具体实施方式
为了对本发明的技术特征、目的和有益效果有更加清楚的理解,现对本发明的技术方案进行以下详细说明,但不能理解为对本发明的可实施范围的限定。下述实施例中所述实验方法,如无特殊说明,均为常规方法;所述试剂和材料,如无特殊说明,均可从商业途径获得。
在下述的实施例中,所用溶剂和药品均为分析纯或化学纯;溶剂在使用前均经过重新蒸馏;无水溶剂均按照标准方法或文献方法进行处理。柱层析硅胶(100-200目)和薄层层析硅胶(GF254)为青岛海洋化工厂和烟台化工厂产品;如未特别说明,均采用石油醚(60-90℃)/乙酸乙酯(v/v)作为洗脱剂;显色剂用碘或磷钼酸的乙醇溶液;所有萃取溶剂未经说明均用无水Na2SO4干燥。1HNMR用varian-400型核磁共振仪记录,TMS为内标。LC-MS用美国Agilent公司1100型高效液相色谱-离子阱质谱联用仪(LC-MSDTrap)记录,二极管阵列检测器(DAD),检测波长214nm和254nm,离子阱质谱(ESI源)。HPLC柱为AgelaDurashellC18(4.6×50mm,3.5μm);流动相为0.1%NH4HCO3水溶液:乙腈(5分钟内从5:95到95:5);流速为1.8mL/min。
实施例1
杂环化合物C1和C2,其是由如下方法合成的:
1)中间体C1-2的合成:
Boc-D-脯氨酸(5g,23mmol),丙二酸亚异丙酯(3.4g,23mmol)和DMAP(5.7g,46mmol)溶于70mL二氯甲烷,冰浴搅拌下,加入DCC(4.8g,23mmol),常温搅拌48h。过滤,滤液加入200mL二氯甲烷和100mL 1N盐酸溶液分层,水相用二氯甲烷萃取。二氯甲烷相合并,干燥旋干,得黄色油状物(9g,粗品)。
2)中间体C1-3的合成:
中间体C1-2(9g,粗品)溶于100mL无水乙醇,回流搅拌2h。乙醇旋干,得到液体,经柱层析纯化(石油醚:乙酸乙酯=4:1),得黄色油状物(4.4g,67%)。
3)中间体C1-4的合成:
中间体C1-3(1g,3.5mmol),S-甲基异硫脲硫酸盐(2g,7mmol),溶于50mL水,加入碳酸钾(2.2g,16mmol),常温搅拌过夜。加入醋酸调PH至酸性,加入二氯甲烷(100mL)萃取三次。有机相干燥旋干,得到液体,经柱层析纯化(二氯甲烷:甲醇=20:1),得无色油状物(1.0g,91%)。
4)中间体C1-5的合成:
中间体C1-4(1.2g,3.8mmol),三乙胺(3.9g,38mmol),N-甲基哌嗪(580mg,5.7mmol)溶于20mL乙腈,加入PyBOP(2.2g,4.2mmol),回流搅拌过夜。加入200mL二氯甲烷和200mL碳酸氢钠水溶液分层,水相用二氯甲烷萃取。二氯甲烷相合并,干燥旋干,得到液体,经柱层析纯化(二氯甲烷:甲醇=100:1),得黄色油状物(1.2g,86%)。5)中间体C1-6的合成:
中间体C1-5(1.2g,3mmol)溶于3mL乙酸乙酯,加入3M氯化氢乙酸乙酯溶液(5mL),常温搅拌过夜。乙酸乙酯旋干,加入100mL二氯甲烷和100mL碳酸氢钠水溶液分层,萃取,水相用二氯甲烷萃取。二氯甲烷相合并,干燥旋干,得淡黄色油状物(570mg,65%)。
6)产物C1和C2的合成:
中间体C1-7(100mg,0.6mmol),中间体C1-6(210mg,0.7mmol)和三乙胺(610mg,6mmol)溶于乙醇(5mL),回流搅拌过夜。加入100mL二氯甲烷和100mL碳酸氢钠水溶液分层,萃取,水相用二氯甲烷萃取。二氯甲烷相合并,干燥旋干,经柱层析纯化(二氯甲烷:甲醇:氨水=100:1:1至50:1:1),得产物C1(34mg,13%)和产物C2(50mg,20%),均为棕色油状液体。
实施例2
根据实施例1的合成方法,在步骤1中用Boc-L-脯氨酸代替Boc-D-脯氨酸,合成得到杂环化合物C3和C4。
实施例3
杂环化合物C5,其是由如下方法合成的:
1)中间体C5-1的合成:
中间体C1-3(1g,3.5mmol)和乙脒盐酸盐(990mg,10.5mmol)溶于200mL乙醇,加入乙醇钠(480mg,7mmol),回流搅拌过夜。加入醋酸调PH至酸性,二氯甲烷(100mL)萃取三次。有机相干燥旋干,得到液体,经柱层析纯化(二氯甲烷:甲醇=20:1),得无色油状液体(930mg,95%)
2)中间体C5-2的合成:
