KR101581059B1 - 섬유화 억제제 - Google Patents

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Abstract

본 발명의 목적은, 주로, 섬유화 억제제를 제공하는 것에 있다.
본 발명은, 하기 화학식 1로 표시되는 복소환 유도체 또는 그 의약상 허용되는 염을 유효성분으로서 함유하는 섬유화 억제제에 관한 것이다.
화학식 1
Figure 112010055154814-pct00009

상기 화학식 1에서 R1, R2는 동일하거나 상이하며 치환되어 있어도 좋은 아릴을 나타내고; R3, R4는 동일하거나 상이한 수소 원자 또는 알킬을 나타내며; R5는 수소 원자, 알킬 또는 할로겐 원자를 나타내고; Y는 N 또는 N→O를 나타내며; A는 NR6을 나타내고, R6은 수소 원자, 알킬 등을 나타내며; D는 히드록시로 치환되어 있어도 좋은 알킬렌 또는 알케닐렌을 나타내고; E는 페닐렌 또는 단일 결합을 나타내며; G는 O, S 등을 나타내고; Q는 카르복시, 알콕시카르보닐 등을 나타낸다.

Description

섬유화 억제제{FIBROSIS INHIBITOR}
본 발명은, 다음 화학식 1로 표시되는 복소환 유도체[이하, 「본 복소환 유도체(1)」라고 함] 또는 그 의약상 허용되는 염을 유효성분으로서 함유하는 섬유화 억제제에 관한 것이다.
화학식 1
Figure 112010055154814-pct00001
상기 화학식 1에서 R1, R2는 동일하거나 상이하며 할로겐 원자, 알킬, 할로알킬, 아릴알킬, 알콕시, 알킬티오, 알콕시알킬, 알킬술포닐, 히드록시, 아미노, 모노알킬아미노, 디알킬아미노, 카르복시, 시아노 및 니트로로 이루어진 군으로부터 선택되는 1∼3개의 치환기로 치환되어 있어도 좋은 아릴을 나타내고;
R3, R4는 동일하거나 상이하며, 수소 원자 또는 알킬을 나타내며;
R5는 수소 원자, 알킬 또는 할로겐 원자를 나타내고;
Y는 N 또는 N→O를 나타내며;
A는 NR6을 나타내고, R6은 수소 원자, 알킬, 알케닐 또는 시클로알킬을 나타내며;
D는 히드록시로 치환되어 있어도 좋은 알킬렌 또는 알케닐렌을 나타내거나 또는 A와 D가 함께 하기 화학식 2로 표시되는 2가의 기를 나타내고;
화학식 2
Figure 112010055154814-pct00002
상기 화학식 2에서 r은 0∼2의 정수를 나타내고, q는 2 또는 3을 나타내며, t는 0∼4의 정수를 각각 나타낸다.
E는 페닐렌 또는 단일 결합을 나타내거나 또는 D와 E가 함께 하기 화학식 3으로 표시되는 2가의 기를 나타내고;
화학식 3
Figure 112010055154814-pct00003
( --- 는 단일 결합 또는 이중 결합을 나타냄)
상기 화학식 3식에서 u는 0∼2의 정수를 나타내고, v는 0 또는 1을 나타낸다.
G는 O, S, SO 또는 SO2를 나타내고;
Q는 카르복시, 알콕시카르보닐, 테트라졸릴, 카르바모일, 모노알킬카르바모일, 디알킬카르바모일 또는 하기 화학식 4로 표시되는 기를 나타낸다.
화학식 4
Figure 112010055154814-pct00004
상기 화학식 4에서 R7은 아미노, 모노알킬아미노, 디알킬아미노, 혹은 히드록시, 또는 할로겐 원자, 알킬, 할로알킬, 아릴알킬, 알콕시, 알킬티오, 알콕시알킬, 알킬술포닐, 히드록시, 아미노, 모노알킬아미노, 디알킬아미노, 카르복시, 시아노 및 니트로로 이루어진 군으로부터 선택되는 1∼3개의 치환기로 치환되어 있어도 좋은 하기 1) 내지 4) 중 어느 하나의 기를 나타낸다;
1) 알킬
2) 아릴
3) 아릴옥시
4) 복소환기
장기 등의 섬유화는 장기 등이 어떠한 원인, 예컨대, 침습 또는 손상을 받음으로써, 세포외 기질이 장기 내에 지나치게 축적되어 생기는 것이다. 침습 또는 손상에 의한 장기 등의 장애 정도가 경미하면, 수복 반흔도 남지 않고, 장기 등은 정상적으로 회복된다. 그러나, 침습 또는 손상에 의한 장기 등의 장애 정도가 큰 경우나 지속되는 경우에는, 수복 반흔의 섬유화가 장기 등의 원래의 기능에 장애를 부여하게 된다. 또한, 그것이 원인이 되어 새로운 섬유화가 발생한다고 하는 악순환이 형성되며, 최종적으로는 장기 등의 기능 부전에까지 이르게 된다.
장기 등의 섬유화에 의해 발생하는 질환으로서, 간질성 폐렴(폐섬유증) 등이 알려져 있다. 간질성 폐렴은, 어떠한 원인에 의해 폐포벽에 염증이 발생하여 간질성 섬유아 세포가 증식하고, 콜라겐 섬유의 지나친 침착에 의해 폐가 경화하며, 가스 교환 장애을 일으켜 최종적으로는 호흡 부전에 이르는 질환이다. 발증 후 3∼5년에 사망한다. 간질성 폐렴 발증의 상세한 기서는 아직 밝혀져 있지 않고, 확립된 치료법도 존재하지 않는다.
