CN110372786B

CN110372786B - 用于制备mPRα单克隆抗体的免疫原

Info

Publication number: CN110372786B
Application number: CN201910552308.XA
Authority: CN
Inventors: 罗韬; 曾旭辉; 陈厚仰; 彭真; 程一民
Original assignee: Nanchang University
Current assignee: Nanchang University
Priority date: 2019-06-24
Filing date: 2019-06-24
Publication date: 2021-08-24
Anticipated expiration: 2039-06-24
Also published as: CN110372786A

Abstract

本发明提供了一种用于制备mPRα单克隆抗体的免疫原，属于生物技术领域。该免疫原为多肽，氨基酸序列为YEARRPIYE PLHTHWPHN。本发明还提供了一种将该免疫原制备成的mPRα单克隆抗体的制备方法，通过对目的多肽YEARRPIYE PLHTHWPHN于与KLH交联，之后依次经免疫原制备和免疫小鼠、杂交瘤细胞制备、融合细胞筛选、杂交瘤细胞的克隆化、腹水法制备单克隆抗体、单克隆抗体鉴定及纯化等步骤获得。本发明还提供了一种上述mPRα单克隆抗体在制备精子生理调节机制药物或男性避孕药中的应用。该免疫原制成的mPRα单克隆抗体具有高效价、特异性，能特异性识别mPRα，可以为调控精子功能化合物和男性避孕药的新型分子靶点。

Description

用于制备mPRα单克隆抗体的免疫原

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及用于制备mPRα单克隆抗体的免疫原。

背景技术

当今，生育问题已成为全世界范围内的健康和社会问题。另一方面，目前全球人口总量已达70亿总人口，寻找理想的避孕方式以主动控制人口数量具有重大的意义。当前市场中避孕药主要是针对女性的激素类药物，尚无市场化针对男性生殖生理的避孕药物。基于现有女用避孕药的副作用以及人们生殖伦理观的改变，研发安全、有效、易恢复的男性避孕药具有非常广阔的市场需求。因此，在分子水平揭示男性生殖调控的机制，对于研究男性不育症的病理生理机制、探索其可能的治疗途径以及开发新型男性避孕药物，均具有重要的社会意义。

生理激素孕酮是调节精子功能的重要生理激素且精子响应孕酮能力下降是男性不育症的常见病征。精子胞膜上的孕酮受体是精子响应孕酮的关键蛋白，可作为开发调控精子功能化合物和男性避孕药的新型分子靶点。然而，目前精子中功能性孕酮膜受体鲜有报道，也未开发相关靶向药物。

单克隆抗体具有特异性、多样性和定向性特点，具有成为靶向药物的潜力。找寻合适的免疫原是制备单克隆抗体的关键，进一步研究制备精子生理调节机制工具药和制备男性避孕药具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于制备孕酮膜受体mPRα单克隆抗体的免疫原，该免疫原制备的单克隆抗体具有效价高、特异性好的特点。该单克隆抗体与人精子孵育可显著抑制人精子对孕酮的响应(钙含量、CatSper电流、穿粘液能力以及顶体反应的增加)。

用于制备mPRα(孕酮膜受α，membrane progesterone receptorα，UniProtKB：Q86WK9)单克隆抗体的免疫原为多肽，氨基酸序列为YEARRPIYE PLHTHWPHN。

本发明还涉及前述免疫原制备的mPRα单克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：

1)多肽合成：合成目的多肽YEARRPIYE PLHTHWPHN，并与钥孔血蓝蛋白(KLH)交联；

2)免疫原制备和免疫小鼠：取5只6-8周Balb/c小鼠雌性小鼠，用400μl 0.01mol/l磷酸缓冲液溶解50μg(1只剂量)上述KLH交联多肽，与弗氏完全佐剂等比例混合，充分震荡乳化，将该乳化的免疫原在小鼠多点皮下注射，间隔3周后，第二次免疫，剂量途径同第一次免疫，佐剂换成弗氏不完全佐剂，间隔3周后，第三次免疫，剂量同上(但用200μl磷酸缓冲液)，不加佐剂，腹腔注射，7天后尾部采血ELISA检测抗体效价，间隔3周后，再加强一次免疫，腹腔注射，3天后，取脾融合；

