中的密码子优化；Humphreys et al.,"High-levelperiplasmic expression in Escherichia coli using a eukaryotic signal peptide:importance of codon usage at the 5'end of the coding sequence",ProteinExpr.Purif.,vol.20,pp.252-64,2000，其描述了密码子使用如何影响大肠杆菌中的蛋白分泌。
细胞生产宿主可以是选自CHO、HEK293、IM9、DS-I、THP-I、Hep G2、COS、NIH 3T3、C33a、A549、A375、SK-MEL-28、DU 145、PC-3、HCT 116、Mia PACA-2、ACHN、Jurkat、MML-1、Ovcar 3、HT 1080、Panc-1、U266、769P、BT-474、Caco-2、HCC 1954、MDA-MB-468、LnCAP、NRK-49F和SP2/0细胞系，和小鼠脾细胞和兔PBMC中的一种的哺乳动物细胞生产宿主。哺乳动物细胞生产宿主，例如选自CHO或HEK293细胞系。在一个具体方面，哺乳动物细胞生产宿主是CHO-S细胞系。在另一个实施方案中，哺乳动物细胞生产宿主是HEK293细胞系。
在一些实施方案中，细胞生产宿主是酵母细胞，例如酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞或毕赤酵母(Pichia)细胞。在一些实施方案中，细胞生产宿主是原核细胞，例如大肠杆菌(E.coli)(Owens,R.J.and Young,R.J.,J.Immunol.Meth.,vol.168,p.149,1994；JohnsonS and Bird RE,Methods Enzymol.,vol.203,p.88,1991)。条件活性蛋白也可以在植物细胞或植物中产生(Firek et al.,Plant Mol.Biol.,vol.23,p.861,1993)。
如WO 2016/138071中所述，可以通过天然过程或使用化学修饰技术来修饰条件活性蛋白。条件活性蛋白可以使用固相化学肽合成方法合成，也如WO 2016/138071中所述。
可以使用衰老细胞的细胞外条件下的测试和/或在正常生理条件下的测试来选择条件活性蛋白。所选择的条件活性蛋白表现出以下至少一种特性：
(a)在所述正常生理条件下的测试中的活性与相同测试中的所述亲本蛋白的相同活性相比降低，而在所述衰老细胞的细胞外条件下的测试中的活性与在所述正常生理条件下的测试中的所述条件活性蛋白的相同活性相比增加；和
(b)在所述正常生理条件下的测试中的活性与相同测试中的所述亲本蛋白的相同活性相比降低，而在所述衰老细胞的细胞外条件下的测试中的活性与所述衰老细胞的细胞外条件下的测试中的所述亲本蛋白的相同活性相比增加。
该条件是同种条件，但与在正常生理条件下的测试相比，在衰老细胞的细胞外条件下的测试中该条件具有不同的值，例如，该条件可以是pH，在正常生理条件下的pH值可以是pH7.2-7.8或7.2-7.6，而衰老细胞的细胞外条件下的pH值可以是pH6.0-7.0或6.2-6.8。
该活性可以是与任何衰老细胞的治疗相关的任何活性，例如，条件活性抗体与靶标或特定表位的结合活性、蛋白的内化效率，或者对于酶，该活性可以是，例如，条件活性酶对作为底物的衰老细胞的至少一部分的酶活性。
衰老细胞的细胞外条件选自在紧邻衰老细胞的细胞外环境中引起的一个或多个差异，这些差异是由衰老细胞的特殊特征与例如正常细胞的特征相比而获得的结果。可用于本发明的衰老细胞的一组特殊特征是衰老细胞的代谢活性。例如，衰老细胞可以表现出一种或多种以下特殊特征：(1)衰老细胞的生长停滞基本上是永久性的，并且不能通过已知的生理刺激逆转；(2)衰老细胞的大小增加，有时相对于非衰老细胞的大小增加两倍以上；(3)衰老细胞表达衰老相关的β-半乳糖苷酶(SAP-gal)，其部分地反映了溶酶体质量的增加；(4)许多衰老细胞表达p16INK4a，其通常不由静止期细胞或终末分化的细胞表达；(5)一些具有持久性DNA损伤反应(DDR)信号传导的衰老细胞具有持久性核灶(nuclear foci)，称为具有增强衰老的染色质改变的DNA片段(DNA-SCARS，例如功能失调的端粒或端粒功能障碍诱导的病灶(TIF))，含有激活的DDR蛋白并可与瞬时损伤病灶区分开来；(6)衰老细胞表达并可以分泌与衰老相关的分子，在某些情况下可以在持久性DDR信号传导存在的情况下观察到这些分子；(7)衰老细胞的细胞核失去结构蛋白(例如核纤层蛋白B1)或染色质相关的蛋白(例如组蛋白和HMGB1)。参见，例如，Freund et al,Mol.Biol.Cell,vol.23,pp.2066-75,2012；Davalos et al,J.Cell Biol.,vol.201,pp.613-29,2013；Ivanov etal,J.Cell Biol.,DOI:10.1083/jcb.201212110,pp.1-15,2013；Funayama et al,J.CellBiol.,vol.175,pp.869-80,2006。
在一些实施方案中，衰老细胞的细胞外条件是由衰老细胞中的糖酵解代谢增加引起的低pH(James et al.,“Senescent human fibroblasts show increased glycolysisand redox homeostasis with extracellular metabolomes that overlap with thoseof irreparable DNA damage,aging,and disease,”J Proteome Res.,vol.14,pp.1854-71,2015)。糖酵解涉及分解葡萄糖以形成两个丙酮酸和两个ATP，其中丙酮酸可以转化为乳酸并排出，从而降低衰老细胞的细胞外环境中的pH(Wiley and Campisi,“From AncientPathways to Aging Cells-Connecting Metabolism and Cellular Senescence,”CellMetab.,vol.23,pp.1013-21,2016)。这类似于肿瘤微环境，其中癌细胞中的糖酵解代谢降低了肿瘤微环境中的pH。因此，衰老细胞的细胞外条件可以是约5.5至约7.2，或约6.0至约7.0，或约6.2至约7.0，或约6.2至约6.8，或约6.4至约6.8的酸性pH。相应的正常生理条件是正常生理pH，其范围为约7.2至约7.8，优选约7.2至约7.6，或更优选约7.4至约7.6。
在一些实施方案中，与正常细胞环境中的正常生理浓度的脱氧核苷酸相比，衰老细胞的细胞外条件可以是低浓度的脱氧核苷酸(Wiley and Campisi,“From AncientPathways to Aging Cells-Connecting Metabolism and Cellular Senescence,”CellMetab.,vol.23,pp.1013-21,2016)。与正常细胞的细胞外环境中的脱氧核苷酸的细胞外浓度相比，一些衰老细胞可能丧失了合成脱氧核苷酸的能力，从而导致衰老细胞的细胞外环境中的脱氧核苷酸浓度较低。因此，相对于正常细胞的细胞外环境中相同脱氧核苷酸的正常生理浓度，衰老细胞的细胞外条件可以选择为较低浓度的脱氧核苷酸，并且相应的正常生理条件是正常细胞的细胞外环境中相同脱氧核苷酸的浓度。
在一些实施方案中，与正常细胞的细胞外环境中的氧的生理浓度相比，衰老细胞的细胞外条件可以是低浓度的氧(Wiley and Campisi,“From Ancient Pathways toAging Cells-Connecting Metabolism and Cellular Senescence,”Cell Metab.,vol.23,pp.1013-21,2016)。与非衰老细胞相比，衰老细胞具有增加的氧消耗，这可能导致与正常细胞的细胞外环境相比衰老细胞的细胞外环境中存在较低浓度的氧。因此，衰老细胞的细胞外条件可以选择为相对于正常细胞的细胞外环境中的氧的正常生理浓度的较低氧浓度，并且相应的正常生理条件是正常细胞的细胞外环境中的氧的浓度。
在一些实施方案中，衰老细胞的细胞外条件可以是NAD+/NADH比低于正常细胞的细胞外环境中的NAD+/NADH比(Wiley and Campisi,“From Ancient Pathways to AgingCells-Connecting Metabolism and Cellular Senescence,”Cell Metab.,vol.23,pp.1013-21,2016)。因此，衰老细胞的细胞外条件可以选择为相对于正常细胞的细胞外环境中NAD+/NADH的正常生理比的较低的NAD+/NADH比，并且相应的正常生理条件是正常细胞的细胞外环境中正常的NAD+/NADH比。
在一些实施方案中，衰老细胞的细胞外条件可以是氧化还原内稳态代谢物的浓度增加(与正常生长的融合或静止期细胞的细胞外环境中相同氧化还原内稳态代谢物的正常浓度相比)，所述氧化还原内稳态代谢物选自亚牛磺酸、半胱氨酸亚磺酸、半胱氨酸-谷胱甘肽二硫化物、γ-谷氨酰基丙氨酸、γ-谷氨酰基蛋氨酸、吡哆酸(pyridoxate)、γ-谷氨酰基谷氨酰胺和丙氨酸(James et al.,“Senescent human fibroblasts show increasedglycolysis and redox homeostasis with extracellular metabolomes that overlapwith those of irreparable DNA damage,aging,and disease,”J Proteome Res.,vol.14,pp.1854-71,2015)。因此，衰老细胞的细胞外条件可以选择为氧化还原内稳态代谢物的浓度增加(相对于可选自生长中的融合或静止期细胞的正常细胞的细胞外环境中相同氧化还原内稳态代谢物的正常生理浓度)，并且相应的正常生理条件是正常细胞的细胞外环境中氧化还原内稳态代谢物的浓度。
在一些实施方案中，衰老细胞的细胞外条件可以是核苷酸代谢物的浓度增加(与正常增殖增殖细胞、融合细胞或静止期细胞的细胞外环境中相同核苷酸代谢物的浓度相比)，所述核苷酸代谢物选自3-脲基丙酸、尿酸、7-甲基鸟嘌呤和次黄嘌呤(James et al.,“Senescent human fibroblasts show increased glycolysis and redox homeostasiswith extracellular metabolomes that overlap with those of irreparable DNAdamage,aging,and disease,”J Proteome Res.,vol.14,pp.1854-71,2015)。因此，衰老细胞的细胞外条件可以选择为核苷酸代谢物的浓度增加(相对于可选自增殖增殖细胞、融合细胞或静止期细胞的正常细胞的细胞外环境中相同核苷酸代谢物的正常生理浓度)，并且相应的正常生理条件是正常细胞的细胞外环境中核苷酸代谢物的浓度。
在一些实施方案中，衰老细胞的细胞外条件可以是与正常增殖增殖细胞、融合细胞或静止期细胞的细胞外环境中的胸苷浓度相比，胸苷的浓度降低(James et al.,“Senescent human fibroblasts show increased glycolysis and redox homeostasiswith extracellular metabolomes that overlap with those of irreparable DNAdamage,aging,and disease,”J Proteome Res.,vol.14,pp.1854-71,2015)。因此，衰老细胞的细胞外条件可以选择为相对于可选自增殖增殖细胞、融合细胞或静止期细胞的正常细胞的细胞外环境中胸苷的正常生理浓度，胸苷的浓度降低，并且相应的正常生理条件是正常细胞的细胞外环境中胸苷的浓度。
在一些实施方案中，衰老细胞的细胞外条件可以是二肽的浓度降低(与正常增殖增殖细胞、融合细胞或静止期细胞的细胞外环境中相同二肽的浓度相比)，所述二肽选自甘氨酰异亮氨酸、甘氨酰缬氨酸、甘氨酰亮氨酸、异亮氨酰甘氨酸和缬氨酰甘氨酸(James etal.,“Senescent human fibroblasts show increased glycolysis and redoxhomeostasis with extracellular metabolomes that overlap with those ofirreparable DNA damage,aging,and disease,”J Proteome Res.,vol.14,pp.1854-71,2015)。因此，衰老细胞的细胞外条件可以选择为二肽的浓度降低(相对于可选自增殖增殖细胞、融合细胞或静止期细胞的正常细胞的细胞外环境中相同二肽的正常生理浓度)，并且相应的正常生理条件是正常细胞的细胞外环境中相同二肽的浓度。
在一些实施方案中，衰老细胞的细胞外条件可以是脂肪酸浓度降低(与正常增殖增殖细胞、融合细胞或静止期细胞的细胞外环境中相同脂肪酸的浓度相比)，所述脂肪酸选自亚油酸、二高-亚油酸和10-十七碳烯酸(James et al.,“Senescent human fibroblastsshow increased glycolysis and redox homeostasis with extracellularmetabolomes that overlap with those of irreparable DNA damage,aging,anddisease,”J Proteome Res.,vol.14,pp.1854-71,2015)。因此，衰老细胞的细胞外条件可以选择为选自亚油酸、二高-亚油酸和10-十七碳烯酸的脂肪酸的浓度降低(相对于可选自增殖增殖细胞、融合细胞或静止期细胞的正常细胞的细胞外环境中相同脂肪酸的正常生理浓度)，并且相应的正常生理条件是正常细胞的细胞外环境中相同脂肪酸的浓度。
在一些实施方案中，衰老细胞的细胞外条件可以是磷脂代谢物的浓度增加(与正常增殖细胞、融合细胞或静止期细胞的细胞外环境中相同的磷脂代谢物的浓度相比)，所述磷脂代谢物选自2-羟基棕榈酸、2-羟基硬脂酸、3-羟基癸酸、3-羟基辛酸和甘油磷酸胆碱(James et al.,“Senescent human fibroblasts show increased glycolysis andredox homeostasis with extracellular metabolomes that overlap with those ofirreparable DNA damage,aging,and disease,”J Proteome Res.,vol.14,pp.1854-71,2015)。因此，衰老细胞的细胞外条件可以选择为磷脂代谢物的浓度增加(相对于可选自增殖细胞、融合细胞或静止期细胞的正常细胞的细胞外环境中相同磷脂代谢物的正常生理浓度)，并且相应的正常生理条件是正常细胞的细胞外环境中相同磷脂代谢物的浓度。
在一些实施方案中，衰老细胞的细胞外条件可以是氨基酸代谢物的浓度增加(与正常增殖细胞、融合细胞或静止期细胞的细胞外环境中相同氨基酸代谢物的浓度相比)，所述氨基酸代谢物选自丙氨酸、C-糖基色氨酸、犬尿氨酸、二甲基精氨酸和鸟氨酸(orthithine)(James et al.,“Senescent human fibroblasts show increasedglycolysis and redox homeostasis with extracellular metabolomes that overlapwith those of irreparable DNA damage,aging,and disease,”J Proteome Res.,vol.14,pp.1854-71,2015)。因此，衰老细胞的细胞外条件可以选择为氨基酸代谢物的浓度增加(相对于可选自增殖细胞、融合细胞或静止期细胞的正常细胞的细胞外环境中相同氨基酸代谢物的正常生理浓度)，并且相应的正常生理条件是正常细胞的细胞外环境中相同氨基酸代谢物的浓度。
在一些实施方案中，衰老细胞的细胞外条件可以是与正常增殖细胞、融合细胞或静止期细胞的细胞外环境中的苯丙酮酸的浓度相比，苯丙酮酸的浓度降低(James et al.,“Senescent human fibroblasts show increased glycolysis and redox homeostasiswith extracellular metabolomes that overlap with those of irreparable DNAdamage,aging,and disease,”J Proteome Res.,vol.14,pp.1854-71,2015)。因此，衰老细胞的细胞外条件可以选择为相对于正常细胞的细胞外环境中苯丙酮酸的正常生理浓度，苯丙酮酸的浓度降低，并且相应的正常生理条件是正常细胞的细胞外环境中苯丙酮酸的浓度。
在一些实施方案中，衰老细胞的细胞外条件可以是代谢物的浓度增加(与正常生长的增殖细胞、融合细胞或静止期细胞的细胞外环境中相同代谢物的浓度相比)，所述代谢物选自富马酸、丙二酸、二十碳五烯酸和柠檬酸(James et al.,“Senescent humanfibroblasts show increased glycolysis and redox homeostasis withextracellular metabolomes that overlap with those of irreparable DNA damage,aging,and disease,”J Proteome Res.,vol.14,pp.1854-71,2015)。因此，衰老细胞的细胞外条件可以选择为选自富马酸、丙二酸、二十碳五烯酸和柠檬酸的代谢物的浓度增加(相对于正常细胞的细胞外环境中相同代谢物的正常生理浓度)，并且相应的正常生理条件是正常细胞的细胞外环境中相同代谢物的浓度。
在一些实施方案中，衰老细胞的细胞外条件可以是甘油磷酸胆碱与磷酸胆碱的比增加(与正常的非静止期细胞的细胞外环境中的甘油磷酸胆碱与磷酸胆碱的比相比)(Geyand Seeger,“Metabolic changes during cellular senescence investigated byproton NMR-spectroscopy,”Mech Ageing Dev.,vol.134,pp.130-8,2013)。因此，衰老细胞的细胞外条件可以选择为甘油磷酸胆碱与磷酸胆碱的比增加(相对于正常的非静止期细胞的细胞外环境中相同的甘油磷酸胆碱与磷酸胆碱的比)，并且相应的正常生理条件是正常的非静止期细胞的细胞外环境中甘油磷酸胆碱与磷酸胆碱的比。
衰老细胞分泌多种不同的蛋白，其统称为衰老相关的分泌表型(SASP)。这些分泌的蛋白包括，例如，GM-CSF、GROa、GRC-α、GRC-β、GRC-γ、IGFBP-7、IL-1α、IL-6、IL-7、IL-8、MCP-1、MCP-2、MIP-1a、MMP-1、MMP-10、MMP-3、双调蛋白、ENA-78、嗜酸细胞活化趋化因子-3、GCP-2、GITR、HGF、ICAM-1、IGFBP-2、IGFBP-4、IGFBP-5、IGFBP-6、IL-13、IL-Iβ、MCP-4、MIF、MIP-3a、MMP-12、MMP-13、MMP-14、NAP2、制瘤素M、骨保护素、、PIGF、RANTES、sgp130、TIMP-2、TRAIL-R3、Acrp30、血管生成素、Axl、bFGF、BLC、BTC、CTACK、EGF-R、Fas、FGF-7、G-CSF、GDNF、HCC-4、I-309、IFN-γ、IGFBP-1、IGFBP-3、IL-1R1、IL-11、IL-15、IL-2R-a、IL-6R、I-TAC、瘦蛋白、LIF、MMP-2、MSP-a、PAI-1、PAI-2、PDGF-BB、SCF、SDF-1、sTNF RI、sTNF RII、血小板生成素、TIMP-1、tPA、uPA、uPAR、VEGF、MCP-3、IGF-1、TGF-β3、MIP-1-delta、IL-4、FGF-7、PDGF-BB、IL-16、BMP-4、MDC、MCP-4、IL-10、TIMP-1、Fit-3配体、ICAM-1、Axl、CNTF、INF-γ、EGF和BMP-6。衰老细胞分泌的其他蛋白包括IGF-2、IGF-2R、IGFBP-3、IGFBP-7、TGF-β、WNT2、CXCR2结合趋化因子、WNT16B、SFRP2、SPINK1、ENPP5、EREG、ANGPTL4、CSGALNACT、CCL26、AREG、ANGPT1、CCK、THBD、CXCL14、NOV、GAL、NPPC、FAM150B、CST1、MUCL1、NPTX2、TMEM155、EDN1、PSG9、ADAMTS3、CD24、PPBP、CXCL3、CST2、PSG8、PCOLCE2、PSG7、TNFSF15、C17orf67、CALCA、FGF18、BMP-2、MATN3、TFP1、SERPINI 1、TNFRSF25和IL-23A。在一些实施方案中，衰老细胞的细胞外条件是这些分泌蛋白中的一种或多种的存在或者浓度增加(与正常细胞的细胞外环境中的相同蛋白的浓度相比)，且正常生理条件是不存在相同分泌蛋白，或者为正常细胞的细胞外环境中相同分泌蛋白的正常生理浓度。
本发明的条件活性蛋白可以用作衰老细胞溶解剂以杀死或去除个体的衰老细胞。条件活性蛋白和衰老细胞之间的相互作用可以通过抑制在细胞衰老过程中激活的细胞存活信号传导途径和/或炎症途径来抑制甚至杀死衰老细胞。细胞存活信号传导途径和/或炎症途径的抑制可诱导(即，启动、触发、刺激或以某种方式消除或阻止抑制作用)衰老细胞中的细胞死亡途径，例如细胞凋亡途径，其将导致衰老细胞的死亡。
在衰老过程中被激活的细胞存活信号传导途径包括src激酶信号传导途径、PI3K/Akt途径、PBK/Akt/mTor途径、p38/MAPK途径、ERK/MAPK途径、mTOR途径、胰岛素/IGF-1信号传导途径和TGF-β信号传导途径。在衰老过程中激活的炎症途径包括p38/MAPK信号传导途径、ERK/MAPK途径、src激酶信号传导途径和NF-κB途径。