中间体C5-2(920mg,3.3mmol),三乙胺(3.3g,33mmol),N-甲基哌嗪(500mg,5mmol)溶于20mL乙腈,加入PyBOP(1.9g,3.4mmol),回流搅拌过夜,加入200mL二氯甲烷和200mL碳酸氢钠水溶液分层,水相用二氯甲烷萃取。二氯甲烷相合并,干燥旋干,得到液体,经柱层析纯化(二氯甲烷:甲醇=100:1),得黄色油状液体(1g,84%)。3)中间体C5-3的合成:
中间体C5-2(1g,2.7mmol)溶于5mL乙酸乙酯,加入3M氯化氢乙酸乙酯溶液(5mL),常温搅拌过夜。乙酸乙酯旋干,加入100mL二氯甲烷和50mL碳酸氢钠水溶液分层,水相用二氯甲烷萃取。二氯甲烷相合并,干燥旋干,得无色油状液体(660mg,94%)。4)产物C5的合成:
中间体C5-3(200mg,0.8mmol),中间体C5-4(135mg,0.9mmol)和氰基硼氢化钠(97mg,1.5mmol)溶于甲醇(5mL),常温搅拌过夜,加入100mL二氯甲烷和100mL碳酸氢钠水溶液分层,水相用二氯甲烷萃取。二氯甲烷相合并,干燥旋干,得到液体,经柱层析纯化(二氯甲烷:甲醇:氨水=100:1:1至50:1:1),得产物(140mg,45%),为一淡黄色固体。
实施例4
根据实施例1的合成方法,在步骤1用(R)-1-N-Boc-哌啶-2-甲酸代替Boc-D-脯氨酸,在步骤3中用乙脒盐酸盐代替S-甲基异硫脲硫酸盐,合成得到杂环化合物C6和C7。
实施例5
根据实施例1的合成方法,在步骤1中用(S)-1-N-Boc-哌啶-2-甲酸代替Boc-D-脯氨酸,在步骤3中用乙脒盐酸盐代替S-甲基异硫脲硫酸盐,合成得到杂环化合物C8和C9。
实施例6
杂环化合物C10,其是由如下方法合成的:
1)中间体C10-2的合成:
C10-1(3g,17mmol),S-甲基异硫脲硫酸盐(9.5g,34mmol)溶于100mL水,加入碳酸钾(17.6g,76.5mmol),常温搅拌过夜,加入醋酸调PH至酸性,加入二氯甲烷(100mL)萃取三次。有机相干燥旋干,残余物经柱层析纯化(二氯甲烷:甲醇=100:1),得白色固体(3.4g,92%)。
2)中间体C10-3的合成:
C10-2(3.4g,16mmol),三乙胺(16g,160mmol),N-甲基哌嗪(2.4g,40mmol)溶于100mL乙腈,加入PyBOP(9g,17.6mmol),回流搅拌过夜,加入200mL二氯甲烷和200mL碳酸氢钠水溶液萃取,二氯甲烷相干燥旋干。残余物经柱层析纯化(二氯甲烷:甲醇=100:3),得黄色油状液体(2.8g,59%)。
3)中间体C10-4的合成:
C10-3(149mg,0.5mmol),溶于5mL 20%硫酸水溶液,回流搅拌过夜,加入碳酸氢钠水溶液调PH至碱性,加入二氯甲烷萃取,二氯甲烷相干燥旋干,得无色油状液体(90mg,73%)。
4)产物C10的合成:
将中间体C10-5(50mg,0.31mmol)与C10-4(80mg,0.31mmol)溶于1,2-二氯乙烷(3mL)中。再加入催化量的冰醋酸(0.2ml)后,在室温下搅拌5h。再将三乙酰氧基硼氢化钠(131mg,0.62mmol)加入反应体系,搅拌过夜。加入二氯甲烷(10ml)稀释后,饱和碳酸氢钠水溶液洗涤(20mL),有机相干燥旋干,经硅胶柱层析(DCM:MeOH:NH3H2O=100:1:1)纯化后得无色油状液体(2mg,1.6%)
实施例7
根据实施例6的合成方法,在步骤4中用C12-3代替C10-5,合成得到杂环化合物C11。
实施例8
杂环化合物C12,其是由如下方法合成的:
1)中间体C12-2的合成:
将4-氯乙酰乙酸乙酯(16.5g,100mmol)和盐酸乙脒(10g,106mmol)依次溶于乙醇(100mL)中。冰水浴下缓慢加入DBU(30.4g,200mmol),常温下搅拌过夜。抽干溶剂,加入二氯甲烷(120mL)稀释,饱和食盐水洗(30mL*3)后有机相干燥,抽干溶剂。残留物溶于POCl3(20mL),于110℃下回流搅拌30min。待冷至室温后,抽去大部分的POCl3,残留物用饱和碳酸氢钠调节至中性,乙酸乙酯(30mL*3)萃取,合并有机相并干燥。旋干溶剂后,残留物通过硅胶柱层析纯化(PE:EA=5:1)得淡黄色固体(4.0g,23%)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.41(s,1H),4.55(s,2H),2.71(s,3H).