최근, 블레오마이신에 의해 유발된 간질성 폐렴 모델 마우스에 있어서, 프로스타글란딘 I2(이하, 「PGI2」라고 함) 수용체 작동약인 ONO-1301이, 간질성 폐렴의 억제 효과를 갖는 것이 보고되어 있다(예컨대, 비특허문헌 1을 참조).
본 복소환 유도체(1) 또는 그 의약상 허용되는 염은 PGI2 수용체 작동제로서, 폐고혈압증이나 폐색성 동맥경화증의 치료에 유용하다는 것이 이미 보고되어 있다(예컨대, 특허문헌 1을 참조).
특허문헌 1 : 국제 공개 제02/088084호 팜플렛
비특허문헌 1 : American J. physiology, 2006년, vol.290, p.59-65
본 발명의 목적은, 주로, 신규한 섬유화 억제제를 제공하는 것에 있다.
본 발명자들은, 본 복소환 유도체(1)가, 섬유아세포의 증식 억제 효과를 갖는 것을 발견하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명에서는, 예컨대, 본 복소환 유도체(1) 또는 그 의약상 허용되는 염을 유효성분으로서 함유하는 섬유화 억제제를 들 수 있다.
도 1은 EGF로 자극한 인간 폐섬유아세포에 있어서의, 화합물 A 및 화합물 B의 세포 증식 억제 효과를 나타낸다. 종축은 흡광도를 나타낸다.
도 2는 TGFα로 자극한 인간 폐섬유아세포에 있어서의, 화합물 A의 세포 증식 억제 효과를 나타낸다. 종축은 흡광도를 나타낸다.
도 3은, TGFβ1로 자극한 인간 폐섬유아세포에 있어서의, 화합물 A의 콜라겐 생성 억제 효과를 나타낸다. 종축은, PIP 농도 측정값을 세포 증식 활성값(흡광도)으로 보정하고, 무자극 대조군의 평균값을 1로 한 상대값으로서 산출한 값을 나타낸다.
도 4는 TGFβ1로 자극한 인간 폐섬유아세포에 있어서의, COL1α1의 mRNA 발현 억제 효과를 나타낸다. 종축은, COL1α1의 mRNA의 발현량을 GAPDH의 mRNA 발현량으로 보정하고, 무자극 대조군의 평균값을 1로 한 상대값을 나타낸다.
도 5는 TGFβ1로 자극한 인간 폐섬유아세포에 있어서의, COL1α2의 mRNA 발현 억제 효과를 나타낸다. 종축은, COL1α2의 mRNA의 발현량을 GAPDH의 mRNA 발현량으로 보정하고, 무자극 대조군의 평균값을 1로 한 상대값을 나타낸다.
도 6은 TGFβ1로 자극한 인간 폐섬유아세포에 있어서의, ACTA의 mRNA 발현 억제 효과를 나타낸다. 종축은, ACTA의 mRNA의 발현량을 GAPDH의 mRNA 발현량으로 보정하고, 무자극 대조군의 평균값을 1로 한 상대값을 나타낸다.
도 7은 TGFβ1로 자극한 인간 폐섬유아세포에 있어서의, 화합물 A의 TGFβ1의 mRNA 발현 억제 효과를 나타낸다. 종축은, TGFβ1의 mRNA의 발현량을 GAPDH의 mRNA 발현량으로 보정하고, 무자극 대조군의 평균값을 1로 한 상대값을 나타낸다.
도 8은 PDGFBB로 자극한 래트 신간질 세포에 있어서의, 화합물 A의 세포 증식 억제 효과를 나타낸다. 종축은, 무자극 대조군의 흡광도의 평균값을 1로 한 상대값을 나타낸다.
도 9는 TGFβ1로 자극한 인간 피부 섬유아세포에 있어서의, 화합물 A의 콜라겐 생성 억제 효과를 나타낸다. 종축은, PIP 농도 측정값을 세포 증식 활성값(흡광도)으로 보정하고, 무자극 대조군의 평균값을 1로 한 상대값으로서 산출한 값을 나타낸다.
본 복소환 유도체(1)에 있어서, 예컨대,
R1, R2는 동일하거나 상이하며 할로겐 원자, 알킬 및 알콕시로 이루어진 군으로부터 선택되는 1∼3개의 치환기로 치환되어 있어도 좋은 페닐이고,
R3, R4는 동일하거나 상이하며 수소 원자 또는 알킬이며,
R5가 수소 원자이고,
Y가 N이며,
A가 NR6이고, R6이 알킬이며,
D가 알킬렌이고,
E가 단일 결합이며,
G가 O이고,
Q가 카르복시 또는 화학식 4로 표시되는 기이며, R7이 아미노, 모노알킬아미노, 디알킬아미노, 혹은 히드록시, 또는 할로겐 원자, 알킬, 할로알킬, 아릴알킬, 알콕시, 알킬티오, 알콕시알킬, 알킬술포닐, 히드록시, 아미노, 모노알킬아미노, 디알킬아미노, 카르복시, 시아노 및 니트로로 이루어진 군으로부터 선택되는 1∼3개의 치환기로 치환되어 있어도 좋은 하기 1) 내지 4) 중 어느 하나의 기인 화합물이 바람직하다.
