KR20160144846A

KR20160144846A - 세포 또는 개체의 노화를 감소시키기 위한 조성물 및 그의 용도

Info

Publication number: KR20160144846A
Application number: KR1020150081531A
Authority: KR
Inventors: 박준태; 박상철; 이영삼; 최고봉
Original assignee: 삼성전자주식회사
Priority date: 2015-06-09
Filing date: 2015-06-09
Publication date: 2016-12-19

Abstract

세포 또는 개체의 노화 수준을 감소시키기 위한 조성물, 세포의 ROS 수준을 증가 또는 감소시키는 물질을 스크리닝하는 방법, 상기 조성물을 이용한 세포 또는 개체에서 노화 수준을 감소시키는 방법, 및 세포 또는 개체에서 노화와 연관된 증상 또는 질병을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다. 이에 따르면, 세포의 ROS를 감소시키는 물질을 스크리닝하고, 스크리닝된 물질을 이용하여 세포 또는 개체의 노화 수준을 효율적으로 감소시키고, 노화와 연관된 증상 또는 질병을 효율적으로 예방 또는 치료할 수 있다.

Description

세포 또는 개체의 노화를 감소시키기 위한 조성물 및 그의 용도{Composition for reducing senescence of a cell or a subject and use thereof}

세포 또는 개체의 노화 수준을 감소시키기 위한 조성물, 세포의 ROS 수준을 증가 또는 감소시키는 물질을 스크리닝하는 방법, 상기 조성물을 이용한 세포 또는 개체에서 노화 수준을 감소시키는 방법, 및 세포 또는 개체에서 노화와 연관된 증상 또는 질병을 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다.

노화(senesence 또는 aging)는 나이가 들면서 일어나는 쇠퇴적인 현상을 말한다. 사람의 경우 노화에 따라 생리 활성이 저하되기도 하지만 일부 효소 활성이나 호르몬 분비 기능은 증가되기도 한다. 세포의 노화는 세포 분열(cellular division)의 영구적 정지(permanent halt)로서 정의될 수 있다. 복제 노화(replicative senescence) 또는 세포 노화(cellular senescence)는 세포 수준에서 에이징(aging)을 위한 모델로서 관찰되었다. 세포가 연속으로 배양되는 경우, 많은 회수의 분열을 하지만, 노화에 따라 세포는 더 이상 분열할 수 없다. 노화된 세포는 실제로 프로그램된 세포사(programmed cell death)에 저항성이고 일부 노화된 세포는 수년 동안 비증식 상태(nondividing state)로 유지되었다.

활성 산소종(reactive oxygen species: ROS)은 산소 원자를 포함하는, 화학적으로 반응성이 있는 분자이다. ROS는 산소의 정상적인 대사 과정의 부산물로서 생성되고, 세포 신호전달 및 항상성과 관련된다. 그러나, 환경적 스트레스, 예를 들어 자외선 또는 열 노출을 받을 경우, 세포의 ROS 수준은 증가되고, 세포 구조에 손상을 초래할 수 있다. 노화 세포, 예를 들어 조로증 환자의 세포에서는 ROS의 양이 젊은 세포에 비해 많고, 쌓여진 ROS는 노화 세포의 노화 수준을 더욱 빨리 증가시킬 수 있다.

상기한 선행기술에 의하더라도, 세포의 ROS 수준을 감소시킴으로써 세포 또는 개체의 노화를 감소시키는 조성물 및 방법이 요구되고 있다.

일 양상은 세포 또는 개체의 노화 수준을 감소시키기 위한 조성물을 제공한다.

다른 양상은 세포의 ROS 수준을 증가 또는 감소시키는 물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다.

다른 양상은 세포 또는 개체에서 노화 수준을 감소시키는 방법을 제공한다.

다른 양상은 세포 또는 개체에서 노화와 연관된 증상 또는 질병을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.

일 양상은 VEGFR(Vascular Endothelial Growth Factor Receptor), EGFR(Epidermal growth factor receptor), 또는 FGFR(Fibroblast growth factor receptor)의 저해제; MEK(MAPK/ERK kinase) 저해제; MAPK(Mitogen-activated protein kinase) 또는 PI3K(Phosphoinositide 3-kinase) 저해제; PAK(p21 activated kinase) 저해제; mTOR(Mammalian target of rapamycin) 저해제; IGF-1R(Insulin-like growth factor 1 receptor) 저해제; ROCK(Rho-associated protein kinase) 저해제; PDK-1(Phosphoinositide-dependent kinase-1) 저해제; 및 S1P(Sphingosine-1-phosphate) 수용체 저해제로 이루어진 군으로부터 선택된 화합물, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 입체이성질체, 유도체, 용매화물, 또는 이들의 조합을 포함하는 세포 또는 개체의 노화 수준을 감소시키기 위한 조성물을 제공한다.

