CN110339251A - 一种栀子豉发酵菌质的制备方法 - Google Patents

一种栀子豉发酵菌质的制备方法 Download PDF

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Abstract

一种栀子豉发酵菌质的制备方法，它涉及一种中药双向固体发酵产品的制备方法。本发明提供一种栀子豉发酵菌质的制备方法，该方法不同于传统工艺，解决了传统工艺煎煮过程中β‑葡萄糖苷酶被大量破坏，酶活大幅降低的问题。制备方法：一、将栀子、青蒿、桑叶加水煎煮，然后用煎煮液浸泡大豆，大豆吸收煎煮液膨胀后高温灭菌，得到发酵基质；二、将步骤一制备的发酵基质接种含β‑葡萄糖苷酶和蛋白酶的微生物，混匀发酵，既得到栀子豉发酵菌质。传统栀子豉汤为汤剂，而本发明方法制备的栀子豉发酵菌质为固体，不仅制备工艺区别大，而且改变了药物的剂型，减少了服用剂量，携带出行也更为方便。

Description

一种栀子豉发酵菌质的制备方法
技术领域
本发明涉及一种中药双向固体发酵产品的制备方法。
背景技术
栀子豉汤为张仲景《伤寒论》中的经典名方，由栀子和淡豆豉两味药组成，为清宣胸中郁热，治疗虚烦懊恼不得眠之良方。据报道，栀子豉汤能够提高抑郁模型大鼠血液中多巴胺和五羟色胺含量，表现出明显的抗抑郁作用。原方记载栀子豉汤的煎煮方法为“栀子、淡豆豉二味，以水四升，先煮栀子，得二升半，后下入豉，煮取一升半，去滓……”，有学者对此种煎煮方法进行研究，结果表明，先煎栀子使栀子苷溶出，再被后下豆豉中的β-葡萄糖苷酶水解成京尼平，京尼平再与淡豆豉中的氨基酸反应生成京尼平-氨基酸复合物从而发挥抗抑郁作用。
由于β-葡萄糖苷酶受热易分解，一般保存在2～8℃，使用温度则控制在40～55℃。现有文献报道β-葡萄糖苷酶最高最适温度为75℃，但仍远低于100℃的煎煮温度。因此，栀子豉汤传统工艺煎煮过程中β-葡萄糖苷酶被大量破坏，酶活大幅降低，导致京尼平-氨基酸复合物产量较少，抗抑郁效果较差。
发明内容
本发明提供一种栀子豉发酵菌质的制备方法，该方法不同于传统工艺，解决了传统工艺煎煮过程中β-葡萄糖苷酶被大量破坏，酶活大幅降低的问题。
栀子豉发酵菌质的制备方法：
一、将栀子、青蒿、桑叶加水煎煮，然后用煎煮液浸泡大豆，大豆吸收煎煮液膨胀后高温灭菌，得到发酵基质；
二、将步骤一制备的发酵基质接种含β-葡萄糖苷酶和蛋白酶的微生物，混匀发酵，既得到栀子豉发酵菌质；
其中，大豆、栀子、青蒿和桑叶的干重比为100：(20～40)：(5～10)：(5～10)。
以及，上述方法制备的栀子豉发酵菌质。
本发明采用双向固体发酵技术将栀子豉汤制成栀子豉发酵菌质，实现了工艺和品质的大幅提升。相对于传统栀子豉汤煎煮过程中京尼平与氨基酸的静态结合，本发明一方面通过发酵在微生物β-葡萄糖苷酶和蛋白酶的作用下在体外实现栀子苷和大豆蛋白的转化及降解，另一方面随着发酵时间的延长，栀子苷和大豆蛋白逐渐降解为京尼平和氨基酸，且二者可随时结合成京尼平-氨基酸复合物，直至发酵终点，实现生物转化、化学反应产物量的动态不断积累增加的过程，极大的增强其抗抑郁功效，且发酵法条件温和，成本低，适用于规模化生产。
传统栀子豉汤为汤剂，而本发明方法制备的栀子豉发酵菌质为固体，不仅制备工艺区别大，而且改变了药物的剂型，减少了服用剂量，携带出行也更为方便。
微生物来源β-葡萄糖苷酶的酶活高于植物来源的β-葡萄糖苷酶，本发明采用微生物进行发酵，能够进一步提高京尼平-氨基酸生成量，提高抗抑郁效果。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。
具体实施方式一：本实施方式栀子豉发酵菌质的制备方法，其特征在于制备方法按以下步骤进行：
一、将栀子、青蒿、桑叶加水煎煮，然后用煎煮液浸泡大豆，大豆吸收煎煮液膨胀后高温灭菌，得到发酵基质；
二、将步骤一制备的发酵基质接种含β-葡萄糖苷酶和蛋白酶的微生物，混匀发酵，既得到栀子豉发酵菌质；
其中，大豆、栀子、青蒿和桑叶的干重比为100：(20～40)：(5～10)：(5～10)。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一的不同点是：制备方法，其特征在于步骤二中所述微生物为枯草芽孢杆菌和/或伞枝梨头霉。其它与实施方式一相同。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二的不同点是：步骤二中枯草芽孢杆菌(105～106CFU/ml)和/或伞枝梨头霉(105～106个孢子/ml)的接种量为20～40ml/kg。其它与实施方式一或二相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一的不同点是：步骤一中所述大豆洗净后用清水浸泡10～18小时再沥干使用。其它与实施方式一至三之一相同。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一的不同点是：步骤一中高温灭菌为121℃灭菌30～40分钟。其它与实施方式一至四之一相同。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一至五之一的不同点是：步骤一中按栀子、青蒿和桑叶总干重的8～10倍加水进行煎煮2次，每次1h，合并煎煮液浓缩至大豆干重的0.9-1.2倍。其它与实施方式一至五之一相同。