3)制备杂交瘤细胞：制备饲养细胞(小鼠腹腔巨噬细胞)和骨髓瘤细胞备用；提取免疫小鼠脾细胞，并将该脾细胞与骨髓瘤细胞融合；

4)融合细胞的筛选：在HAT选择培养液中筛选杂交瘤细胞；

5)杂交瘤细胞的克隆化和冻存：有限稀释法将抗体阳性的杂交瘤细胞筛选出分泌抗体的杂交瘤细胞克隆，对培养上清进行ELISA检测，挑选阳性亚克隆并进行标准处理；

6)腹水法制备单克隆抗体：腹腔注射阳性杂交瘤细胞，接种7-10天后抽取腹水。

进一步地，所述步骤5)中的克隆杂交瘤细胞冻存方法为：将杂交瘤细置于50％小牛血清、40％不完全培养液和10％DMSO的细胞冻存液中，用程序降温法冻存于液氮中。

进一步地，所述步骤6)中的单克隆的鉴定与纯化包括如下步骤：用ELISA确定抗体与抗原的亲和力，抗体效价大于1∶10000，抗体进行ProtienA/G纯化。

本发明还涉及所述mPRα单克隆抗体在制备研究精子生理调节机制药物或男性避孕药中的应用。

本发明的有益效果在于：以特定氨基酸序列的多肽为抗原设计的mPRα单克隆抗体具有高效价、特异性，能特异性识别mPRα，经研究发现，mPRα介导人精子对孕酮的响应，其含量下降与孕酮响应下降的男性不育症密切相关，因而mPRα可作为开发调控精子功能化合物和男性避孕药的新型分子靶点。本发明设计的mPRα单克隆抗体既能作为研究精子生理调节机制的工具药，也可以作为开发新型男性避孕药用途。

附图说明

图1为mPRα蛋白示意图。红色部分为mPRα单克隆抗体免疫原对应位置和具体多肽序列。

图2为mPRα单克隆抗体免疫原纯度鉴定图(FM柱为免疫原对应峰)。

图3为mPRα单克隆抗体免疫原质谱分析图

图4为mPRα单克隆抗体与人精子结合的特异性；M，marker，TP，总蛋白，MP，膜蛋白。Triton X-100作用是帮助mPRα单克隆抗体透过细胞膜，进入精子。不加Triton X-100的精子，mPRα单克隆抗体不能透过细胞膜，只能作用于精子细胞表面。无论精子是否用TritonX-100处理，mPRα单克隆抗体皆能识别mPRα，且说明mPRα是精子膜蛋白。

图5为mPRα单克隆抗体对孕酮增加人精子胞内钙含量的影响；

图6为mPRα单克隆抗体对孕酮增加人精子胞内钙含量的影响；P4，孕酮，浓度为1μmol/L；IgG和anti-mPRα浓度为10μg/ml。

图7为mPRα单克隆抗体对孕酮增加人精子穿粘液能力的影响；P4，孕酮，浓度为10μmol/L；IgG和anti-mPRα浓度为10μg/ml。

图8为mPRα单克隆抗体对孕酮增加人精子获能(capacitation)和顶体反应(acrosome reaction)的影响；P4，孕酮，浓度为10μmol/L；IgG和anti-mPRα浓度为20μg/ml。

具体实施方式

实施例1mPRα单克隆抗体的设计和制备

1.多肽序列的分析与设计

利用DNAstar软件对mPRα的氨基酸进行抗原表位分析，评估其亲水性、抗原性、表面可能性、柔性区等指数，综合考虑氨基酸类别、分布、结构复杂程度、易氧化难度、合成难度、小鼠与人的同源性等，最终确定mPRα上297-314位18个氨基酸作为合成多肽的序列，对应序列为YEARRPIYEP LHTHWPHN。如图1，mPRα具有7次跨膜结构，此多肽位于第6和第7跨膜区之间，覆盖整个膜外段。采用ACT396全自动多通道多肽合成仪，按照编制好的程序自动合成目的多肽，将合成后的多肽溶于50％乙腈，采用HPLC和质谱仪进行鉴定和纯度分析。制备的多肽纯度为83.4％，多肽的氨基酸肽序列为：YEARRPIYEP LHTHWPHN，具体见图2和图3。