1) 알킬
2) 아릴
3) 아릴옥시
4) 복소환기
구체적으로는, 예컨대,
2-{4-[N-(5,6-디페닐피라진-2-일)-N-이소프로필아미노]부틸옥시}아세트산(이하, 「화합물 A」라고 함) 및
2-{4-[N-(5,6-디페닐피라진-2-일)-N-이소프로필아미노]부틸옥시}-N-(메틸술포닐)아세트아미드(이하, 「화합물 B」라고 함)가 바람직하다.
본 발명에 있어서의 「알킬」로서는, 직쇄형 또는 분지쇄형의 탄소수 1∼6인 것, 예컨대, 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, sec-부틸, tert-부틸, n-펜틸, 이소펜틸, n-헥실, 이소헥실을 들 수 있다. 특히, 탄소수 1∼4인 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서의 「할로알킬」, 「아릴알킬」, 「알킬티오」, 「알콕시알킬」, 「알킬술포닐」, 「모노알킬아미노」, 「디알킬아미노」, 「모노알킬카르바조일」 및 「디알킬카르바모일」의 알킬 부분으로서는, 상기한 알킬과 동일한 것을 들 수 있다.
본 발명에 있어서의 「알콕시」로서는, 직쇄형 또는 분지쇄형의 탄소수 1∼6인 것, 예컨대, 메톡시, 에톡시, n-프로폭시, 이소프로폭시, n-부톡시, 이소부톡시, sec-부톡시, tert-부톡시, n-펜틸옥시, 이소펜틸옥시, n-헥실옥시, 이소헥실옥시를 들 수 있다. 특히, 탄소수 1∼4인 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서의 「알콕시카르보닐」 및 「알콕시알킬」의 알콕시 부분으로서는, 상기한 알콕시와 동일한 것을 들 수 있다.
본 발명에 있어서의 「알케닐」로서는 직쇄형 또는 분지쇄형의 탄소수 2∼6인 것, 예컨대, 비닐, 1-프로페닐, 2-프로페닐, 1-부테닐, 2-부테닐, 3-부테닐, 1-펜테닐, 2-펜테닐, 3-펜테닐, 4-펜테닐, 4-메틸-3-펜테닐, 1-헥세닐, 2-헥세닐, 3-헥세닐, 4-헥세닐, 5-헥세닐을 들 수 있다. 특히, 탄소수 3 또는 4인 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서의 「시클로알킬」로서는, 탄소수 3∼8인 것, 예컨대, 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸, 시클로헥실, 시클로헵틸, 시클로옥틸을 들 수 있다. 특히, 탄소수 5∼7인 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서의 「할로겐 원자」로서는, 예컨대, 불소 원자, 염소 원자, 브롬 원자, 요오드 원자를 들 수 있다.
본 발명에 있어서의 「아릴」로서는, 탄소수 6∼10인 것, 예컨대, 페닐, 1-나프틸, 2-나프틸을 들 수 있다. 특히, 페닐이 바람직하다.
본 발명에 있어서의 「아릴알킬」 및 「아릴옥시」의 아릴 부분으로서는, 상기한 아릴과 동일한 것을 들 수 있다.
본 발명에 있어서의 「알킬렌」으로서는, 직쇄형 또는 분지쇄형의 탄소수 1∼8인 것, 예컨대, 메틸렌, 에틸렌, 1-메틸에틸렌, 2-메틸에틸렌, 트리메틸렌, 테트라메틸렌, 펜타메틸렌, 헥사메틸렌, 헵타메틸렌, 옥타메틸렌을 들 수 있다. 특히, 탄소수 3∼6인 것이 바람직하고, 탄소수 4인 것이 특히 바람직하다.
본 발명에 있어서의 「알케닐렌」으로서는, 직쇄형 또는 분지쇄형의 탄소수 2∼8인 것, 예컨대, 에테닐렌, 1-프로페닐렌, 2-프로페닐렌, 1-부테닐렌, 2-부테닐렌, 3-부테닐렌, 1-펜테닐렌, 2-펜테닐렌, 3-펜테닐렌, 4-펜테닐렌, 4-메틸-3-펜테닐렌, 1-헥세닐렌, 2-헥세닐렌, 3-헥세닐렌, 4-헥세닐렌, 5-헥세닐렌, 1-헵테닐렌, 2-헵테닐렌, 3-헵테닐렌, 4-헵테닐렌, 5-헵테닐렌, 6-헵테닐렌, 1-옥테닐렌, 2-옥테닐렌, 3-옥테닐렌, 4-옥테닐렌, 5-옥테닐렌, 6-옥테닐렌, 7-옥테닐렌을 들 수 있다. 특히, 탄소수 3∼6인 것이 바람직하고, 탄소수 4인 것이 특히 바람직하다.
본 발명에 있어서의 「복소환기」로서는, 하기 (1) 또는 (2)를 들 수 있다.
(1) 질소 원자, 산소 원자 및 황 원자로부터 선택되는 1∼4개까지의 헤테로 원자를 갖는 5 또는 6원의 방향환기 또는 이들의 벤젠 축합환으로서, 이러한 고리 구성 원자가 질소 원자 또는 황 원자인 경우, 이러한 질소 원자, 황 원자는 옥사이드를 형성하고 있어도 좋다. 예컨대, 1-피롤릴, 2-피롤릴, 3-피롤릴, 3-인돌릴, 2-푸라닐, 3-푸라닐, 3-벤조푸라닐, 2-티에닐, 3-티에닐, 3-벤조티에닐, 1,3-옥사졸-2-일, 4-이소옥사졸릴, 2-티아졸릴, 5-티아졸릴, 2-벤조티아졸릴, 1-이미다졸릴, 2-이미다졸릴, 4-이미다졸릴, 2-벤즈이미다졸릴, 1H-1,2,4-트리아졸-1-일, 1H-테트라졸-5-일, 2H-테트라졸-5-일, 2-피리딜, 3-피리딜, 4-피리딜, 3-피라졸릴, 2-피리미디닐, 4-피리미디닐, 2-피라지닐, 1,3,5-트리아진-2-일을 들 수 있다.