src激酶信号传导途径参与细胞增殖、分化、凋亡、细胞粘附和应激反应的调节(参见，例如，Wang，Wang,Oncogene,vol.19,pp.5643-50,2000and Thomas et al,Annu.Rev.Cell Dev.Biol.,vol.13,pp.513-609,1997)。src激酶信号传导途径还涉及炎症反应，包括巨噬细胞介导的免疫应答(参见，例如，Byeon et al,Mediators ofInflammation,vol.2012,article ID 512926,2012)和急性炎症反应(参见，例如，Okutaniet al,Am.J.Physiol.Lung Cell Mol.Physiol.,vol.291,pp.L129-L141,2006)。因此，改变src激酶信号传导途径的条件活性蛋白可以改变信号传导途径和炎症途径。
改变细胞的信号传导途径和/或炎症途径可以影响一种或多种下游蛋白的功能，或者可以影响一种或多种下游蛋白与相应细胞信号传导或炎性途径的其他组分的相互作用。例如，改变src激酶信号传导途径或PBK/Akt途径的条件活性蛋白可以改变相应途径中的一种或多种下游蛋白的功能，或者可以影响一种或多种下游蛋白与相应的途径的另一种组分的相互作用(参见，例如，实施例1；图2B-2D)。在衰老细胞中上调的示例性蛋白包括P38/MAPK、ERK1/2和PBK(复合物)。在某些实施方案中，作为细胞信号传导途径的PBK/Akt途径在衰老期间被激活，并且本文所述的条件活性蛋白抑制PBK/Akt途径以增强或诱导衰老细胞中的细胞凋亡。
用于衰老细胞的细胞外条件下的测试和正常生理条件下的测试的测试溶液，例如，包括选自柠檬酸盐缓冲液(例如柠檬酸钠)、磷酸盐缓冲液、碳酸氢盐缓冲液(例如Krebs缓冲液)、磷酸盐缓冲盐水(PBS)缓冲液、Hank缓冲液、Tris缓冲液、HEPES缓冲液等的组分。可以使用本领域技术人员已知的适合于测试的其他缓冲液。
本发明的测试溶液可含有选自无机化合物、离子和有机分子的至少一种组分，例如通常存在于哺乳动物(例如人或动物)的体液中的组分。这些无机化合物、离子和有机分子在WO 2016/138071中有详细描述。
条件活性蛋白可以与无机化合物、离子和有机分子中的一种或多种相互作用。条件活性蛋白与可选自无机化合物、离子和有机分子的组分之间的这种相互作用包括氢键键合、疏水相互作用和范德华相互作用。
在一些实施方案中，衰老细胞的细胞外条件是5.5至7.2，或6.0至7.0，或6.2至6.8的较低pH，正常生理条件是正常生理pH，例如，7.2至7.8的范围内的pH。用于细胞外条件的pH的测试溶液可以包括具有在细胞外条件的较低pH和正常生理pH之间的pKa的组分。该pKa，例如，与细胞外条件的较低pH相差至多0.5、1、1.5、2、2.5或3个单位。在一些实施方案中，该组分的分子量小于900a.m.u，例如，可以选自组氨酸、组胺、氢化二磷酸腺苷、氢化三磷酸腺苷、柠檬酸盐、碳酸氢盐、乙酸盐、乳酸盐、二硫化物(bisulfide)、硫化氢、铵、磷酸二氢盐及其任意组合。
已经观察到，与衍生条件活性蛋白的亲本蛋白的氨基酸残基相比，某些条件活性蛋白含有数量(或比例)增加的带电荷的氨基酸残基。有三个带正电荷的氨基酸残基：赖氨酸、精氨酸和组氨酸；和两个带负电荷的氨基酸残基：天冬氨酸和谷氨酸。与衍生条件活性蛋白的亲本蛋白相比，这些带电荷的氨基酸残基在某些条件活性蛋白中被过度表达。结果，条件活性蛋白更可能与测试溶液中的带电物质相互作用，因为条件活性蛋白中带电荷的氨基酸残基的数量增加。反过来，这会影响条件活性蛋白的活性。
还观察到当在测试溶液中存在不同的物质时，某些条件活性蛋白通常具有不同的活性。具有至少两种电离状态的物质(在诸如pH的一种条件为一个值时的不带电荷状态或带较少电荷的状态，和在该同种条件为一个不同的值时的带电荷或带较多电荷的状态)可以改变条件活性蛋白的活性。物质的带电荷或带较多电荷的状态可以增加物质与条件活性蛋白中存在的带电荷的氨基酸残基的相互作用。该机制可用于增强条件活性蛋白的选择性和/或pH依赖性活性。
条件活性蛋白上的电荷的性质可以是用于确定影响条件活性蛋白的活性的合适物质的一个因素。在一些实施方案中，与亲本蛋白相比，条件活性蛋白可具有带更多正电荷的氨基酸残基：赖氨酸、精氨酸和组氨酸。因此，可以选择条件活性蛋白以与衰老细胞的细胞外环境中存在的特定物质具有所需水平的相互作用(在需要活性的情况下)，或者与正常生理条件下存在的特定物质具有所需水平的相互作用(在需要降低活性的情况下)。
条件活性蛋白上带电荷的氨基酸残基的位置也可能对活性产生影响。例如，带电荷的氨基酸残基邻近条件活性蛋白的结合位点可用于影响条件活性蛋白的活性。
在一些实施方案中，情况可能是带电荷的物质与条件活性蛋白的相互作用可在蛋白上的不同部分(尤其是带电荷或极化的部分)之间形成盐桥。已知盐桥的形成可稳定多肽结构(Donald,et al.,“Salt Bridges:Geometrically Specific,DesignableInteractions,”Proteins,79(3):898–915,2011；Hendsch,et al.,“Do salt bridgesstabilize proteins？A continuum electrostatic analysis,”Protein Science,3:211-226,1994)。盐桥可以稳定或固定蛋白结构，该蛋白结构通常经历称为“呼吸(breathing)”的恒定的微小结构变化(Parak,“Proteins in action:the physics of structuralfluctuations and conformational changes,”Curr Opin Struct Biol.,13(5):552-557,2003)。蛋白结构的“呼吸”对于蛋白功能及其与其配偶体的结合是重要的，因为结构波动允许条件活性蛋白有效识别并结合其配偶体(Karplus,et al.,“Molecular dynamicsand protein functions,”PNAS,vol.102,pp.6679-6685,2015)。通过形成盐桥，条件活性蛋白上的结合位点，尤其是结合口袋(binding pocket)可能不易接近其配偶体，这可能是因为盐桥可能直接阻止配偶体进入结合位点。即使盐桥远离结合位点，变构效应(allosteric effect)也可能改变结合位点的构象而抑制结合。因此，在盐桥稳定(固定)条件活性蛋白的结构后，蛋白与其配偶体的结合可能变得较不活跃，导致活性降低。
蛋白及其结构如何通过盐桥稳定的一个已知实例是血红蛋白。结构和化学研究表明，至少有两组化学基团与形成盐桥有关：组氨酸β146和α122的氨基末端和侧链，其pKa值接近pH7。在脱氧血红蛋白中，β146的末端羧酸盐基团与另一个αβ二聚体的α亚基中的赖氨酸残基形成盐桥。该相互作用将组氨酸β146的侧链锁定在其可以参与同一链中具有带负电荷的天冬氨酸94的盐桥的位置，条件是组氨酸残基的咪唑基被质子化(图2)。在高pH下，组氨酸β146的侧链未质子化，并且不形成盐桥。然而，随着pH下降，组氨酸β146的侧链变为质子化，形成组氨酸β146和天冬氨酸β94之间的盐桥，这稳定了脱氧血红蛋白的四级结构，导致氧在活跃代谢组织(具有较低的pH值)处释放的趋势更大。血红蛋白显示出对氧的pH依赖性结合活性，在低pH下，由于盐桥的形成，氧的结合活性降低。另一方面，在高pH下，由于没有盐桥，对氧的结合活性增加。
类似地，小分子例如碳酸氢盐可通过在条件活性蛋白中形成盐桥来降低条件活性蛋白与其配偶体的结合活性。例如，在低于其pKa(6.4)的pH下，碳酸氢盐被质子化，因此不带电荷。不带电荷的碳酸氢盐不能形成盐桥，因此对条件活性蛋白与其配偶体的结合几乎没有影响。因此，条件活性蛋白在低pH下与其配偶体具有高结合活性。另一方面，在高于碳酸氢盐的pKa的高pH下，碳酸氢盐通过失去质子而离子化，从而变成带负电荷的。带负电荷的碳酸氢盐将在条件活性蛋白上的带正电荷的部分或极化部分之间形成盐桥，以稳定条件活性蛋白的结构。这将阻断或减少条件活性蛋白与其配偶体的结合。因此，条件活性蛋白在高pH下具有低活性。因此，条件活性蛋白在碳酸氢盐存在下具有pH依赖性活性，在低pH下比在高pH下具有更高的结合活性。
当测试溶液中不存在诸如碳酸氢盐的物质时，条件活性蛋白可能失去其条件活性。这可能是由于条件活性蛋白上缺乏盐桥来稳定(固定)蛋白的结构。因此，配偶体在任何pH下都有类似的途径进入条件活性蛋白上的结合位点，在第一pH和第二pH下产生相似的活性。
应当理解，尽管盐桥(离子键)是物质影响条件活性蛋白活性的最强和最常见的方式，但这些物质与条件活性蛋白之间的其他相互作用也可能有助于稳定(固定)条件活性蛋白的结构。其他相互作用包括氢键、疏水相互作用和范德华相互作用。
在一些实施方案中，为了选择作为物质的合适的化合物或离子，将条件活性蛋白与作为该条件活性蛋白演变来源的亲本蛋白进行比较，以确定条件活性蛋白是否具有较高比例的带负电荷的氨基酸残基或带正电荷的氨基酸残基。然后可以选择在正常生理pH下具有合适电荷的化合物以影响条件活性蛋白的活性。例如，当条件活性蛋白具有比亲本蛋白更高比例的带正电荷的氨基酸残基时，合适的化合物通常应在正常生理pH下带负电荷以与条件活性蛋白相互作用。另一方面，当条件活性蛋白比亲本蛋白具有更高比例的带负电荷的氨基酸残基时，合适的小分子通常应在正常生理pH下带正电荷以与条件活性蛋白相互作用。
因此，合适的物质可以是下述无机分子或有机分子：其在衰老细胞的细胞外条件的较低pH下从不带电荷或带较少电荷的状态转变为在正常生理pH下的带电荷或带较多电荷的状态。该物质通常应具有在较低pH和正常生理pH之间的pKa。例如，碳酸氢盐的pKa为6.4。因此，在较高的pH如pH 7.4下，带负电荷的碳酸氢盐将与条件活性蛋白中的带电荷的氨基酸残基结合并降低活性。另一方面，在较低的pH如pH6.0-6.2下，带较少电荷的碳酸氢盐不会以相同的量结合条件活性蛋白，因此使得条件活性蛋白的活性更高。
二硫化物的pKa为7.05。因此，在较高的pH如pH 7.4下，带较多负电荷的二硫化物将与条件活性蛋白中的带正电荷的氨基酸残基结合并降低其活性。另一方面，在较低的pH如pH6.0-6.8下，带较少电荷的硫化氢/二硫化物不会以相同的水平与条件活性蛋白结合，因此允许条件活性蛋白的活性更高。
一些物质选自二硫化物、硫化氢、组氨酸、组胺、柠檬酸盐、碳酸氢盐、乙酸盐和乳酸盐。这些小分子中的每一个的pKa在6.2和7.0之间。其他合适的小分子可以在使用本申请的原理的教科书中找到，例如CRC Handbook of Chemistry and Physics,96th Edition,by CRC press,2015；Chemical Properties Handbook,McGraw-Hill Education,1998。
例如，物质具有低分子量和/或相对小的构象，以通过使空间位阻最小化来确保最大限度地进入条件活性蛋白上的小口袋。因此，小分子的分子量通常小于900a.m.u.，或更优选小于500a.m.u.，或者更优选小于200a.m.u.，或还更优选地小于100a.m.u.。例如，硫化氢、二硫化物和碳酸氢盐都具有低分子量和小的结构，以进入条件活性蛋白上的口袋。
测试溶液中物质的浓度为例如个体中物质的生理浓度或生理浓度附近。例如，碳酸氢盐(在人血清中)的生理浓度在15至30mM的范围内。因此，测试溶液中碳酸氢盐的浓度可以是10mM至40mM，或15mM至30mM，或20mM至25mM，或约20mM。二硫化物的生理浓度也较低。测试溶液中二硫化物的浓度可以是3至500nM，或5至200nM，或10至100nM，或10至50nM。
该物质可以以基本相同的浓度(例如，对于碳酸氢盐，浓度约为20μM)存在于用于衰老细胞的细胞外条件的测试溶液以及用于正常生理条件的测试溶液中。
在一些实施方案中，当存在两种或更多种不同的小分子(例如，碳酸氢盐和组氨酸的组合)时，条件活性蛋白是pH依赖性的。因此，这两种或更多种小分子存在于测试溶液中。
测试溶液中的物质可以由测试溶液的组分原位形成或直接包含在测试溶液中。例如，来自空气的CO2可溶解在测试溶液中以提供碳酸氢盐作为测试溶液中的物质。又例如，可以将磷酸二氢钠添加到测试溶液中以提供磷酸二氢盐作为测试溶液中的物质。
当该物质不存在时，条件活性蛋白可能失去pH依赖性。因此，在该物质不存在的情况下，条件活性蛋白可以在衰老细胞的细胞外条件的较低pH和该物质不存在时的正常生理pH之间具有相似的活性。基于不同于正常生理条件的衰老细胞的任何细胞外条件，可以实现相同的结果。
在一些实施方案中，在辅助蛋白存在的情况下，条件活性蛋白在衰老细胞的细胞外条件的较低pH下的活性，与在正常生理pH下的相同活性相比表现出活性增加。辅助蛋白可以是血液或人血清中存在的蛋白。一种合适的蛋白可以是白蛋白，特别是哺乳动物白蛋白，例如牛白蛋白或人白蛋白。
在一个方面，辅助蛋白(如白蛋白)存在于用于从演变步骤产生的突变蛋白筛选和选择条件活性蛋白的测试溶液中。另一方面，具有辅助蛋白(如白蛋白)的测试溶液也用于在相同或不同条件下测试所选条件活性蛋白的活性。
在一些实施方案中，本申请中讨论的这些无机化合物、离子和有机分子中的两种或更多种以基本相同的浓度添加到用于正常生理条件和衰老细胞的细胞外条件的两种测试溶液中。例如，将碳酸氢盐和组氨酸都加入两种测试溶液中。
在一个实施方案中，可以以基本相同的浓度将人血清加入到用于正常生理条件和衰老细胞的细胞外条件的两种测试溶液中。由于人血清中含有大量的无机化合物、离子、有机分子(包括蛋白)，因此测试溶液将含有选自无机化合物、离子、有机分子的多种大量的组分，这些组分以两种测试溶液之间的基本相同的浓度存在。
在一些其他实施方案中，将两种或更多种组分中的至少一种以不同的浓度加入到用于正常生理条件和衰老细胞的细胞外条件的测试溶液中。例如，将碳酸氢盐和组氨酸都加入到测试溶液中。测试溶液之间的碳酸氢盐浓度可以不同，而组氨酸在两种测试溶液中可以具有相同的浓度。
在一些实施方案中，可以设计测试溶液用于选择具有依赖于两种或更多种条件的活性的条件活性生物蛋白。在一个示例性实施方案中，条件活性蛋白可具有依赖于pH和碳酸氢盐的活性。用于选择这种条件活性蛋白的测试溶液可以是用于正常生理条件的pH为7.2-7.6、碳酸氢盐的浓度为25-30mM的测试溶液。用于衰老细胞的细胞外条件的测试溶液可以具有pH 6.4-6.8、10-20mM的碳酸氢盐浓度。任选地，用于正常生理条件和衰老细胞的细胞外条件的测试溶液还可以包含离子以促进突变蛋白和结合配偶体之间的结合，从而增加条件活性蛋白的命中数(number of hits)。
在一些实施方案中，可以有目的地尽量减少或从测试溶液中省略血清的某些组分。例如，当筛选抗体时，可以在测试溶液中尽量减少或省略与抗体结合或吸附抗体的血清组分。这种结合的抗体可以产生假阳性，从而包括结合的突变抗体，该突变抗体不具有条件活性，而是仅在各种不同条件下与血清中存在的组分结合。因此，仔细选择测试组分以尽量减少或省略可能与测试中的突变蛋白结合的组分，可以减少假阳性突变蛋白的数量，这些假阳性突变蛋白可能由于与测试中除所需配偶体之外的组分结合而被无意间鉴定为条件活性阳性。例如，在筛选具有与人血清中的组分结合的倾向的突变蛋白的一些实施方案中，可以在测试溶液中使用牛血清白蛋白，以减少或消除由突变蛋白与人血清成分结合造成的假阳性的可能性。在特定情况下也可以进行其他类似的替换以实现相同的目标，这是本领域技术人员所熟知的。
在一些实施方案中，演变步骤可以产生突变蛋白，该突变蛋白除了具有上面讨论的条件活性特征之外，可以同时具有其他所需的性质。可以演变的合适的其他所需的性质可以包括结合亲和力、表达、人源化等。因此，本发明可以用于产生条件活性蛋白，该条件活性蛋白还具有这些其他所需的性质中的至少一种或多种的改善。
在一些实施方案中，可以使用本文公开的诱变技术之一在例如第二演变步骤中进一步使条件活性蛋白突变，以改善条件活性蛋白的另一性质，例如结合亲和力、表达、人源化等。在第二个演变步骤之后，可以筛选突变蛋白的条件活性和改善的性质。
在一些实施方案中，在演变亲本蛋白以产生突变蛋白后，选择第一种条件活性蛋白，其表现出以下至少一种特性：
(a)在所述正常生理条件下的测试中的活性与相同测试中的所述亲本蛋白的相同活性相比降低，而在所述衰老细胞的细胞外条件下的测试中的活性与在所述正常生理条件下的测试中的所述条件活性蛋白的相同活性相比增加；和
(b)在所述正常生理条件下的测试中的活性与相同测试中的所述亲本蛋白的相同活性相比降低，而在所述衰老细胞的细胞外条件下的测试中的活性与所述衰老细胞的细胞外条件下的测试中的所述亲本蛋白的相同活性相比增加。
然后可以进一步对所选择的第一条件活性蛋白进行一个或多个额外的演变、表达和选择步骤以选择至少一种第二条件活性蛋白，该第二条件活性蛋白还表现出以下至少一种特性：
(a)在所述正常生理条件下的测试中的活性与相同测试中的所述亲本蛋白的相同活性相比降低，而在所述衰老细胞的细胞外条件下的测试中的活性与在所述正常生理条件下的测试中的所述条件活性蛋白的相同活性相比增加；和
(b)在所述正常生理条件下的测试中的活性与相同测试中的所述亲本蛋白的相同活性相比降低，而在所述衰老细胞的细胞外条件下的测试中的活性与所述衰老细胞的细胞外条件下的测试中的所述亲本蛋白的相同活性相比增加。第二活性可以与第一活性相同，在这种情况下，与第一条件活性蛋白相比，期望第二种条件活性蛋白在细胞外条件下的活性与正常生理条件下的活性之间的比更大。在一些实施方案中，第二活性可以是与第一活性不同的活性，在这种情况下，诸如内化效率或结合到特定表位的活性可为第二活性。
在某些实施方案中，本发明旨在产生条件活性蛋白，其在衰老细胞的细胞外条件下的活性与在正常生理条件下的活性比大于1.0(例如，在两种条件之间的高选择性)。在衰老细胞的细胞外条件下的活性或选择性与正常生理条件下的活性的比可以是至少约1.3:1，或至少约2:1，或至少约3:1，或至少约4:1，或至少约5:1，或至少约6:1，或至少约7:1，或至少约8:1，或至少约9:1，或至少约约10:1，或至少约11:1，或至少约12:1，或至少约13:1，或至少约14:1，或至少约15:1，或至少约16:1，或至少约17:1，或至少约18:1，或至少约19:1，或至少约20:1，或至少约30:1，或至少约40:1，或至少约50:1，或至少约60:1，或至少约70:1，或至少约80:1，或至少约90:1，或至少约100:1。
在一个实施方案中，条件活性蛋白是抗体，其在衰老细胞的细胞外条件下的活性与正常生理条件下的活性的比为至少约5:1，或至少约6:1，或至少约7:1，或至少约8:1，或至少约9:1，或至少约10:1，或至少约20:1，或至少约40:1，或至少约70:1，或至少约100:1。
在一些实施方案中，条件活性蛋白是包含通过接头(L)与掩蔽部分(MM)缀合的抗体或抗体片段(统称为“抗体”)的前体(probody)。与正常细胞的细胞外环境相比，该前体在衰老细胞的细胞外环境中更具活性。特别地，在正常细胞的细胞外环境中，该前体的掩蔽部分将掩蔽抗体的活性，结果，抗体将对靶衰老细胞具有较低的结合活性。掩蔽部分将通过存在于衰老细胞的细胞外环境中的蛋白酶从抗体上切割下来。因此，抗体未被掩蔽并自由结合靶衰老细胞。因此，该前体在衰老细胞的细胞外环境中对靶衰老细胞的结合活性与在正常细胞的细胞外环境中对同一靶标的结合活性相比增加。
可以包括在该前体中的抗体片段可以包括抗体的轻链和/或重链的可变区或高变区(VL、VH)、可变片段(Fv)、Fab’片段、F(ab’)2片段、Fab片段、单链抗体(scAb)、单链可变区(scFv)、互补决定区(CDR)、结构域抗体(dAb)、BHH或BNAR型单结构域重链免疫球蛋白和单结构域轻链免疫球蛋白。
与没有掩蔽部分的(例如，在掩蔽部分从前体上切割下来之后)相同抗体的结合活性相比，掩蔽部分起到降低前体中抗体与靶衰老细胞的结合活性的作用。抗体与靶衰老细胞的结合活性可以通过掩蔽部分降低至少50％，至少55％，至少60％，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或甚至100％。结合活性的降低可以持续，例如，至少2、4、6、8、12、28、24、30、36、48、60、72、84或96小时的时间。
在一个实施方案中，掩蔽部分(MM)通过接头(L)缀合至抗体(Ab)的一个或多个可变区，以在抗体和靶衰老细胞之间产生屏障。例如，掩蔽部分可以与一个或多个可变区的N末端缀合。掩蔽部分和接头形成与一个或多个可变区的N末端缀合的单链。在另一个实例中，掩蔽部分可以与一个或多个可变区的氨基酸的侧链缀合，在这种情况下，掩蔽部分和接头形成与一个或多个可变区中的氨基酸的侧链缀合的单链。在另一个实例中，当前体仅包含抗体的片段(例如仅可变区)时，掩蔽部分与一个或多个可变区的C末端缀合。在一些实施方案中，该前体具有从N末端到C末端的MM-L-Ab的结构。在其他实施方案中，该前体具有从N末端到C末端的Ab-L-MM的结构。
在一些实施方案中，可以通过从多种肽的文库中筛选与抗体的一个或多个可变区结合的肽来鉴定掩蔽部分(Desnoyers et al.,“Tumor-specific activation of anEGFR-targeting probody enhances therapeutic index,”Sci Transl Med.,vol.5,207ra144,2013)。当与抗体通过接头缀合时，可以特异性结合抗体并阻断抗体与靶衰老细胞结合的肽被选为掩蔽部分。筛选可以使用已知技术进行，包括但不限于淘选、荧光激活细胞分选和用链霉亲和素包被的磁珠进行磁选(Rice et al.,“Bacterial display usingcircularly permuted outer membrane protein OmpX yields high affinity peptideligands,”Protein Sciences,vol.15,pp.825-36,2006)。
在一些实施方案中，可以在筛选方法中使用随机肽文库(例如，具有约2至约40个氨基酸，或约5至约30个氨基酸，或约8至约20个氨基酸，或超过40个氨基酸的肽)以鉴定合适的掩蔽部分。例如，可通过包括提供肽骨架文库(其中每个骨架由跨膜蛋白和候选物组成)的筛选程序来鉴定对抗体具有特异性结合亲和力的掩蔽部分。然后使文库与抗体接触，以鉴定一种或多种对抗体具有可检测的结合活性的合适的掩蔽部分。筛选可以包括一轮以上的磁激活分选或荧光激活细胞分选。
因此，本发明认为掩蔽部分可以对前体中的抗体具有特异性。对于特定抗体有效的一种掩蔽部分对于另一种抗体可能不是最佳的。因此，使用前体中的抗体从多种肽的文库中筛选对于抗体最佳的掩蔽部分对于本发明的一些实施方案可能是重要的。