상기 VEGFR(Vascular Endothelial Growth Factor Receptor)은 VEGFR-1, VEGFR-2, 또는 VEGFR-3일 수 있다. 상기 EGFR(Epidermal growth factor receptor)은 ErbB-1 또는 HER1으로도 지칭될 수 있다. 상기 FGFR은 FGFR1, FGFR2, FGFR3, 또는 FGFR4일 수 있다. 상기 MEK는 MAPKK(Mitogen-activated protein kinase kinase), 또는 MAP2K로도 불릴 수 있고, MEK1, MEK2, MEK3, MEK4, MEK5, MEK6, 또는 MEK7일 수 있다. 상기 MAPK는 MAPK1, MAPK3, MAPK4, MAPK6, MAPK7, MAPK8, MAPK9, MAPK10, MAPK11, MAPK12, MAPK13, MAPK14, 또는 MAPK15일 수 있다. 상기 PI3K는 포스파티딜이노시톨-4,5-비스포스페이트 3-키나제로도 지칭될 수 있다. 상기 PAK는 PAK1, PAK2, PAK3, PAK4, PAK5, 또는 PAK6일 수 있다. 상기 mTOR는 FRAP1(FK506-binding protein 12-rapamycin-associated protein 1)으로도 지칭될 수 있고, mTORC1 또는 mTORC2의 복합체를 형성할 수 있다. 상기 IGF-1R은 CD221, IGFIR, IGFR, 또는 JTK13으로도 지칭될 수 있다. 상기 ROCK은 ROCK1 또는 ROCK2일 수 있다. 상기 S1P(Sphingosine-1-phosphate) 수용체는 S1PR1, S1PR2, S1PR3, S1PR4 또는 S1PR5일 수 있다.

상기 저해제는 표적 물질을 특이적으로 저해하는 화합물을 말한다. 예를 들어, VEGFR, EGFR, 또는 FGFR의 저해제는 VEGFR, EGFR, 또는 FGFR을 특이적으로 저해하는 화합물을 말한다. 상기 VEGFR, EGFR, 또는 FGFR의 저해제는 'VEGFR/EGFR/FGFR 저해제'로도 표시될 수 있다.

상기 VEGFR, EGFR, 또는 FGFR의 저해제는 RAF265 (1-메틸-5-[2-[5-(트리플로오로메틸)-1H-이미다졸-2-일]피리딘-4-일]옥시-N-[4-(트리플루오로메틸)페닐]벤즈이미다졸-2-아민), AC480 ([(3S)-모르폴린-3-일]메틸 N-[4-[[1-[(3-플루오로페닐)메틸]인다졸-5-일]아미노]-5-메틸피롤로[2,1-f][1,2,4]트리아진-6-일]카르바메이트), AG-490 ((E)-N-벤질-2-시아노-3-(3,4-디히드록시페닐)프로프-2-엔아미드), TSU-68(3-[2,4-디메틸-5-[(Z)-(2-옥소-1H-인돌-3-일이덴)메틸]-1H-피롤-3-일]프로판산), 또는 이들의 조합일 수 있다.

상기 MEK 저해제는 U0126-EtOH ((2Z,3Z)-2,3-비스[아미노-(2-아미노페닐)술파닐메틸이덴]부탄디니트릴-에탄올)일 수 있다.

상기 MAPK 또는 PI3K 저해제는 SB203580 (4-[4-(4-플루오로페닐)-2-(4-메틸술피닐페닐)-1H-이미다졸-5-일]피리딘), BIRB 796 (1-[5-터트-부틸-2-(4-메틸페닐)피라졸-3-일]-3-[4-(2-모르폴린-4-일에톡시)나프탈렌-1-일]우레아), ZSTK474 (4-[4-[2-(디플루오로메틸)벤즈이미다졸-1-일]-6-모르폴린-4-일-1,3,5-트리아진-2-일]모르폴린), CAY10505 ((5E)-5-[[5-(4-플로오로페닐)푸란-2-일]메틸이덴]-1,3-티아졸리딘-2,4-디온), 또는 이들의 조합일 수 있다.

상기 PAK 저해제는 IPA-3 (1-[(2-히드록시나프탈렌-1-일)디술파닐]나프탈렌-2-올)일 수 있다.

상기 mTOR 저해제는 GDC-0349 (1-에틸-3-[4-[4-[(3S)-3-메틸모르폴린-4-일]-7-(옥세탄-3-일)-6,8-디히드로-5H-피리도[3,4-d]피리미딘-2-일]페닐]우레아), 라파마이신 (1-메틸-5-[2-[5-(트리플루오로메틸)-1H-이미다졸-2-일]피리딘-4-일]옥시-N-[4-(트리플루오로메틸)페닐]벤즈이미다졸-2-아민), 또는 이들의 조합일 수 있다.

상기 IGF-1R 저해제는 GSK1838705A (2-[[2-[[1-[2-(디메틸아미노)아세틸]-5-메톡시-2,3-디히드로인돌-6-일]아미노]-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일]아미노]-6-플루오로-N-메틸벤즈아미드)일 수 있다.

상기 ROCK 저해제는 Y-27632 2HCl (2-[4-[1-(1-아미노에틸)피롤-3-일]옥시페닐]-3-(7-카르밤이미도일나프탈렌-2-일)프로파논신)일 수 있다.

상기 PDK-1 저해제는 OSU-03012 (2-아미노-N-[4-[5-페난트렌-2-일-3-(트리플루오로메틸)피라졸-1-일]페닐]아세트아미드)일 수 있다.

상기 S1P 수용체 저해제는 SKI II (4-[[4-(4-클로로페닐)-1,3-티아졸-2-일]아미노]페놀)일 수 있다.

상기 화합물은 SRAF265, U0126-EtOH, Y-27632 2HCl, AC480, AG-490, SB203580, IPA-3, GDC-0349, GSK1838705A, TSU-68, OSU-03012, ZSTK474, CAY10505, BIRB 796, SKI II, 및 라파마이신(Rapamycin)으로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다.