(2) 고리 구성 원자로서, 질소 원자, 산소 원자 또는 황 원자를, 동일하거나 또는 상이하여 1∼4개 함유하고 있어도 좋고, 4∼8원환의 포화 고리기, 또는 이들의 벤젠 축합환기로서, 고리 구성 원자가 질소 원자 또는 황 원자인 경우, 이러한 질소 원자, 황 원자는 옥사이드를 형성하고 있어도 좋다. 예컨대, 피페리디노, 피페라지닐, 3-메틸피페라진-1-일, 호모피페라지닐, 모노폴리노, 티오모노폴리노, 1-피롤리디닐, 2-피롤리디닐, 2-테트라히드로푸라닐을 들 수 있다.
본 복소환 유도체(1)는 상기 특허문헌 1(국제 공개 제02/088084호 팜플렛)에 기재한 방법에 의해 합성할 수 있다.
본 복소환 유도체(1)는 유리 염기 또는 산의 상태로 의약으로서 이용할 수 있지만, 공지의 방법에 의해 의학상 허용되는 염의 형태로 하여 이용할 수도 있다.
본 복소환 유도체(1)가 염기성을 나타내는 경우의 「염」으로서는, 예컨대, 염산, 황산, 질산, 인산, 불화수소산, 혹은 브롬화수소산의 무기산의 염, 또는 아세트산, 타르타르산, 젖산, 시트르산, 푸마르산, 말레산, 호박산, 메탄술폰산, 에탄술폰산, 벤젠술폰산, p-톨루엔술폰산, 나프탈렌술폰산, 혹은 캄파술폰산의 유기산의 염을 들 수 있다.
본 복소환 유도체(1)가 산성을 나타내는 경우의 「염」으로서는, 예컨대, 나트륨염, 칼륨염 등의 알칼리 금속염 또는 칼슘염 등의 알칼리 토류 금속염을 들 수 있다.
본 복소환 유도체(1)에는 기하 이성체(Z체 및 E체)가 존재하지만, 각 기하 이성체 및 이들의 혼합물도 본 복소환 유도체(1)에 포함된다. 또한, 본 복소환 유도체(1)에는 비대칭 탄소를 갖는 것도 존재하지만, 각 광학 이성체 및 이들의 라세미체도 본 복소환 유도체(1)에 포함된다. 광학 이성체는 상기한 바와 같이 하여 얻어진 라세미체로부터, 그 염기성을 이용하여 광학 활성인 산(예컨대, 타르타르산, 디벤조일타르타르산, 만델산, 10-캄파술폰산)을 이용하여 공지의 방법에 의해 광학 분할하거나 혹은 미리 조제한 광학 활성인 화합물을 원료로 이용하여 제조할 수 있다.
본 발명에 따른 섬유화 억제제는, 예컨대, 장기 또는 조직의 섬유화가 관여하는 하기 질환의 치료에 이용할 수 있다.
(1) 신장 질환
요세관 간질성 신염
(2) 호흡기 질환
간질성 폐렴(폐섬유증)
(3) 소화기 질환
간경변, 만성 췌장염, 스킬스 위암
(4) 심혈관 질환
심근 섬유증
(5) 골·관절 질환
골수 섬유증, 관절 류머티즘
(6) 피부 질환
수술 후의 반흔, 열상성 반흔, 켈로이드, 비후성 반흔, 강피증
(7) 산과 질환
자궁 근종
(8) 비뇨기 질환
전립선 비대증
(9) 기타 질환
알츠하이머병, 경화성 복막염, I형 당뇨병, 수술 후 장기 유착
본 발명에 따른 섬유화 억제제는, 본 복소환 유도체(1)를, 그대로 또는 의약상 허용되는 무독성 또한 불활성 담체 속에 0.01%∼99.5%의 범위 내에서, 바람직하게는 0.5%∼90%의 범위 내에서 함유하는 것이다.
상기 담체로서는, 고형, 반고형 또는 액상의 희석제, 충전제, 기타 처방용 조제(助劑)를 들 수 있다. 이들을 1종 또는 2종 이상 이용할 수 있다.
본 발명에 따른 섬유화 억제제는, 고형 또는 액상의 용량 단위로, 말제, 캡슐제, 정제, 당의제, 과립제, 산제, 현탁제, 액제, 시럽제, 엘릭시르제, 트로키제 등의 경구 투여 제제, 주사제, 좌제 등의 비경구 투여 제제 중 어느 한 형태를 취할 수도 있다. 서방성 제제여도 좋다. 이들 중에서, 특히 정제 등의 경구 투여 제제가 바람직하다.
말제는, 본 복소환 유도체(1)를 적당히 미세하게 함으로써 제조할 수 있다.
산제는, 본 복소환 유도체(1)를 적당히 미세하게 하고, 계속해서 마찬가지로 미세하게 한 의약용 담체, 예컨대, 전분, 만니톨과 같은 가식성 탄수화물과 혼합함으로써 제조할 수 있다. 임의로 풍미제, 보존제, 분산제, 착색제, 향료 등을 첨가할 수 있다.