2)中间体C12-4的合成:
将C12-3(152mg,1.03mmol)与C12-2(200mg,1.13mmol)溶于乙腈(5mL)中。依次加入碘化钾(17mg,0.103mmol)、DIPEA(332mg,2.6mmol)后于常温下搅拌过夜。旋干溶剂,经硅胶柱层析(DCM:MeOH=100:1)纯化后得无色油状液体(100mg,34%)。3)产物C12的合成:
将C12-4(100mg,0.35mmol)与N-甲基哌嗪(350mg,3.5mmol)溶于乙醇中(5ml)。加入三乙胺(354mg,3.5mmol)后于85℃下回流反应3h。冷却至室温后加入二氯甲烷(15ml)稀释后,再水洗(20ml)。有机相干燥旋干,经硅胶柱层析(DCM:MeOH=100:1-50:1)得无色油状液体(90mg,73%)。
实施例9
根据实施例3的合成方法,用(R)-1-N-Boc-吖丁啶-2-甲酸代替Boc-D-脯氨酸,合成得到杂环化合物C13和C14。
实施例10
杂环化合物C15,其是由如下方法合成的:
1)中间体C15-2的合成:
N-Boc-顺式-4-羟基-D-脯氨酸(1.2g,5.2mmol),咪唑(880mg,13mmol),DMAP(64mg,0.5mmol)溶于50mL二氯甲烷,冰浴搅拌下,加入TBSCl(950mg,6.2mmol),常温搅拌过夜,加入100mL柠檬酸水溶液,分层,水相用二氯甲烷萃取3次。二氯甲烷相合并,干燥旋干,得淡黄色油状液体(1.6g,88%)。
2)中间体C15-3的合成:
C15-2(1.6g,4.6mmol),丙二酸亚异丙酯(670mg,4.6mmol)和DMAP(1.1g,9.2mmol)溶于20mL二氯甲烷,冰浴搅拌下,加入DCC(955mg,4.6mmol),常温搅拌48h。过滤,滤液加入200mL二氯甲烷和100mL 1N盐酸分层,水相用二氯甲烷萃取3次。二氯甲烷相合并,干燥旋干,得黄色油状液体(2.4g,粗品)。
3)中间体C15-4的合成:
中间体C15-3(2.4g,粗品)溶于15mL无水乙醇,回流搅拌2h,乙醇旋干,得到液体,经柱层析纯化(石油醚:乙酸乙酯=5:1),得无色油状液体(1g,52%)。
4)中间体C15-5的合成:
中间体C15-4(980mg,2.3mmol),乙脒盐酸盐(670mg,7.1mmol),溶于30mL乙醇,加入乙醇钠(320mg,4.6mmol),回流搅拌过夜。加入醋酸调PH至酸性,加入二氯甲烷(100mL)萃取三次。有机相合并,干燥旋干,得到液体,经柱层析纯化(二氯甲烷:甲醇=20:1),得淡黄色油状液体(580mg,62%)。
5)中间体C15-6的合成:
中间体C15-5(580mg,1.4mmol),三乙胺(1.4g,14mmol),N-甲基哌嗪(213mg,2.1mmol)溶于20mL乙腈,加入PyBOP(812mg,1.5mmol),回流搅拌过夜,加入200mL二氯甲烷200mL碳酸氢钠水溶液萃取,二氯甲烷相干燥旋干,得到液体,经柱层析纯化(二氯甲烷:甲醇=100:1),得黄色油状液体(500mg,73%)。
6)中间体C15-7a和C15-7b的合成:
中间体C15-6(500mg,1mmol)溶于5mL乙酸乙酯,加入3M氯化氢乙酸乙酯溶液(5mL),常温搅拌过夜。乙酸乙酯旋干,加入100mL二氯甲烷和50mL碳酸氢钠水溶液分层,水相用二氯甲烷萃取。有机相合并,干燥旋干,得到液体,经柱层析纯化(二氯甲烷:甲醇:氨水=100:1:1至100:4:1)得C15-7a(100mg,25%)和C15-7b(300mg,75%),均为无色油状液体。
7)产物C15的合成:
中间体C5-4(36mg,0.24mmol),C15-7b(80mg,0.2mmol)溶于甲醇(3mL),常温搅拌下加入氰基硼氢化钠(26mg,0.4mmol),常温搅拌过夜,加入100mL二氯甲烷和100mL碳酸氢钠水溶液分层,水相用二氯甲烷萃取。有机相合并,干燥旋干,得到液体,经柱层析纯化(二氯甲烷:甲醇:氨水=200:1:1至100:1:1),得产物(60mg,48%),为一无色油状液体。
实施例11
杂环化合物C16,其是由如下方法合成的:
C15(50mg,0.1mmol)溶于5mL 2N盐酸,常温搅拌2小时,加入100mL二氯甲烷和100mL碳酸氢钠水溶液分层,水相用二氯甲烷萃取。有机相合并,干燥旋干,得产物(35mg,86%),为一白色固体。
实施例12
杂环化合物C17,其是由如下方法合成的:
1)中间体C17-1的合成:
C15-7a(300mg,0.76mmol)溶于5mL 2N盐酸,常温搅拌2小时,加入100mL二氯甲烷和100mL碳酸氢钠水溶液分层,水相用二氯甲烷萃取。有机相合并,干燥旋干,得白色固体产物(200mg,95%)。
2)产物C17的合成:
中间体C5-4(72mg,0.22mmol),中间体C17-1(50mg,0.18mmol)溶于甲醇(3mL),常温搅拌下加入氰基硼氢化钠(23mg,0.36mmol),常温搅拌过夜,加入100mL二氯甲烷100mL碳酸氢钠水溶液分层,水相用二氯甲烷萃取。有机相合并,干燥旋干,得到液体,经柱层析纯化(二氯甲烷:甲醇:氨水=100:1:1至50:1:1),得产物(16mg,18%),为一无色油状液体。
实施例13
根据实施例8的合成方法,在步骤2中用C10-5代替C12-3,合成得到杂环化合物C18。
实施例14
杂环化合物C19,其是由如下方法合成的:
1)中间体C19-2的合成:
N-Boc-顺式-4-羟基-D-脯氨酸甲酯(2g,8.1mmol)溶于50mL二氯甲烷,常温搅拌下,加入PCC(2.6g,12.1mmol),常温搅拌过夜,加硅藻土继续搅拌10分钟,过滤,滤液旋干,得到液体,经柱层析纯化(石油醚:乙酸乙酯=4:1),得无色油状液体(900mg,46%)。
2)中间体C19-3的合成:
中间体C19-2(900mg,3.7mmol)溶于20mL二氯甲烷,-78℃下搅拌10分钟,加入DAST(1.7g,11.1mmol),缓慢升至0℃,继续搅拌两小时。加入碳酸氢钠水溶液(100mL),二氯甲烷(200mL)萃取。二氯甲烷相干燥旋干,得到液体,经柱层析纯化(石油醚:乙酸乙酯=10:1),得淡黄色油状液体(800mg,82%)。
3)中间体C19-4的合成:
中间体C19-3(800mg,3mmol),溶于5mL甲醇,加入2N氢氧化钠水溶液(6mL),50℃搅拌过夜。旋掉甲醇,加入100mL柠檬酸水溶液和100mL二氯甲烷分层,水相用二氯甲烷萃取。二氯甲烷相合并,干燥旋干,得淡黄色固体(740mg,98%)。
4)中间体C19-5的合成:
中间体C19-4(740mg,2.9mmol),丙二酸亚异丙酯(425mg,2.9mmol)和DMAP(720mg,5.8mmol)溶于20mL二氯甲烷,冰浴搅拌下,加入DCC(608mg,2.9mmol),常温搅拌48h。过滤,滤液加入200mL二氯甲烷和100mL 1N盐酸溶液分层,水相用二氯甲烷萃取。二氯甲烷相合并,干燥旋干,得黄色油状液体(1.2g,粗品)。
5)中间体C19-6的合成:
中间体C19-5(1.2g,粗品),溶于20mL无水乙醇,回流搅拌2h,乙醇旋干,得到液体,经柱层析纯化(石油醚:乙酸乙酯=10:1),得无色油状液体(600mg,64%)。