상기 화합물은 그의 약제학적으로 허용가능한 염의 형태일 수 있다. 상기 염은 약학 분야, 예를 들면 세포의 노화와 연관된 질환 분야에서 사용되는 통상의 산 부가염을 포함한다. 산 부가염은 예를 들면 염산, 브롬산, 황산, 술팜산, 인산 또는 질산과 같은 무기산으로부터 유도된 염 및 아세트산, 프로피온산, 숙신산, 글리콜산, 스테아르산, 시트르산, 말레산, 말론산, 메탄술폰산, 타르타르산, 말산, 페닐아세트산, 글루탐산, 벤조산, 살리실산, 2-아세톡시벤조산, 푸마르산, 톨루엔술폰산, 옥살산, 또는 트리플루오로아세트산과 같은 유기산으로부터 유도된 염을 포함한다. 또한, 상기 염은 통상의 금속 염 형태, 예를 들면 리튬, 소듐, 칼륨, 마그네슘, 또는 칼슘과 같은 금속으로부터 유도된 염을 포함한다. 상기 산 부가염 또는 금속염은 통상의 방법에 따라 제조될 수 있다.

상기 화합물은 그의 입체이성질체의 형태일 수 있다. 상기 입체이성질체는 거울상 이성질체(enantiomer) 또는 부분입체이성질체(diastereomer)일 수 있다. 상기 화합물은 입체이성질체의 순수 형태(stereoisomerically pure form) 또는 하나 이상의 입체이성질체의 혼합물, 예를 들면 라세미 혼합물일 수 있다. 특정 입체이성질체의 분리는 당해 분야에 공지된 통상의 방법 중 하나에 의해 수행될 수 있다.

상기 화합물은 그의 유도체의 형태일 수 있다. 상기 유도체는 상기 화합물의 일부를 다른 원자나 원자단으로 화학적으로 변화시켜 얻어진 화합물일 수 있다.

상기 화합물은 그의 용매화물(solvate)의 형태일 수 있다. 상기 용매화물은 하나 이상의 용질 분자, 즉 상기 화합물, 그의 약학적으로 허용가능한 염, 입체이성질체, 또는 유도체, 및 하나 이상의 용매 분자에 의해 형성되는 복합체 또는 집합체를 의미한다. 용매화물은 예를 들면 물, 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, 또는 아세트산과 형성된 복합체 또는 집합체일 수 있다.

상기 화합물, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 입체이성질체, 유도체, 용매화물, 또는 이들의 조합은 세포의 활성 산소종(reactive oxygen species: ROS)의 수준을 음성 대조군에 비해 감소시킬 수 있다. ROS는 산소 원자를 포함하는, 화학적으로 반응성이 있는 분자이다. 노화 세포, 예를 들면 조로증 환자의 세포에서는 ROS의 양이 젊은 세포에 비해 증가할 수 있다.

상기 세포는 예를 들면, 신경 세포, 면역 세포, 상피 세포, 생식 세포, 근육세포, 또는 암세포일 수 있다. 상기 세포는 섬유아세포 또는 조기 노화 세포일 수 있다. 상기 조기 노화 세포는 조로증(progeria) 환자 유래의 세포일 수 있다.

상기 개체는 포유동물, 예를 들면, 사람, 소, 말, 돼지, 개, 양, 염소, 래트, 마우스, 래빗, 또는 고양이일 수 있다.

상기 노화는 시간의 경과에 따라 나타나는 변화 현상을 의미한다. 세포 또는 개체의 노화(senescence)는 표준(reference) 세포 또는 표준 개체에 비하여 세포의 증식능의 감소, 리포푸신(lipofuscin) 축적, β-갈락토시다제 활성 증가, 미토콘드리아 활성 산소 종 증가, 또는 이들의 조합을 포함하거나, 그를 야기하는 과정을 나타낼 수 있다. 세포 또는 개체의 노화는 자식작용(autophagy) 활성 감소 또는 미토콘드리아 막 전위 감소를 포함하거나, 이들을 야기하는 과정을 더 포함할 수 있다. 젊은(young) 세포 또는 개체는 표준 세포 또는 개체에 비하여 세포의 증식능의 증가, 리포푸신 축적 감소, β-갈락토시다제 활성 감소, 또는 이들의 조합을 포함하는 것을 나타낼 수 있다. 예를 들면, 노화 세포는 계대수 2의 분열 시간(doubling time)에 비해 분열 시간이 2 배 이상, 3배 이상, 4배 이상, 5배 이상, 6배 이상, 7배 이상, 9배 이상, 10배 이상, 50배 이상, 또는 100배 이상 증가한 경우 그 세포는 노화 세포라고 할 수 있다. 조로증 환자로부터 수득된 세포는 노화 세포라고 할 수 있다. 사람의 경우, 약 30세 이상, 약 40세 이상, 약 50세 이상, 약 60세 이상, 약 70세 이상, 약 80세 이상, 약 90세 이상, 또는 약 100세 이상의 사람으로부터 수득된 세포는 노화 세포라고 할 수 있다.