캡슐제는, 우선 전술한 바와 같이 하여 분말형이 된 말제나 산제 혹은 정제의 항에서 설명한 바와 같이 과립화한 것을, 예컨대, 젤라틴 캡슐과 같은 캡슐 외피 속에 충전함으로써 제조할 수 있다. 활택제나 유동화제, 예컨대, 콜로이드형 실리카, 탈크, 스테아린산마그네슘, 스테아린산칼슘, 고형의 폴리에틸렌글리콜을 분말형의 것과 혼합하고, 그 후, 충전 조작을 행함으로써 제조할 수도 있다. 붕괴제나 가용화제, 예컨대, 카르복시메틸셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스칼슘, 저치환도 히드록시프로필셀룰로오스, 크로스카르멜로오스나트륨, 카르복시메틸스타치나트륨, 탄산칼슘, 탄산나트륨을 첨가하면, 캡슐제가 섭취되었을 때의 의약의 유효성을 개선할 수 있다. 또한, 본 복소환 유도체(1)의 미분말을 식물유, 폴리에틸렌글리콜, 글리세린, 계면활성제 속에 현탁 분산시켜, 이것을 젤라틴 시트로 싸서 연질 캡슐제로 할 수도 있다.
정제는, 부형제를 첨가하여 분말 혼합물을 만들어 과립화 혹은 슬래그화하고, 계속해서 붕괴제 또는 활택제를 첨가한 후, 타정함으로써 제조할 수 있다.
분말 혼합물은, 적당히 분말화된 물질을 전술한 희석제나 베이스와 혼합함으로써 제조할 수 있다. 필요에 따라, 결합제(예컨대, 카르복시메틸셀룰로오스나트륨, 메틸셀룰로오스, 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈, 폴리비닐알코올), 용해 지연화제(예컨대, 파라핀), 재흡수제(예컨대, 4급염), 흡착제(예컨대 벤토나이트, 카올린) 등을 첨가할 수 있다.
분말 혼합물은, 우선, 결합제, 예컨대, 시럽, 전분 풀, 아라비아 고무, 셀룰로오스 용액 또는 고분자 물질 용액으로 적셔 교반 혼합하고, 이것을 건조, 분쇄하여 과립으로 만들 수 있다. 이와 같이 분말을 과립화하는 대신에 우선 타정기에 건 후, 얻어지는 불완전한 형태의 슬래그를 파쇄하여 과립으로 만드는 것도 가능하다. 이와 같이 하여 만들어지는 과립에, 활택제로서 스테아린산, 스테아린산염, 탈크, 미네랄 오일 등을 첨가함으로써, 서로 부착되는 것을 막을 수 있다.
또한, 정제는, 전술한 바와 같이 과립화나 슬래그화의 공정을 거치지 않고, 본 복소환 유도체(1)를 유동성의 불활성 담체와 혼합한 후에 직접 타정함으로써도 제조할 수 있다.
이렇게 해서 제조된 정제에 필름 코팅이나 당의(糖衣)를 행할 수 있다. 셸락의 밀폐 피막으로 이루어진 투명 또는 반투명의 보호 피복, 당이나 고분자 재료의 피복 및 왁스로 이루어진 연마 피복도 이용할 수 있다.
다른 경구 투여 제제, 예컨대, 액제, 시럽제, 트로키제, 엘릭시르제도 또한 그 일정량이 본 복소환 유도체(1)의 일정량을 함유하도록 용량 단위 형태로 할 수 있다.
시럽제는, 본 복소환 유도체(1)를 적당한 향기 수용액에 용해시켜 제조할 수 있다. 엘릭시르제는, 비독성의 알코올성 담체를 이용함으로써 제조할 수 있다.
현탁제는, 본 복소환 유도체(1)를 비독성 담체 속에 분산시킴으로써 제조할 수 있다. 필요에 따라, 가용화제나 유화제(예컨대, 에톡시화된 이소스테아릴알코올류, 폴리옥시에틸렌소르비톨에스테르류), 보존제, 풍미부여제(예컨대, 페퍼민트유, 사카린) 등을 첨가할 수 있다.
필요하면, 경구 투여를 위한 용량 단위 처방을 마이크로 캡슐화할 수 있다. 이 처방은 또한, 피복을 하거나, 고분자·왁스 등 속에 매립하거나 함으로써 작용 시간의 연장이나 지속 방출을 초래할 수도 있다.
비경구 투여 제제는, 피하·근육 또는 정맥내 주사용으로 한 액상 용량 단위 형태, 예컨대, 용액이나 현탁액의 형태를 취할 수 있다. 이 비경구 투여 제제는, 본 복소환 유도체(1)의 일정량을, 주사의 목적에 적합한 비독성의 액상 담체, 예컨대, 수성이나 유성의 매체에 현탁시키거나 또는 용해시키고, 계속해서 이 현탁액 또는 용액을 멸균함으로써 제조할 수 있다. 주사액을 등장(等張)으로 하기 위해서 비독성의 염이나 염 용액을 첨가할 수 있다. 또한, 안정제, 보존제, 유화제 등을 첨가할 수도 있다.
좌제는, 본 복소환 유도체(1)를 저융점의 물에 가용 또는 불용의 고체, 예컨대, 폴리에틸렌글리콜, 카카오기름, 반합성의 유지[예컨대, 위텝솔(등록상표)], 고급 에스테르류(예컨대, 팔미트산미리스틸에스테르) 또는 이들의 혼합물에 용해 또는 현탁시켜 제조할 수 있다.