6)中间体C19-7的合成:
中间体C19-6(520mg,1.6mmol),乙脒盐酸盐(457mg,4.8mmol),溶于20mL乙醇,加入乙醇钠(220mg,3.2mmol),回流搅拌过夜。加入醋酸调PH至酸性,加入二氯甲烷(100mL)萃取三次。有机相合并,干燥旋干,得到液体,经柱层析纯化(二氯甲烷:甲醇=50:1),得淡黄色油状液体(320mg,63%)。
7)中间体C19-8的合成:
中间体C19-7(320mg,1mmol),三乙胺(1g,10mmol),N-甲基哌嗪(152mg,1.5mmol)溶于20mL乙腈,加入PyBOP(581mg,1.1mmol),回流搅拌过夜,加入200mL二氯甲烷和200mL碳酸氢钠水溶液分层,水相用二氯甲烷萃取。二氯甲烷相合并,干燥旋干,得到液体,经柱层析纯化(二氯甲烷:甲醇=100:1),得黄色油状液体(350mg,88%)。8)中间体C19-9的合成:
中间体C19-8(350mg,0.88mmol)溶于5mL乙酸乙酯,加入3M氯化氢乙酸乙酯溶液(5mL),常温搅拌过夜。乙酸乙酯旋干,加入100mL二氯甲烷和50mL碳酸氢钠水溶液分层,萃取,水相用二氯甲烷萃取。二氯甲烷相合并,干燥旋干,得无色油状液体(160mg,61%)。
9)产物C19的合成:
中间体C5-4(30mg,0.2mmol),中间体C19-9(50mg,0.17mmol)溶于甲醇(3mL),常温搅拌下加入氰基硼氢化钠(22mg,0.34mmol),常温搅拌过夜,加入100mL二氯甲烷和100mL碳酸氢钠水溶液分层,萃取,水相用二氯甲烷萃取。二氯甲烷相合并,干燥旋干,得到液体,经柱层析纯化(二氯甲烷:甲醇:氨水=100:1:1至100:3:1),得产物(50mg,69%),为一无色油状。
实施例15
杂环化合物C20和C21,其是由如下方法合成的:
1)中间体C20-1的合成:
N-Boc-顺式-4-羟基-D-脯氨酸甲酯(2g,8.1mmol)溶于20mL DMF,0℃下,加入氢化钠(392mg,60%,9.7mmol),常温搅拌过夜。加100mL水淬灭,100mL乙醚萃取3次。乙醚相合并,干燥旋干,得到液体,经柱层析纯化(石油醚:乙酸乙酯=2:1),得无色油状液体(1.9g,90%)。
2)中间体C20-2的合成:
中间体C20-1(1.9g,7.3mmol)溶于5mL甲醇,加入2N氢氧化钠水溶液(6mL),50℃搅拌过夜。旋掉甲醇,加入100mL柠檬酸水溶液和100mL二氯甲烷分层,水相用二氯甲烷萃取。二氯甲烷相合并,干燥旋干,得淡黄色固体(1.6g,89%)。
3)中间体C20-3的合成:
中间体C20-2(1.6g,6.5mmol),丙二酸亚异丙酯(980mg,6.5mmol)和DMAP(1.66mg,13mmol)溶于20mL二氯甲烷,冰浴搅拌下,加入DCC(1.4g,6.5mmol),常温搅拌48h。过滤,滤液加入200mL二氯甲烷和100mL 1N盐酸溶液分层,水相用二氯甲烷萃取。二氯甲烷相合并,干燥旋干,得黄色油状液体(2g,粗品)。
4)中间体C20-4的合成:
中间体C20-3(2g,粗品)溶于20mL无水乙醇,回流搅拌2h,乙醇旋干,得到液体,经柱层析纯化(石油醚:乙酸乙酯=5:1),得无色油状液体(1.4g,68%)。
5)中间体C20-5的合成:
中间体C20-4(1.3g,4.1mmol),乙脒盐酸盐(1.1g,12.3mmol)溶于20mL乙醇,加入乙醇钠(560mg,8.2mmol),回流搅拌过夜。加入醋酸调PH至酸性,加入二氯甲烷(100mL)萃取三次。有机相合并,干燥旋干,得到固体,经柱层析纯化(二氯甲烷:甲醇=50:1),得淡黄色固体(570mg,45%)。