在一些实施方案中，从多种合成肽的文库中筛选掩蔽部分。这种类型的掩蔽部分可以与靶衰老细胞(抗体的天然结合配偶体)具有一定水平的相似性。在某些实施方案中，掩蔽部分可仿照抗体的天然结合配偶体来建模。例如，可以通过改变一个或多个氨基酸残基来修饰天然结合配偶体，以略微降低其对抗体的结合活性。在其他实施方案中，掩蔽部分与抗体的天然结合配偶体的序列同一性不超过5％，不超过7％，不超过10％，不超过15％，不超过20％，不超过25％，不超过30％，不超过35％，不超过40％，不超过45％，不超过50％，不超过55％，不超过60％，不超过65％，不超过70％，不超过75％，或不超过80％。
掩蔽部分的结构性质取决于若干因素，例如干扰抗体与靶衰老细胞结合所需的最小氨基酸序列、抗体的大小(全长抗体或片段)、接头的长度等。在一些实施方案中，掩蔽部分通过共价键合与抗体偶联。在一个实例中，抗体通过接头和抗体之间的半胱氨酸-半胱氨酸二硫键与掩蔽部分偶联。在另一个实例中，抗体通过接头和抗体之间的肽键与掩蔽部分偶联。
在一些实施方案中，掩蔽部分可以不特异性结合抗体，而是仅通过一种或多种非特异性相互作用(例如空间位阻)干扰抗体与靶衰老细胞的结合。例如，掩蔽部分可以位于前体中，使得前体的结构允许掩蔽部分通过基于电荷的相互作用掩蔽抗体，从而将掩蔽部分保持在适当的位置以干扰对抗体上的结合位点的接近。
前体的接头位于掩蔽部分和抗体之间。接头包含切割位点(CS)，其中存在于衰老细胞的细胞外环境中的蛋白酶将切割接头以从前体释放掩蔽部分。然后抗体被暴露并且可用于结合靶衰老细胞。接头可以进一步包含一个或多个柔性区域(FR)，该柔性区域位于切割位点的一侧或两侧。例如，接头可具有以下结构：-FR-CS-FR-、-FR-CS-、-CS-FR-、-FR-FR-CS-、-CS-FR-FR-、-FR-FR-CS-FR-、-FR-CS-FR-FR-、-FR-FR-CS-FR-FR-。
柔性区域为掩蔽部分的构象提供了灵活性，以允许掩蔽部分到达抗体的结合位点并干扰其结合。柔性区域基本上由小氨基酸(例如甘氨酸、丝氨酸和丙氨酸)组成，所述氨基酸具有小的侧链以提供最大的柔韧性。甘氨酸和甘氨酸-丝氨酸聚合物相对非结构化，因此可以用作组分之间的中性系链。与丙氨酸相比，甘氨酸能获得明显更多的空间，并且与具有更长侧链的残基相比更少受到限制(参见Scheraga,Rev.ComputationalChem.,pp.11173-11142,1992)。
合适的柔性区域可以具有不同的长度，例如1个氨基酸至20个氨基酸，2个氨基酸至15个氨基酸，3个氨基酸至12个氨基酸，4个氨基酸至10个氨基酸，5个氨基酸至9个氨基酸，6个氨基酸至8个氨基酸，或7个氨基酸至8个氨基酸，并且长度可以是1、2、3、4、5、6或7个氨基酸。
示例性柔性区域包括甘氨酸聚合物(G)n，甘氨酸-丝氨酸聚合物(包括，例如，(GS)n(SEQ ID NO:14)、(GGS)n(SEQ ID NO:15)、(GSGGS)n(SEQ ID NO:16)、(GSGGS)n(SEQ IDNO:17)和(GGGS)n(SEQ ID NO:18))，其中n是至少为1的整数；甘氨酸-丙氨酸聚合物、丙氨酸-丝氨酸聚合物和本领域已知的其它柔性区域。柔性区域的更多实例包括GGSG(SEQ IDNO:19)、GGSGG(SEQ ID NO:20)、GSGSG(SEQ ID NO:21)、GSGGG(SEQ ID NO:22)、GGGSG(SEQID NO:23)和GSSSG(SEQ ID NO:24)、GSSGGSGGSGGSG(SEQ ID NO:25)、GSSGGSGGSGG(SEQ IDNO:26)、GSSGGSGGSGGS(SEQ ID NO:27)、GSSGGSGGSGGSGGGS(SEQ ID NO:28)、GSSGGSGGSG(SEQ ID NO:29)或GSSGGSGGSGS(SEQ ID NO:30)、GSSGT(SEQ ID NO:31)或GSSG(SEQ IDNO:32)。
切割位点是衰老细胞的细胞外环境中的蛋白酶的底物。切割位点通常作为接头的一部分包括在内。但是在一些情况下，切割位点可以是掩蔽部分的一部分，使得当前体处于抑制状态或未切割状态或掩蔽状态时，切割位点的全部或部分有助于掩蔽抗体。
可以基于衰老细胞的细胞外环境中的蛋白酶来选择切割位点。已知衰老细胞将蛋白酶(例如基质金属蛋白酶(MMP))分泌到其细胞外环境中。MMP家族成员的实例包括溶基质素-1和溶基质素-2(分别为MMP-3和MMP-10)和胶原酶-1(MMP-1)。其他MMP包括MMP1、MMP2、MMP7、MMP8、MMP9、MMP13和MMP14。这些蛋白酶的天然底物也是已知的，其可以帮助设计在前体中使用的切割位点。例如，这些MMP可以切割MCP-1、MCP-2和MCP-4以及IL-8。多种其他CXCL/CCL家族成员也可被MMP-9、MMP-2或MMP-7切割。丝氨酸蛋白酶也存在于衰老细胞的细胞外环境中。丝氨酸蛋白酶的成员包括尿激酶或组织型纤溶酶原激活物(分别为uPA或tPA)。参见Coppe et al.,“The Senescence-Associated Secretory Phenotype:The DarkSide of Tumor Suppression,”Annu Rev Pathol.,vol.5,pp.99–118,2010。
在一个示例性实施方案中，切割位点是基质金属蛋白酶的底物，因此可被MMP切割以释放掩蔽部分。在另一个实施方案中，切割位点是丝氨酸uPA或PSA的底物。在一些实施方案中，所述前体可包含一个以上的切割位点，并且每个切割位点可以是不同蛋白酶的底物。可以是蛋白酶的底物的示例性切割位点包括：ADAM10、ADAM12、ADAM17、ADAMTS、ADAMTS5、BACE、半胱天冬酶1-14、组织蛋白酶A、组织蛋白酶B、组织蛋白酶D、组织蛋白酶E、组织蛋白酶K、组织蛋白酶S、FAP、MT1-MMP、颗粒酶B、胍基苯甲酸酶、丝氨酸蛋白酶(Hepsin)、人中性粒细胞弹性蛋白酶、豆荚蛋白酶、蛋白裂解酶2、穿膜肽酶(Meprin)、MMP1-17、MT-SP1、脑啡肽酶、NS3/4A、纤溶酶、PSA、PSMA、TRACE、TMPRSS 3、TMPRSS 4和uPA。一些示例性切割位点是可以被MMP切割的PLGLWA(SEQ ID NO:33)和可以被胶原酶切割的GPQGIAGQ(SEQ ID NO:34)。切割位点的其他实例包括YGLLGIAGPPGP(SEQ ID NO:35)、SPGRVVRG(SEQ ID NO:36)、VRG(SEQ ID NO:37)。
在一些实施方案中，前体中的抗体本身是条件活性的。特别地，抗体本身在衰老细胞的细胞外环境中的条件下对其靶标的结合活性，与在正常生理条件下对该靶标的相同结合活性相比可以更高。一旦前体到达衰老细胞的细胞外环境，该前体通过以下所述提供了双重提高：通过(1)切割掩蔽部分以将抗体的结合位点从掩蔽部分释放出来，以及(2)在衰老细胞的细胞外环境中的条件下对靶标的结合活性与正常生理条件下的结合活性相比增加的抗体。
在一个实施方案中，条件活性蛋白是旨在与另一种药剂缀合的抗体。条件活性抗体在衰老细胞的细胞外条件下的活性与在正常生理条件下的活性的比值较高，该比值为至少约10:1，或至少约11:1，或至少约12:1，或至少约13:1，或至少约14:1，或至少约15:1，或至少约16:1，或至少约17:1，或至少约18:1，或至少约19:1，或至少约20:1，或至少约40:1，或至少约60:1，或至少约80:1，或至少约100:1。当缀合的药剂例如是有毒的或放射性的时，这可能是特别重要的，因为这种缀合的药剂理想地在患处或治疗部位处集中。
在一些实施方案中，缀合的药剂是D-反向-翻转肽(“DRI肽”)。由于反向序列中的D氨基酸，DRI肽可以维持氨基酸的侧链拓扑结构(类似于衍生该DRI肽的天然蛋白的侧链拓扑结构)。此外，DRI肽对蛋白水解降解更具抵抗力，因此倾向于具有比衍生该DRI肽的天然蛋白长得多的半衰期。此外，DRI肽具有与衍生该DRI肽的天然蛋白的结构相似的结构。最后，DRI肽具有与衍生该DRI肽的天然蛋白相当的生物利用度。因此，DRI肽可以是衍生该DRI肽的天然蛋白的功能性替代物，并且可以与衍生该DRI肽的天然蛋白竞争。因此，DRI肽被视为有前景的药剂。
FOXO4是决定受损细胞是否经历衰老或凋亡的分子枢纽(molecular pivot)。FOXO蛋白家族，包括FOXO1、FOXO3和FOXO4，受生长因子信号传导的负调控，但也可被氧化应激激活(Brunet,A.et al.,Science,vol.303,pp.2011-2015(2004)；de Keizer,P.L.et al.,Cancer Res,vol.70,pp.8526-8536(2010)；Essers,M.A.et al.,EMBO J.,vol.23,pp.4802-4812(2004))。组成型foxo1-/-小鼠是胚胎致死的并且foxo3-/-小鼠显示出生殖缺陷，但是foxo4-/-小鼠没有明显缺陷的表型(Hosaka,T.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A,vol.101,pp.2975-2980(2004)；Castrillon,D.H.et al.,Science,vol.301,pp.215-218(2003))。个别条件性体细胞foxo3-/-小鼠的寿命略有缩短，而条件性体细胞foxo1-/-和foxo4-/-则不是这样(Paik,J.H.et al.,Cell,vol.128,pp.309-323(2007))。体细胞三倍foxo1,3,4-/-小鼠显示淋巴瘤增大，因此表明在这方面FOXO蛋白在功能上是多余的(同上)。然而值得注意的是，单个体细胞foxo4-/-小鼠没有显示任何缩短的寿命，也没有显示无瘤生存率的任何变化。此外，与其对应物FOXO1和FOXO3不同，FOXO4 mRNA和蛋白表达响应于DNA损伤的衰老诱导水平而显著上升。
由电离辐射(XRAY)诱导的DNA损伤引起的衰老的特征在于形成持久性核灶，称为DNA-SCARS(或具有增强衰老的染色质改变的DNA片段)，其是生长停滞所需的(Rodier,F.etal.,J Cell Sci,vol.124,pp.68-81(2011))。在这些DNA损伤条件下，使用稳定的基于短发夹的RNA干扰(shRNA)导致FOXO4表达的丧失诱导细胞凋亡而不是衰老。这表明FOXO4是分子决定细胞衰老或细胞凋亡是否响应于基因毒性应激而发生的关键因素。
FOXO4抑制有利于衰老的细胞凋亡的机制涉及其与p53肿瘤抑制蛋白的物理结合。众所周知，p53在DNA损伤后调控细胞命运(Rodier,F.et al.,Nucleic Acids Res,vol.35,pp.7475-7484(2007))，并且是DNA-SCARS的主要成分(Rodier,F.et al.,Nat.Cell Biol.,vol.11,pp.973-979(2009))。p53可以诱导衰老以及细胞凋亡，这取决于其翻译后修饰及其相互作用配偶体(Vousden,K.H.et al.,Nat.Rev.Mol.Cell Biol.,vol.8,pp.275-283(2007))。当在Ser46上磷酸化时，p53强烈支持在细胞周期停止期间的细胞凋亡(Bulavin,D.V.et al.,EMBO J.,vol.18,pp.6845-6854(1999))。然而，Ser46响应于几种诱导衰老的刺激(包括活化的致癌基因)而被磷酸化(Feng,L.et al.,Cell Cycle,vol.5,pp.2812-2819(2006)；Bischof,O.et al.,EMBO J.,vol.21,pp.3358-3369(2002))。在DNA损伤条件下，p53的Ser46磷酸化升高并且干扰HIPK2激酶(其负责Ser46磷酸化)(Dauth,I.et al.,Cancer Res,vol.67,pp.2274-2279(2007))，损害由FOXO4耗尽引起的细胞凋亡反应。因此，FOXO4通过抑制有利于衰老的p53信号传导的凋亡功能来抑制衰老细胞中的细胞凋亡。抑制FOXO4，特别是其与p53的相互作用，将使衰老细胞转变为细胞凋亡。
人FOXO4蛋白具有两种变体(SEQ ID NO:1和2)。在一些实施方案中，FOXO4蛋白的任何片段可以用作设计FOXO4 DRI肽的基础。在一个实施方案中，FOXO4片段包含FOXO4蛋白的功能结构域的至少一部分，例如其DNA结合结构域(SEQ ID NO:3)或p53相互作用结构域(SEQ ID NO:4)。
可以抑制FOXO4的功能和/或干扰其与p53相互作用的任何FOXO4DRI肽可以用作条件活性抗体的缀合剂。特别地，三种FOXO4 DRI肽优选用于有效干扰FOXO4和p53之间的相互作用：LTLRKEPASE IAQSILEAYS QNGWANRRSG GKRP(SEQ ID NO:5)、LTLRKEPASE IAQSILEAYSQNGWANRRSG GKRPPPRRRQ RRKKRG(SEQ ID NO:6)和SEIAQSILEAYSQNGW(SEQ ID NO:7)。这三种FOXO4 DRI肽均由D氨基酸残基组成。这些FOXO4 DRI肽中的至少一些D氨基酸残基可以被L氨基酸残基取代，而不会明显降低它们在衰老细胞中诱导细胞凋亡的能力。这些FOXO4DRI肽干扰FOXO4和p53之间的相互作用，从而阻碍FOXO4抑制p53的功能，这导致衰老细胞中的细胞凋亡。
FOXO4本身受其他蛋白调控。参考图8所示，FOXO家族的成员，包括FOXO4在内，通过磷酸化或甲基化被其他蛋白激活(通过磷酸化被AMPK、JNK、MST1、CK1、STAT3、p38激活，通过甲基化被PRMT1激活)。应激激活的c-Jun N末端激酶(JNK)和能量感应AMP活化蛋白激酶(AMPK)在暴露于氧化和营养应激刺激后，使FOXO磷酸化并激活FOXO。任何激活FOXO4的蛋白可以是用于设计可用于本发明的DRI肽的基础(即天然或野生型蛋白)。在一些实施方案中，天然蛋白选自AMPK、JNK、MST1、CK1、STAT3、p38和PRMT1。
以JNK蛋白为例。JNK是一种c-Jun N末端激酶，其可以磷酸化并激活FOXO4。人JNK具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列。基于JNK蛋白的DRI肽可以通过使用竞争机制阻断对其底物的接近来变构和选择性地调控JNK(Bonny,C.et al.Diabetes,vol.50,pp.77-82(2001)；Borsello,T.et al.Trends Mol Med,vol.10,pp.239-244,(2004)；and Borsello,T.etal.Nat Med,vol.9,pp.1180-1186,(2003))。一种示例性JNK DRI肽是DQSRPVQPFLQLTTPRKP(SEQ ID NO:9)。
此外，AMPK、JNK、MST1、CK1、STAT3、p38和PRMT1的激活剂也可用作设计DRI肽的天然蛋白。例如，ASK1是凋亡信号调节激酶1，其激活JNK。人ASK1具有GenBank登录号NP_005914。ASK1蛋白可以是用于设计DRI肽的天然蛋白。这种DRI肽可以抑制ASK1，从而抑制JNK的活性，这将导致FOXO4的抑制。
在一些实施方案中，用于设计本发明的DRI肽的天然蛋白是人蛋白，例如人FOXO4、AMPK、JNK、MST1、CK1、STAT3、p38、PRMT1和ASK1。在一些其他实施方案中，用于设计本发明DRI肽的天然蛋白是哺乳动物蛋白，例如灵长类动物或小鼠蛋白FOXO4、AMPK、JNK、MST1、CK1、STAT3、p38、PRMT1和ASK1。通常理解的是，直系同源蛋白也可以在另一物种中起作用，这意味着基于直接同源(ortholog)设计的DRI肽可以在另一物种中起作用。例如，基于小鼠FOXO4设计的DRI肽可能在人FOXO4上起作用，因此可以用作本发明的缀合物，用于诱导人体衰老细胞的凋亡。
在一个实施方案中，天然蛋白的片段用于设计DRI肽。在另一个实施方案中，天然蛋白的全长用于设计DRI肽。在这些实施方案中，DRI肽的氨基酸序列与天然蛋白FOXO4、AMPK、JNK、MST1、CK1、STAT3、p38、PRMT1和ASK1的片段或全长的氨基酸序列完全相反。
在一些实施方案中，DRI肽的氨基酸序列与天然蛋白FOXO4、AMPK、JNK、MST1、CK1、STAT3、p38、PRMT1和ASK1的片段或全长的氨基酸序列不完全相反。在此类实施方案中，DRI肽的氨基酸序列与天然蛋白的片段或全长的反向序列可具有至少51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。
DRI肽可以是例如小肽，用于使DRI肽进入衰老细胞。在一些实施方案中，DRI肽含有5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100或者更多个氨基酸残基。
尽管在一些实施方案中DRI肽全部由D氨基酸残基组成，但一些功能性DRI肽可含有L-氨基酸残基和D氨基酸残基的组合。在一些实施方案中，DRI肽中至多1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、35％、40％、45％、50％、55％或60％的氨基酸残基为L氨基酸残基。
在一些实施方案中，DRI肽可进一步包含一个或多个功能结构域，其不是用作设计DRI肽的基础的天然蛋白的一部分。在一个实施方案中，DRI肽包含序列“PPRRRQRRKKRG”(SEQ ID NO:10)，其促进DRI肽进入衰老细胞以诱导细胞凋亡。技术人员应理解该功能结构域可以被促进DRI肽进入衰老细胞的任何其他蛋白结构域替代。
可以包括在DRI肽中的一些其他功能结构域包括细胞可渗透肽(“CPP”)，例如原发性两亲性肽MPG(GALFLGFLGA AGSTMGAWSQ PKKKRKV，SEQ ID NO:11)、Pep-1(KETWWETWWTEWSQPKKKRKV,SEQ ID NO:12)、继发性两亲性肽CADY(Ac-GLWRALWRLLRSLWRLLWRA-Cya,SEQID NO:13)或八精氨酸(R(8))。
DRI肽中的功能结构域本身不具有任何凋亡诱导活性，但可用于增加DRI肽的另一部分的凋亡诱导活性。功能结构域包含至少1、2、3、4、5、6、7或10个D氨基酸残基，更优选功能结构域的所有氨基酸残基都是D氨基酸残基。
如果DRI肽可杀灭、清除、去除、灭活或降低衰老细胞的活力，则根据本发明的DRI肽在衰老细胞中具有凋亡诱导活性。在一些实施方案中，DRI肽可杀灭、清除、去除、灭活或降低衰老细胞培养物中至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％的细胞的活力。
在一些实施方案中，DRI肽在衰老细胞中选择性地表现出凋亡诱导活性，因此在非衰老细胞中具有很低的凋亡诱导活性或没有凋亡诱导活性。DRI肽在衰老细胞中的凋亡诱导活性与在非衰老细胞中的凋亡诱导活性之比至少为1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.5、3、4、5、6、7、8、9、10或更高。
利用一般常识，本领域技术人员可以通过标准体外试验评估本发明的DRI肽是否在衰老细胞中表现出凋亡诱导活性。例如，通过使细胞培养物经受电离辐射或化学治疗剂处理然后与非衰老细胞混合，可以获得衰老细胞的细胞培养物。提供衰老细胞的其他方法是(i)连续传代直至发生复制衰老(＝端粒缩短)，(ii)通过使用氧化应激物，例如H2O2和鱼藤酮，(iii)染色质重塑物例如二丁酸钠，或(iv)表达过度活化的致癌基因，例如RASG12V或BRAFV600E。通过测试SA-B-GAL可以确定衰老细胞的存在。
第二步是向细胞培养物施用本发明的肽并测量一种或多种凋亡标志物，例如(i)细胞质细胞色素C染色或(ii)TUNEL染色。细胞色素C数据可以通过对细胞(其中细胞色素C已从线粒体释放到胞质溶胶中)的数量计数(DAPI可用于指示细胞)或者(在后期阶段)对完全消失的细胞的数量计数来量化。该测试可以在半胱天冬酶抑制剂的存在下进行，使得即将发生凋亡的细胞(由细胞色素C释放到胞质溶胶指示)不会发生实际死亡，因为细胞死亡需要半胱天冬酶。该测试的益处在于可以获得几天(例如5天)内衰老量的累积计数。在TUNEL染色中，计数TUNEL染色阳性的细胞核(DAPI阳性)的百分比。这可以通过眼睛轻松完成，但也可以使用名为Cellprofiler(免费软件)的软件工具。
在一些实施方案中，条件活性蛋白包含与肽接头共价键合的前药，所述肽接头又与条件活性蛋白缀合。前药是与肽接头缀合的药物。由于存在共价键合的肽接头，药物不是活性形式。肽接头可以在衰老细胞的细胞外环境中被蛋白酶切割，从而以活性形式从条件活性蛋白中释放共价键合的药物。
药物和条件活性蛋白之间的肽接头可以包含与本申请中描述的前体中使用的相同的切割位点(例如，具有SEQ ID NO:33-37的切割位点)。在衰老细胞的细胞外环境中能够释放前体中的抗体的相同蛋白酶也会切割肽接头，以在衰老细胞的细胞外环境中从条件活性蛋白以释放活性形式的前药。
在一些实施方案中，肽接头可以被酶(豆荚蛋白酶)切割。这种肽接头包含豆荚蛋白酶的切割位点。一些示例性切割位点是：PTN(SEQ ID NO:38)、PNN(SEQ ID NO:39)、PAN(SEQ ID NO:40)、PPN(SEQ ID NO:41)、TTN(SEQ ID NO:42)、TNN(SEQ ID NO:43)、TAN(SEQID NO:44)、TPN(SEQ ID NO:45)、NTN(SEQ ID NO:46)、NNN(SEQ ID NO:47)、NAN(SEQ IDNO:48)、NPN(SEQ ID NO:49)、ATN(SEQ ID NO:50)、ANN(SEQ ID NO:51)、AAN(SEQ ID NO:52)、APN(SEQ ID NO:53)、TTNL(SEQ ID NO:54)、TTNA(SEQ ID NO:55)、PTNL(SEQ ID NO:56)、PTNA(SEQ ID NO:57)、PNNL(SEQ ID NO:58)、PNNA(SEQ ID NO:59)、TNNL(SEQ ID NO:60)、TNNA(SEQ ID NO:61)、NK(SEQ ID NO:62)、NL(SEQ ID NO:63)、NA(SEQ ID NO:64)、NE(SEQ ID NO:65)、ND(SEQ ID NO:66)和NN(SEQ ID NO:67).
