CN116874582A - 一种用于制备CatSper钙通道新亚基TMEM262多克隆抗体的免疫原及其应用 - Google Patents
一种用于制备CatSper钙通道新亚基TMEM262多克隆抗体的免疫原及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种用于制备CatSper钙通道新亚基TMEM262多克隆抗体的免疫原及其应用，所述免疫原为多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明以该氨基酸序列为一级结构设计出的抗原多肽具有高效价、特异性强的优点，该多克隆抗体能够特异性识别TMEM262位点，TMEM262是新发现的一个构成精子CatSper通道结构中的新亚基之一，且具有与其他因子结合发挥作用的功能，也很有可能参与介导CatSper电流。因此，本发明的TMEM262多克隆抗体可以用于研究精子CatSper通道的定位以及探索CatSper通道在生理调节中的机制，作为调控精子功能的化合物，进而作为男性避孕药的新型分子靶位点。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于制备CatSper钙通道新亚基TMEM262多克隆抗体的免疫原及其应用。
背景技术
据文献报道，在一对夫妇中排除女方不孕因素，男方不育比例占据20％以上。在这些不育男性中，约有15％的男性具有正常的精液参数，即实验室常规参数检查都正常，但8％的比例即使有正常的精子参数但男性依然不育，除了精子DNA，精子染色质、精子相关结构蛋白异常之外，离子通道异常导致受精失败也是原因之一，目前精子表面的离子通道也越来越证明其对于男性生育力的至关重要性。
精子特异性离子通道包括CatSper、KSper通道等，它们会受到pH或药物如孕酮等刺激物刺激开放，其中CatSper已经被大量实验证明，其通道开放后，会诱导Ca2+进入精子鞭毛细胞膜促进细胞内Ca2+的增加使人精子发生超活化、获能，促进精子穿过透明带与卵细胞的受精过程。本实验室已经研究发现CatSper突变患者完全不育，且只能通过辅助生殖技术-ICSI挽救；该通道亚基敲除小鼠完全不育，精子不能够和卵细胞相结合，与小鼠性成熟发育时间密切相关。CatSper是膜蛋白构成的重要离子通道，由4个主亚基构成的孔道蛋白，另有包括TMEM262在内的辅助性亚基。CatSper主亚基敲除小鼠完全不育，但辅助性亚基CatSperδ亚基敲除小鼠完全不育而EFCAB9亚基敲除小鼠可育。TMEM249亚基也是近年新发现的CatSper通道辅助性亚基之一，但是本实验室研究发现商业化TMEM249抗体并不能显示人精子和小鼠精子特异性荧光信号，故精子CatSper的TMEM249亚基具有与其他部位TMEM249蛋白不同的位置与功能特性。并且CatSper通道复合物各个亚基之间的互相作用与每个亚基承载的功能远不止目前现有的实验数据报道。综上所述足可见，CatSper离子通道复合物特有钙信号的传导在精子发育、成熟、运动等完成受精的过程中发挥着可以称为极为关键、必不可少、独一无二的功能。
目前CatSper已经发展为大多学者公认的、能够作为男性非激素避孕药物的重要靶点之一。但针对CatSper通道的物理特性与开放机制未知、是如何感知多种分子和药物的刺激进行调控也是未知，因此需要依赖研究工具。现临床试验的男性避孕药大多是激素类药物，可能会导致抑郁、胆固醇水平增加等副作用。而作为2021年新发现的TMEM262亚基，针对该亚基的研究尚不明确，研究该亚基的功能、特点与作用方式就显得尤为重要。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供一种用于制备CatSper钙通道新亚基TMEM262多克隆抗体的免疫原及其应用，该免疫原制备的多克隆抗体具有效价高、特异性好的优点，可以用于研究精子CatSper通道的定位以及探索CatSper通道在生理调节中的机制。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种用于制备CatSper钙通道新亚基TMEM262多克隆抗体的免疫原，所述免疫原为多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
利用上述免疫原制备的TMEM262多克隆抗体。
上述的TMEM262多克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：
(1)免疫原制备：制备氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的多肽，多肽制备成功后，将靶多肽偶联载体蛋白作为免疫原；
(2)动物免疫：采用快速免疫方式，将合成的靶多肽与载体蛋白混合后免疫动物，所述免疫动物为新西兰兔，并采用间接ELISA方法进行抗体效价检测与质量控制；
(3)多克隆抗体生产：常规方法进行终免后将免疫动物的抗血清收集，采用抗原亲和纯化方法进行抗体纯化、混合纯化，即得。