6)中间体C20-6的合成:
中间体C20-5(570mg,1.8mmol),三乙胺(1.8g,18mmol),N-甲基哌嗪(277mg,2.7mmol)溶于20mL乙腈,加入PyBOP(1.05g,2mmol),回流搅拌过夜。加入200mL二氯甲烷和200mL碳酸氢钠水溶液分层,水相用二氯甲烷萃取。二氯甲烷相合并,干燥旋干,得到液体,经柱层析纯化(二氯甲烷:甲醇=100:1),得黄色油状液体(700mg,99%)。7)中间体C20-7的合成:
中间体C20-6(700mg,1.7mmol)溶于5mL乙酸乙酯,加入3M氯化氢乙酸乙酯溶液(5mL),常温搅拌过夜。乙酸乙酯旋干,加入100mL二氯甲烷和50mL碳酸氢钠水溶液分层,萃取,水相用二氯甲烷萃取。二氯甲烷相合并,干燥旋干,得无色油状液体(400mg,81%)。
8)产物C20和C21的合成:
中间体C5-4(50mg,0.34mmol),中间体C20-7(83mg,0.3mmol)溶于甲醇(3mL),常温搅拌下加入氰基硼氢化钠(36mg,0.6mmol),常温搅拌过夜。加入100mL二氯甲烷和100mL碳酸氢钠水溶液分层,萃取,水相用二氯甲烷萃取。二氯甲烷相合并,干燥旋干,得到液体,经柱层析纯化(二氯甲烷:甲醇:氨水=100:1:1至100:3:1),得产物C20(25mg,20%)和C21(10mg,8%),均为白色固体。
实施例16
杂环化合物C22,其是由如下方法合成的:
中间体C5-3(50mg,0.19mmol),2-乙酰基吡啶(35mg,0.29mmol)和氰基硼氢化钠(24mg,0.38mmol)溶于甲醇(3mL),常温搅拌过夜。加入100mL二氯甲烷和100mL碳酸氢钠水溶液分层,萃取,水相用二氯甲烷萃取。二氯甲烷相合并,干燥旋干,得到液体,经柱层析纯化(二氯甲烷:甲醇:氨水=200:1:1),得产物(30mg,43%),为一无色油状液体。
实施例17
杂环化合物C23,其是由如下方法合成的:
1)中间体C23-2的合成:
将镁粉(1.06g,44mmol)与催化量的碘(20mg)置于两口瓶中。在氮气环境下,加入干燥的四氢呋喃(15mL)。将2-(2-溴乙基)-1,3-二恶烷(7.16g,40mmol)溶于燥的四氢呋喃(15mL)中,然后逐滴加入到两口瓶中(保持反应温度在30℃左右)。常温搅拌1.5小时后,将制备好的格氏试剂冷至0℃。同时将2-氰基吡啶(2.08g,20mmol)溶于干燥的四氢呋喃中,在氮气环境中,于0℃下将制备好的格氏试剂缓慢加入,并在此温度下反应1.5小时。加水(10mL)淬灭反应,过滤,滤液加乙酸乙酯(50mL)稀释后,饱和食盐水(30mL*2)洗涤,有机相干燥后,抽去溶剂,得无色油状液体(1.3g,61%),直接进行下一步。
2)中间体C23-3的合成:
将C23-2(1.3g,6mmol)溶于丙酮中(10mL),加入等体积的3N HCl溶液。常温搅拌过夜。饱和碳酸氢钠调反应液pH至8-9,抽去反应液中的丙酮。剩余水液用二氯甲烷(10mL*3)萃取,有机相合并,干燥浓缩。残留物通过硅胶柱色谱纯化(石油醚:乙酸乙酯=10:1),得淡绿色油状液体(800mg,82%)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.89(s,1H),8.68(d,J=4.0Hz,1H),8.02(d,J=8.0Hz,1H),7.83(t,J=7.6Hz,1H),7.48(t,J=5.6Hz,1H),3.57(t,J=8.0Hz,2H),2.91(t,J=8.0Hz,2H).