본 발명에 따른 섬유화 억제제의 투여량은, 체중, 연령 등의 환자의 상태, 투여 경로, 증상의 정도 등에 따라 다르지만, 일반적으로는 성인에 대하여, 본 복소환 유도체(1)의 양으로서, 1일당 0.01 ㎎∼1000 ㎎의 범위 내가 적당하며, 0.1 ㎎∼100 ㎎의 범위 내가 보다 바람직하다. 경우에 따라서는, 이 이하여도 충분하고, 또한, 반대로 이 이상의 용량을 필요로 할 때도 있다. 또한, 1일 1회∼수회의 투여 또는 1일∼수일간의 간격으로 투여할 수 있다.
[실시예]
이하에, 시험예를 들어 본 발명을 더욱 상세히 설명하지만, 본 발명은 실시예에 나타내는 범위로 한정되는 것은 아니다.
시험예 1
(1) 시험 방법
인간 폐섬유아세포(Lonza Walkersville사 제조. 이하 동일함)는 인간 폐섬유아세포용 기초 배지(Lonza Walkersville사 제조. 이하 동일함)(이하, 「기초 배지」라고 함)에 FGM-2 첨가 인자 세트(Lonza Walkersville사 제조. 이하 동일함)를 가한 증식용 배지를 이용하여 37℃, 5% CO2 조건 하에서 배양하였다. 인간 폐섬유아세포를 96 well 플레이트에 1×103 cells/well로 파종하고, 증식용 배지에서 밤새 배양하였다.
이 세포를 100 ㎕의 인산 완충 생리식염수(닛스이세이야꾸사 제조. 이하 동일함)로 1회 세정하고, 기초 배지를 첨가하여 24시간 동안 배양하였다. 또한, 100 ㎕의 인산 완충 생리식염수로 1회 세정하고, 80 ㎕/well의 기초 배지를 첨가하였다. 여기에 100 μM의 화합물 A 또는 화합물 B의 약액을 각 well에 10 ㎕씩 첨가하여 2시간 동안 배양하였다. 또한, 첨가한 약액은, 화합물 A 또는 화합물 B를 미리 디메틸술폭시드(DMSO)에 용해시켜 10 mM의 약액을 조제하고, 이것을 기초 배지로 100배로 희석한 것을 이용하였다. 무자극 대조군 및 대조군에 대해서는 DMSO를 기초 배지로 100배 희석한 것을 이용하였다.
여기에 100 ng/㎖의 상피 성장 인자(Epidermal Growth Factor: EGF)(PeproTech사 제조) 용액을 각 well에 10 ㎕씩 첨가하여 48시간 동안 배양하였다. 또한, 무자극 대조군에 대해서는 기초 배지를 이용하였다.
48시간 동안 배양한 후, 세포 증식 활성을 조사하기 위해서, CellTiter 96, AQueous Assay(Promega사 제조)를 이용하여 490 ㎚에 있어서의 흡광도를 측정하였다. 흡광도의 측정에는 마이크로 플레이트 리더(Benchmark, Bio-Rad사 제조. 이하 동일함)를 이용하였다.
(2) 결과
도 1에 도시된 바와 같이, 인간 폐섬유아세포는 EGF 자극에 의해 세포 증식 활성이 유의하게 증가하였다. 한편, 화합물 A 및 화합물 B를 처리한 세포는, 대조군에 비하여 세포 증식 활성이 유의하게 감소하였다.
시험예 2
(1) 시험 방법
인간 폐섬유아세포는, 증식용 배지를 이용하여 37℃, 5% CO2 조건 하에서 배양하였다. 인간 폐섬유아세포를 96 well 플레이트에 3×103 cells/well로 파종하고, 증식용 배지에서 밤새 배양하였다.
이 세포를 100 ㎕의 인산 완충 생리식염수로 1회 세정하고, 기초 배지를 첨가하여 24시간 동안 배양하였다. 또한, 100 ㎕의 인산 완충 생리식염수로 1회 세정하고, 80 ㎕/well의 기초 배지를 첨가하였다. 여기에 1 μM의 화합물 A의 약액을 각 well에 10 ㎕씩 첨가하여 2시간 동안 배양하였다. 또한, 첨가한 약액은, 화합물 A를 미리 DMSO에 용해시켜 1 mM의 약액을 조제하고, 이것을 기초 배지로 100배로 희석한 것을 이용하였다. 무자극 대조군 및 대조군에 대해서는, DMSO를 기초 배지로 100배 희석한 것을 이용하였다.
여기에 100 ng/㎖의 트랜스포밍 증식 인자-α(Transforming Growth Factor-α: TGFα)(CHEMICON사 제조) 용액을 각 well에 10 ㎕씩 첨가하여 48시간 동안 배양하였다. 또한, 무자극 대조군에 대해서는, 기초 배지를 이용하였다.
48시간 동안 배양한 후, 세포 증식 활성을 조사하기 위해서, 시험예 1과 마찬가지로 세포 증식 활성 측정 시약을 이용하여 490 ㎚에 있어서의 흡광도를 측정하였다. 흡광도의 측정에는 마이크로 플레이트 리더를 이용하였다.
(2) 결과
도 2에 도시된 바와 같이, 인간 폐섬유아세포는, TGFα 자극에 의해 세포 증식 활성이 유의하게 증가하였다. 한편, 화합물 A를 처리한 세포는, 대조군에 비하여 세포 증식 활성이 유의하게 감소하였다.