2.单克隆抗体的制备

1)多肽合成：委托上海强耀生物科技有限公司合成目的多肽并与钥孔血蓝蛋白(KLH)交联，提高免疫原性。

2)免疫原制备和免疫小鼠：取5只6-8周Balb/c雌性小鼠，用400μl 0.01mol/l磷酸缓冲液溶解50μg(1只剂量)上述KLH交联多肽，与弗氏完全佐剂等比例混合，充分震荡乳化，将该乳化的免疫原在小鼠多点皮下注射，间隔3周后，第二次免疫，剂量途径同第一次免疫，佐剂换成弗氏不完全佐剂，间隔3周后，第三次免疫，剂量同上(但用200μl磷酸缓冲液)，不加佐剂，腹腔注射，7天后尾部采血ELISA检测抗体效价，间隔3周后，再加强一次免疫，腹腔注射，3天后，取脾融合。

3)制备杂交瘤细胞：制备饲养细胞(小鼠腹腔巨噬细胞)和骨髓瘤细胞备用；取已经免疫的Balb/c小鼠，摘除眼球采血，并分离血清作为抗体检测时的阳性对照血清。同时通过颈脱位致死小鼠，浸泡于75％酒精中5分钟，于培养皿上固定后掀开左侧腹部皮肤，可看到脾脏，换眼科剪镊，在超净台中用无菌手术剪开腹膜，取出脾脏置于已盛有10ml不完全培养基的平皿中，轻轻洗涤，并细心剥去周围结缔组织。置平皿中不锈钢筛网上，用注射器针芯研磨成细胞悬液后计数。使脾细胞进入平皿中的不完全培养基。用吸管吹打数次，制成单细胞悬液。通常每只小鼠1×10⁸-2.5×10⁸个脾细胞；将骨髓瘤细胞与脾细胞按1∶10或1∶5的比例混合在一起，在50ml离心管中用无血清不完全培养液洗1次，离心，1200r/min 8分钟，弃去上清，用吸管吸净残留液体(为了避免影响PEG的浓度)，轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略松动。用吸管在60s内(时间最好控制在45s左右)加预热至40℃的50％PEG(PH 8.0)1ml，边加边轻轻搅拌。用10ml吸管在90s内加20-30ml预热的不完全培养基(终止PEG作用)；

20-27℃静置10分钟。1000r/min离心6分钟，弃上清加入5ml HAT培养基，轻轻吹吸沉淀细胞，使其悬浮并混匀，然后补加含腹腔巨噬细胞的HAT培养基至80-100ml。分装96孔细胞培养板(孔板内有饲养细胞层)，每孔0.1-0.15ml(或分装24孔板，每孔1.0-1.5ml)，然后将培养板置37℃，6％CO₂培养箱内培养。5天后用HAT培养基换出1/2培养，基7-10天后用HT培养基换出HAT培养基；经常观察杂交瘤细胞的生长情况，待其长至孔底面积1/10以上时，吸出上清供抗体检测。

4)融合细胞的筛选：脾细胞和骨髓瘤细胞经PEG处理后，形成多种细胞的混合体，只有脾细胞与骨髓细胞形成的杂交瘤细胞才有意义。在HAT选择培养液中培养时，由于骨髓瘤细胞缺乏胸苷激酶或次黄嘌呤鸟嘌呤核糖转移酶，故不能生长繁殖，而杂交瘤细胞具有上述两种酶，在HAT选择培养液可以生长繁殖。