3)中间体C23-4的合成:
将C23-3(490mg,3mmol)溶于二氯甲烷(20mL)中,在-70℃下缓慢加入三乙酰氧基硼氢化钠(1.9g,9mmol),再加入催化量的醋酸(20mg)。于低温下搅拌三十分钟后,常温加入(R)-1-(4-甲氧基苯基)乙胺(332mg,2.2mmol),搅拌过夜。旋干溶剂,残留物通过硅胶色谱柱纯化(石油醚:乙酸乙酯=1:10),得红色固体(410mg,48%)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.43(s,1H),7.55(s,1H),7.49(d,J=4.0Hz,1H),7.16(d,J=8.0Hz,2H),7.05(s,1H),6.79(d,J=8.0Hz,2H),3.98(s,1H),3.80-3.71(m,4H),3.11(s,1H),2.63(s,1H),2.24(s,1H),1.99-1.85(m,1H),1.76(s,2H),1.35(d,J=4.8Hz,3H).
4)中间体C23-5的合成:
将C23-4(410mg,1.5mmol)溶于三氟乙酸中,于50℃下搅拌12小时。冷至室温后,抽去溶剂。用1N HCl(15mL)溶解后,二氯甲烷(5mL*3)洗涤。水相用饱和碳酸氢钠溶液调节pH至8-9,二氯甲烷萃取(10mL*5)。有机相合并,干燥浓缩,得无色油状液体(110mg,50%)。
5)中间体C23-6的合成:
将中间体C23-5(110mg,0.74mmol)与C12-2(145mg,0.81mmol)溶于乙腈(5mL)中。依次加入碘化钾(12mg,0.074mmol)、DIPEA(240mg,1.85mmol)后于常温下搅拌过夜。旋干溶剂后,通过硅胶柱色谱(二氯甲烷:甲醇=150:1)纯化,得淡黄色油状液体(68mg,32%)。
6)产物C23的合成:
将中间体C23-6(68mg,0.24mmol)与N-甲基哌嗪(118mg,1.2mmol)溶于乙醇中(5ml)。加入三乙胺(240mg,2.4mmol)后于85℃下回流反应3h。冷却至室温后加入二氯甲烷(15ml)稀释后,再水洗(20ml)。有机相干燥旋干,经硅胶柱色谱(二氯甲烷:甲醇=100:1-50:1)纯化,得产物(70mg,83%),为一无色油状液体。
实施例18
根据实施例17的合成方法,在步骤3中用(S)-1-(4-甲氧基苯基)乙胺代替(R)-1-(4-甲氧基苯基)乙胺,合成得到杂环化合物C24。
实施例19
杂环化合物C25,其是由如下方法合成的:
1)中间体C25-1的合成
将镁粉(338mg,14.1mmol)与催化量的碘(20mg)置于两口瓶中。在氮气环境下,加入干燥的四氢呋喃(15mL)。将2-(2-溴乙基)-1,3-二氧戊环(2.3g,13mmol)溶于干燥的四氢呋喃(15mL)中,然后向两口瓶中加入2-(2-溴乙基)-1,3-二氧戊环的四氢呋喃溶液(1.5mL)。待溶液的颜色消失后,缓慢加入剩余的2-(2-溴乙基)-1,3-二氧戊环溶液(保持反应温度在30℃左右)。常温搅拌1.5小时后,将制备好的格氏试剂冷至0℃。同时将3-甲基-2-氰基吡啶(750mg,6.4mmol)溶于干燥的四氢呋喃中,在氮气环境中,于0℃下将制备好的格氏试剂缓慢加入,并在此温度下反应1.5小时。加水(10mL)淬灭反应,过滤,滤液加乙酸乙酯(50mL)稀释后,饱和食盐水(30mL*2)洗涤,有机相干燥后,抽去溶剂,得无色油状液体(680mg,48.6%),直接进行下一步。
2)中间体C25-2的合成
将C25-1(680mg,3.1mmol)溶于丙酮中(10mL),加入等体积的3N HCl溶液。常温搅拌过夜。饱和碳酸氢钠调反应液pH至8-9,抽去反应液中的丙酮。剩余水液用二氯甲烷(10mL*3)萃取,分离有机相、干燥、抽干。残留物通过硅胶柱色谱纯化(PE:EA=10:1)得淡绿色油状液体产物(480mg,87%)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.90(s,H),7.82(d,J=6.8Hz,1H),7.71(t,J=6.4Hz,1H),7.32(d,J=6.8Hz,1H),3.57(d,J=6.4Hz,2H),2.89(d,J=6.4Hz,2H),2.61(s,3H).