상기 세포 또는 개체의 노화 수준을 감소시키는 것은 세포 또는 개체의 노화를 지연 또는 방지하거나, 노화 세포 또는 개체를 그보다 젊은 세포 또는 개체로 전환시키는 것일 수 있다. 예를 들면, 세포 또는 개체의 노화 수준을 감소시키는 것은 세포의 증식능을 증가시키는 것, β-갈락토시다제 활성을 감소시키는 것, 리포푸신 축적을 감소시키는 것, 또는 이들의 조합을 포함하는 것일 수 있다. 세포 또는 개체의 노화 수준을 감소시키는 것은 자식작용 활성을 증가시키는 것, 미토콘드리아 막 전위를 높이는 것, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 세포의 증식능을 증가시키는 것은 세포 분열 시간의 감소 또는 세포 분열 횟수의 증가일 수 있다. 상기 β-갈락토시다제는 노화 연관 β-갈락토시다제일 수 있다.

상기 조성물은 세포 또는 개체의 노화와 연관된 증상 또는 질병을 예방 또는 치료하기 위한 것일 수 있다. 상기 세포 또는 개체의 노화와 연관된 증상 또는 질병은 조로증, 피부 주름, 상처 재생 저하, 퇴행성 뇌질환(예를 들면, 알츠하이머병, 파킨슨씨병, 및 치매), 뇌졸중, 당뇨(예를 들면, 제2형 당뇨), 관절염, 동맥경화, 심장병, 탈모, 골다공증, 근감소증, 리소좀 축적 질환(lysosome storage disease), 또는 이들의 조합일 수 있다. 용어 "예방"은 조성물의 투여에 의해 노화와 연관된 증상 또는 질병을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 말한다. 용어 "치료"는 조성물의 투여에 의해 노화와 연관된 증상 또는 질병의 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 말한다.

상기 세포 또는 개체의 노화와 연관된 증상 또는 질병은 미토콘드리아 활성 산소종과 연관된 질병일 수 있다.

상기 조성물은 약학적 조성물일 수 있다. 상기 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 더 포함할 수 있다. 상기 조성물에 있어서, "약학적으로 허용가능한 담체"는 활성 성분의 적용을 돕기 위하여 활성 성분과 조합되어 사용되는 물질, 일반적으로 불활성 물질을 나타낸다. 상기 담체는 통상적인 약학적으로 허용가능한 부형제, 첨가제 또는 희석제를 포함한다. 상기 담체는 예를 들면 충전제(filler), 결합제(binder), 붕해제(disintergrant), 완충제, 보존제, 항산화제, 활택제, 향미제, 점증제(thickener), 발색제(coloring agent), 유화제, 현탁화제, 안정화제, 및 등장화제로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다.

상기 조성물은 상기 화합물, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 입체이성질체, 유도체, 용매화물, 또는 이들의 조합을 "치료학적 유효량"으로 포함하는 것일 수 있다. 상기 조성물에 있어서, "치료학적 유효량"은 치료를 필요로 하는 개체에게 투여되는 경우 치료 효과를 나타내기에 충분한 양을 의미한다. 상기 유효량은 질환의 중증도, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 사용된 본 발명의 조성물과 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 상기 "유효량"은 상기 조성물 당 0.01 mg 내지 10,000 mg, 0.1 mg 내지 1000 mg, 1 mg 내지 100 mg, 0.01 mg 내지 1000 mg, 0.01 mg 내지 100 mg, 0.01 mg 내지 10 mg, 또는 0.01 mg 내지 1 mg일 수 있다.

상기 조성물의 투여량은 예를 들면, 성인 기준으로 약 0.001 ㎎/kg 내지 약 100 ㎎/kg, 약 0.01 ㎎/kg 내지 약 10 ㎎/kg, 또는 약 0.1 ㎎/kg 내지 약 1 ㎎/kg의 범위 내이고, 1일 1회, 1일 다회, 수일 1회 투여될 수 있다.

상기 조성물은 경구 투여하거나, 정맥내, 복강내, 피하, 직장 및 국소 투여를 포함한 비경구로 투여될 수 있다. 따라서, 상기 조성물은 정제, 캡슐제, 수성액제, 또는 현탁제 등의 다양한 형태로 제제화될 수 있다. 경구용 정제의 경우 락토스, 또는 옥수수 전분 등의 부형제 및 마그네슘 스테아레이트와 같은 활택제가 통상 가해질 수 있다. 경구투여용 캡슐제의 경우, 락토스 및/또는 건조 옥수수 전분이 희석제로서 사용될 수 있다. 경구용 수성 현탁제가 필요할 경우, 활성 성분을 유화제 및/또는 현탁화제와 결합시킬 수 있다. 필요할 경우, 특정 감미제 및/또는 향미제를 가할 수 있다. 신경내, 근육내, 복강내, 피하 및 정맥내 투여의 경우, 활성성분의 멸균 용액이 통상 제조되며, 용액의 pH를 적합하게 조절하고 완충시킬 수 있다. 정맥내 투여의 경우, 용질의 총 농도는 제제에 등장성이 부여되도록 조절될 수 있다. 상기 조성물은 pH가 7.4인 염수와 같은 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 수용액제의 형태일 수 있다. 상기 용액은 국소 주사(local bolus injection)로 환자의 근육내 또는 신경내 혈류에 투여될 수 있다.

상기 조성물은 세포 또는 개체의 노화와 연관 질환을 치료하기 위한 하나 이상의 다른 치료제를 더 포함할 수 있다.