5)杂交瘤细胞的克隆化和冻存：有限稀释法将抗体阳性的杂交瘤细胞筛选出分泌抗体的杂交瘤细胞克隆，对培养上清进行ELISA检测，挑选阳性亚克隆并进行标准处理。并于50％小牛血清，40％不完全培养液和10％DMSO的细胞冻存液中，用程序降温法冻存于液氮中。

7)单克隆抗体的鉴定：用ELISA确定抗体与抗原的亲和力，抗体效价大于1∶10000。

8)抗体进行Protien A/G纯化。

3.单克隆抗体效价

纯化后的单克隆抗体效价为1∶50000。

实施例2mPRα单克隆抗体抑制人精子响应孕酮能力

mPRα单克隆抗体制备如实施例1。

主要实验方法

人精子纯化

采用Percoll非连续梯度离心法，具体为：将等渗Percoll分层液按体积比用PBS稀释为终浓度为45％和90％的Percoll液，加3mL 90％Percoll液于一个无菌圆锥底试管中，小心轻轻加45％Percoll液于90％Peroll液层上面，注意不要打乱两种液体的界面，再将精液小心吸放在90％～45％Percoll分离液的表层上，使3个层面清晰，500g离心20min。然后将沉降在90％的液层底部的精子团小心吸取，重新悬浮于10mL的PBS液中，500g离心5min，最后将沉淀物重悬于1mL人输卵管液(human tubal fluid，HTF)中备用；

人精子胞内钙含量测定

精子经percoll密度梯度离心纯化后，用HS缓冲液调整密度到2×10⁶细胞/ml后，与终浓度为5μM fluo-4(AM)和0.05％F-127于室温下避光共孵育30min。染色后，离心去除多余染料，用HS缓冲液洗2遍后，用HS重悬，分别取54μL加入到酶标板中。用铂金埃尔默公司多功能酶标仪检测Fluo-4荧光(488nm激发，510nm发散)，每隔2s检测一次，检测60s后，用排枪在每个孔中加入6μL 100μg/ml的鼠IgG以及mPRα单克隆抗体，迅速检测300s后，加入10μL21μmol/l孕酮(progresterone)。[Ca²⁺]i变化由fluo-4荧光的百分比(ΔF/F₀，％)变化来间接反映。计算公式为ΔF/F₀(％)＝(F-F₀)/F₀×100％。其中，F₀为加药前每个检测点荧光值的平均值。F表示每一记录时间点的荧光强度。

3)精子膜片钳技术

以精子胞质小粒(Cytosolic Droplet)为高阻封接位点，将电极尖端缓慢靠近胞质小粒，通过施加负压形成高阻封接后，采用系统的ZAP功能形成全细胞构型。然后，通过局部灌流系统，将所需溶液灌流至精子细胞周围，以创造局部微环境。在全细胞模式下给予细胞-100mV～+100mV电压刺激，记录相应的IKSper或ICatSper，记录和分析软件系统分别采用Axon公司的Clampex10.0和Clampfit10.0。

4)人工粘性介质的穿透实验

纯化精子在HTF++中获能2小时后，加入鼠IgG以及mPRα单克隆抗体至终浓度10μg/ml，孵育30min后再加入终浓度为10μM孕酮。取内径1.0mm的长度为7.5cm扁平毛细管中，用吸头注满1％(w/v)甲基纤维素溶液，一端用橡皮泥封住，另一头插入上述孵育液中，静置1h。取出毛细管，用显微镜观察。距管基部1cm和2cm处计算精子数目。

5)获能和顶体反应检测

纯化精子分成四组：IgG组(10μg/ml)、IgG(10μg/ml)+孕酮组(20μmol/l)、抗体组(10μg/ml)、抗体(10μg/ml)+孕酮组(20μmol/l)，分别在HTF++中37℃、5％CO₂培养箱获能4h后，取200μL加入等体积CTC染液染色1min，加入适量4％多聚甲醛-PBS重悬精子沉淀，固定10min。涂片、中性树脂封片，立即于荧光显微镜高倍镜下完整视野计数，至少200个精子计算，以2位观察者读片为准，取平均值。可见精子头部呈3种不同的荧光染色类型，即F型、B型、AR型。F型为未获能精子，其顶体帽完整，整个顶体布满强黄绿色荧光；B型为已获能但未发生顶体反应精子，表现为精子顶体区现强烈的黄绿色荧光，但在顶体后区出现无或暗淡的荧光区带；AR型为完成顶体反应的精子，表现为整个精子头部显示淡黄色或无荧光染色。