与前药中的肽接头共价键合的药物可以是细胞毒性药物、细胞抑制药物或抗增殖药物。这些药物的例子如下：
生物碱：多西紫杉醇、依托泊苷、伊立替康、紫杉醇、替尼泊苷、拓扑替康、长春碱、长春新碱、长春地辛。
烷化剂：白消安、英丙舒凡、哌泊舒凡、苯佐替派、卡波醌、美妥替哌、乌瑞替哌、六甲蜜胺、曲他胺、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代磷酰胺、苯丁酸氮芥、Chloranaphazine、环磷酰胺、雌氮芥、异环磷酰胺、氮芥、盐酸甲氧氮芥、美法仑，Novemebichin、培磷酰胺苯芥胆甾醇(Perfosfamide Phenesterine)、泼尼氮芥、曲磷胺、尿嘧啶芥末、卡莫司汀、氯脲霉素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀、司莫司汀、雷莫司汀、达卡巴嗪、甘露莫司汀、二溴甘露醇、二溴卫矛醇、哌泊溴烷、替莫唑胺。
抗生素和类似物：阿克那霉素、放线菌素(Actinomycins)、安曲霉素、重氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素C(Cactinomycin)、卡柔比星、嗜癌菌素(Carzinophilin)、色霉素、放线菌素D(Dactinomycins)、柔红霉素、6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸、阿霉素、表柔比星、伊达比星、美诺立尔、丝裂霉素、霉酚酸、诺加拉霉素(Nogalamycine)、橄榄霉素、培洛霉素、吡柔比星、普卡霉素、甲基丝裂霉素、嘌呤霉素、链黑菌素、链脲霉素、杀结核菌素、净司他丁、佐柔比星。
抗代谢药：二甲叶酸、依达曲沙、甲氨蝶呤、吡曲克辛、蝶罗呤、雷替曲塞、三甲曲沙、克拉曲滨(Cladridine)、氟达拉滨(Fludarabine)、6-巯基嘌呤、喷司他丁(Pentostatine)硫咪嘌呤(Thiamiprine)、硫鸟嘌呤、安西他滨、阿扎胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖孢苷、去氧氟尿苷、乙嘧替氟、氟尿苷、氟尿嘧啶、吉西他滨、喃氟啶(Tegafur)；
铂络合物：卡铂、顺铂、米铂、奥沙利铂；
其他药物：醋葡醛内酯、安吖啶、比生群(Bisantrene)、芥磷胺(Defosfamide)、秋水仙胺、亚丝醌、依洛尼塞、依利醋铵、依托格鲁、足叶乙甙、芬维A胺(Fenretinide)、硝酸镓、羟基脲(Hdroxyurea)、氯尼达明、米替福新、米托胍腙(Mitoguazone)、米托蒽醌、莫哌达醇、硝基可润(Nitracrine)、喷司他丁(Pentostatin)、苯来美特(Phenamet)、鬼臼酸2-乙基酰肼(Podophillinic acid 2-Ethyl-Hydrazide)、丙卡巴肼、雷佐生(Razoxane)、索布佐生(Sobuzoxane)、锗螺胺(Spirogermanium)、替尼泊甙(Teniposide)细偶氮酸(Tenuazonicacid)、三亚胺醌(Triaziquone)、2,2',2”-三氯三乙胺、氨基甲酸乙酯(Urethan)。
与前药中的肽接头共价键合的药物也可以是化学治疗药物。化学治疗药物可能以不同的方式抑制衰老细胞。化学治疗药物可通过烷基化、交联或DNA的双链切割来破坏DNA模板。其他化学治疗药物可通过插入来阻断RNA合成。一些化学治疗药物是纺锤体毒物，或抑制酶活性的抗代谢药，或激素剂和抗激素剂。化学治疗药物可选自各种药剂，包括但不限于烷化剂、抗代谢药、抗肿瘤抗生素、长春花生物碱、表鬼臼毒素、亚硝基脲、激素剂和抗激素剂以及毒素。一些例子如下：
烷化剂的实例包括环磷酰胺、苯丁酸氮芥、白消安、美法仑、噻替哌(thiotepa)、异环磷酰胺(ifosphamide)、氮芥。
抗代谢药的实例包括甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、胞嘧啶阿拉伯糖苷、6-硫鸟嘌呤、6-巯基嘌呤。
抗肿瘤抗生素的实例包括多柔比星、柔红霉素、阿霉素、尼莫西诺酮、放线菌素、博来霉素、丝裂霉素、普利卡霉素。
长春花生物碱和表鬼臼毒素的实例包括长春新碱、长春碱、长春花碱、依托泊苷、替尼泊苷。
亚硝基脲的实例包括卡莫司汀(carmustin)、洛莫司汀(lomustin)、司莫司汀(semustin)、链脲霉素。
激素剂和抗激素剂的实例包括肾上腺皮质激素、雌激素、抗雌激素、孕激素、芳香酶抑制剂、雄激素、抗雄激素。
无规合成剂的实例包括达卡巴嗪、六甲基三聚氰胺、羟基脲、米托坦、丙卡巴肼、顺铂、卡铂。
另一方面，本发明提供条件活性分子或条件活性药物(CAM)，其在异常条件下比在正常生理条件下更具活性。条件活性分子是有机化合物和/或其盐，其衍生自分子量小于约3000a.m.u.的母体有机化合物。母体有机化合物可以是分子量为约100a.m.u.至约1500a.m.u.，或约150a.m.u.至约1250a.m.u.，或约300a.m.u.至约1100a.m.u.，或约400a.m.u.至约1000a.m.u.的治疗活性化合物。
母体有机化合物可选自由抗癌剂、抗菌剂、免疫调节剂、抗肥胖药、抗糖尿病药、抗真菌剂、抗病毒剂、避孕药、镇痛药、抗炎药(例如类固醇或非甾体抗炎药(NSAID))、止吐药、血管舒张剂、血管收缩剂和心血管药。特别地，母体化合物可包括但不限于抗癌剂，例如阿扎胞苷、苯达莫司汀、硼替佐米、顺铂、卡铂、环磷酰胺、卡莫司汀、柔红霉素、多柔比星、依托泊苷、氟达拉滨、吉西他滨、美法仑、丝裂霉素、奥沙利铂、培美曲塞、喷司他丁、链脲佐菌素、噻替哌、托泊替康或长春碱；细胞保护剂，例如氨磷汀；抗菌剂，例如替加环素、强力霉素、氯霉素、阿奇霉素或头孢唑啉；抗真菌剂，例如卡泊芬净、米卡芬净、阿尼芬净或伏立康唑；抗病毒剂，例如阿昔洛韦或更昔洛韦；抗精神病药物，例如硫代噻吩或咪达唑仑；抗溃疡剂，例如埃索美拉唑、兰索拉唑或泮托拉唑；镇痛药，例如安乃近(Metamizole)、氢吗啡酮或瑞芬太尼；抗炎药，例如氢化可的松、甲基强的松龙、吲哚美辛、酮洛芬或帕瑞考昔；免疫调节剂，例如甲氨蝶呤；止吐药，例如阿瑞匹坦、多拉司琼(dolasetron)、福沙吡坦、格拉司琼、昂丹司琼、甲氧氯普胺、hycosine或异丙嗪；心血管药，例如阿替洛尔、多巴酚丁胺或依前列醇；麻醉剂，例如美索比妥；及其药学上可接受的盐、或其组合。
在一些实施方案中，本发明提供了由母体有机化合物产生条件活性分子的方法。该方法包括通过引入一个或多个带电荷的基团来修饰母体有机化合物以产生经修饰的有机化合物的步骤；将经修饰的有机化合物在正常生理条件下进行测试并在异常条件下进行测试；从在异常条件下与正常生理条件下相比，表现出更高的活性的经修饰的有机化合物中选择条件活性分子。
母体有机化合物的修饰可以通过用一个或多个部分带电的或带电的基团取代母体有机化合物上的一个或多个不带电的和/或部分带电的基团，或通过向母体有机化合物添加一个或多个部分带电的或带电的基团来实现。向母体有机化合物添加一个或多个部分带电的或带电的基团可以通过用一个或多个部分带电的或带电的基团取代一个或多个原子(例如母体有机化合物上的氢原子或中性基团)来修饰。部分带电的或带电的基团可带正电或带负电。合适的带电的基团的实例包括但不限于–COO-、-SO3 -、-PO4 -、-PO3 -、-PO2 -、-BO3 -、-NH2 +、-NH3 +和其他带电的基团。合适的部分带电的基团的实例包括极性基团或极性侧链。
在其他实施方案中，可通过从母体有机化合物中去除一个或多个部分带电的或带电的基团来修饰母体有机化合物。
将生成的经修饰的有机化合物在正常生理条件下进行测试，并在异常条件下进行测试。在一些实施方案中，异常条件是衰老细胞的细胞外条件的值，例如pH范围为约5.0至小于7.0，或约5.5至小于7.0，或约6.0至小于7.0，或约6.2至约6.8。正常生理条件是正常细胞的细胞外环境中的条件的不同值，例如pH范围为约7.0至约7.8，或约7.2至约7.8，或约7.2至约7.6。
在两种测试中测量经修饰的有机化合物的活性。条件活性分子可以选自具有以下至少一种特性的经修饰的有机化合物：
(a)在所述正常生理条件下的测试中的活性与相同测试中的所述亲本蛋白的相同活性相比降低，而在所述异常条件下的测试中的活性与在所述正常生理条件下的测试中的所述条件活性蛋白的相同活性相比增加；和
(b)在所述正常生理条件下的测试中的活性与相同测试中的所述亲本蛋白的相同活性相比降低，而在所述异常条件下的测试中的活性与所述异常条件下的测试中的所述亲本蛋白的相同活性相比增加。用于异常条件下的测试和正常生理条件下的测试的测试溶液也可含有上述小分子和/或物质。
在异常条件和正常生理条件下的两种测试中测量的活性可以是分子与其靶标的结合活性。
在某些实施方案中，条件活性分子在异常条件下的活性与在正常生理条件下的活性的比大于1.0(例如，两种条件之间的较大的选择性)。活性比可以是至少约1.3:1，或至少约2:1，或至少约3:1，或至少约4:1，或至少约5:1，或至少约6:1，或至少约7:1，或至少约8:1，或至少约9:1，或至少约10:1，或至少约11:1，或至少约12:1，或至少约13:1，或至少约14:1，或至少约15:1，或至少约16:1，或至少约17:1，或至少约18:1，或至少约19:1，或至少约20:1，或至少约30:1，或至少约40:1，或至少约50:1，或至少约60:1，或至少约约70:1，或至少约80:1，或至少约90:1，或至少约100:1。
可以如WO 2016/138071中所述进一步工程化改造条件活性蛋白。条件活性蛋白可以通过抗体缀合进行工程化，可以工程化以产生多特异性抗体，工程化以产生针对免疫效应细胞表面抗原的双特异性条件活性抗体，工程化以产生掩蔽的条件活性蛋白；和/或可工程化抗体的Fc区域，分别如WO 2016/138071中所述。条件活性蛋白也可用于工程化条件活性病毒颗粒，如WO 2015/175375中所述。
哺乳动物免疫系统使用T细胞来对抗具有外来抗原的物质或细胞。CAR-T技术使用基因工程方法通过将嵌合抗原受体(CAR)插入T细胞来对自然循环的T细胞进行重编程，以产生高度特异性的CAR-T细胞，其中CAR通过特异性结合靶组织表面上的抗原将工程化的CAR-T细胞导向靶组织。因此，CAR-T细胞可以特异性靶向肿瘤细胞，使CAR-T细胞比自然循环的T细胞更有效。可以将CAR-T细胞工程化以靶向衰老细胞。
本发明的CAR包括至少一个抗原特异性靶向区域(ASTR)、细胞外间隔区结构域(ESD)、跨膜结构域(TM)、一个或多个共刺激结构域(CSD)和细胞内信号传导结构域(ISD)，参见图3和Jensen et al.,“Design and implementation of adoptive therapy withchimeric antigen receptor-modified T cells,”Immunol Rev.,vol.257,pp.127–144,2014。在ASTR特异性结合靶抗原后，ISD激活CAR-T细胞中的细胞内信号传导。例如，ISD可以利用抗体的抗原结合特性，以非MHC限制的方式将CAR-T细胞特异性和反应性重定向到选定的靶标。非MHC限制性抗原识别赋予CAR-T细胞识别衰老细胞并启动抗原加工的能力。在一个实施方案中，ESD和/或CSD是可选的。在另一个实施方案中，ASTR具有双特异性，这允许其与两种不同的抗原或表位特异性结合。本发明的条件活性蛋白可以被工程化为ASTR或其部分，以使CAR在衰老细胞的细胞外环境中更具活性。此类CAR可以优先将T细胞递送至衰老细胞，从而明显降低由T细胞攻击正常组织引起的副作用。这允许使用更高剂量的T细胞以增加治疗功效并改善个体对治疗的耐受性。
ASTR可包含条件活性蛋白，例如抗体，尤其是单链抗体，或与衰老细胞上的抗原特异性结合的抗体片段。适用于ASTR的蛋白的一些实例包括连接的细胞因子(其使得可识别具有细胞因子受体的细胞)、亲和体、来自天然存在的受体的配体结合结构域、以及衰老细胞上的受体的可溶性蛋白/肽配体。
在一些实施方案中，本发明的CAR包括至少两种ASTR，其靶向至少两种不同的抗原或同一抗原上的两种表位。在一个实施方案中，CAR包括靶向至少三种或更多种不同的抗原或表位的三种或更多种ASTR。当CAR中存在多个ASTR时，ASTR可以串联排列并且可以通过接头肽分隔开(图3)。
在另一个实施方案中，ASTR包括双链抗体(diabody)。在双链抗体中，创建具有接头肽的scFv，所述接头肽太短以至于两个可变区不能折叠在一起，从而驱使scFv二聚化。更短的接头(一个或两个氨基酸)导致形成三聚体，即所谓的三链抗体(triabody)或三抗体(tribody)。四链抗体也可用于ASTR。
靶抗原包括在衰老细胞上发现的表面蛋白，例如上文讨论的表面蛋白。
在一些实施方案中，细胞外间隔区结构域和跨膜结构域可以是泛素化抗性的(ubiquitylation-resistant)，这可以增强CAR-T细胞信号传导并因此增强其活性(Kuniiet la.,“Enhanced function of redirected human t cells expressing linker foractivation of t cells that is resistant to ubiquitylation,”Human GeneTherapy,vol.24,pp.27–37,2013)。在该区域内，细胞外间隔区结构域位于CAR-T细胞之外，因此暴露于不同条件下并且可能有条件地产生泛素化抗性。
如WO 2016/138071中详细描述的，本发明的条件活性蛋白可以包括在用于人类药物或诊断用途的药物组合物、医疗装置、试剂盒或制品中。
本发明的条件活性蛋白和药物组合物可用于在有需要的个体中治疗与衰老细胞相关的疾病和病症，包括与年龄相关的疾病和病症。可通过施用本文所述的条件活性蛋白或药物组合物治疗的与衰老细胞相关的病症、紊乱或疾病的实例包括认知疾病(例如，轻度认知障碍(MCI)、阿尔茨海默氏病和其他痴呆；亨廷顿氏病)；心血管疾病(例如动脉粥样硬化、心脏舒张功能障碍、主动脉瘤、心绞痛、心律失常、心肌病、充血性心力衰竭、冠状动脉疾病、心肌梗塞、心内膜炎、高血压、颈动脉疾病、外周血管疾病、心脏应激反应、心肌纤维化)；代谢疾病和病症(例如，肥胖、糖尿病、代谢综合征)；神经疾病和病症，包括神经退行性疾病和病症(例如帕金森病、运动神经元功能障碍(MND))；脑血管疾病；肺气肿；良性前列腺肥大；肺部疾病(例如，特发性肺纤维化、慢性阻塞性肺病(COPD)、肺气肿、阻塞性细支气管炎、哮喘)；肺功能不全；炎症/自身免疫疾病和病症(例如，骨关节炎、湿疹、牛皮癣、骨质疏松症、粘膜炎、移植相关疾病和病症)；眼科疾病或病症(例如，年龄相关性黄斑变性、白内障、青光眼、视力丧失、老花眼)；糖尿病性溃疡；转移；化疗副作用，放疗副作用；与衰老相关的疾病和障碍(例如，驼背、肾功能衰竭或功能障碍、虚弱、脱发、听力丧失、肌肉疲劳、皮肤状况、肌肉减少症和椎间盘突出症)和衰老引起的其他与年龄相关的疾病(例如，辐射、化学暴露、吸烟、高脂肪/高糖饮食和环境因素引起的疾病/紊乱)；伤口愈合；皮肤痣和纤维化疾病和病症(例如，囊性纤维化、肾纤维化、肝纤维化、肺纤维化、口腔粘膜下纤维化、心脏纤维化和胰腺纤维化)。
在更具体的实施方案中，提供了通过施用条件活性蛋白或药物组合物，杀死或去除患有与衰老细胞相关的疾病或病症的个体中与该疾病或病症相关的衰老细胞(即，已成熟的衰老细胞)来治疗与衰老细胞相关的疾病或病症的方法。通过。在某些示例性实施方案中，本发明用于治疗骨关节炎、特发性肺纤维化、慢性阻塞性肺病(COPD)或动脉粥样硬化。
可以受益于使用本文所述的包括施用条件活性蛋白或药物组合物的方法的受试者(即，患者、个体(人或非人动物))包括那些也可能患有癌症的受试者。通过这些方法治疗的受试者可被认为是部分缓解或完全缓解(也称为癌症缓解)。如本文详细讨论的，用于选择性杀死或去除衰老细胞的方法中的条件活性蛋白或药物组合物不旨在用于治疗癌症，即以统计学上显著的杀死或破坏癌细胞的方式。因此，本文公开的方法不包括以被认为是治疗癌症的主要疗法的方式使用条件活性蛋白或药物组合物。尽管单独或与其他化学治疗剂或放射治疗剂一起使用的条件活性蛋白不以足以被视为主要癌症疗法的方式使用，但本文所述的条件活性蛋白或药物组合物可以以一种用于抑制转移的方式(例如，短期疗程)使用。在某些实施方案中，将用条件活性蛋白或药物组合物治疗的受试者不患有癌症(即，受试者未被医学领域的技术人员诊断为患有癌症)。
心血管疾病和病症
由条件活性蛋白或药物组合物治疗的衰老细胞相关的疾病或病症可以是心血管疾病。心血管疾病可以是心绞痛、心律失常、动脉粥样硬化、心肌病、充血性心力衰竭、冠状动脉疾病、颈动脉疾病、心内膜炎、心脏病发作(冠状动脉血栓形成、心肌梗塞)、高血压/血压高、主动脉瘤、脑动脉瘤、心脏纤维化、心脏舒张功能障碍、高胆固醇血症/高脂血症、二尖瓣脱垂、外周血管疾病(例如外周动脉疾病)、心脏应激抵抗和中风中的任何一种或多种。
在某些实施方案中，提供了用于治疗与动脉硬化(即动脉的硬化)相关或由其引起的衰老细胞相关的心血管疾病的方法。心血管疾病可以是动脉粥样硬化(例如，冠状动脉疾病(CAD)和颈动脉疾病)、心绞痛、充血性心力衰竭和外周血管疾病(例如外周动脉疾病(PAD))中的任何一种或多种。治疗与动脉硬化相关或由动脉硬化引起的心血管疾病的方法可以降低发生高血压/血压高、心绞痛、中风和心脏病发作(即冠状动脉血栓形成、心肌梗塞(MI))的可能性。在某些实施方案中，提供了用于稳定受试者的血管(例如动脉)中的动脉粥样硬化斑块的方法，从而降低血栓形成事件发生的可能性或延迟血栓形成事件(例如中风或心肌梗塞)的发生。在某些实施方案中，包括施用条件活性蛋白的这些方法可减少(即，降低)受试者的血管(例如，动脉)中的动脉粥样硬化斑块的脂质含量和/或增加纤维帽厚度(即，增加、增强或促进纤维帽的增厚)。
在一个实施方案中，提供了通过施用条件活性蛋白或药物组合物来抑制动脉粥样硬化斑块形成(或减少、缩减、降低动脉粥样硬化斑块形成)的方法。在其他实施方案中，提供了用于减少(降低、缩减)斑块的量(即水平)的方法。血管(例如，动脉)中斑块的量的减少可以通过例如斑块表面积的减少，或者通过血管(例如，动脉)阻塞的范围或程度(例如，百分比)来确定，这可以通过血管造影或心血管技术中使用的其他可视化方法来确定。本文还提供了用于增加存在于受试者的一个或多个血管(例如，一个或多个动脉)中的动脉粥样硬化斑块的稳定性(或改善、促进、增强稳定性)的方法，该方法包括向受试者施用条件活性蛋白或药物组合物。
用于治疗或预防心血管疾病(例如，动脉粥样硬化)的条件活性蛋白或药物组合物的有效性(即，减少或降低心血管疾病的发展或发生的可能性)可由医学和临床技术领域的技术人员容易地确定。可以使用包括以下所述中的一种或任何组合的诊断方法来监测受试者的健康状况：身体检查、临床症状的评估和监测，以及执行本文所述和本技术领域中实施的分析检测和方法(例如，血管造影、心电图、压力测试、非压力测试)。可以使用本领域已知的技术分析条件活性蛋白或药物组合物的治疗效果，例如将接受治疗的患有心血管疾病或有患心血管疾病风险的患者的症状与没有接受这种治疗的或者接受安慰剂治疗的患者的症状相比较。
炎症和自身免疫性疾病和疾病
在某些实施方案中，衰老细胞相关的疾病或病症是炎性疾病或病症，例如作为非限制性实例，可根据本文所述的包括施用条件活性蛋白或药物组合物的方法来治疗或预防骨关节炎(即，降低发生的可能性)。其他炎症或自身免疫性疾病或病症包括骨质疏松症、牛皮癣、口腔粘膜炎、类风湿性关节炎、炎性肠病、湿疹、驼背、椎间盘突出症、肺部疾病、COPD和特发性肺纤维化。
出乎意料的是，通过选择性杀死衰老细胞，条件活性蛋白或药物组合物可降低关节中蛋白多糖层的损失或侵蚀发生的可能性、减少或抑制关节中蛋白多糖层的损失或侵蚀，减少受影响关节中的炎症，并促进(即，刺激、增强、诱导)胶原蛋白(例如，2型胶原蛋白)的产生。去除衰老细胞可导致关节中产生的炎性细胞因子(例如IL-6)的量(即水平)降低，并且减少炎症。本文提供了通过给有需要的受试者施用至少一种条件活性蛋白，通过选择性地杀死或去除可能位于受试者的患骨关节炎的关节中的衰老细胞，和/或通过在受试者的关节中诱导胶原(例如2型胶原)的产生来治疗骨关节炎的方法。条件活性蛋白还可用于降低(抑制、减少)金属蛋白酶13(MMP-13，其降解关节中的胶原蛋白)的产生，并用于恢复蛋白多糖层或抑制蛋白多糖层的损失和/或降解。因此，用条件活性蛋白或药物组合物治疗可以预防或减少骨骼侵蚀发生的可能性，抑制或减少骨骼侵蚀或延缓骨骼侵蚀。如本文详细描述的，在某些实施方案中，将条件活性蛋白或药物组合物直接施用于(例如，通过关节内、外部、透皮、皮内或皮下递送)患骨关节炎的关节。用条件活性蛋白或药物组合物治疗还可以恢复、改善或抑制关节强度的恶化。此外，包括施用条件活性蛋白或药物组合物的方法可以减轻关节疼痛，因此可用于患骨关节炎关节的疼痛控制。
用于在受试者中治疗或预防骨关节炎的一种或多种条件活性蛋白的有效性和对接受一种或多种衰老细胞溶解剂的受试者的监测可由医学和临床技术领域的技术人员容易地确定。可以使用包括以下所述中的一种或任何组合的诊断方法来监测受试者的健康状况：身体检查(例如确定受影响关节的压痛、肿胀或发红)、临床症状(例如疼痛、僵硬、活动性)的评估和监测，以及执行本文所述和本技术领域中实施的分析测试和方法(例如，确定炎性细胞因子或趋化因子的水平；X射线图像以确定如关节中骨之间的空间变窄所示的软骨损失；磁共振成像(MRI)，提供详细的骨和软组织(包括软骨)的图像)。可以通过将已接受治疗的患有炎性疾病或病症(例如骨关节炎)或有此患病风险的患者的症状与没有接受过这种治疗的或接受了安慰剂治疗的患者的症状相比较来分析一种或多种衰老细胞溶解剂的治疗效果。
在某些实施方案中，条件活性蛋白或药物组合物可用于治疗和/或预防(即降低或减少发生的可能性)类风湿性关节炎(RA)。
慢性炎症也可能导致其他与年龄相关或老化相关的疾病和病症，例如驼背和骨质疏松症。驼背与细胞衰老有关。可以在本领域中使用的临床前动物模型中确定衰老细胞溶解剂治疗驼背的能力。举例来说，TTD小鼠发生驼背(参见，例如，de Boer et al.Science,vol.296,pp.1276-1279,2002)；可以使用的其他小鼠包括BubRlH/H小鼠，已知该小鼠也会发生驼背(参见，例如，Baker et al.Nature,vol.479,pp.232-36,2011)。随时间目测测量驼背形成。通过用衰老细胞溶解剂治疗而降低的衰老细胞的水平可以通过检测一种或多种衰老细胞相关标志物的存在(例如通过SA-P-Gal染色)来确定。
在其他实施方案中，可用本文所述的条件活性蛋白或药物组合物治疗或预防(即，发生的可能性降低)的炎性/自身免疫性病症包括肠易激综合征(IBS)和炎性肠病，例如溃疡性结肠炎和克罗恩病。根据本领域常规实施的方法和诊断测试进行疾病的诊断和监测，包括血液检测、结肠镜检查、柔性乙状结肠镜检查、钡灌肠、CT扫描、MRI、内窥镜检查和小肠成像。
在其他实施方案中，本文描述的方法可用于治疗患有椎间盘突出的受试者。患有椎间盘突出的受试者表现出血液和血管壁中细胞衰老的升高(参见例如，Roberts etal.Eur.Spine J.,15Suppl 3:S312-316,2006)。在衰老和退化的椎间盘组织中也发现促炎分子和基质金属蛋白酶水平增加，表明衰老细胞的作用(参见例如，Chang-Qing etal.Ageing Res.Rev.,vol.6,pp.247-61,2007)。动物模型可用于表征衰老细胞溶解剂在治疗椎间盘突出中的有效性；通过压缩和椎间盘强度升高在小鼠中诱导的椎间盘退变(参见例如，Lotz et al.Spine,vol.23,pp.2493-506,1998)。
可通过使用条件活性蛋白或药物组合物治疗或预防(即，发生的可能性降低)的其他炎症或自身免疫性疾病包括湿疹、牛皮癣、骨质疏松症和肺病(例如，慢性阻塞性肺病(COPD)、特发性肺纤维化(IPF)、哮喘)、炎性肠病和粘膜炎(包括口腔粘膜炎，在某些情况下由辐射诱导)。可以使用条件活性蛋白或药物组合物治疗器官的某些纤维变性或纤维化病症，例如肾纤维化、肝纤维化、胰腺纤维化、心脏纤维化、皮肤伤口愈合和口腔粘膜下纤维化。
在某些实施方案中，衰老细胞相关的病症是皮肤的炎性病症，例如作为非限制性实例，可以用包括施用条件活性蛋白或药物组合物的本文所述的方法治疗或预防(即，发生的可能性降低)的牛皮癣和湿疹。用于治疗牛皮癣和湿疹的条件活性蛋白或药物组合物的有效性以及对接受这种治疗的受试者的监测可以由医学或临床技术领域的技术人员容易地确定。包括以下所述中的一种或任何组合的诊断方法：身体检查(例如皮肤外观)、临床症状(例如瘙痒、肿胀和疼痛)的评估和/或监测，以及执行本文所述且本技术领域中实施的分析检测和方法(即确定促炎细胞因子的水平)。
肺部疾病和病症
在一个实施方案中，提供了通过施用条件活性蛋白或药物组合物，杀死或去除患有与衰老细胞相关的疾病或病症(即肺部疾病和病症)的受试者中与该疾病或病症相关的衰老细胞(即，已成熟的衰老细胞)来治疗或预防(即，降低发生的可能性)与衰老细胞相关的疾病或病症(肺部疾病和病症)的方法。衰老相关的肺部疾病和病症包括例如特发性肺纤维化(IPF)、慢性阻塞性肺病(COPD)、哮喘、囊性纤维化、支气管扩张和肺气肿。观察到IPF疾病的发病率随着年龄的增长而增加，并且IPF患者的肺组织富含SA-P-Gal阳性细胞且含有升高水平的衰老标记物p21，这表明IPF与细胞衰老相关(参见例如，Minagawa et al,Am.J.Physiol.Lung Cell.Mol.Physiol.,vol.300,pp.L391-L401,2011)。短端粒是IPF和细胞衰老共同的风险因子(参见，例如，Alder et al,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,vol.105,pp.13051-56,2008)。不希望受理论束缚，报道表明细胞衰老对IPF的作用是衰老细胞的SASP组分(例如IL-6、IL-8和IL-1β)促进成纤维细胞向肌成纤维细胞分化和上皮-间充质转化，导致肺泡和胞间隙的细胞外基质的广泛重塑(参见，例如，Minagawa等，同上)。