시험예 3
(1) 시험 방법
인간 폐섬유아세포는 96 well 플레이트에 5×103 cells/well로 파종하고, 시험예 1과 마찬가지로 증식용 배지에서 밤새 배양하였다. 이 세포를 100 ㎕의 기초 배지로 1회 세정하고, 100 ㎕의 기초 배지를 첨가하여 24시간 동안 배양하였다. 또한, 100 ㎕의 기초 배지로 1회 세정하고, 80 ㎕/well의 기초 배지를 첨가하였다. 여기에 0.1, 1, 10 또는 100 μM의 화합물 A의 약액을 각 well에 10 ㎕씩 첨가하였다. 또한, 약액은 화합물 A를 미리 DMSO에 용해시켜 10 μM, 100 μM, 1 mM 및 10 mM 농도로 조제하고, 이들을 기초 배지로 100배로 희석한 것을 이용하였다. 또한, 무자극 대조군 및 대조군으로서, DMSO를 기초 배지로 100배 희석한 것을 10 ㎕씩 첨가하였다. 2시간 동안 배양한 후에, 100 ng/㎖의 트랜스포밍 증식 인자 β1(Transforming Growth Factor β1: TGFβ1)(PeproTech사 제조. 이하 동일함) 용액을 10 ㎕씩, 또한, 무자극 대조군에 대해서는 기초 배지를 10 ㎕씩 첨가하였다. 48시간 동안 배양한 후에 배지 속의 프로콜라겐 I형 C 말단 펩티드(PIP) 농도를 측정하기 위해서 배지를 회수하고, 새롭게 100 ㎕의 기초 배지를 첨가하여 3-(4,5-디메틸-2-티아졸릴)-2,5-디페닐-2H 테트라졸륨 브로마이드(MTT)(나카라이테스크사 제조)를 이용하여 세포 증식 활성을 측정하였다. 세포 증식 활성의 측정은 5 ㎎/㎖의 MTT 스톡 용액을 각 well에 10 ㎕씩 첨가하여 4시간 동안 배양한 후, 각 well에 0.04 M 염산이소프로판올 용액을 100 ㎕씩 첨가하고, 마이크로 플레이트 리더로 595 ㎚에 있어서의 흡광도(참조 파장 655 ㎚)를 측정하였다. 48시간 동안 배양한 후의 배지 속 PIP 농도는 Procollagen Type I C-peptide(PIP) EIA Kit(Takara사 제조. 이하 동일함)를 이용하여 첨부한 사용설명서에 따라 측정하였다. 본 시험의 고찰은 PIP 농도 측정값을 세포 증식 활성값(흡광도)으로 보정하고, 무자극 대조군의 평균값을 1로 한 상대값으로서 산출한 값(콜라겐 생성의 지표)을 이용하여 행하였다.
(2) 결과
도 3에 도시된 바와 같이, 인간 폐섬유아세포는, TGF β1 자극에 의해 콜라겐 생성이 유의하게 증가하였다. 한편, 화합물 A를 처리한 세포는 대조군에 비하여 콜라겐 생성이 유의하게 감소하였다.
시험예 4
(1) 시험 방법
인간 폐섬유아세포는 24 well 플레이트에 1×105 cells/well로 파종하고, 시험예 1과 마찬가지로 증식용 배지에서 밤새 배양하였다. 이 세포를 500 ㎕의 기초 배지로 1회 세정하고, 500 ㎕의 기초 배지를 첨가하여 24시간 동안 배양하였다. 더욱, 500 ㎕의 기초 배지로 1회 더 세정하고, 400 ㎕/well의 기초 배지를 첨가하였다. 여기에 시험예 3과 동일한 방법으로 조제한 1, 10 또는 100 μM의 화합물 A의 약액을 각 well에 50 ㎕씩 첨가하였다. 또한, 무자극 대조군 및 대조군으로서, DMSO를 기초 배지로 100배 희석한 것을 50 ㎕씩 첨가하였다. 2시간 동안 배양한 후에 100 ng/㎖의 TGF β1 용액을 각 well에 50 ㎕씩 첨가하고, 또한 무자극 대조군에 대해서는 기초 배지를 50 ㎕씩 첨가하였다. 24시간 동안 배양한 후, SV Total RNA Isolation System(Invitrogen사 제조)을 이용하여 RNA를 추출하고, SuperScriptIII(Invitrogen사 제조)를 이용하여 RNA로부터 1st strand cDNA를 합성하였다. 이렇게 해서 제작한 cDNA를 주형으로 하여 실시간 정량 PCR법에 의해 I형 콜라겐 α1쇄(COL1α1), I형 콜라겐 α2쇄(COL1α2), α평활근 액틴(ACTA), TGFβ1 및 글리세르알데히드3-인산 탈수소효소(GAPDH)의 mRNA 발현량을 측정하였다. 실시간 정량 PCR은 Platinum SYBR Green qPCR Super-Mix-UDG with ROX(Invitrogen사 제조)및 각 유전자에 특이적인 프라이머를 사용하고, Platinum SYBR Green qPCR Super-Mix-UDG with ROX 첨부한 사용설명서에 따라 ABI PRISM 7000(Applied Biosystems사)을 이용하여 행하였다. 본 시험의 고찰은, 각 유전자의 mRNA의 발현량을 GAPDH의 mRNA 발현량으로 보정하고, 무자극 대조군의 평균값을 1로 하는 상대값으로서 산출한 값(mRNA 발현 레벨)을 이용하여 행하였다.
(2) 결과
도 4 내지 도 7에 도시된 바와 같이, 인간 폐섬유아세포는 TGFβ1 자극에 의해 각 mRNA 발현 레벨이 증가하였다. 한편, 화합물 A를 처리한 세포는 대조군에 비하여 각 mRNA 레벨이 감소하였다.