具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一至六之一的不同点是：步骤一中大豆将煎煮液90％～99.9％吸收后高温灭菌。其它与实施方式一至六之一相同。
具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式一至七之一的不同点是：步骤二中所述发酵为25～40℃温度条件下发酵1～7天。其它与实施方式一至七之一相同。
实施例1栀子豉发酵菌质的制备
步骤一、配制发酵基质：
准备大豆100g、栀子30g、青蒿10g、桑叶10g，将栀子、青蒿、桑叶加500ml水煎煮2次，每次1h，合并煎煮液浓缩至120ml后用于浸泡洗净的大豆，待浓缩滤液被大豆吸尽，于121℃灭菌30分钟，得到发酵基质；其中大豆用清水浸泡14小时再沥干使用；
步骤二、纯菌种发酵：
将步骤一制备的发酵基质接种枯草芽孢杆菌(CICC 24713)菌液(2ml，浓度为106CFU/ml)，混匀，于37℃培养2天，得到栀子豉发酵菌质。
实施例2栀子豉发酵菌质的制备
步骤一、配制发酵基质：
准备大豆100g、栀子24g、青蒿8g、桑叶8g，将栀子、青蒿、桑叶加360ml水煎煮2次，每次1h，合并煎煮液浓缩至110ml后用于浸泡洗净的大豆，待浓缩滤液被大豆吸尽，于121℃灭菌40分钟，得到发酵基质；其中大豆用清水浸泡18小时再沥干使用；
步骤二、纯菌种发酵：
将步骤一制备的发酵基质接种伞枝梨头霉(CICC 3151)菌液(3ml，浓度为105个孢子/ml)，混匀，于28℃培养7天，得到栀子豉发酵菌质。
实施例3栀子豉发酵菌质的制备
步骤一、配制发酵基质：
准备大豆100g、栀子30g、青蒿10g、桑叶10g，将栀子、青蒿、桑叶加400ml水煎煮2次，每次1h，合并煎煮液浓缩100ml后用于浸泡洗净的大豆，待浓缩滤液被大豆吸尽，于121℃灭菌40分钟，得到发酵基质；其中大豆用清水浸泡18小时再沥干使用；
步骤二、纯菌种发酵：
将步骤一制备的发酵基质接种枯草芽孢杆菌(CICC 24713，2ml，浓度为106CFU/ml)和伞枝梨头霉(CICC 3151，2ml，浓度为106个孢子/ml)混合菌种菌液4ml，混匀，于30℃培养5天，得到栀子豉发酵菌质。
实施例4栀子豉汤
淡豆豉100g，栀子30g，按照栀子豉汤在《伤寒论》中煎煮方法：先将栀子加水煎煮1h，再加淡豆豉煎煮1h，过滤，滤液浓缩至100ml。
实验：
采用孤养和慢性不可预见性温和应激(CUMS)方法建立大鼠抑郁症模型。SD大鼠60只，雄性，体重200±20g，适应性饲养1周，随机分成6组，分别为空白对照组、模型组、栀子豉汤给药组(实施例4)、栀子豉发酵菌质1-3组(实施例1～3)，每组10只。第2周开始造模，除空白对照组在实验中不接受任何刺激外，其余各组每笼一只孤养，接受各种不同的慢性应激，包括禁食、禁水、通宵照明、冷水游泳、夹尾、潮湿垫料、行为限制共7种刺激方法。每天安排一种，同种刺激不连续出现，使大鼠不能预料发生的刺激，进行2周刺激后，开始给药，连续灌胃给药4周，除空白组外，其余各组继续接受不同刺激，按照栀子豉汤成人临床用药剂量(栀子15g、淡豆豉50g)65g/70kg折合成大鼠的给药量，以含相同生药量的栀子豉汤(实施例4)、栀子豉发酵菌质(实施例1～3)匀浆液进行分组灌胃。通过糖水消耗、强迫游泳实验评价大鼠抑郁行为。
糖水消耗实验方法：本实验用以评估大鼠欣快感的缺乏，实验以糖水摄取量占总液体摄取量的百分比为指标。测试前需进行糖水偏爱实验训练，具体测试过程如下：大鼠禁食禁水24h，然后将1％蔗糖水和自来水各一瓶(100ml)让大鼠自由饮用12h，12h后取走两瓶水，测量大鼠摄入蔗糖水和自来水的量，计算出摄入蔗糖水的百分比＝蔗糖水量/(蔗糖水量+自来水量)×100％。
强迫游泳实验方法：本实验为行为绝望实验法，目的为评价大鼠是否产生绝望行为，以大鼠在水中漂浮静止不动的时间为观察指标，糖水消耗量及强迫游泳的静止时间结果如表1。
表1
从表1可见，通过抗抑郁作用实验结果表明，实施例1、实施例2、实施例3实验组大鼠糖水消耗量均接近正常水平(空白组)，且优于栀子豉汤组；实施例1、实施例2、实施例3实验组大鼠强迫游泳静止时间与模型组相比均显著下降，且优于栀子豉汤组，表明本发明方法在同样中药饮片用量条件下具有更好的抗抑郁作用。