可通过使用条件活性蛋白或药物组合物治疗的其他肺部疾病或病症包括例如肺气肿、哮喘、支气管扩张和囊性纤维化(参见，例如，Fischer et al,Am J Physiol LungCell Mol Physiol.,vol.304,pp.L394-400,2013)。
本文描述的用于治疗或预防(即，降低发生的可能性)衰老相关的肺部疾病或病症的方法也可用于治疗患有衰老和肺功能丧失(或退化)的个体(即，与年轻的个体相比肺功能下降或受损)和/或肺组织退化的个体。通过向衰老的个体(包括无症状的中年成人)施用衰老细胞溶解剂，可以通过杀死和去除呼吸道中的衰老细胞来减缓或抑制肺功能的下降。可以使用本领域已知的技术分析条件活性蛋白或药物组合物的治疗效果，例如将已接受治疗的患有肺部疾病或有患此病风险的患者的症状与没有接受这种治疗的或接受安慰剂治疗的患者的症状进行比较。此外，可以执行评估肺的机械功能的方法和技术，例如，测量肺容量、弹性和气道超敏性(airway hypersensitivity)的技术。为了确定肺功能并在整个治疗过程中监测肺功能，可以获得多种测量值中的任何一种：呼气储备容积(ERV)、用力肺活量(FVC)、用力呼气量(FEV)(例如、一秒内的FEV、FEV1)、FEV1/FEV比、用力呼气流量(25％至75％)、最大自主通气量(MVV)、呼气峰流量(PEF)、缓慢肺活量(SVC)。总肺容积包括总肺容量(TLC)、肺活量(VC)、残气量(residual volume，RV)和功能残气量(Functional residualcapacity，FRC)。可以使用一氧化碳的扩散能力(DLCO)测量肺泡毛细血管膜上的气体交换。还可以测量外周毛细血管氧饱和度(SpO2)。
神经疾病和病症
可通过施用条件活性蛋白或药物组合物治疗的衰老细胞相关的疾病或病症包括神经疾病或病症。这种衰老细胞相关的疾病和病症包括帕金森病、阿尔茨海默病(和其他痴呆)、运动神经元功能障碍(MND)、轻度认知障碍(MCI)、亨廷顿氏病以及眼睛的疾病和病症，例如与年龄有关的黄斑变性。与年龄增长相关的其他眼疾是青光眼、视力减退、老花眼和白内障。
产生多巴胺的神经元的衰老被认为是通过产生活性氧物质导致PD中观察到的细胞死亡的原因(参见，例如，Cohen et al,J.Neural Transm.Suppl.19:89-103(1983))。因此，本文所述的条件活性蛋白和药物组合物可用于治疗和预防帕金森氏病。
用于检测、监测或量化与帕金森氏病相关的神经变性缺陷和/或运动缺陷的方法是本领域已知的，例如组织学研究、生物化学研究和行为评估(参见例如U.S.2012/0005765)。帕金森氏病的症状在本领域中是已知的并且包括但不限于难以开始或完成自主运动、抽筋、动作僵硬、肌肉萎缩、颤抖(震颤)和心率改变(但是正常反射)、运动迟缓、和姿势不稳。
本文所述的条件活性蛋白或药物组合物在接受一种或多种衰老细胞溶解剂的受试者中的有效性可由医学和临床技术领域的技术人员容易地确定。可以使用包括以下所述中的一种或任何组合的诊断方法来监测受试者的健康状况：身体检查、临床症状的评估和监测，以及执行本文所述的分析测试和方法。可以使用本领域已知的技术分析施用条件活性蛋白或药物组合物的效果，例如将接受治疗的患有阿尔茨海默病或有患阿尔茨海默病风险的患者的症状与没有接受这种治疗的或接受安慰剂治疗的患者的症状进行比较。
轻度认知障碍(MCI)
MCI是脑功能综合征，其涉及超出了基于个体的年龄和教育程度的预期的认知缺陷的发生和演化，但是不足以干扰该个体的日常活动。施用条件活性蛋白可通过杀死或去除衰老细胞来减少或抑制MCI。用于检测、监测、量化或评估与MCI相关的神经病理学缺陷的方法是本领域已知的，包括星形胶质细胞形态学分析、乙酰胆碱的释放、用于评估神经变性的银染色、以及用于检测β淀粉样沉积物的PiB PET成像(参见，例如U.S.2012/0071468)。用于检测、监测、量化或评估与MCI相关的行为缺陷的方法也是本领域已知的，包括八臂放射迷宫范式、非匹配样本任务(non-matching-to-sample task)、水迷宫中的异我中心位置确定任务(allocentric place determination task)、Morris迷宫测试、视觉空间任务和延迟响应空间记忆任务、嗅觉新颖性测试(参见，同上)。
运动神经元功能障碍(MND)
MND是一组进行性神经障碍，其破坏运动神经元，即控制基本随意肌活动(例如说话、行走、呼吸和吞咽)的细胞。MND的实例包括但不限于肌萎缩侧索硬化症(ALS)(也称为Lou Gehrig病)、进行性延髓麻痹、假性延髓麻痹、原发性侧索硬化、进行性肌萎缩、下运动神经元疾病和脊髓性肌萎缩(SMA)(例如、SMA1也称为Werdnig-Hoffmann病、SMA2、SMA3也称为Kugelberg-Welander病和肯尼迪病)、脊髓灰质炎后综合征和遗传性痉挛性截瘫。施用条件活性蛋白可通过杀死或去除衰老细胞来减少或抑制MND。用于检测、监测或量化与帕金森氏病(例如MND)相关的运动缺陷和/或其他缺陷的方法是本领域已知的(参见例如，U.S.20120005765)。用于检测、监测、量化或评估与MND相关的运动缺陷和组织病理学缺陷的方法是本领域已知的，包括组织病理学、生物化学和电生理学研究和运动活动分析(参见，例如，Rich et al.,J Neurophysiol,vol.88,pp.3293-3304,2002；Appel et al,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,vol.88,pp.647-51,1991)。
眼科疾病和病症
在某些实施方案中，与衰老细胞相关的疾病或病症是眼睛的疾病、病症或疾患，例如老花眼、黄斑变性或白内障。在其他某些实施方案中，衰老细胞相关的疾病或病症是青光眼。黄斑变性是一种神经退行性疾病，导致视网膜中心部分(称为黄斑)感光细胞的丢失。虽然年龄相关性黄斑变性的确切原因尚不清楚，但衰老的视网膜色素上皮(RPE)细胞的数量随着年龄而增加。年龄和某些遗传因素和环境因素是发生ARMD的风险因素(参见，例如，Lyengar et al,Am.J.Hum.Genet.,vol.74,pp.20-39,2004；Kenealy et al,Mol.Vis.,vol.10,pp.57-61,2004；Gorin et al,Mol.Vis.,vol.5,p.29,1999)。微RNA的减少有助于衰老细胞概况(senescent cell profile)，而DICER1消融诱发早衰。具有黄斑变性的受试者的诊断和监测可以由眼科领域的技术人员根据本领域公认的定期眼睛检查程序和受试者的症状报告来完成。
年龄相关的晶状体前囊和晶状体后囊的力学性能的变化表明晶状体后囊的力学强度随着年龄的增长而显著降低(参见，例如，Krag et al,Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.,vol.44,pp.691-96,2003；Krag et al,Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.,vol.38,pp.357-63,1997)。囊的片层结构也会改变并且可以至少部分地由组织的组成变化引起。
研究表明胶原蛋白IV影响细胞功能，这是从上皮层下面的基底膜的定位推断的，并且数据支持胶原蛋白IV在组织稳定中的作用。后囊膜混浊(PCO)在白内障手术后的随后几年中在大约20-40％的患者中发展为并发症(参见，例如，Awasthi et al,ArchOphthalmol.,vol.127,pp.555-62,2009)。后囊膜混浊是因沿后囊残留的晶状体上皮细胞的增殖和活性所致，其反应类似于伤口愈合。生长因子(例如成纤维细胞生长因子)、转化生长因子β、表皮生长因子、肝细胞生长因子、胰岛素样生长因子和白细胞介素IL-1和IL-6也可以促进上皮细胞迁移。如本文所讨论的，衰老细胞产生的这些因子和细胞因子有助于SASP。相反，体外研究表明胶原蛋白IV促进晶状体上皮细胞的粘附(参见，例如，Olivero etal,Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.,vol.34,pp.2825-34,1993)。胶原蛋白IV、纤连蛋白和层粘连蛋白与人工晶状体的粘附抑制细胞迁移并可降低PCO的风险(参见，例如，Raj et al,Int.J.Biomed.Sci.,vol.3,pp.237-50,2007)。
不希望受任何特定理论的束缚，通过本文所述的条件活性蛋白选择性杀死或去除衰老细胞可减缓或阻碍(延迟、抑制、阻止)IV型胶原网络的无序化(disorganization)。去除衰老细胞从而消除SASP的炎症作用可以减少或抑制上皮细胞迁移，并且还可以延迟(抑制)老花眼的发作或减少或减缓病症的进行性严重性(例如减缓从轻度到中度或中度至重度的进展)。本文所述的条件活性蛋白和药物组合物还可用于白内障手术后降低PCO发生的可能性。
BubR1亚效等位基因小鼠(hypomorphic mice)在生命早期双侧出现后囊下白内障，表明衰老可能发挥作用(参见，例如，Baker et al,Nat.Cell Biol.,vol.10,pp.825-36,2008)。可以使用眼科领域的技术人员常规进行的方法通过眼睛检查来监测白内障的存在和严重程度。
在某些实施方案中，至少一种选择性杀死衰老细胞的条件活性蛋白可以施用于具有罹患老花眼、白内障或黄斑变性风险的受试者。当人类受试者年龄至少为40岁时，可开始用条件活性蛋白治疗，以延迟或抑制白内障、老花眼和黄斑变性的发生或发展。因为几乎所有人都会发生老花眼，在某些实施方案中，在受试者达到40岁之后，可以以本文所述的方式将衰老细胞溶解剂施用于人类受试者，以延迟或抑制老花眼的发生或发展。
在某些实施方案中，衰老相关的疾病或病症是青光眼。青光眼是一个宽泛的术语，用于描述导致视野丧失的一组疾病，通常没有任何其他主要症状。当对流体流出所需的细胞网络进行SA-P-Gal染色时，在青光眼患者中观察到衰老增加了四倍(参见，例如，Litonet al,Exp.Gerontol.,vol.40,pp.745-748,2005)。
为了监测治疗对抑制青光眼进展的效果，标准自动视野检查(视野测试)是最广泛使用的技术。此外，已经开发了几种用于进展检测的算法(参见，例如，Wesselink等人，Wesselink et al,Arch Ophthalmol.,vol.127,pp.270-274,2009，以及其中的参考文献)。其他方法包括房角镜检查(检查小梁网和液体流出眼睛的角度)；成像技术，例如扫描激光断层摄影术(例如HRT3)、激光偏振测量法(例如GDX)和眼睛相干断层扫描术(ocularcoherence tomography)；眼底镜检查；和确定中心角膜厚度的测厚仪测量。
代谢疾病或病症
可通过施用条件活性蛋白或药物组合物治疗的衰老细胞相关的疾病或病症包括代谢疾病或病症。这种衰老细胞相关的疾病和病症包括糖尿病、代谢综合征、糖尿病性溃疡和肥胖症。本文所述的条件活性蛋白可用于治疗2型糖尿病，特别是年龄、饮食和肥胖相关的2型糖尿病。
人们认为衰老细胞参与代谢疾病(例如肥胖症和2型糖尿病)是对损伤或代谢功能障碍的反应(参见，例如，Tchkonia et al,Aging Cell,vol.9,pp.667-684,2010)。来自肥胖小鼠的脂肪组织显示衰老标志物SA-P-Gal、p53和p21的诱导(参见，例如，Minamino etal,Nat.Med.,vol.15,pp.1082-1087,2009)。在相同的脂肪组织中观察到促炎细胞因子(例如肿瘤坏死因子-α和Ccl2/MCP1)的伴随上调(参见，例如，Minamino等，同上)。肥胖症中衰老细胞的诱导可能具有临床意义，因为促炎性SASP组分也可能导致2型糖尿病(参见，例如，Tchkonia等，同上)。衰老标志物和SASP组分的上调的类似模式与小鼠和人类的糖尿病相关(参见，例如，Minamino等，同上)。因此，本文所述的包括施用衰老细胞溶解剂的方法可用于治疗或预防2型糖尿病，以及肥胖症和代谢综合征。不希望受理论束缚，衰老的前脂肪细胞与衰老细胞溶解剂接触从而杀死衰老的前脂肪细胞可以为患有糖尿病、肥胖症或代谢综合征中的任何一种的人提供临床和健康益处。
与糖尿病和衰老相关的病症或病症是糖尿病性溃疡(即糖尿病性伤口)。溃疡是皮肤中的破裂，可以延伸至涉及皮下组织，甚至肌肉或骨骼。这些病变尤其发生在下肢。患有糖尿病性静脉溃疡的患者在慢性伤口部位表现出细胞衰老的升高(参见，例如，Stanley etal.J.Vas.Surg.,vol.33,pp.1206-1211,2001)。在慢性伤口部位也观察到慢性炎症，例如糖尿病性溃疡(参见，例如，Goren et al.Am.J.Pathol.,vol.168,pp.65-77)，表明衰老细胞的促炎细胞因子表型在病理学中具有一定的作用。
条件活性蛋白的有效性可以由医学和临床技术领域的技术人员容易地确定。可以使用包括以下所述中的一种或任何组合的诊断方法来监测受试者的健康状况：身体检查、临床症状的评估和监测，以及执行本文所述的分析检测和方法。可以监测接受本文所述的用于治疗或预防糖尿病的一种或多种衰老细胞溶解剂的受试者，例如，通过测定葡萄糖和胰岛素耐受性、能量消耗、身体成分、脂肪组织、骨骼肌和肝脏炎症，和/或脂毒性(肌肉和肝脏脂质的体内成像，肌肉、肝脏、骨髓和胰腺β-细胞脂质的积累和组织学炎症)来监测。2型糖尿病的其他特征或表型是已知的，并且可以如本文所述通过使用本领域已知和常规实施的其他方法和技术进行测定。
患有2型糖尿病或有罹患2型糖尿病风险的受试者可能患有代谢综合征。人类的代谢综合征通常与肥胖有关，其特征在于心血管疾病、肝脂肪变性、高脂血症、糖尿病和胰岛素抵抗中的一种或多种。患有代谢综合征的受试者可能出现一系列代谢紊乱或异常，可包括例如高血压、2型糖尿病、高脂血症、血脂异常(例如，高甘油三酯血症、高胆固醇血症)、胰岛素抵抗、肝脂肪变性(脂肪性肝炎)、高血压、动脉粥样硬化和其他代谢紊乱中的一种或多种。
皮肤疾病或病症
可通过施用本文所述的条件活性蛋白或药物组合物治疗的与衰老细胞相关的疾病或病症包括皮肤疾病或病症。这种与衰老细胞相关的疾病和病症包括牛皮癣和湿疹，它们也是炎性疾病，并如以上所述进行了更详细的讨论。与衰老相关的其他皮肤疾病或病症包括皱纹(由衰老引起的皱纹)；瘙痒症(与糖尿病和衰老有关)；感觉迟钝(与糖尿病和多发性硬化有关的化疗副作用)；牛皮癣(如上所述)和其他丘疹鳞屑病，例如，红皮病、扁平苔癣和苔藓样皮肤病；特应性皮炎(湿疹的一种形式，与炎症有关)；湿疹型出疹(通常在老年患者中观察到并与某些药物的副作用有关)。与衰老相关的其他皮肤疾病或病症包括嗜酸性皮肤病(与某些类型的血液癌症有关)；反应性中性粒细胞性皮肤病(与炎症性肠综合征等基础疾病有关)；天疱疮(一种自身免疫性疾病，其中针对桥粒芯糖蛋白形成自身抗体)；类天疱疮和其他免疫性皮肤病(皮肤自身免疫性水疱)；与衰老有关的皮肤纤维组织细胞增生；和在老年人群中更常见的皮肤淋巴瘤。可根据本文所述方法治疗的另一种皮肤疾病包括皮肤狼疮，其是红斑狼疮的症状。迟发性狼疮可能与衰老相关的T细胞和B细胞和细胞因子(免疫衰老)的功能降低(即下降)有关。
转移
在一个具体实施方案中，条件活性蛋白或药物组合物可用于治疗或预防从体内的一个器官或组织到另一个器官或组织的转移(即，癌症细胞或肿瘤细胞的扩散和传播)。患有癌症的个体可受益于施用条件活性蛋白或药物组合物以抑制转移。这种条件活性蛋白或药物组合物可以抑制肿瘤增殖。当癌细胞(即肿瘤细胞)扩散到解剖学起源部位之外并初始定植到个体体内的其他区域时，就会发生癌症的转移。肿瘤增殖可以通过肿瘤大小来确定，肿瘤大小可以以本领域技术人员熟悉的各种方式测量，例如通过PET扫描、MRI、CAT扫描、活组织检查来测量。还可以通过检查肿瘤细胞的分化来评估治疗剂对肿瘤增殖的影响。
如本文和本领域所使用的，术语癌症或肿瘤是临床描述性术语，其涵盖通常以表现出异常细胞增殖的细胞为特征的疾病。术语癌症通常用于描述恶性肿瘤或由肿瘤引起的疾病状态。或者，异常生长在本领域中可称为瘤(neoplasm)。术语肿瘤，例如与组织有关的，通常是指任何异常的组织生长，其至少部分地由过度的和异常的细胞增殖表征。肿瘤可以是转移性的并且能够扩散到其解剖学起源部位之外并初始定植到个体体内的其他区域。癌症可以包括实体瘤或可以包括“液体”肿瘤(例如，白血病和其他血癌)。
通过癌症疗法(例如放射和某些化疗药物)诱导细胞衰老。衰老细胞的存在使炎性分子的分泌增加(参见本文对衰老细胞的描述)，促进肿瘤进展(可包括促进肿瘤生长和增加肿瘤大小)，促进转移并改变分化。当衰老细胞被破坏时，肿瘤进展被明显抑制，导致肿瘤尺寸小并且几乎没有或没有观察到转移性生长(参见，例如WO2013/090645)。因此，条件活性蛋白或药物组合物可以在化学治疗或放射治疗后施用以杀死或去除这些衰老细胞。如本文所讨论和本领域所理解的，衰老的确立(establishment of senescence)，例如通过衰老细胞相关的分泌表型(SASP)的存在所示，在几天内发生。因此，当衰老已经确立时，开始施用衰老细胞溶解剂以杀死衰老细胞，从而降低发生转移的可能性或降低转移程度。
在某个特定实施方案中，当在至少一天治疗(即化学治疗或放射治疗)然后至少一周停止治疗(off-therapy)的治疗周期中施用化学疗法或放射疗法时，在停止治疗时间间隔期间的一天或多天施用条件活性蛋白或药物组合物，在停止治疗时间间隔的第二天或之后开始并且在停止治疗时间间隔的最后一天或之前结束。在更具体的实施方案中，当在至少一天治疗(即化学治疗或放射治疗)然后至少一周停止治疗的治疗周期中施用化学疗法或放射疗法时，在停止治疗时间间隔中的一天(停止治疗时间间隔的第六天)施用条件活性蛋白或药物组合物。在其他具体实施方案中，当在至少一天治疗(即化学治疗或放射治疗)然后至少两周停止治疗的治疗周期中施用化学疗法或放射疗法时，从停止化学治疗或放射治疗时间间隔的第六天开始施用条件活性蛋白或药物组合物，并且在随后的化学治疗或放射治疗疗程的第一天之前的至少一天或至少两天结束。
在用于治疗转移的另一个实施方案中，可以在化学疗法或放射疗法的治疗方案完成后施用条件活性蛋白或药物组合物。在一个具体实施方案中，在化学治疗或放射治疗完成后，在不超过14天的治疗窗口(即，衰老细胞溶解剂疗程)中的一天或多天施用条件活性蛋白或药物组合物。
本文所述的方法还可用于抑制、延缓或减缓医学领域中所述的任何一种类型肿瘤的转移性癌症的进展。癌症(肿瘤)的类型包括：肾上腺皮质癌、儿童肾上腺皮质癌、艾滋病相关癌症、肛门癌、阑尾癌、基底细胞癌、儿童基底细胞癌、膀胱癌、儿童膀胱癌、骨癌、脑肿瘤、儿童星形细胞瘤、儿童脑干胶质瘤、儿童中枢神经系统非典型畸形/横纹肌样瘤、儿童中枢神经系统胚胎肿瘤、儿童中枢神经系统生殖细胞肿瘤、儿童颅咽管瘤脑瘤、儿童室管膜瘤脑肿瘤、乳腺癌、儿童支气管肿瘤、类癌瘤、儿童类癌瘤、胃肠道类癌瘤、原发性不明原因癌、原发性不明儿童癌、儿童心脏(心)肿瘤、宫颈癌、儿童宫颈癌、儿童脊索瘤、慢性骨髓增生性疾病、结肠癌、结直肠癌、儿童结直肠癌、肝外胆管癌、导管原位癌(DCIS)、子宫内膜癌、食道癌、儿童食管癌、儿童鼻腔神经胶质瘤(esthesioneuroblastoma)、眼癌、骨恶性纤维组织细胞瘤、胆囊癌、胃癌、儿童胃癌、胃肠道间质瘤(GIST)、儿童胃肠道间质瘤、儿童颅外生殖细胞肿瘤、外生殖细胞肿瘤、妊娠滋养细胞肿瘤、胶质瘤、头颈癌、儿童头颈癌、肝细胞癌(肝癌)、下咽癌、肾癌、肾细胞肾癌、肾母细胞瘤、儿童肾肿瘤、朗格汉斯细胞组织细胞增生症、喉癌、儿童喉癌、白血病、急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性髓性白血病(AML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、慢性骨髓性白血病(cml)、毛细胞白血病、唇癌、肝癌(原发性)、儿童肝癌(原发性)、小叶原位癌(LCIS)、肺癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、淋巴瘤、艾滋病相关淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤(CNS)、黑素瘤、儿童黑素瘤、眼内(眼睛)黑素瘤、Merkel细胞癌、恶性间皮瘤、儿童恶性间皮瘤、隐匿原发性转移性鳞状颈癌、涉及NUT基因的中线癌(midline tract carcinoma)、口腔癌、儿童多发性内分泌肿瘤综合征、蕈样真菌病、骨髓增生异常综合征、骨髓增生异常肿瘤、骨髓增生性肿瘤、多发性骨髓瘤、鼻腔癌、鼻咽癌、儿童鼻咽癌、神经母细胞瘤、口腔癌、儿童口腔癌、口咽癌、卵巢癌、儿童卵巢癌、上皮性卵巢癌、低度恶性潜在肿瘤卵巢癌、胰腺癌、儿童胰腺癌、胰腺神经内分泌肿瘤(胰岛细胞瘤)、儿童乳头状瘤病、副神经节瘤、鼻窦癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、咽癌、嗜铬细胞瘤、垂体瘤、浆细胞肿瘤、儿童胸膜肺母细胞瘤、前列腺癌、直肠癌、肾盂移行细胞癌、视网膜母细胞瘤、唾液腺癌、儿童唾液腺癌、尤文肉瘤家族肿瘤、卡波西肉瘤、骨肉瘤、横纹肌肉瘤、儿童横纹肌肉瘤、软组织肉瘤、子宫肉瘤、Sezary综合征、儿童皮肤癌、非黑素瘤皮肤癌、小肠癌、鳞状细胞癌、儿童鳞状细胞癌、睾丸癌、儿童睾丸癌、咽喉癌、胸腺瘤和胸腺癌、儿童胸腺瘤和胸腺癌、甲状腺癌、儿童甲状腺癌、输尿管移行细胞癌、尿道癌、子宫内膜癌、阴道癌、外阴癌、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症。
化学疗法和放射疗法副作用
在另一个实施方案中，衰老细胞相关的疾病或病症是化学疗法副作用或放射疗法副作用。诱导非癌细胞衰老的化学治疗剂的实例包括蒽环霉素(例如多柔比星、柔红霉素)；紫杉醇(例如paclitaxel)；吉西他滨；泊马度胺(pomalidomide)；和来那度胺。如本文所述施用的一种或多种衰老细胞溶解剂可用于治疗和/或预防(即，降低发生的可能性)化学疗法副作用或放射疗法副作用。去除或破坏衰老细胞可以减轻急性毒性，包括化学疗法或放射疗法的包括能量失衡的急性毒性。急性毒副作用包括但不限于胃肠道毒性(例如恶心、呕吐、便秘、厌食、腹泻)、周围神经病变、疲劳、不舒服、体力活动低、血液毒性(例如贫血)、肝毒性、脱发(头发损失)、疼痛、感染、粘膜炎、液体潴留、皮肤毒性(例如皮疹、皮炎、色素沉着过度、荨麻疹、光过敏、指甲变化)、口腔问题(例如口腔粘膜炎)、牙龈或喉咙问题、或化学疗法或放射疗法引起的任何毒副作用。例如，通过本文所述的方法可以减轻由放射疗法或化学疗法引起的毒性副作用(参见例如美国国家癌症研究所网站)。因此，在某些实施方案中，本文提供了用于在接受治疗的个体中减轻(减少、抑制或预防发生(即，降低发生的可能性))化学疗法或放射疗法或两者的急性毒性或降低毒副作用(即，有害的副作用)的严重性的方法，其中该方法包括向个体施用选择性杀死、去除或破坏衰老细胞或促进衰老细胞的选择性破坏的药剂。
可以通过与上述用于治疗/预防转移的疗程相同的疗程来施用用于治疗或降低发生化学疗法或放射疗法副作用的可能性或降低化学疗法或放射疗法副作用的严重性的条件活性蛋白或药物组合物。如针对治疗或预防转移(即，降低转移发生的可能性)所述，在停止化学治疗或停止放射治疗时间间隔期间或在化学疗法或放射疗法治疗方案完成后施用条件活性蛋白或药物组合物。
在更具体的实施方案中，急性毒性是包含能量失衡的急性毒性，并且可以包括体重减轻、内分泌变化(例如，激素失衡、激素信号传导的变化)和身体成分变化中的一种或多种。在某些实施方案中，包含能量失衡的急性毒性涉及个体体力活动的能力下降或降低，如与未接受药物治疗的个体中观察到的相比能量消耗减少或下降所表明的。作为非限制性实例，包括能量失衡的这种急性毒性作用包括体力活动低。在其他特定实施方案中，能量失衡包括疲劳或不舒服。
在一个实施方案中，条件活性蛋白或药物组合物所治疗或预防(即，降低发生的可能性)的化学疗法副作用是心脏毒性。患有癌症的采用蒽环霉素(例如多柔比星、柔红霉素)治疗的个体可以用本文所述的可减少、减轻或降低蒽环霉素的心脏毒性的一种或多种衰老细胞溶解剂来治疗。如在医学领域中充分理解的，由于与蒽环霉素相关的心脏毒性，即使癌症对药物有反应，个体可接受的最大终身剂量也是有限的。施用一种或多种条件活性蛋白可以降低心脏毒性，使得可以向个体施用额外量的蒽环霉素，从而改善与癌症疾病相关的预后。在一个实施方案中，心脏毒性由施用蒽环霉素(例如多柔比星)引起。多柔比星是一种蒽环霉素拓扑异构酶，被批准用于治疗铂基疗法失败后的卵巢癌患者；原发性全身化疗失败(或对治疗不耐受)后的卡波西肉瘤患者；或与硼替佐米联合用于既往未接受过硼替佐米治疗或至少接受过一次治疗的多发性骨髓瘤患者。如果给予患者的总终身剂量超过550mg/m2，多柔比星可能会造成心肌损伤，从而导致充血性心力衰竭。如果患者还接受纵隔照射或另一种心脏毒性药物，则甚至可以在更低剂量下发生心脏毒性。参见药品说明书(例如，阿霉素脂质体(doxil)、阿霉素)。
在其他实施方案中，本文所述的条件活性蛋白或药物组合物可用于本文提供的方法中，用于减轻慢性或长期的副作用。慢性毒性副作用通常是由于在较长时间内多次遭受或施用化疗或放疗而引起的。某些毒性效应(也称为后期毒性效应)在治疗后很长时间内出现，并且由治疗对器官或系统的损害引起。在儿童时期接受癌症治疗的患者中观察到器官功能障碍(例如，神经、肺、心血管和内分泌功能障碍)(参见，例如，Hudson et al,JAMA,vol.309,pp.2371-81,2013)。不希望受任何特定理论的束缚，通过破坏衰老细胞，尤其是通过化学疗法或放射疗法被诱导衰老的正常细胞，可以减少发生慢性副作用的可能性，或可以减少或降低慢性副作用的严重程度，或者可以延迟慢性副作用的发作时间。在接受化学疗法或放射疗法的个体中发生的慢性和/或后期毒性副作用包括(非限制性实例)心肌病、充血性心脏病、炎症、早期绝经、骨质疏松症、不育、认知功能受损、周围神经病、继发性癌症、白内障和其他视力问题、听力损失、慢性疲劳、肺活量降低和肺部疾病。
此外，通过施用条件活性蛋白或药物组合物杀死或去除患有癌症的个体中的衰老细胞，与没有施用条件活性蛋白或药物组合物相比，可以以临床或统计学显著的方式增强对化学疗法或放射疗法的敏感性。换句话说，当将条件活性蛋白或药物组合物施用于分别采用化学疗法或放射疗法治疗的个体时，可以抑制化学疗法或放射疗法抗性的发展。
与年龄有关的疾病和病症