다른 양상은 세포와 후보 물질을 인큐베이션하는 단계;

상기 세포와 ROS 검출 물질을 인큐베이션시켜 상기 세포의 ROS 강도를 측정하는 단계;

상기 세포의 DNA 양을 측정하는 단계;

상기 ROS 강도를 상기 DNA 양으로 나누어 상기 세포의 ROS 수준을 산출하는 단계; 및

산출된 세포의 ROS 수준이 음성 대조군과 비교하여 증가 또는 감소시키는 후보 물질을 선별하는 단계를 포함하는, 세포의 ROS 수준을 증가 또는 감소시키는 물질을 스크리닝하는 방법.을 제공한다.

상기 방법은 세포와 후보 물질을 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 상기 세포는 노화 세포일 수 있다. 예를 들면, 노화 세포는 계대수 2의 분열 시간에 비해 분열 시간이 2 배 이상, 3배 이상, 4배 이상, 5배 이상, 6배 이상, 7배 이상, 9배 이상, 10배 이상, 50배 이상, 또는 100배 이상 증가한 세포일 수 있다. 노화 세포는 조로증 환자로부터 수득된 세포일 수 있다. 노화 세포는 약 30세 이상, 약 40세 이상, 약 50세 이상, 약 60세 이상, 약 70세 이상, 약 80세 이상, 약 90세 이상, 또는 약 100세 이상의 사람으로부터 수득된 세포일 수 있다.

상기 인큐베이션은 시험관 내에서(in vitro) 수행될 수 있다. 인큐베이션은 예를 들어, 약 20℃ 내지 약 40℃, 약 25℃ 내지 약 37℃, 또는 약 30℃ 내지 약 37℃에서 수행될 수 있다. 상기 인큐베이션은 예를 들면 5% CO₂ 공기에서 수행될 수 있다.

상기 방법은 세포와 후보 물질을 인큐베이션된 세포와 ROS 검출 물질을 인큐베이션시켜 상기 세포의 ROS 강도를 측정하는 단계를 포함한다.

상기 ROS 검출 물질은 비형광 물질이나, ROS의 존재에 의해 형광 물질로 전환되는 물질일 수 있다. 상기 ROS 검출 물질은 디히드로로다민(dihydrorhodamine), 디히드로에티디움(dihydroethidium), mitoSOX, 디클로로디히드로플루오레세인 이다세테이트(Dichlorodihydrofluorescein diacetate), 또는 이들의 조합일 수 있다.

세포의 ROS 강도를 측정하는 방법은 ROS 검출 물질에 따라 결정될 수 있다. 세포와 ROS 검출 물질을 인큐베이션시켜 세포가 ROS 검출 물질로 염색될 수 있다. 예를 들면, 염색된 세포에서 형광 강도를 측정함으로써 ROS 검출 물질의 강도를 측정할 수 있다.

상기 방법은 세포와 후보 물질을 인큐베이션된 세포의 DNA 양을 측정하는 단계를 포함한다. 상기 세포의 DNA 양을 측정하는 단계는 세포의 ROS 강도를 측정하는 단계와 순차 또는 동시에 수행될 수 있다. 세포의 DNA 양은 핵산 염색 염료를 사용하여 DNA를 염색함으로써 수행될 수 있다. 예를 들면, 염색된 세포에서 형광 강도를 측정함으로써 세포의 DNA 양을 측정할 수 있다. 핵산 염색 염료는 예를 들면, SYBR? 염료, 시아닌 염료, TOTO 염료, TO-PRO 염료, SYTOX 염료, SYTO 염료, 펜아크리딘, 아크리딘, 인돌, 및 이미다졸일 수 있다.

상기 방법은 상기 ROS 강도를 상기 DNA 양으로 나누어 상기 세포의 ROS 수준을 산출하는 단계를 포함한다. 세포의 DNA 양은 세포마다 일정하기 때문에 세포의 DNA 양으로부터 세포의 수를 측정할 수 있다.

상기 방법은 산출된 세포의 ROS 수준이 음성 대조군과 비교하여 증가 또는 감소시키는 후보 물질을 선별하는 단계를 포함한다. 음성 대조군은 표준 세포, 후보 물질을 인큐베이션하지 않은 세포, 또는 후보 물질 대신에 디메틸 술폭시드(DMSO)를 인큐베이션한 세포일 수 있다.

상기 방법은 세포의 ROS 수준을 감소시키는 물질 중에서 세포의 노화 수준을 증가 또는 감소시키는 물질을 선별하는 단계를 더 포함할 수 있다.

다른 양상은 VEGFR, EGFR, 또는 FGFR의 저해제; MEK 저해제; MAPK 또는 PI3K 저해제; PAK 저해제; mTOR 저해제; IGF-1R 저해제; ROCK 저해제; PDK-1 저해제; 및 S1P 수용체 저해제로 이루어진 군으로부터 선택된 화합물, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 입체이성질체, 유도체, 용매화물, 또는 이들의 조합을 세포 또는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 세포 또는 개체에서 노화 수준을 감소시키는 방법을 제공한다.

상기 VEGFR, EGFR, 또는 FGFR의 저해제, MEK 저해제, MAPK 또는 PI3K 저해제, PAK 저해제, mTOR 저해제, IGF-1R 저해제, ROCK 저해제, PDK-1 저해제, S1P 수용체 저해제, 화합물, 약학적으로 허용가능한 염, 입체이성질체, 유도체, 및 용매화물은 전술한 바와 같다.