以AR型所占比率为顶体反应发生率，以AR+B型所占比率为获能率。

3实验结果

mPRα单克隆抗体与人精子结合的特异性

提取人精子总蛋白和膜蛋白，利用mPRα单克隆抗体进行western blot检测(图4)，结果在总蛋白和膜蛋白中均得到分子量大约为40kDa的蛋白条带，该条带符合mPRα预测的分子量大小(39.7kDa)。利用此抗体进行免疫荧光检测(图4)，结果表明mPRα单克隆抗体能识别人精子表面的mPRα蛋白。

mPRα单克隆抗体抑制人精子响应孕酮能力

我们利用精子胞内钙检测技术检测mPRα单克隆抗体对孕酮增加人精子胞内钙含量的影响。结果发现，10μg/mL mPRα单克隆抗体自身对精子胞内钙无影响，但是抑制孕酮增加人精子胞内钙含量(图5)。精子膜片钳结果显示，10μg/mL mPRα单克隆抗体自身对精子CatSper钙电流没有影响，但是抑制孕酮增加人精子CatSper钙电流(图6)。穿粘液实验和金霉素染色实验结果表明，10μg/mL mPRα单克隆抗体自身对获能和顶体反应没有影响，但是抑制精子穿粘液能力、孕酮诱导的精子穿粘液能力、获能和顶体反应(图7和8)。这些结果表明，mPRα单克隆抗体能抑制人精子响应孕酮能力。

序列表

<110> 南昌大学

<120> 用于制备mPRα单克隆抗体的免疫原

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Tyr Glu Ala Arg Arg Pro Ile Tyr Glu Pro Leu His Thr His Trp Pro

1 5 10 15

His Asn

Claims

1.一种用免疫原制备mPRα单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)KLH交联多肽制备：合成目的多肽YEARRPIYE PLHTHWPHN，并与钥孔血蓝蛋白(KLH)交联；

2)免疫原制备和免疫小鼠：磷酸缓冲液50μl溶解步骤1)中的KLH交联多肽后与弗氏完全佐剂等比例混合，充分震荡乳化，将该乳化的免疫原在小鼠多点皮下注射，间隔3周后，第二次免疫，剂量途径同第一次免疫，佐剂换成弗氏不完全佐剂，间隔3周后，第三次免疫，用200μl磷酸缓冲液溶解，不加佐剂，腹腔注射，剂量途径同上，7天后尾部采血ELISA检测抗体效价；间隔3周后，重复上述步骤再加强一次免疫，腹腔注射免疫原3天后，取脾融合；

3)制备杂交瘤细胞：提取步骤2)免疫小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞融合；

4)融合细胞的筛选：在HAT选择培养液中筛选步骤3)杂交瘤细胞；

6)腹水法制备单克隆抗体：腹腔注射阳性杂交瘤细胞，接种7-10天后抽取腹水；所述免疫原为多肽，其氨基酸序列为YEARRPIYE PLHTHWPHN。

2.如权利要求1所述的免疫原制备mPRα单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述步骤6)制备的单克隆抗体的冻存方法为：将杂交瘤细置于50％小牛血清、40％不完全培养液和10％DMSO的细胞冻存液中，用程序降温法冻存于液氮中。

3.如权利要求1所述的免疫原制备mPRα单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述步骤6)制备的单克隆抗体的纯化鉴定包括如下步骤：

单克隆抗体的鉴定：用ELISA确定抗体与抗原的亲和力，抗体效价大于1∶10000；

单克隆抗体的纯化：抗体进行Protien A/G纯化。