시험예 5
(1) 시험 방법
래트 신간질 세포(NRF49F 세포)는 96 well 플레이트에 1×104 cells/well 파종하고, 10% 소태아 혈청(JRH Bioscience사 제조. 이하 동일함)을 함유하는 Minimum Essential Medium(MEM 배지: 니혼세이야꾸사 제조. 이하 동일함)을 이용하여 37℃, 5% CO2 조건 하에서 밤새 배양하였다. 소태아 혈청을 함유하지 않는 MEM 배지(이하, 「무혈청 MEM 배지」라고 함)로 1회 세정하고, 100 ㎕의 무혈청 MEM 배지를 첨가하여 24시간 동안 배양하였다. 무혈청 MEM 배지로 1회 더 세정한 후, 무혈청 MEM 배지를 80 ㎕/well 첨가하였다. 여기에 시험예 1과 동일한 방법으로 조제한 100 μM의 화합물 A의 약액을 각 well에 10 ㎕씩 첨가하였다. 또한, 무자극 대조군 및 대조군에 대해서는, DMSO를 무혈청 MEM 배지로 100배 희석한 것을 10 ㎕씩 첨가하였다. 2시간 동안 배양한 후에 100 ng/㎖의 혈소판 유래 성장 인자(Platelet-Derived Growth Factor-BB: PDGFBB)(Sigma사 제조) 용액을 각 well에 10 ㎕씩, 또한 무자극 대조군은 무혈청 MEM 배지를 10 ㎕씩 첨가하여 배양하였다. 48시간 동안 배양한 후에, 시험예 3과 마찬가지로 MTT법에 의해 세포 증식 활성(흡광도)을 측정하였다. 본 시험의 고찰은 무자극 대조군의 흡광도의 평균값을 1로 하는 상대값으로 나타낸 값(세포 증식 레벨)을 이용하여 행하였다.
(2) 결과
도 8에 도시된 바와 같이, 래트 신간질 세포는, PDGFBB 자극에 의해 세포 증식 레벨이 유의하게 증가하였다. 한편, 화합물 A를 처리한 세포는, 대조군에 비하여 세포 증식 레벨이 유의하게 감소하였다.
시험예 6
(1) 시험 방법
인간 피부 섬유아세포(쿠라보우사 제조. 이하 동일함)는 96 well 플레이트에 5×103 cells/well로 파종하고, 10%의 소태아 혈청을 함유하는 Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM 배지)(니혼세이야꾸사 제조. 이하 동일함)을 이용하여 37℃, 5% CO2 조건 하에서 밤새 배양하였다. 인간 피부 섬유아세포를 소태아 혈청을 함유하지 않는 DMEM 배지(이하, 「무혈청 DMEM 배지」라고 함)로 1회 세정하고, 100 ㎕의 무혈청 DMEM 배지를 첨가하여 24시간 동안 배양하였다. 무혈청 DMEM 배지로 1회 더 세정하고, 80 ㎕/well의 무혈청 DMEM 배지를 첨가하였다. 여기에 시험예 3과 동일한 방법으로 조제한 0.1, 1, 10 또는 100 μM의 화합물 A의 약액을 각 well에 10 ㎕씩 첨가하였다. 또한, 무자극 대조군 및 대조군에 대해서는, DMSO를 무혈청 DMEM 배지로 100배 희석한 것을 10 ㎕씩 첨가하여 배양하였다. 2시간 동안 배양한 후에 100 ng/㎖의 TGFβ1 용액을 각 well에 10 ㎕씩 첨가하고, 무자극 대조군에 대해서는 무혈청 MEM 배지를 10 ㎕씩 첨가하였다. 48시간 동안 배양한 후에 시험예 3과 마찬가지로 MTT법에 의해 세포 증식 활성(흡광도)과, 배지 속의 PIP 농도를 측정하였다. 본 시험의 고찰은, PIP 농도 측정값을 세포 증식 활성값(흡광도)으로 보정하고, 무자극 대조군의 평균값을 1로 한 상대값으로서 산출한 값(콜라겐 생성의 지표)을 이용하여 행하였다.
(2) 결과
도 9에 도시된 바와 같이, 인간 피부 섬유아세포는, TGFβ1 자극에 의해 콜라겐 생성이 유의하게 증가하였다. 한편, 화합물 A를 처리한 세포는, 대조군에 비하여 콜라겐 생성이 유의하게 감소하였다.

Claims (7)

  1. 2-{4-[N-(5,6-디페닐피라진-2-일)-N-이소프로필아미노]부틸옥시}아세트산, 2-{4-[N-(5,6-디페닐피라진-2-일)-N-이소프로필아미노]부틸옥시}-N-(메틸술포닐)아세트아미드 또는 그 의약상 허용되는 염을 유효성분으로서 함유하는 섬유화 억제제로서, 요세관 간질성 신염, 간질성 폐렴, 간경변, 만성 췌장염, 스킬스 위암, 심근 섬유증, 골수 섬유증, 관절 류머티즘, 수술 후의 반흔, 열상성 반흔, 켈로이드, 비후성 반흔, 강피증, 자궁 근종, 전립선 비대증, 알츠하이머병, 경화성 복막염, I형 당뇨병 및 수술 후 장기 유착으로 이루어진 군으로부터 선택되는 질환을 치료하기 위한 섬유화 억제제.
  2. 제1항에 있어서, 간질성 폐렴을 치료하기 위한 섬유화 억제제.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
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