상기 세포 또는 개체는 노화와 연관된 증상 또는 질병에 걸리거나 노화와 연관된 증상 또는 질병에 걸릴 위험이 있는 세포 또는 개체일 수 있다.

상기 투여는 국소 또는 전신 투여일 수 있다. 상기 투여는 예를 들면, 성인 기준으로 약 0.001 ㎎/kg 내지 약 100 ㎎/kg, 약 0.01 ㎎/kg 내지 약 10 ㎎/kg, 또는 약 0.1 ㎎/kg 내지 약 1 ㎎/kg의 범위 내일 수 있고, 1일 내지 1년의 기간 동안 1일 1회, 1일 다회, 또는 수일 1회 투여될 수 있다. 상기 투여는 당업계에 알려진 방법에 의하여 투여될 수 있다. 투여는 예를 들면, 경구, 정맥내, 근육내, 경구, 경피(transdermal), 점막, 코안(intranasal), 기관내(intratracheal) 또는 피하 투여와 같은, 임의의 수단에 의하여 개체로 직접적으로 투여될 수 있다. 상기 투여는 국소 또는 전신 투여일 수 있다. 상기 투여는 노화 세포를 포함하는 조직에 국소적으로 투여하는 것일 수 있다.

상기 세포 또는 개체의 노화 수준을 감소시키는 것은 세포의 증식능을 증가시키는 것, β-갈락토시다제 활성을 감소시키는 것, 리포푸신 축적을 감소시키는 것, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.

다른 양상은 VEGFR, EGFR, 또는 FGFR의 저해제; MEK 저해제; MAPK 또는 PI3K 저해제; PAK 저해제; mTOR 저해제; IGF-1R 저해제; ROCK 저해제; PDK-1 저해제; 및 S1P 수용체 저해제로 이루어진 군으로부터 선택된 화합물, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 입체이성질체, 유도체, 용매화물, 또는 이들의 조합을 세포 또는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 세포 또는 개체에서 노화와 연관된 증상 또는 질병을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.

상기 VEGFR, EGFR, 또는 FGFR의 저해제, MEK 저해제, MAPK 또는 PI3K 저해제, PAK 저해제, mTOR 저해제, IGF-1R 저해제, ROCK 저해제, PDK-1 저해제, S1P 수용체 저해제, 화합물, 약학적으로 허용가능한 염, 입체이성질체, 유도체, 용매화물, 세포, 개체, 투여, 예방, 및 치료는 전술한 바와 같다.

상기 세포 또는 개체에서 노화와 연관된 증상 또는 질병은 조로증, 피부 주름, 상처 재생 저하, 퇴행성 뇌질환, 뇌졸중, 당뇨, 관절염, 동맥경화, 심장병, 탈모, 골다공증, 근감소증, 리소좀 축적 질환, 또는 이들의 조합일 수 있다.

일 양상에 따른 세포 또는 개체의 노화 수준을 감소시키기 위한 조성물, 세포의 ROS 수준을 증가 또는 감소시키는 물질을 스크리닝하는 방법, 상기 조성물을 이용한 세포 또는 개체에서 노화 수준을 감소시키는 방법, 및 세포 또는 개체에서 노화와 연관된 증상 또는 질병을 예방 또는 치료하는 방법에 따르면, 세포의 ROS를 감소시키는 물질을 스크리닝하고, 스크리닝된 물질을 이용하여 세포 또는 개체의 노화 수준을 효율적으로 감소시키고, 노화와 연관된 증상 또는 질병을 효율적으로 예방 또는 치료할 수 있다.

도 1a는 호에크스트(Hoechst) 33342 및/또는 DHR 123으로 염색된 젊은 세포 또는 노화된 세포를 형광현미경으로 관찰하여 수득된 이미지이고(막대: 10 nm), 도 1b는 젊은 세포와 노화된 세포에서 상대적인 활성 산소종의 수준을 나타내는 그래프이다(**: p<0.05).

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 세포의 활성 산소종 수준을 감소시키는 약물의 스크리닝

1. 세포의 활성 산소종 수준을 고속 대용량으로 스크리닝하는 방법

노로증 환자의 피부에서 채취한 노화된 섬유아세포 세포주(Hutchinson-Gilford Progeria Syndrome Skin Fibroblasts, Coriell Cell Repositories, AG03198 B, 분열 시간 약 14일)를 준비하였다.

준비된 세포를 96-웰 플레이트의 각 웰에 1,000 세포/웰의 농도로 접종하였다. 통계적 유의성을 위해서, 한 개의 약물당 6개의 웰에 동일하게 처리하였고, 플레이트마다 음성 대조군으로 0.05 %(v/v)의 DMSO를 처리한 그룹을 포함시켰다. 4일에 한 번씩 약물을 갈아주고, 16 일째에 측정을 하였다. 각 그룹당 DHR 123 염색 값과 DNA 함량 값을 동시에 측정하기 위해 두 개의 동일한 플레이트를 준비하였다.

각 웰에 있는 세포를 10 μM의 디히드로로다민(dihydrorhodamine: DHR) 123 (Life Technology, D-23806)으로 염색하였다. DHR 123의 산화 형태인 로다민 123으로부터 각각 여기광 및 방출광을 488 nm 및 530 nm로 하여 형광을 측정함으로써, 세포의 활성 산소종(Reactive oxygen species: ROS)의 양을 결정하였다.