Claims (9)

1.栀子豉发酵菌质的制备方法，其特征在于制备方法按以下步骤进行：
一、将栀子、青蒿、桑叶加水煎煮，然后用煎煮液浸泡大豆，大豆吸收煎煮液膨胀后高温灭菌，得到发酵基质；
二、将步骤一制备的发酵基质接种含β-葡萄糖苷酶和蛋白酶的微生物，混匀发酵，既得到栀子豉发酵菌质；
其中，大豆、栀子、青蒿和桑叶的干重比为100：(20～40)：(5～10)：(5～10)。
2.根据权利要求1所述的栀子豉发酵菌质的制备方法，其特征在于步骤二中所述微生物为枯草芽孢杆菌和/或伞枝梨头霉。
3.根据权利要求2所述的栀子豉发酵菌质的制备方法，其特征在于步骤二中枯草芽孢杆菌(105～106CFU/ml)和/或伞枝梨头霉(105～106个孢子/ml)的接种量为20～40ml/kg。
4.根据权利要求1所述的栀子豉发酵菌质的制备方法，其特征在于步骤一中所述大豆洗净后用清水浸泡10～18小时再沥干使用。
5.根据权利要求1所述的栀子豉发酵菌质的制备方法，其特征在于步骤一中高温灭菌为121℃灭菌30～40分钟。
6.根据权利要求1所述的栀子豉发酵菌质的制备方法，其特征在于步骤一中按栀子、青蒿和桑叶总干重的8～10倍加水进行煎煮2次，每次1h，合并煎煮液浓缩至大豆干重的0.9-1.2倍。
7.根据权利要求6所述的栀子豉发酵菌质的制备方法，其特征在于步骤一中大豆将煎煮液90％～99.9％吸收后高温灭菌。
8.根据权利要求3所述的栀子豉发酵菌质的制备方法，其特征在于步骤二中所述发酵为25～40℃温度条件下发酵1～7天。
9.根据权利要求1至8之一所述方法制备的栀子豉发酵菌质。
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