条件活性蛋白或药物组合物还可用于治疗或预防(即，降低发生的可能性)与年龄相关的疾病或病症，该疾病或病症作为自然衰老过程的一部分发生，或当个体暴露于衰老诱导剂或衰老诱导因素(例如，辐射、化学疗法、吸烟、高脂肪/高糖饮食、其他环境因素)时发生。年龄相关的疾病或病症或年龄敏感性状可能与诱导衰老的刺激有关。本文所述治疗方法的功效可通过减少与衰老诱导刺激相关的年龄相关病症或年龄敏感性状的症状的数量、降低一种或多种症状的严重程度或延迟与衰老诱导刺激相关的年龄相关病症或年龄敏感性状的进展来表现。在其他特定实施方案中，预防与衰老诱导刺激相关的年龄相关病症或年龄敏感性状是指预防(即，降低发生的可能性)或者延迟与衰老诱导刺激相关的年龄相关的病症或年龄敏感性状的发病或与衰老诱导刺激相关的一种或多种年龄相关的病症或年龄敏感性状的复发。
与年龄相关的疾病或病症包括，例如，肾功能障碍、驼背、椎间盘突出、虚弱、脱发、听力丧失、视力丧失(失明或视力受损)、肌肉疲劳、皮肤病症、皮肤痣、糖尿病、代谢综合征和肌肉减少症。视力丧失是指先前有视力的个体丧失视力。已经开发了各种尺度来描述基于视敏度的视力和视力丧失的程度。与年龄有关的疾病和病症还包括皮肤病症，例如但不限于，治疗以下一种或多种病症：皱纹，包括浅表细皱纹；色素沉着；伤疤；瘢痕疙瘩；皮炎；银屑病；湿疹(包括脂溢性湿疹)；酒渣鼻；白癜风；寻常型鱼鳞病；皮肌炎；和光化性角化病。
虚弱已被定义为由多个生理系统中的衰老相关性的储备和功能的下降导致的、临床上可识别的脆弱性增加的状态，其损害了个体应对每天的或急性的应激源的能力。在某些实施方案中，通过施用条件活性蛋白或药物组合物，可以治疗或预防(即，降低发生的可能性)衰老和与衰老相关的疾病和病症。条件活性蛋白或药物组合物可以抑制成体干细胞的衰老或抑制衰老的成体干细胞的积累，杀死衰老的成体干细胞或促进其去除。参见，例如，Park et al,J.Clin.Invest.,vol.113,pp.175-79,2004和Sousa-Victor,Nature,vol.506,pp.316-21,2014，其中描述了防止干细胞衰老以维持组织再生能力的重要性。
条件活性蛋白或药物组合物在治疗本文所述的与衰老细胞相关的疾病或病症方面的有效性可由医学和临床技术领域的技术人员容易地确定。例如，可以使用包括以下所述中的一种或任何组合的本领域技术人员公知的适用于特定疾病或病症的诊断方法来监测受试者的健康状况和衰老细胞溶解剂的有效性：身体检查，患者自我评估、临床症状的评估和监测、执行分析测试和方法包括临床实验室测试、物理测试和探索性手术。可以使用本领域已知的技术分析本文所述的治疗方法的效果，例如将接受条件活性蛋白或药物组合物的患有特定疾病或病症的或有患此病风险的患者的症状与没有接受条件活性蛋白或药物组合物治疗的或接受安慰剂治疗的患者的症状相比较。
条件活性蛋白或药物组合物的有效性可包括有益的或期望的临床效果，其包括但不限于减轻、减少或缓解由待治疗的疾病引起或与之相关的症状；症状发生率下降；生活质量提高；无病状态更长(即，降低个体出现症状的可能性或倾向，该症状为进行疾病的诊断的根据)；减少疾病的程度；稳定疾病状态(即没有恶化)；延迟或减缓疾病进展；改善或缓和疾病状态；缓解(无论是局部还是全部)，无论是可检测的还是不可检测的；和/或总生存率。条件活性蛋白或药物组合物的有效性还可以意指与个体未接受条件活性蛋白或药物组合物情况下的预期存活期相比，存活期延长。
需要用本文所述的条件活性蛋白或药物组合物治疗的受试者、患者或个体可以是已经出现与衰老细胞相关的疾病或病症的症状或者有罹患与衰老细胞相关的疾病或病症的风险的人类或非人类灵长类动物或其他动物(即兽医用途)。可以治疗的非人类动物包括哺乳动物，例如，非人类灵长类动物(例如，猴子、黑猩猩、大猩猩等)，啮齿动物(例如，大鼠、小鼠、沙鼠、仓鼠、雪貂、兔子)、兔类动物、猪科动物(例如猪、小型猪)、马、犬、猫、牛、大象、熊和其他家养动物、农场动物和动物园动物。
实施例
用于制备条件活性蛋白的实施例1-9描述于WO 2016/138071中。
实施例10：条件活性抗体在不同缓冲液中的活性
在两种不同的缓冲液中测量分别由两种单克隆抗体(mAb 048-01和mAb 048-02作为亲本抗体)演变而来的条件活性抗体的活性(图4)。两种缓冲液是磷酸盐缓冲液(条件IV)和Krebs缓冲液(条件I)。六种条件活性抗体由mAb 048-01演变而来：CAB Hit 048-01、CABHit 048-02、CAB Hit048-03、CAB Hit 048-04、CAB Hit 048-05和CAB Hit 048-06。三种条件活性抗体由mAb 048-02演变而来：CAB Hit 048-07、CAB Hit 048-08和CAB Hit 048-09。
该研究表明条件活性抗体的选择性(在pH 6.0下的测试中的活性与在pH7.4下的测试中的活性的比)受测试中使用的缓冲液的影响。由野生型mAb 048-02演变而来的条件活性抗体在Krebs缓冲液中显示出比在磷酸盐缓冲液中明显更高的选择性(图4)。
实施例11：条件活性抗体的选择性和碳酸氢盐
在实施例10中，在Krebs缓冲液(条件I)中观察到比在磷酸盐缓冲液(条件IV)中更高的条件活性抗体的选择性。这涉及鉴别对实施例10中观察到的较高选择性作出最显著贡献的、Krebs缓冲液中的组分。在源自Krebs缓冲液的缓冲液中重新测试条件活性抗体的选择性，每次从Krebs缓冲液的各种组分中减去一种组分(图5，左栏组)。当使用完整的Krebs缓冲液时，条件活性抗体的选择性较高，pH6.0/7.4的活性比约为8。当从Krebs缓冲液中减去A-F组分时，条件活性抗体的选择性并未丧失，尽管当减去C和D组分时，条件活性抗体的选择性降低。然而，当从Krebs缓冲液中减去组分G(碳酸氢盐)时，条件活性抗体的选择性完全丧失，见图5。这表明碳酸氢盐至少是造成Krebs缓冲液中条件活性抗体的高选择性的部分原因。
然后在磷酸盐缓冲液(条件IV)中测量同一条件活性抗体的选择性，该磷酸盐缓冲液不含碳酸氢盐，观察到条件活性抗体的选择性在磷酸盐缓冲液中完全丧失。当将碳酸氢盐加入磷酸盐缓冲液中时，条件活性抗体的选择性恢复到在Krebs缓冲液中观察到的水平。这证实了该条件活性抗体的选择性需要碳酸氢盐。
实施例12：在pH7.4下碳酸氢盐抑制结合
该实施例测量了在pH7.4下在具有不同浓度的碳酸氢盐(范围为从0到碳酸氢盐的生理浓度(约20mM，图6))的缓冲液中三种条件活性抗体(CAB Hit A，CAB Hit B和CAB HitC)的结合活性。观察到当碳酸氢盐的浓度从0增加至生理浓度时，所有三种条件活性抗体在pH7.4下的结合活性以剂量依赖性方式下降(图6)。另一方面，野生型抗体的结合活性不受碳酸氢盐的影响。该研究表明条件活性抗体在碳酸氢盐存在下的选择性可能至少部分地是由于与碳酸氢盐的相互作用导致在pH7.4下条件活性抗体的结合活性丧失。
实施例13：衰老细胞的诱导
细胞铺板：在6孔板中，如下将细胞进行接种：以1.0×105个细胞接种MDA-MB468(P10)和MDA-MB231(Px)，以2.0×105个细胞接种MCF-7(Px)用于空白对照(blank)，并以每孔2mL培养基进行处理。将细胞培养过夜。
·MCF-7是ERα+细胞系。帕波西比(Palbociclib)在该细胞系中具有抗增殖活性，阻止细胞生长并诱导衰老细胞。
·MDA-MB231是ERα-细胞系。帕波西比在该细胞系中具有抗增殖活性，阻止细胞生长并诱导衰老细胞。
·MDA-MB468是另一种ERα-细胞系。帕波西比在该细胞系中没有抗增殖作用，因此不会阻止细胞生长并且不能诱导衰老细胞。
帕波西比溶液的制备：将25mg帕波西比羟乙基磺酸盐(PD-0332991，Selechchem，货号：S1579，批次：4，25mg)加入到0.5mL H2O中，形成浓度为87.15mM的帕波西比溶液作为储备溶液。将2.3μL储备溶液与198μL H2O混合，形成1mM的帕波西比溶液。
诱导衰老细胞：将2μL的1mM帕波西比溶液加入2mL培养基中，得到最终浓度为1μM的帕波西比，用于处理培养的细胞(MCF-7、MDA-MB231和MDA-MB468)。用该培养基处理培养的细胞7天，以试图诱导衰老细胞。
通过FAC检测衰老细胞(B-gal和抗体的共染色)：用帕波西比处理7天后，用SA-B-gal荧光底物(C12FDG)和一组抗体对细胞进行共染色，并使用Zombie NIR活/死染料。
1.用PBS洗涤细胞两次，并用DetachinTM细胞分离溶液分离细胞。
2.用DMEM终止DetachinTM反应并对细胞计数。
3.在PBS中用2mM C12FDG(最终浓度为33uM)、抗体(5μL至1×106个细胞)和ZombieNIR染料(1：1000)于冰上染色1小时。
4.用PBS洗涤细胞两次，并在室温下用4％PFA固定10分钟。
5.用PBS洗涤并在100μL PBS中收集FAC。
6.使用FITC-PE-APC/Cy7。
7.用以下抗体对细胞进行共染色以检测相应抗原的表达：
a)PE抗人CD54克隆HCD54，200ug/mL，同种型(Iso)：Ms IgG1。Biolegend，货号：322707，批号：B232865，5μL/106细胞
b)PE抗人CD73克隆AD2，同种型：Ms IgG1。Biolegend，货号：344004，批号：B216193，5μL/106细胞
c)PE抗人CD261(DR4、TRAIL-R1)克隆DJR1，200ug/mL，同种型：Ms IgG1。Biolegend，货号：307205，批号：B189821，5μL/106细胞
d)PE抗人CD95(Fas)克隆DX2，100ug/mL，同种型：Ms IgG1。Biolegend，货号：305607，批号：B203942，5μL/106细胞
e)PE抗人CD39克隆A1，50μg/mL，同种型：Ms IgG1，Biolegend，货号：328208，批号：B199643，5μL/106细胞
f)PE抗人粘连蛋白4(Nectin4)，同种型：Ms IgG1。R&D系统，货号：FAB2659P，批号：AAAO0217031，5μL/106细胞
g)PE-同种型小鼠抗-IgG1，k：克隆MOPC-21，0.2mg/mL。Biolegend，货号：400112，批号：B220359，5μL/106细胞
通过FACS检测诱导的衰老细胞。用PBS洗涤染色的细胞，并在室温下用4％多聚甲醛(PFA)固定10分钟，用于FACS分析。还使用来自Cell Biolabs的CBA-230试剂盒进行SA-B-gal(衰老相关的B-Gal)染色作为对照。
在帕波西比处理后，在显微镜下观察细胞系(MCF-7、MDA-MB231和MDA-MB468细胞)。此外，还通过用相应的抗体染色来分析帕波西比处理后在细胞系中表达的靶标水平(target profile)。绘制的靶标是靶标1(CD54)、靶标2(CD73)、靶标3(CD261)、靶标4(CD95)、靶标5(CD39)和靶标6(粘连蛋白4)。
MCF-7细胞对帕波西比处理有反应，帕波西比诱导细胞变为衰老细胞(图9A-9B)。MCF-7细胞形成簇，所述簇具有衰老细胞的细胞外环境(图9B)。FACS分析清楚地显示帕波西比处理过的细胞(衰老细胞)与未处理的细胞(非衰老细胞，图9C)不同。发现帕波西比处理过的细胞(衰老细胞)的靶标水平与未处理的细胞(非衰老细胞，图9D)的不同。具体地，靶标1、2和6在衰老细胞中更丰富地表达，其中靶标2的表达水平增加最大。
类似地，MDA-MB231细胞也对帕波西比的处理有反应，帕波西比诱导细胞变为衰老细胞(图10A-10B)。MDA-MB231细胞还形成具有细胞外环境的簇(图10B)。FACS分析清楚地显示帕波西比处理过的细胞(衰老细胞)不同于未处理的细胞(非衰老细胞，图10C)。发现帕波西比处理过的细胞(衰老细胞)的靶标水平与未处理的细胞(非衰老细胞，图10D)的不同。具体地，与未处理的非衰老细胞相比，靶标1和靶标2在衰老细胞中表现出明显更高的表达水平。
对照MDA-MB468细胞对帕波西比的处理没有反应，因此该处理不诱导对照细胞变为衰老细胞(图11A-11B)。FACS和靶标水平分析未显示经处理的细胞和未处理的细胞之间的任何明显差异。
实施例14：帕波西比处理和MDA-MB231细胞的β-半乳糖苷酶染色
将MDA-MB231细胞以1×105个细胞/孔接种在6孔板中，并培养过夜。将培养的细胞分成两批：一批用1μM的帕波西比羟乙基磺酸盐处理7天，另一批未经处理。通过从孔中分离细胞来收获这两个批次。
在PBS缓冲液中，将收获的细胞用β-半乳糖苷酶(B-gal)底物(FITC)和靶抗体(抗CD73抗体)以及活/死染料(APC/Cy7)在冰上染色1小时。使用Cell SignalingTechnologies的货号为9860S的试剂盒进行B-gal染色。在显微镜下观察染色的MDA-MB231细胞。图12A显示，在未经处理的MDA-MB231细胞中，几乎没有衰老细胞，因为没有观察到细胞簇。图12B示出了用帕波西比处理过的MDA-MB231细胞。一些细胞被诱导成为形成簇的衰老细胞，并且还存在细胞外环境。
用PBS洗涤未经处理和经处理的染色细胞，并在室温下用4％多聚甲醛固定10分钟。固定细胞用于FACS细胞分选。
未经处理的细胞大多数为B-gal染色阴性，尽管通过FACS分选并根据它们的CD73活性而将它们分离(图14A)。B-gal阳性细胞以明显较小的数量存在，尽管也通过FACS分选并根据它们的CD73活性而将它们分离(图14C)。相反，经帕波西比处理的细胞具有大约相同数量的B-gal阴性细胞和B-gal阳性细胞(图14B和14D)。同样地，经处理的细胞，无论是B-gal阴性还是B-gal阳性，通过FACS分选并根据它们的CD73活性而将它们分离(图14B和14D)。
MDA-MB231细胞的FACS分选结果总结于图15A-15B中。图15A示出了未经处理的细胞，与包含大量衰老细胞和较高CD73活性的经处理的细胞(图15B)相比，未经处理的细胞中衰老细胞的数量小得多并且细胞的CD73活性处于低得多的水平。
实施例15：MDA-MB468细胞的帕波西比处理和β-半乳糖苷酶染色
如实施例14中对MDA-MD231细胞所述，对MDA-MB468细胞进行培养，染色和收获。在显微镜下观察染色的MDA-MB468细胞。图13A示出了未经处理的MDA-MB468细胞。图13B示出了用帕波西比处理过的MDA-MB468细胞。处理后未观察到明显的衰老细胞(细胞簇)。未经处理的细胞和经处理的细胞在显微镜下观察到的形态看起来是相似。
用PBS洗涤未经处理和用帕波西比处理过的染色细胞，并在室温下用4％多聚甲醛固定10分钟。固定细胞用于FACS细胞分选。
未经处理的细胞大多数为B-gal染色阴性，尽管通过FACS分选并根据它们的CD73活性而将它们分离(图16A)。分离不像实施例14中的MDA-MB231细胞那样清晰。B-gal阳性细胞以明显较小的数量存在，尽管也通过FACS分选并根据它们的CD73活性而将它们分离(图16C)。类似地，经处理的细胞也大部分为B-gal阴性(图16B和16D)。同样地，经处理的细胞，无论是B-gal阴性还是B-gal阳性，都是通过FACS分选并根据它们的CD73活性而将它们分离，尽管不如实施例14中的MDA-MB231细胞那样清晰(图14B和14D)。
MDA-MB468细胞的FACS分选结果总结于图17A-17B中。经处理的细胞和未经处理的细胞具有相似数量的衰老细胞和CD73活性水平。这些结果表明帕波西比处理不会诱导大量的衰老细胞。
实施例16：CD73在MDA-MB231细胞和MDA-MB468细胞中的表达
测量帕波西比处理后MDA-MB231细胞和MDA-MB468细胞中的CD73表达水平(图18A)。在MDA-MB231细胞中，帕波西比处理使CD73的表达水平明显增加(图18A中左侧的两个条形)。与未经处理的MDA-MB231细胞相比，未经处理的MDA-MB468细胞具有更低的CD73表达水平(图18A中的第一条形和第三条形)。此外，帕波西比处理没有使MDA-MB468细胞中CD73的表达水平明显增加(图18A中右侧的两个条形)。
实施例17：通过ZAP测定法测量的衰老细胞杀伤
ZAP测定法根据ZAP测定试剂盒的制造商Advanced Targeting Systems推荐的方案进行。
由于观察到帕波西比处理在MDA-MB231细胞中诱导CD73表达增加的衰老细胞，因此对MDA-MB231细胞进行细胞杀伤测定(ZAP测定)。简而言之，将细胞以4×103个细胞/孔接种在96孔板中并培养过夜。将培养的细胞分成两批：一批用1μM的帕波西比羟乙基磺酸盐处理7天，另一批未用帕波西比羟乙基磺酸盐处理。
在ZAP测定中使用两种类型的MDA-MB231细胞。在以下四组中测定每种类型的细胞：使用BAP147-CD73(条件活性抗CD73抗体)、B12(同种型阴性对照)、皂草素(阴性对照)以及仅使用培养基(阴性对照)的ZAP测定。ZAP测定进行了72小时。
使用条件活性抗CD73抗体和阴性对照的细胞杀伤结果示于图18B中。Y轴的OD450nm值表示活细胞的总数。培养基对用帕波西比处理过的细胞和未经处理的细胞具有类似的作用，这表明培养基对衰老细胞没有细胞杀伤活性。与未经处理的细胞相比，条件活性抗CD73抗体导致用帕波西比处理过的细胞的细胞数量明显减少，这表明条件活性抗CD73抗体对衰老细胞具有明显的细胞杀伤活性。
与未经处理的细胞相比，B12似乎对用帕波西比处理过的细胞具有较小的影响，这表明B12对衰老细胞具有较小且不太明显的细胞杀伤能力。有趣的是，与B12相比，皂草素也导致衰老细胞数量的类似小幅度减少。见图18B。
该实施例证明条件活性抗CD73抗体可靶向在帕波西比诱导的衰老细胞中过表达的CD73，从而杀死大量的衰老细胞。
本文提及的所有文献均通过引用整体并入本文，或者提供其特别依赖的公开内容。申请人不打算将任何公开的实施方案奉献给公众，并且因此任何所公开的改变或者变化，虽然字面上可能不在权利要求的范围内，但是在等同原则下也被认为是本发明的一部分。
然而，可以理解，尽管本发明的多个特征和优点已在前面的说明书与本发明的详细结构和功能一起作出了描述，但是这些内容仅仅是示例性的。因此，在本发明原理的范围至由表述所附权利要求的术语的广泛的普遍含义所表示的整个范围，可进行细节的改变，尤其是部件的形状、尺寸和布置。
序列表
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杰·M·肖特
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<211> 505
<212> PRT
<213> 人类
<400> 1
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Asn Ser Ser Ala Gly Trp Lys Asn Ser Ile Arg His Asn Leu Ser Leu
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His Ser Lys Phe Ile Lys Val His Asn Glu Ala Thr Gly Lys Ser Ser
165 170 175
Trp Trp Met Leu Asn Pro Glu Gly Gly Lys Ser Gly Lys Ala Pro Arg
180 185 190
Arg Arg Ala Ala Ser Met Asp Ser Ser Ser Lys Leu Leu Arg Gly Arg
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Ser Lys Ala Pro Lys Lys Lys Pro Ser Val Leu Pro Ala Pro Pro Glu
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Gly Ala Thr Pro Thr Ser Pro Val Gly His Phe Ala Lys Trp Ser Gly
225 230 235 240
Ser Pro Cys Ser Arg Asn Arg Glu Glu Ala Asp Met Trp Thr Thr Phe
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Arg Pro Arg Ser Ser Ser Asn Ala Ser Ser Val Ser Thr Arg Leu Ser
260 265 270
Pro Leu Arg Pro Glu Ser Glu Val Leu Ala Glu Glu Ile Pro Ala Ser
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Val Ser Ser Tyr Ala Gly Gly Val Pro Pro Thr Leu Asn Glu Gly Leu
290 295 300
Glu Leu Leu Asp Gly Leu Asn Leu Thr Ser Ser His Ser Leu Leu Ser
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Arg Ser Gly Leu Ser Gly Phe Ser Leu Gln His Pro Gly Val Thr Gly
325 330 335
Pro Leu His Thr Tyr Ser Ser Ser Leu Phe Ser Pro Ala Glu Gly Pro
340 345 350
Leu Ser Ala Gly Glu Gly Cys Phe Ser Ser Ser Gln Ala Leu Glu Ala
355 360 365
Leu Leu Thr Ser Asp Thr Pro Pro Pro Pro Ala Asp Val Leu Met Thr
370 375 380
Gln Val Asp Pro Ile Leu Ser Gln Ala Pro Thr Leu Leu Leu Leu Gly
385 390 395 400
Gly Leu Pro Ser Ser Ser Lys Leu Ala Thr Gly Val Gly Leu Cys Pro
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Lys Pro Leu Glu Ala Pro Gly Pro Ser Ser Leu Val Pro Thr Leu Ser
420 425 430
Met Ile Ala Pro Pro Pro Val Met Ala Ser Ala Pro Ile Pro Lys Ala
435 440 445
Leu Gly Thr Pro Val Leu Thr Pro Pro Thr Glu Ala Ala Ser Gln Asp
450 455 460
Arg Met Pro Gln Asp Leu Asp Leu Asp Met Tyr Met Glu Asn Leu Glu
465 470 475 480
Cys Asp Met Asp Asn Ile Ile Ser Asp Leu Met Asp Glu Gly Glu Gly
485 490 495
Leu Asp Phe Asn Phe Glu Pro Asp Pro
500 505
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<212> PRT
<213> 人类
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Met Asp Pro Gly Asn Glu Asn Ser Ala Thr Glu Ala Ala Ala Ile Ile
1 5 10 15
Asp Leu Asp Pro Asp Phe Glu Pro Gln Ser Arg Pro Arg Ser Cys Thr
20 25 30
Trp Pro Leu Pro Arg Pro Glu Ile Ala Asn Gln Pro Ser Glu Pro Pro
35 40 45
Glu Val Glu Pro Asp Leu Gly Glu Lys Ala Ile Glu Ser Ala Pro Glu
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Pro Tyr Phe Lys Asp Lys Gly Asp Ser Asn Ser Ser Ala Gly Trp Lys
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Ser Leu Gln His Pro Gly Val Thr Gly Pro Leu His Thr Tyr Ser Ser
275 280 285
Ser Leu Phe Ser Pro Ala Glu Gly Pro Leu Ser Ala Gly Glu Gly Cys
290 295 300
Phe Ser Ser Ser Gln Ala Leu Glu Ala Leu Leu Thr Ser Asp Thr Pro
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Pro Pro Pro Ala Asp Val Leu Met Thr Gln Val Asp Pro Ile Leu Ser
325 330 335
Gln Ala Pro Thr Leu Leu Leu Leu Gly Gly Leu Pro Ser Ser Ser Lys
340 345 350
Leu Ala Thr Gly Val Gly Leu Cys Pro Lys Pro Leu Glu Ala Pro Gly
355 360 365
Pro Ser Ser Leu Val Pro Thr Leu Ser Met Ile Ala Pro Pro Pro Val
370 375 380
Met Ala Ser Ala Pro Ile Pro Lys Ala Leu Gly Thr Pro Val Leu Thr
385 390 395 400
Pro Pro Thr Glu Ala Ala Ser Gln Asp Arg Met Pro Gln Asp Leu Asp