上述的TMEM262多克隆抗体在制备研究精子离子通道定位与功能机制的工具药中的应用。
上述的TMEM262多克隆抗体在制备男性避孕药物中的应用。
一种用于男性避孕的药物组合物，包括上述的TMEM262多克隆抗体，以及药学上可接受的载体。
优选地，所述药物组合物为口服剂型或非口服剂型。
优选地，所述药物组合物为片剂、胶囊剂、散剂、丸剂、颗粒剂、溶液剂、混悬剂、糖浆剂、注射剂、栓剂、吸入剂或喷雾剂。
本发明的有益效果如下：
本发明以如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列为一级结构设计出的抗原多肽具有高效价、特异性强的优点，该多克隆抗体能够特异性识别TMEM262位点，TMEM262是新发现的一个构成精子CatSper通道结构中的新亚基之一，且具有与其他因子结合发挥作用的功能，也很有可能参与介导CatSper电流。因此，本发明的TMEM262多克隆抗体可以用于研究精子CatSper通道的定位以及探索CatSper通道在生理调节中的机制，作为调控精子功能的化合物，进而作为男性避孕药的新型分子靶位点。
附图说明
图1为实施例1中TMEM262多克隆抗体免疫原抗原表位指数的选择；
图2为实施例1中TMEM262多克隆抗体的质谱分析；
图3为实施例1中TMEM262多克隆抗体的色谱图及峰值表分析；
图4为实施例2中TMEM262多克隆抗体与小鼠精子及人精子结合定位的特异性：A为小鼠精子；B为人精子；C为使用抗原肽阻断TMEM262抗体后人精子荧光信号以及特异人精子TMEM262荧光信号图。
具体实施方式
下面结合附图与具体实施例对本发明做进一步详细说明。
若无特殊说明，以下实施例中所用的技术手段，均为本领域技术人员所熟知的常规手段，未注明具体条件的实验方法，均为本领域常规方法。
以下实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下实施例中涉及的定量实验，均设置至少三次重复实验，结果取平均值。
以下实施例中使用的动物如下：小鼠为C57/B6N，3-6月龄健康雄鼠，来自南通大学实验动物中心平台；新西兰兔为普通实验兔，购自邳州东方养殖有限公司。
以下实施例中使用的人精子样本来自南通大学附属医院生殖中心。
实施例1TMEM262多克隆抗体的设计与制备
1、多肽序列的制备
(1)多肽序列的分析与设计
利用OptimumAntigenTM软件对TMEM262的氨基酸进行抗原表位分析，从抗原性、亲水性、疏水性、表面可能性、跨膜、同源性、柔性区域、螺旋区域、片区域、信号肽和修饰等多个方面进行综合分析后，如图1所示，选择抗原指数最高的序列峰作为抗原表位，即14个氨基酸作为合成多肽的序列，并在C末端添加了“C”以促进共轭，故对应序列如SEQ ID NO.1所示，具体为：CSLEFLAIEYREEHH。
(2)多肽序列的合成
采用PepPowerTM多肽合成技术，全自动多通道化合成目的多肽，采用质谱仪进行鉴定分析(图2)。并对TMEM262多克隆抗体在超纯水、3％氨水、NMP、HCOOH中进行溶解度测试，测试结果如下表1所示。
表1溶解度测试结果
由表1可知，TMEM262多克隆抗体在HCOOH和3％氨水中可以溶解。TMEM262多克隆抗体色谱成像及峰值表分析如图3所示。
2、免疫原制备与动物免疫
常规采用体重范围在2～3kg，4～6月龄的新西兰兔作为免疫动物，采用快速免疫方法，将合成的靶多肽与载体蛋白混合后作为免疫原在新西兰兔背部进行多点皮下注射，间隔2～4周加强免疫，约共免疫4～5次；注射后7～14天抽取兔耳静脉血，分离血清后采用间接ELISA方法进行抗体效价检测与质控；效价＞10000后可从心脏采血，用抗原亲和纯化方法进行抗体纯化和检测，标准法收集血清并完成抗体制备。
实施例2TMEM262多克隆抗体与小鼠精子及人精子结合定位的特异性
1、实验动物与人精子样本处理
(1)小鼠精子取材
取3～6月龄雄鼠脱颈处死后，75％酒精消毒皮肤表面暴露腹腔，提拉出睾丸和附睾组织，分离脂肪、系膜、血管等连带组织后，将单侧附睾尾小鼠精子放置于37℃预热的HS中，在加热台上划开附睾尾，待精子充分游出后，1000rpm离心5min沉淀精子，2～3次重悬至100μL清洗精子。所述HS为细胞外高盐溶液，以维持精子在离体即体外环境中活性孵育，下同。
(2)人精子样本制备
从医院带回且完全液化的样本中吸取1mL，加入500μL HS洗去精浆，以1800rpm离心6min，弃上清，沉淀以HS溶液重悬为1mL，重复清洗3次，最后沉淀用1mL的HS重悬为干净精子样本，置于37℃恒温箱中倾斜45°放置使精子充分上游1h，取上游干净的精子重悬至100μL。
2、免疫荧光定位实验
(1)小鼠精子及人精子的固定与通透
取15μL精子悬液滴到一张粘附性载玻片上，用200μL的枪头侧面将细胞涂成薄薄的一层，晾干后用4％多聚甲醛固定液(PFA)固定细胞15min，固定结束后使用1×PBS洗2～3次，每次约3～5min；再使用预冷的甲醇固定细胞15～20min，按上述步骤清洗；接下来使用0.5％ Triton X-100通透细胞10～20min，通透结束再次用1×PBS浸洗。