각 웰에 있는 세포를 SYBR? Green I nucleic acid gel stain (Molecular Probes, S-7567, Eugene, Oregon USA)를 사용하여 염색하였다. 염색된 세포에서 각각 여기광 및 방출광을 488 nm 및 530 nm로 하여 형광을 측정함으로써, 세포의 DNA 양을 결정하였다. 각 세포마다 DNA 양은 일정하기 때문에, DNA 양을 통해 세포 수를 간접적으로 측정할 수 있다.

각 세포당 ROS 수준을 측정하기 위해, 측정된 DHR 123 값을 측정된 DNA 양으로 나누었다.

2. 젊은 세포와 노화 세포의 ROS 수준의 측정

1.의 세포의 ROS 수준을 고속 대용량으로 스크리닝하는 방법을 젊은 세포와 노화 세포에 적용하였다.

1.에 기재된 바와 같이 노화된 섬유아세포 세포주를 준비하였다. 또한 젊은 세포(Hutchinson-Gilford Progeria Syndrome Skin Fibroblasts, Coriell Cell Repositories, AG03198 B, 분열 시간 약 4일)를 준비하였다.

준비된 세포를 10 μM의 DHR 123 (Life Technology, D-23806)으로 염색하였다. 또한, 세포의 DNA를 염색하기 위해 호에크스트(Hoechst) 33342 (Life Technology)으로 염색하였다. 음성 대조군으로, 호에크스트 33342로 염색하였으나 DHR 123으로 염색하지 않은 세포를 사용하였다.

염색된 세포를 형광현미경으로 관찰하고, 수득된 이미지를 도 1a에 나타내었다. 도 1a에 나타난 바와 같이, 노화세포에서는 염색된 형광의 세기가 젊은 세포와 비교해서 세다는 것을 확인하였다.

1.에 기재된 바와 같이, 세포의 ROS 수준을 측정하고, 측정된 세포의 상대적 ROS 수준을 도 1b에 나타내었다(**: p<0.05). 도 1b에 나타난 바와 같이, 도 1a와 마찬가지로, 노화 세포의 ROS 수준이 젊은 세포의 ROS 수준보다 높다는 것을 확인하였다. 따라서, 1.에 기재된 세포의 ROS 수준을 고속 대용량으로 스크리닝하는 방법을 노화 세포에 적용할 수 있음을 확인하였다.

3. 노화 세포에서 ROS 수준을 감소시키는 약물의 스크리닝

355 종의 키나제 저해제 라이브러리(Selleck Chem, L1200)를 사용하여, 노화 세포의 ROS를 감소시키는 약물을 스크리닝하였다. 1.에 기재된 바와 같은 방법으로, 노화 세포에 약물을 처리하고, 그 후 16일 후 ROS 수준을 측정하였다.

통계적으로 유의하게 ROS Level을 줄이는 약물을 선별하기 위해, 측정된 ROS 수준을 이용하여 DMSO 처리 그룹에 비해서 ROS 수준을 0.61배 이하로 감소시키는 약물을 선별하였다.

선별된 약물을 하기 표 1에 나타내었다.

표 1에 나타난 바와 같이, 노화된 조로증 세포의 ROS 수준을 감소시킬 수 있는 16 종의 약물을 확인하였다. 확인된 16 종의 약물은 VEGFR/EGFR/FGFR 저해제로서 RAF265, AC480, AG-490, 및 TSU-68; MEK 저해제로서 U0126-EtOH; ROCK 저해제로서 Y-27632 2HCl; MAPK/PI3K 저해제로서 SB203580, BIRB 796, ZSTK474, 및 CAY10505; PAK 저해제로서 IPA-3; mTOR 저해제로서 GDC-0349 및 라파마이신(Rapamycin); IGF-1R 저해제로서 GSK1838705A; PDK-1 저해제로서 OSU-03012; 및 S1P 수용체 저해제로서 SKI II이다.