405 410 415
Leu Asp Met Tyr Met Glu Asn Leu Glu Cys Asp Met Asp Asn Ile Ile
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Ser Asp Leu Met Asp Glu Gly Glu Gly Leu Asp Phe Asn Phe Glu Pro
435 440 445
Asp Pro
450
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<212> PRT
<213> 人类
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Ile Leu Gly Ala Val Thr Gly Pro Arg Lys Gly Gly Ser Arg Arg Asn
1 5 10 15
Ala Trp Gly Asn Gln Ser Tyr Ala Glu Leu Ile Ser Gln Ala Ile Glu
20 25 30
Ser Ala Pro Glu Lys Arg Leu Thr Leu Ala Gln Ile Tyr Glu Trp Met
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Val Arg Thr Val Pro Tyr Phe Lys Asp Lys Gly Asp Ser Asn Ser Ser
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Ala Gly Trp Lys Asn Ser Ile Arg His Asn Leu Ser Leu His Ser Lys
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Leu Asn Pro Glu Gly Gly Lys Ser Gly Lys Ala Pro Arg Arg Arg Ala
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Ala Ser Met Asp Ser Ser Ser
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<212> PRT
<213> 人类
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Pro Arg Lys Gly Gly Ser Arg Arg Asn Ala Trp Gly Asn Gln Ser Tyr
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Ala Glu Leu Ile Ser Gln Ala Ile Glu Ser Ala Pro Glu Lys Arg Leu
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Thr Leu
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<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 全部使用D氨基酸的合成序列
<400> 5
Leu Thr Leu Arg Lys Glu Pro Ala Ser Glu Ile Ala Gln Ser Ile Leu
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Glu Ala Tyr Ser Gln Asn Gly Trp Ala Asn Arg Arg Ser Gly Gly Lys
20 25 30
Arg Pro
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<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 全部使用D氨基酸的合成序列
<400> 6
Leu Thr Leu Arg Lys Glu Pro Ala Ser Glu Ile Ala Gln Ser Ile Leu
1 5 10 15
Glu Ala Tyr Ser Gln Asn Gly Trp Ala Asn Arg Arg Ser Gly Gly Lys
20 25 30
Arg Pro Pro Pro Arg Arg Arg Gln Arg Arg Lys Lys Arg Gly
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<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 全部使用D氨基酸的合成序列
<400> 7
Ser Glu Ile Ala Gln Ser Ile Leu Glu Ala Tyr Ser Gln Asn Gly Trp
1 5 10 15
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<212> PRT
<213> 人类
<400> 8
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1 5 10 15
Asp Ser Thr Phe Thr Val Leu Lys Arg Tyr Gln Asn Leu Lys Pro Ile
20 25 30
Gly Ser Gly Ala Gln Gly Ile Val Cys Ala Ala Tyr Asp Ala Ile Leu
35 40 45
Glu Arg Asn Val Ala Ile Lys Lys Leu Ser Arg Pro Phe Gln Asn Gln
50 55 60
Thr His Ala Lys Arg Ala Tyr Arg Glu Leu Val Leu Met Lys Cys Val
65 70 75 80
Asn His Lys Asn Ile Ile Gly Leu Leu Asn Val Phe Thr Pro Gln Lys
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Ser Leu Glu Glu Phe Gln Asp Val Tyr Ile Val Met Glu Leu Met Asp
100 105 110
Ala Asn Leu Cys Gln Val Ile Gln Met Glu Leu Asp His Glu Arg Met
115 120 125
Ser Tyr Leu Leu Tyr Gln Met Leu Cys Gly Ile Lys His Leu His Ser
130 135 140
Ala Gly Ile Ile His Arg Asp Leu Lys Pro Ser Asn Ile Val Val Lys
145 150 155 160
Ser Asp Cys Thr Leu Lys Ile Leu Asp Phe Gly Leu Ala Arg Thr Ala
165 170 175
Gly Thr Ser Phe Met Met Thr Pro Tyr Val Val Thr Arg Tyr Tyr Arg
180 185 190
Ala Pro Glu Val Ile Leu Gly Met Gly Tyr Lys Glu Asn Val Asp Leu
195 200 205
Trp Ser Val Gly Cys Ile Met Gly Glu Met Val Cys His Lys Ile Leu
210 215 220
Phe Pro Gly Arg Asp Tyr Ile Asp Gln Trp Asn Lys Val Ile Glu Gln
225 230 235 240
Leu Gly Thr Pro Cys Pro Glu Phe Met Lys Lys Leu Gln Pro Thr Val
245 250 255
Arg Thr Tyr Val Glu Asn Arg Pro Lys Tyr Ala Gly Tyr Ser Phe Glu
260 265 270
Lys Leu Phe Pro Asp Val Leu Phe Pro Ala Asp Ser Glu His Asn Lys
275 280 285
Leu Lys Ala Ser Gln Ala Arg Asp Leu Leu Ser Lys Met Leu Val Ile
290 295 300
Asp Ala Ser Lys Arg Ile Ser Val Asp Glu Ala Leu Gln His Pro Tyr
305 310 315 320
Ile Asn Val Trp Tyr Asp Pro Ser Glu Ala Glu Ala Pro Pro Pro Lys
325 330 335
Ile Pro Asp Lys Gln Leu Asp Glu Arg Glu His Thr Ile Glu Glu Trp
340 345 350
Lys Glu Leu Ile Tyr Lys Glu Val Met Asp Leu Glu Glu Arg Thr Lys
355 360 365
Asn Gly Val Ile Arg Gly Gln Pro Ser Pro Leu Ala Gln Val Gln Gln
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<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 全部为D氨基酸的合成序列
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Asp Gln Ser Arg Pro Val Gln Pro Phe Leu Gln Leu Thr Thr Pro Arg
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Lys Pro
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<212> PRT
<213> 人工的
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<223> 添加到DRI肽的合成序列
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Pro Pro Arg Arg Arg Gln Arg Arg Lys Lys Arg Gly
1 5 10
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<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 合成序列细胞可渗透肽
<400> 11
Gly Ala Leu Phe Leu Gly Phe Leu Gly Ala Ala Gly Ser Thr Met Gly
1 5 10 15
Ala Trp Ser Gln Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val
20 25
<210> 12
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 合成序列细胞可渗透肽
<400> 12
Lys Glu Thr Trp Trp Glu Thr Trp Trp Thr Glu Trp Ser Gln Pro Lys
1 5 10 15
Lys Lys Arg Lys Val
20
<210> 13
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 合成序列细胞可渗透肽
<400> 13
Gly Leu Trp Arg Ala Leu Trp Arg Leu Leu Arg Ser Leu Trp Arg Leu
1 5 10 15
Leu Trp Arg Ala
20
<210> 14
<211> 2
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 合成序列
<220>
<221> 内部序列重复的范围(repeat)
<222> (1)..(2)
<223> 该段重复n次，其中n是大于0的整数
<400> 14
Gly Ser
1
<210> 15
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 合成序列
<220>
<221> 内部序列重复的范围(repeat)
<222> (1)..(3)
<223> 该段重复n次，其中n是大于0的整数
<400> 15
Gly Gly Ser
1
<210> 16
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 合成序列
<220>
<221> 内部序列重复的范围(repeat)
<222> (1)..(4)
<223> 该段重复n次，其中n是大于0的整数
<400> 16
Gly Ser Gly Gly Ser
1 5
<210> 17
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 合成序列
<220>
<221> 内部序列重复的范围(repeat)
<222> (1)..(4)
<223> 该段重复n次，其中n是大于0的整数
<400> 17
Gly Ser Gly Gly Ser
1 5
<210> 18
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 合成序列
<220>
<221> 内部序列重复的范围(repeat)
<222> (1)..(4)
<223> 该段重复n次，其中n是大于0的整数
<400> 18
Gly Gly Gly Ser
1
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<211> 4
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 合成序列
<400> 19
Gly Gly Ser Gly
1
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<211> 5
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 合成序列
<400> 20
Gly Gly Ser Gly Gly
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<211> 5
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 合成序列
<400> 21
Gly Ser Gly Ser Gly
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<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 合成序列
<400> 22
Gly Ser Gly Gly Gly
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<211> 5
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
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<213> 人工的
<220>
<223> 合成序列
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<212> PRT
<213> 人工的
<220>
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 合成序列
<400> 26
Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly
1 5 10
<210> 27
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 合成序列
<400> 27
Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 28
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 合成序列
<400> 28
Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 29
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 合成序列
<400> 29
Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly
1 5 10
<210> 30
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 合成序列
<400> 30
Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Ser
1 5 10
<210> 31
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 合成序列
<400> 31
Gly Ser Ser Gly Thr
1 5
<210> 32
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 合成序列
<400> 32
Gly Ser Ser Gly
1
<210> 33
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 合成序列
<400> 33
Pro Leu Gly Leu Trp Ala
1 5
<210> 34
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 合成序列
<400> 34
Gly Pro Gln Gly Ile Ala Gly Gln
1 5
<210> 35
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 合成序列
<400> 35
Tyr Gly Leu Leu Gly Ile Ala Gly Pro Pro Gly Pro
1 5 10
<210> 36
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 合成序列
<400> 36
Ser Pro Gly Arg Val Val Arg Gly
1 5
<210> 37
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 合成序列
<400> 37
Val Arg Gly
1
<210> 38
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 合成序列
<400> 38
Pro Thr Asn
1
<210> 39
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 合成序列
<400> 39
Pro Asn Asn
1
<210> 40
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 合成序列
<400> 40
Pro Ala Asn
1
<210> 41
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 合成序列
<400> 41
Pro Pro Asn
1
<210> 42
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 合成序列
<400> 42
Thr Thr Asn
1
<210> 43
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 合成序列
<400> 43
Thr Asn Asn
1
<210> 44
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 合成序列
<400> 44
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1
<210> 45
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 合成序列
<400> 45
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1
<210> 46
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 合成序列
<400> 46
Asn Thr Asn
1
<210> 47
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 合成序列
<400> 47
Asn Asn Asn
1
<210> 48
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 合成序列
<400> 48
Asn Ala Asn
1
<210> 49
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 合成序列
<400> 49
Asn Pro Asn
1
<210> 50
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 合成序列
<400> 50
Ala Thr Asn
1
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<211> 3
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 合成序列
<400> 51
Ala Asn Asn
1
<210> 52
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 合成序列
<400> 52
Ala Ala Asn
1
<210> 53
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 合成序列
<400> 53
Ala Pro Asn
1
<210> 54
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 合成序列
<400> 54
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1
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<211> 4
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 合成序列
<400> 55
Thr Thr Asn Ala
1
<210> 56
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 合成序列
<400> 56
Pro Thr Asn Leu
1
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<211> 4
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 合成序列
<400> 57
Pro Thr Asn Ala
1
<210> 58
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 合成序列
<400> 58
Pro Asn Asn Leu
1
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<211> 4
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 合成序列
<400> 59
Pro Asn Asn Ala
1
<210> 60
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 合成序列
<400> 60
Thr Asn Asn Leu
1
<210> 61
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 合成序列
<400> 61
Thr Asn Asn Ala
1
<210> 62
<211> 2
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 合成序列
<400> 62
Asn Lys
1
<210> 63
<211> 2
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 合成序列
<400> 63
Asn Leu
1
<210> 64
<211> 2
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 合成序列
<400> 64
Asn Ala
1
<210> 65
<211> 2
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 合成序列