(2)TMEM262多克隆抗体与精子结合
吸水纸吸干PBS，用山羊血清配制封闭液，室温封闭精子1h。一号实验组在一张片子添加30μL用封闭液配制的TMEM262多克隆抗体(浓度为1:200)；二号实验组是在用封闭液配制的TMEM262多克隆抗体(浓度为1:200)中加入物质的量超过抗体10倍的抗原肽进行抗体阻断后取30μL用于孵育；对照组在另一张片子添加30μL用封闭液配制的IgG抗体(浓度为1:400)，置于4℃过夜。
孵育结束后用0.1％ Triton X-100沿着避开组织的部位轻轻冲洗掉一抗后清洗3次，每次5～10min，使未结合的一抗充分洗掉；每张片子添加30μL用封闭液适当比例配置的二抗，室温孵育1h；按上述步骤洗3次，每次均大于10min；每张片子添加10μL含DAPI抗淬灭剂，避光孵育5min，定位精子头部；同步清洗洗3次，每次5min，洗去多余的DAPI；小心地盖上盖玻片，尽可能避免气泡，盖玻片四周用指甲油封片后用荧光显微镜进行拍摄观察。
3、实验结果
将野生型小鼠精子和人精子与TMEM262抗体进行孵育结合，并用二抗孵育进行染色发光，结果如图4中A所示，TMEM262抗体能够准确且特异的定位在小鼠精子鞭毛的主段，精子CatSper通道的定位即在小鼠精子的主段，而IgG阴性对照组也未见非特异性信号。同时，如图4中B所示，TMEM262抗体也能够在人精子中定位到CatSper亚基区域且越靠近末端荧光信号越强，精子尾部末端无信号，但与现有文献报道CatSper主要亚基的定位有所不同，即在CatSper通道定位以外也有荧光信号表达，包括颈部和中段，但部分精子也呈现出明显的特异性荧光信号，这很可能是由于人精子与小鼠精子存在物种差异，即使序列在人和小鼠精子保守。另外，如图4中C上图所示，使用抗原肽阻断TMEM262抗体之后，人精子荧光信号消失可辅助证明上述结果；如图4中C下图所示，在人精子中也有部分精子是特异荧光信号，颈部和尾部无荧光信号。
以上实验结果表明，TMEM262抗体能够特异性识别CatSper离子通道，这可以作为一种生物学工具对CatSper通道潜在的调节性功能亚基提供一种证据，可用于小鼠精子和人精子的免疫荧光分析。该抗体在作为寻找精子离子通道信号定位的同时，还可以通过共定位方法探讨分子间相互作用作为佐证，或者对荧光信号强度进行统计，通过表达信号的强弱以助于寻找与TMEM262的互作分子；STOM超分辨显微镜观察TMEM262在CatSper通道上具体亚基空间位置分布，如内侧或外侧、与其他亚基的空间位置关系，是否处于关键和更核心的位置等等探讨其与CatSper四个主亚基之间的联系。现临床试验的男性避孕药大多是激素类药物，可能会导致抑郁、胆固醇水平增加等副作用。然而通过CatSper离子通道在精子细胞膜上特异钙信号的传导特点，可以针对TMEM262等特异性靶点抑制钙信号流入，从而实现减少精子数量、精子无法活化或不能与卵子结合的目的，同时又不损伤破坏其他亚基，以此作为可逆且无副作用的男性避孕药。
以上实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明的保护范围。
Claims (8)
1.一种用于制备CatSper钙通道新亚基TMEM262多克隆抗体的免疫原，其特征在于，所述免疫原为多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.利用权利要求1所述免疫原制备的TMEM262多克隆抗体。
3.权利要求2所述的TMEM262多克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)免疫原制备：制备氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的多肽，多肽制备成功后，将靶多肽偶联载体蛋白作为免疫原；
(2)动物免疫：采用快速免疫方式，将合成的靶多肽与载体蛋白混合后免疫动物，所述免疫动物为新西兰兔，并采用间接ELISA方法进行抗体效价检测与质量控制；
(3)多克隆抗体生产：常规方法进行终免后将免疫动物的抗血清收集，采用抗原亲和纯化方法进行抗体纯化、混合纯化，即得。
4.如权利要求2所述的TMEM262多克隆抗体在制备研究精子离子通道定位与功能机制的工具药中的应用。
5.如权利要求2所述的TMEM262多克隆抗体在制备男性避孕药物中的应用。
6.一种用于男性避孕的药物组合物，其特征在于，包括如权利要求2所述的TMEM262多克隆抗体，以及药学上可接受的载体。
7.根据权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物为口服剂型或非口服剂型。
8.根据权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物为片剂、胶囊剂、散剂、丸剂、颗粒剂、溶液剂、混悬剂、糖浆剂、注射剂、栓剂、吸入剂或喷雾剂。
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