Claims

VEGFR(Vascular Endothelial Growth Factor Receptor), EGFR(Epidermal growth factor receptor), 또는 FGFR(Fibroblast growth factor receptor)의 저해제;
MEK(MAPK/ERK kinase) 저해제;
MAPK(Mitogen-activated protein kinase) 또는 PI3K(Phosphoinositide 3-kinase) 저해제;
PAK(p21 activated kinase) 저해제;
mTOR(Mammalian target of rapamycin) 저해제;
IGF-1R(Insulin-like growth factor 1 receptor) 저해제;
ROCK(Rho-associated protein kinase) 저해제;
PDK-1(Phosphoinositide-dependent kinase-1) 저해제; 및
S1P(Sphingosine-1-phosphate) 수용체 저해제로 이루어진 군으로부터 선택된 화합물, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 입체이성질체, 유도체, 용매화물, 또는 이들의 조합을 포함하는 세포 또는 개체의 노화 수준을 감소시키기 위한 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 화합물은 SRAF265, U0126-EtOH, Y-27632 2HCl, AC480, AG-490, SB203580, IPA-3, GDC-0349, GSK1838705A, TSU-68, OSU-03012, ZSTK474, CAY10505, BIRB 796, SKI II, 및 라파마이신(Rapamycin)으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 화합물, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 입체이성질체, 유도체, 용매화물, 또는 이들의 조합은 세포의 활성 산소종(reactive oxygen species: ROS)의 수준을 음성 대조군에 비해 감소시키는 것인 조성물.
청구항 1에 있어서, 세포 또는 개체의 노화 수준을 감소시키는 것은 세포 또는 개체의 노화를 지연 또는 방지하거나, 노화(senescent) 세포 또는 개체를 그보다 젊은(young) 세포 또는 개체로 전환시키는 것인 조성물.
청구항 1에 있어서, 세포 또는 개체의 노화 수준을 감소시키는 것은 세포의 증식능을 증가시키는 것, β-갈락토시다제 활성을 감소시키는 것, 리포푸신 축적을 감소시키는 것, 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 조성물.
청구항 1에 있어서, 세포 또는 개체의 노화와 연관된 증상 또는 질병을 예방 또는 치료하기 위한 것인 조성물.
청구항 6에 있어서, 상기 세포 또는 개체의 노화와 연관된 증상 또는 질병은 조로증(progeria), 피부 주름, 상처 재생 저하, 퇴행성 뇌질환, 뇌졸중, 당뇨, 관절염, 동맥경화, 심장병, 탈모, 골다공증, 근감소증, 리소좀 축적 질환(lysosome storage disease), 또는 이들의 조합인 것인 조성물.
청구항 6에 있어서, 상기 세포 또는 개체의 노화와 연관된 증상 또는 질병은 미토콘드리아 활성 산소종의 증가와 연관된 질병인 것인 조성물.
세포와 후보 물질을 인큐베이션하는 단계;
상기 세포와 ROS 검출 물질을 인큐베이션시켜 상기 세포의 ROS 강도를 측정하는 단계;
상기 세포의 DNA 양을 측정하는 단계;
상기 ROS 강도를 상기 DNA 양으로 나누어 상기 세포의 ROS 수준을 산출하는 단계; 및
산출된 세포의 ROS 수준이 음성 대조군과 비교하여 증가 또는 감소시키는 후보 물질을 선별하는 단계를 포함하는, 세포의 ROS 수준을 증가 또는 감소시키는 물질을 스크리닝하는 방법.
청구항 9에 있어서, 상기 ROS 검출 물질은 디히드로로다민(dihydrorhodamine), 디히드로에티디움(dihydroethidium), mitoSOX, 디클로로디히드로플루오레세인 이다세테이트(Dichlorodihydrofluorescein diacetate), 또는 이들의 조합인 것인 방법.
청구항 9에 있어서, 상기 세포의 DNA 양을 측정하는 단계는 핵산 염색 염료를 사용하여 DNA를 염색하는 것인 방법.
청구항 9에 있어서, 상기 세포의 ROS 수준을 감소시키는 물질 중에서 세포의 노화 수준을 증가 또는 감소시키는 물질을 선별하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
VEGFR, EGFR, 또는 FGFR의 저해제;
MEK 저해제;
MAPK 또는 PI3K 저해제;
PAK 저해제;
mTOR 저해제;
IGF-1R 저해제;
ROCK 저해제;
PDK-1 저해제; 및
S1P 수용체 저해제로 이루어진 군으로부터 선택된 화합물, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 입체이성질체, 유도체, 용매화물, 또는 이들의 조합을 세포 또는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 세포 또는 개체에서 노화 수준을 감소시키는 방법.
VEGFR, EGFR, 또는 FGFR의 저해제;
MEK 저해제;
MAPK 또는 PI3K 저해제;
PAK 저해제;
mTOR 저해제;
IGF-1R 저해제;
ROCK 저해제;
PDK-1 저해제; 및
S1P 수용체 저해제로 이루어진 군으로부터 선택된 화합물, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 입체이성질체, 유도체, 용매화물, 또는 이들의 조합을 세포 또는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 세포 또는 개체에서 노화와 연관된 증상 또는 질병을 예방 또는 치료하는 방법.
청구항 13 또는 14에 있어서, 상기 세포 또는 개체는 노화와 연관된 증상 또는 질병에 걸리거나 노화와 연관된 증상 또는 질병에 걸릴 위험이 있는 것인 방법.
청구항 13 또는 14에 있어서, 상기 투여는 국소 또는 전신 투여인 것인 방법.
청구항 13 또는 14에 있어서, 상기 화합물은 SRAF265, U0126-EtOH, Y-27632 2HCl, AC480, AG-490, SB203580, IPA-3, GDC-0349, GSK1838705A, TSU-68, OSU-03012, ZSTK474, CAY10505, BIRB 796, SKI II, 및 라파마이신(Rapamycin)로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
청구항 13 또는 14에 있어서, 상기 화합물, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 입체이성질체, 유도체, 용매화물, 또는 이들의 조합은 세포의 ROS의 수준을 음성 대조군에 비해 감소시키는 것인 방법.
청구항 13에 있어서, 상기 세포 또는 개체의 노화 수준을 감소시키는 것은 세포의 증식능을 증가시키는 것, β-갈락토시다제 활성을 감소시키는 것, 리포푸신 축적을 감소시키는 것, 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 방법.
청구항 14에 있어서, 상기 세포 또는 개체에서 노화와 연관된 증상 또는 질병은 조로증, 피부 주름, 상처 재생 저하, 퇴행성 뇌질환, 뇌졸중, 당뇨, 관절염, 동맥경화, 심장병, 탈모, 골다공증, 근감소증, 리소좀 축적 질환, 또는 이들의 조합인 것인 방법.