<400> 65
Asn Glu
1
<210> 66
<211> 2
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 合成序列
<400> 66
Asn Asp
1
<210> 67
<211> 2
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 合成序列
<400> 67
Asn Asn
1

Claims (70)

1.一种由结合与衰老细胞相关的靶标的亲本抗体或抗体片段制备结合所述与衰老细胞相关的靶标的溶解衰老细胞的(senolytic)的条件活性抗体或抗体片段的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)使用一种或多种演变技术来演变编码所述亲本抗体或抗体片段的DNA以产生突变DNA；
(ii)表达所述突变DNA以获得突变抗体或抗体片段；
(iii)使所述突变抗体或抗体片段在所述衰老细胞的为5.5-7.0的细胞外pH下进行靶标结合活性测试，并在为7.2-7.8的正常生理pH下进行靶标结合活性测试；和
(iv)从经历步骤(iii)的测试的突变抗体或抗体片段中选择表现出以下中的至少一种特性的溶解衰老细胞的条件活性抗体或抗体片段：
(a)在所述7.2-7.8的正常生理pH下的测试中的靶标结合活性与相同测试中的所述亲本抗体或抗体片段的同一结合活性相比降低，而在所述衰老细胞的为5.5-7.0的细胞外pH下的测试中的靶标结合活性与在所述7.2-7.8的正常生理pH下的测试中的所述溶解衰老细胞的条件活性抗体或抗体片段的同一靶标结合活性相比增加；和
(b)在所述7.2-7.8的正常生理pH下的测试中的靶标结合活性与相同测试中的所述亲本抗体或抗体片段的同一靶标结合活性相比降低，而在所述衰老细胞为5.5-7.0的的细胞外pH下的测试中的靶标结合活性与在所述衰老细胞的为5.5-7.0的细胞外pH下的测试中的所述亲本抗体或抗体片段的同一靶标结合活性相比增加；
其中所述靶标选自APC、ARHGAP1、ARMCX-3、AXL、B2MG、BCL2L1、CAPNS2、CD261、CD39、CD54、CD73、CD95、CDC42、CDKN2C、CLYBL、COPG1、CRKL、DCR1、DCR2、DCR3、DEP1、DGKA、EBP、EBP50、FASL、FGF1、GBA3、GIT2、ICAM1、ICAM3、IGF1、ISG20、ITGAV、KITLG、LaminB1、LANCL1、LCMT2、LPHN1、MADCAM1、MAG、MAP3K14、MAPK、MEF2C、miR22、MMP3、MTHFD2、NAIP、NAPG、NCKAP1、连接素4(Nectin4)、NNMT、NOTCH3、NTAL、OPG、OSBPL3、p16、p16INK4a、p19、p21、p53、PAI1、PARK2、PFN1、PGM、PLD3、PMS2、POU5F1、PPP1A、PPP1CB、PRKRA、PRPF19、PRTG、RAC1、RAPGEF1、RET、Smurf2、STX4、VAMP3、VIT、VPS26A、WEE1、YAP1、YH2AX和YWHAE。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述亲本抗体或抗体片段为抗体。
3.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中所述溶解衰老细胞的条件活性抗体或抗体片段在所述衰老细胞的为5.5-7.0的细胞外pH下的测试中的结合活性与所述溶解衰老细胞的条件活性抗体或抗体片段在7.2-7.8的正常生理pH下的测试中的结合活性的比为1.3:1至20:1。
4.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中所述衰老细胞的细胞外pH为6.0至7.0。
5.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中所述衰老细胞的细胞外pH为6.2至6.8。
6.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中所述正常生理pH为7.2至7.6。
7.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中所述正常生理pH为7.4至7.6。
8.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中在所述正常生理pH下的测试和在所述衰老细胞的细胞外pH下的测试在含有选自无机化合物、离子和有机分子的至少一种组分的测试溶液中进行。
9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述至少一种组分在用于所述正常生理pH下的测试和用于所述衰老细胞的细胞外pH下的测试的测试溶液中具有相同的浓度。
10.根据权利要求8所述的方法，其中所述至少一种组分是无机化合物，并且选自硼酸、氯化钙、硝酸钙、磷酸二铵、硫酸镁、磷酸一铵、磷酸一钾、氯化钾、硫酸钾、硫酸铜、硫酸铁、硫酸锰、硫酸锌、硫酸镁、硝酸钙、钙螯合物、铜螯合物、铁螯合物、铁螯合物、锰螯合物、锌螯合物、钼酸铵、硫酸铵、碳酸钙、磷酸镁、碳酸氢钾、硝酸钾、盐酸、二氧化碳、硫酸、磷酸、碳酸、尿酸、氯化氢和尿素。
11.根据权利要求8所述的方法，其中所述至少一种组分是离子，并且选自磷离子、硫离子、氯离子、镁离子、钠离子、钾离子、铵离子、铁离子、锌离子和铜离子。
12.根据权利要求8所述的方法，其中所述至少一种组分为选自浓度范围为2-7.0mg/dL的尿酸、浓度范围为8.2-11.6mg/dL的钙离子、浓度范围为355-381mg/dL的氯离子、浓度范围为0.028-0.210mg/dL的铁离子、浓度范围为12.1-25.4mg/dL的钾离子、浓度范围为300-330mg/dL的钠离子和浓度范围为15-30mM的碳酸中的一种或多种。
13.根据权利要求8所述的方法，其中所述至少一种组分是有机分子，并且是选自组氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、精氨酸、亮氨酸、天冬酰胺、赖氨酸、天冬氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、色氨酸、甘氨酸、缬氨酸、吡咯赖氨酸、脯氨酸、硒代半胱氨酸、丝氨酸和酪氨酸的氨基酸。
14.根据权利要求8所述的方法，其中所述至少一种组分是有机分子，并且是选自柠檬酸、α-酮戊二酸、琥珀酸、苹果酸、富马酸、乙酰乙酸、β-羟基丁酸、乳酸、丙酮酸、α-酮酸、乙酸和挥发性脂肪酸的有机酸。
15.根据权利要求8所述的方法，其中所述至少一种组分是有机分子，并且是选自葡萄糖、戊糖、己糖、木糖、核糖、甘露糖、半乳糖、乳糖、GlcNAcβ1-3Gal、Galα1-4Gal、Manα1-2Man、GalNAcβ1-3Gal和O-糖苷、N-糖苷、C-糖苷和S-糖苷的糖。
16.根据权利要求8所述的方法，其中所述至少一种组分是离子并且选自镁离子、硫酸根离子、硫酸氢根离子、碳酸根离子、碳酸氢根离子、硝酸根离子、亚硝酸根离子、磷酸根离子、磷酸氢根离子、磷酸二氢根离离子、过硫酸根离子、单过硫酸根子、硼酸根离子和铵离子。
17.根据权利要求1所述的方法，其中在含有至少一种分子量小于900a.m.u且pKa与所述衰老细胞的细胞外pH相差至多0.5、1、2、3或4个pH单位的物质的测试溶液中进行所述一种或多种测试。
18.根据权利要求1所述的方法，其中在含有至少一种分子量小于900a.m.u的物质的测试溶液中进行所述一种或多种测试，并且
所述物质具有在所述衰老细胞的细胞外pH和所述正常生理pH之间的pKa。
19.根据权利要求1所述的方法，其中在含有选自组氨酸、组胺、氢化腺苷二磷酸、氢化腺苷三磷酸、柠檬酸盐、碳酸氢盐、乙酸盐、乳酸盐、二硫化物、硫化氢、铵和磷酸二氢盐的至少一种物质的测试溶液中进行所述一种或多种测试。
20.根据权利要求1所述的方法，其中所述选择步骤(iv)包括选择表现出以下特性的溶解衰老细胞的条件活性抗体或抗体片段：(a)在所述为7.2-7.8的正常生理pH下的测试中的靶标结合活性与相同测试中的所述亲本抗体或抗体片段的同一活性相比降低，而在所述衰老细胞的为5.5-7.0的细胞外pH下的测试中的靶标结合活性与在所述为7.2-7.8的正常生理pH下的测试中的所述溶解衰老细胞的条件活性抗体或抗体片段的同一靶标结合活性相比增加。
21.根据权利要求1所述的方法，其中所述选择步骤(iv)包括选择表现出以下特性的溶解衰老细胞的条件活性抗体或抗体片段：(b)在所述为7.2-7.8的正常生理pH下的测试中的靶标结合活性与相同测试中的所述亲本抗体或抗体片段的同一靶标结合活性相比降低，而在所述衰老细胞的为5.5-7.0的细胞外pH下的测试中的靶标结合活性与所述衰老细胞的为5.5-7.0的细胞外pH下的测试中的所述亲本抗体或抗体片段的同一靶标结合活性相比增加。
22.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中所述溶解衰老细胞的条件活性抗体或抗体片段是条件活性抗体，并且所述方法还包括通过接头将所述条件活性抗体与掩蔽部分缀合的步骤。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述掩蔽部分将所述条件活性抗体与所述靶标结合的活性降低50％至100％。
24.根据权利要求22所述的方法，其中所述接头与所述条件活性抗体的可变区共价键合。
25.根据权利要求22所述的方法，其中所述掩蔽部分特异性结合所述条件活性抗体的可变区。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述掩蔽部分与所述靶标的序列同一性为5％至80％。
27.根据权利要求22所述的方法，其中所述接头包含柔性区和切割位点。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述柔性区基本上由选自甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸的至少一种氨基酸组成。
29.根据权利要求27所述的方法，其中所述柔性区的长度为1个氨基酸至20个氨基酸。
30.根据权利要求27所述的方法，其中所述切割位点可以在所述衰老细胞的细胞外环境中被蛋白酶切割。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述蛋白酶为选自ADAM10、ADAM12、ADAM17、ADAMTS、ADAMTS5、BACE、半胱天冬酶1-14、组织蛋白酶A、组织蛋白酶B、组织蛋白酶D、组织蛋白酶E、组织蛋白酶K、组织蛋白酶S、FAP、MT1-MMP、颗粒酶B、胍基苯甲酸酶、丝氨酸蛋白酶、人中性粒细胞弹性蛋白酶、豆荚蛋白酶、蛋白裂解酶2、穿膜肽酶、MMP1-17、MT-SP1、脑啡肽酶、NS3/4A、纤溶酶、PSA、PSMA、TRACE、TMPRSS 3、TMPRSS 4和uPA中的至少一种。
32.根据权利要求1所述的方法，其还包括通过接头将所述溶解衰老细胞的条件活性抗体或抗体片段与细胞毒性药物、细胞抑制药物或抗增殖药物缀合的步骤。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述接头包含切割位点，所述切割位点可以在所述衰老细胞的细胞外环境中被蛋白酶切割。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述蛋白酶为选自ADAM10、ADAM12、ADAM17、ADAMTS、ADAMTS5、BACE、半胱天冬酶1-14、组织蛋白酶A、组织蛋白酶B、组织蛋白酶D、组织蛋白酶E、组织蛋白酶K、组织蛋白酶S、FAP、MT1-MMP、颗粒酶B、胍基苯甲酸酶、丝氨酸蛋白酶、人中性粒细胞弹性蛋白酶、豆荚蛋白酶、蛋白裂解酶2、穿膜肽酶、MMP1-17、MT-SP1、脑啡肽酶、NS3/4A、纤溶酶、PSA、PSMA、TRACE、TMPRSS 3、TMPRSS 4和uPA中的至少一种。
35.根据权利要求32所述的方法，其中所述抗增殖药物是化学治疗药物。
36.根据权利要求1所述的方法，其还包括将所述溶解衰老细胞的条件活性抗体或抗体片段与选自毒性剂、放射性剂或D-反向-翻转肽的药剂缀合的步骤。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述溶解衰老细胞的条件活性抗体或抗体片段是条件活性抗体。
38.根据权利要求36所述的方法，其中所述D-反向-翻转肽的氨基酸序列与天然蛋白的片段或全长的反向序列具有70％至100％的氨基酸序列同一性。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述天然蛋白为选自FOXO4、AMPK、JNK、MST1、CK1、STAT3、p38、PRMT1和ASK1中的至少一种。
40.根据权利要求36所述的方法，其中所述D-反向-翻转肽的长度为至多5个氨基酸残基。
41.根据权利要求36所述的方法，其中所述D-反向-翻转肽的至多60％的氨基酸残基为L氨基酸残基。
42.根据权利要求36所述的方法，其中所述D-反向-翻转肽具有100％的D氨基酸残基。
43.根据权利要求36所述的方法，其中所述D-反向-翻转肽包含选自PPRRRQRRKKRG(SEQID NO：10)、GALFLGFLGA AGSTMGAWSQ PKKKRKV(SEQ ID NO：11)、KETWWETWWT EWSQPKKKRKV(SEQ ID NO：12)、Ac-GLWRALWRLLRSLWRLLWRA-Cya(SEQ ID NO：13)和八精氨酸的一个或多个功能结构域。
44.根据权利要求37所述的方法，其中所述D-反向-翻转肽包含LTLRKEPASEIAQSILEAYS QNGWANRRSG GKRP(SEQ ID NO：5)、LTLRKEPASE IAQSILEAYS QNGWANRRSGGKRPPPRRRQ RRKKRG(SEQ ID NO：6)或SEIAQSILEAYSQNGW(SEQ ID NO：7)。
45.根据权利要求1-2中任一项所述的方法制备的溶解衰老细胞的条件活性抗体或抗体片段。
46.根据权利要求45所述的溶解衰老细胞的条件活性抗体或抗体片段，其中所述溶解衰老细胞条件活性抗体或抗体片段是抗体。
47.根据权利要求46所述的溶解衰老细胞的条件活性抗体或抗体片段，其中所述抗体是单链抗体或抗体片段。
48.根据权利要求46所述的溶解衰老细胞的条件活性抗体或抗体片段，其中所述抗体是人源化抗体。
49.根据权利要求46所述的溶解衰老细胞的条件活性抗体或抗体片段，其中所述抗体是双特异性抗体。
50.根据权利要求46所述的溶解衰老细胞的条件活性抗体或抗体片段，其中所述抗体适合被工程化改造为T细胞的嵌合抗原受体的一部分。
51.根据权利要求45所述的溶解衰老细胞的条件活性抗体或抗体片段，其中所述溶解衰老细胞的条件活性抗体或抗体片段是通过接头与掩蔽部分缀合的条件活性抗体。
52.根据权利要求51所述溶解衰老细胞的的条件活性抗体或抗体片段，其中所述掩蔽部分将所述条件活性抗体与所述靶标的结合活性降低50％至100％。
53.根据权利要求51所述的溶解衰老细胞的条件活性抗体或抗体片段，其中所述接头与所述条件活性抗体的可变区共价键合。
54.根据权利要求51所述的溶解衰老细胞的条件活性抗体或抗体片段，其中所述接头包含柔性区和切割位点。
55.根据权利要求54所述的溶解衰老细胞的条件活性抗体或抗体片段，其中所述切割位点可以在衰老细胞的细胞外环境中被蛋白酶切割。
56.根据权利要求55所述的溶解衰老细胞的条件活性抗体或抗体片段，其中所述蛋白酶为选自ADAM10、ADAM12、ADAM17、ADAMTS、ADAMTS5、BACE、半胱天冬酶1-14、组织蛋白酶A、组织蛋白酶B、组织蛋白酶D、组织蛋白酶E、组织蛋白酶K、组织蛋白酶S、FAP、MT1-MMP、颗粒酶B、胍基苯甲酸酶、丝氨酸蛋白酶、人中性粒细胞弹性蛋白酶、豆荚蛋白酶、蛋白裂解酶2、穿膜肽酶、MMP1-17、MT-SP1、脑啡肽酶、NS3/4A、纤溶酶、PSA、PSMA、TRACE、TMPRSS 3、TMPRSS4和uPA中的至少一种。
57.根据权利要求45所述的溶解衰老细胞的条件活性抗体或抗体片段，其中所述溶解衰老细胞的条件活性抗体或抗体片段通过接头与细胞毒性药物、细胞抑制药物或抗增殖药物缀合。
58.根据权利要求57所述的溶解衰老细胞的条件活性抗体或抗体片段，其中所述接头包含衰老细胞的细胞外环境中的蛋白酶的切割位点。
59.根据权利要求58所述的溶解衰老细胞的条件活性抗体或抗体片段，其中所述蛋白酶为选自ADAM10、ADAM12、ADAM17、ADAMTS、ADAMTS5、BACE、半胱天冬酶1-14、组织蛋白酶A、组织蛋白酶B、组织蛋白酶D、组织蛋白酶E、组织蛋白酶K、组织蛋白酶S、FAP、MT1-MMP、颗粒酶B、胍基苯甲酸酶、丝氨酸蛋白酶、人中性粒细胞弹性蛋白酶、豆荚蛋白酶、蛋白裂解酶2、穿膜肽酶、MMP1-17、MT-SP1、脑啡肽酶、NS3/4A、纤溶酶、PSA、PSMA、TRACE、TMPRSS 3、TMPRSS4和uPA中的至少一种。
60.根据权利要求57所述的溶解衰老细胞的条件活性抗体或抗体片段，其中所述抗增殖药物是化学治疗药物。
61.一种药物组合物，其包含有效量的权利要求45所述的溶解衰老细胞的条件活性抗体或抗体片段和药学上可接受的载体。
62.权利要求45所述的溶解衰老细胞的条件活性抗体或抗体片段或权利要求61所述的药物组合物在制备用于治疗以下之一的药物中的应用：衰老以及与衰老细胞相关的疾病或病症。
63.根据权利要求62所述的应用，其中所述与衰老细胞相关的疾病或病症为选自认知疾病、心血管疾病、代谢疾病和病症、运动功能疾病和病症、脑血管病、肺气肿、骨关节炎、肺病、炎症/自身免疫疾病和病症、眼科疾病或病症、转移、化学疗法或放射疗法副作用、衰老相关的疾病和病症、纤维化疾病和病症中的至少一种。
64.一种由结合靶标的亲本抗体或抗体片段产生结合所述靶标的分子量小于3000a.m.u的溶解衰老细胞的条件活性抗体或抗体片段的方法，其包括以下步骤：
通过将一个或多个部分带电的或带电的基团引入所述亲本抗体或抗体片段中来修饰所述亲本抗体或抗体片段，以产生一种或多种经修饰的抗体或抗体片段；
使所述一种或多种经修饰的抗体或抗体片段在衰老细胞的为5.5-7.0的细胞外pH下进行靶标结合活性测试，并在为7.2-7.8的正常生理pH下进行靶标结合活性测试；和
从所述经修饰的抗体或抗体片段中选择表现出以下至少一种特性的溶解衰老细胞的条件活性抗体或抗体片段：
(a)在所述7.2-7.8的正常生理pH下的测试中的靶标结合活性与相同测试中所述亲本抗体或抗体片段的同一靶标结合活性相比降低，而在所述衰老细胞的为5.5-7.0的细胞外pH下的测试中的靶标结合活性与在所述7.2-7.8的正常生理pH下的测试中所述溶解衰老细胞的条件活性抗体或抗体片段的同一靶标结合活性相比增加；和
(b)在所述7.2-7.8的正常生理pH下的测试中的靶标结合活性与相同测试中的所述亲本抗体或抗体片段的同一靶标结合活性相比降低，而在所述衰老细胞为5.5-7.0的的细胞外pH下的测试中的靶标结合活性与在所述衰老细胞的为5.5-7.0的细胞外pH下的测试中的所述亲本抗体或抗体片段的同一靶标结合活性相比增加；
其中所述靶标选自APC、ARHGAP1、ARMCX-3、AXL、B2MG、BCL2L1、CAPNS2、CD261、CD39、CD54、CD73、CD95、CDC42、CDKN2C、CLYBL、COPG1、CRKL、DCR1、DCR2、DCR3、DEP1、DGKA、EBP、EBP50、FASL、FGF1、GBA3、GIT2、ICAM1、ICAM3、IGF1、ISG20、ITGAV、KITLG、LaminB1、LANCL1、LCMT2、LPHN1、MADCAM1、MAG、MAP3K14、MAPK、MEF2C、miR22、MMP3、MTHFD2、NAIP、NAPG、NCKAP1、连接素4(Nectin4)、NNMT、NOTCH3、NTAL、OPG、OSBPL3、p16、p16INK4a、p19、p21、p53、PAI1、PARK2、PFN1、PGM、PLD3、PMS2、POU5F1、PPP1A、PPP1CB、PRKRA、PRPF19、PRTG、RAC1、RAPGEF1、RET、Smurf2、STX4、VAMP3、VIT、VPS26A、WEE1、YAP1、YH2AX和YWHAE。
65.一种由结合靶标的亲本抗体或抗体片段产生结合所述靶标的分子量小于3000a.m.u的溶解衰老细胞的条件活性抗体或抗体片段的方法，其包括以下步骤：
通过从所述亲本抗体或抗体片段中去除一个或多个部分带电的或带电的基团来修饰所述亲本抗体或抗体片段，以产生一种或多种经修饰的抗体或抗体片段；
使所述一种或多种经修饰的抗体或抗体片段在衰老细胞的为5.5-7.0的细胞外pH下进行靶标结合活性测试，并在为7.2-7.8的正常生理pH下进行靶标结合活性测试；和
从经历所述测试的所述经修饰的抗体或抗体片段中选择表现出以下至少一种特性的溶解衰老细胞的条件活性抗体或抗体片段：
(a)在所述7.2-7.8的正常生理pH下的测试中的靶标结合活性与相同测试中所述亲本抗体或抗体片段的同一靶标结合活性相比降低，而在所述衰老细胞的为5.5-7.0的细胞外pH下的测试中的靶标结合活性与在所述7.2-7.8的正常生理pH下的测试中所述溶解衰老细胞的条件活性抗体或抗体片段的同一靶标结合活性相比增加；和
(b)在所述7.2-7.8的正常生理pH下的测试中的靶标结合活性与相同测试中的所述亲本抗体或抗体片段的同一靶标结合活性相比降低，而在所述衰老细胞为5.5-7.0的的细胞外pH下的测试中的靶标结合活性与在所述衰老细胞的为5.5-7.0的细胞外pH下的测试中的所述亲本抗体或抗体片段的同一靶标结合活性相比增加；
其中所述靶标选自APC、ARHGAP1、ARMCX-3、AXL、B2MG、BCL2L1、CAPNS2、CD261、CD39、CD54、CD73、CD95、CDC42、CDKN2C、CLYBL、COPG1、CRKL、DCR1、DCR2、DCR3、DEP1、DGKA、EBP、EBP50、FASL、FGF1、GBA3、GIT2、ICAM1、ICAM3、IGF1、ISG20、ITGAV、KITLG、LaminB1、LANCL1、LCMT2、LPHN1、MADCAM1、MAG、MAP3K14、MAPK、MEF2C、miR22、MMP3、MTHFD2、NAIP、NAPG、NCKAP1、连接素4(Nectin4)、NNMT、NOTCH3、NTAL、OPG、OSBPL3、p16、p16INK4a、p19、p21、p53、PAI1、PARK2、PFN1、PGM、PLD3、PMS2、POU5F1、PPP1A、PPP1CB、PRKRA、PRPF19、PRTG、RAC1、RAPGEF1、RET、Smurf2、STX4、VAMP3、VIT、VPS26A、WEE1、YAP1、YH2AX和YWHAE。
66.一种由结合靶标的亲本抗体或抗体片段产生结合所述靶标的分子量小于3000a.m.u的溶解衰老细胞的条件活性抗体或抗体片段的方法，其包括以下步骤：
通过用一个或多个部分带电的或带电的基团取代所述亲本抗体或抗体片段的一个或多个基团来修饰所述亲本抗体或抗体片段，以产生一种或多种经修饰的抗体或抗体片段；
使所述一种或多种经修饰的抗体或抗体片段在衰老细胞的为5.5-7.0的细胞外pH下进行靶标结合活性测试，并在为7.2-7.8的正常生理pH下进行靶标结合活性测试；和
从经历所述测试的所述经修饰的抗体或抗体片段中选择表现出以下至少一种特性的溶解衰老细胞的条件活性抗体或抗体片段：
(a)在所述7.2-7.8的正常生理pH下的测试中的靶标结合活性与相同测试中所述亲本抗体或抗体片段的同一靶标结合活性相比降低，而在所述衰老细胞的为5.5-7.0的细胞外pH下的测试中的靶标结合活性与在所述7.2-7.8的正常生理pH下的测试中所述溶解衰老细胞的条件活性抗体或抗体片段的同一靶标结合活性相比增加；和
(b)在所述7.2-7.8的正常生理pH下的测试中的靶标结合活性与相同测试中的所述亲本抗体或抗体片段的同一靶标结合活性相比降低，而在所述衰老细胞为5.5-7.0的的细胞外pH下的测试中的靶标结合活性与在所述衰老细胞的为5.5-7.0的细胞外pH下的测试中的所述亲本抗体或抗体片段的同一靶标结合活性相比增加；
其中所述靶标选自APC、ARHGAP1、ARMCX-3、AXL、B2MG、BCL2L1、CAPNS2、CD261、CD39、CD54、CD73、CD95、CDC42、CDKN2C、CLYBL、COPG1、CRKL、DCR1、DCR2、DCR3、DEP1、DGKA、EBP、EBP50、FASL、FGF1、GBA3、GIT2、ICAM1、ICAM3、IGF1、ISG20、ITGAV、KITLG、LaminB1、LANCL1、LCMT2、LPHN1、MADCAM1、MAG、MAP3K14、MAPK、MEF2C、miR22、MMP3、MTHFD2、NAIP、NAPG、NCKAP1、连接素4(Nectin4)、NNMT、NOTCH3、NTAL、OPG、OSBPL3、p16、p16INK4a、p19、p21、p53、PAI1、PARK2、PFN1、PGM、PLD3、PMS2、POU5F1、PPP1A、PPP1CB、PRKRA、PRPF19、PRTG、RAC1、RAPGEF1、RET、Smurf2、STX4、VAMP3、VIT、VPS26A、WEE1、YAP1、YH2AX和YWHAE。
67.根据权利要求64-66中任一项所述的方法，其中所述亲本抗体或抗体片段的的分子量的范围为100a.m.u.至3000a.m.u.。
68.根据权利要求64-66中任一项所述的方法，其中所述衰老细胞的细胞外pH的范围为6.0至7.0。
69.根据权利要求64-66中任一项所述的方法，其中所述衰老细胞的细胞外pH的范围为6.2至6.8。
70.根据权利要求64-66中任一项所述的方法，其中所述正常生理pH的范围为7.2至7.6。
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