3)中间体C25-3的合成
将C25-2(480mg,2.7mmol)溶于二氯甲烷(15mL)中,在-70℃下缓慢加入三乙酰氧基硼氢化钠(1.72g,8.1mmol),再加入催化量的醋酸(20mg)。于低温下搅拌三十分钟后,常温加入(R)-1-(4-甲氧基苯基)乙胺(450mg,3.0mmol),搅拌过夜。旋干溶剂,残留物通过硅胶色谱柱纯化(DCM:MeOH=50:1)得淡绿色油状产物(200mg,25%)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.40(s,1H),7.17(d,J=6.8Hz,1H),7.11(d,J=7.6Hz,2H),6.97-6.89(m,1H),6.59(d,J=7.6Hz,2H),4.22(s,1H),3.75-3.62(m,4H),3.40(s,1H),2.70-2.59(m,1H),2.30-2.14(m,5H),1.91-1.72(m,2H),1.34(d,J=6.0Hz,3H).
4)中间体C25-4的合成
将C25-3(200mg,0.68mmol)溶于三氟乙酸(5mL)中,于70℃下搅拌12小时。冷至室温后,抽去溶剂。用1N HCl(15mL)溶解后,二氯甲烷(5mL*3)洗涤。水相用饱和碳酸氢钠溶液调节pH至8-9,二氯甲烷萃取(10mL*5)。分离有机相,干燥、抽取溶剂得无色油状产物(90mg,82.4%)。
5)中间体C25-5的合成
将中间体C25-4(90mg,0.56mmol)与SM2(108mg,0.61mmol)溶于乙腈(10mL)中。依次加入碘化钾(10mg,0.056mmol)、DIPEA(180mg,1.4mmol)后于常温下搅拌过夜。旋干溶剂后,通过硅胶柱色谱(DCM:MeOH=150:1)纯化后得淡黄色油状液体(54mg,32%)。
6)终产物C25的合成
将中间体C25-5(54mg,0.18mmol)与N-甲基哌嗪(90mg,0.9mmol)溶于乙醇中(5ml)。加入三乙胺(182mg,1.8mmol)后于85℃下回流反应3h。冷却至室温后加入二氯甲烷(15ml)稀释后,再水洗(20ml)。有机相干燥、旋干、再用硅胶柱色谱(DCM:MeOH=100:1-50:1)得无色油状液体(15mg,23%)。
实施例20
根据实施例19的合成方法,在步骤1中用不同位置甲基取代的2-氰基吡啶代替2-氰基吡啶,合成得到杂环化合物C26、C27和C28。
实施例21
杂环化合物C29,其是由如下方法合成的:
1)中间体C29-2的合成:
将2-胺甲基吡啶(3.97g,37mmol),二苯甲酮(6.69g,37mmol)溶于甲苯(50mL)中,将对甲苯磺酸(10mg)加入,采用分水装置,于120℃下反应过夜。冷却至室温,饱和NaHCO3水溶液洗两次(2*30mL),水洗两次(2*30mL)。有机相用无水硫酸钠干燥,过滤,滤液旋干,得黄色油状液体(10g,粗品)。
2)中间体C29-3的合成:
将C29-2(1.5g,粗品),50%NaOH(110mg,2.75mmol),苄基三乙基氯化铵(60mg,0.3mmol)于乙腈(15mL)中,常温反应30min后,加入反式丁烯酸乙酯(630mg,5.5mmol),常温反应过夜。二氯甲烷(3*10mL)萃取,合并有机相,并用无水硫酸钠干燥。过滤,滤液旋干。残余物经柱层析(石油醚:乙酸乙酯=5:1)纯化,得黄色油状液体(1.3g,粗品)。
3)中间体C29-4的合成:
将C29-3(1.3g,3.3mmol)溶于乙腈(15mL)中,浓盐酸(3mL)逐滴加入,于室温下反应2h,二氯甲烷(2*10mL)萃取。弃去有机相,水相重新加入乙腈,氨水(5mL)逐滴加入,继续反应5h。二氯甲烷(3*10mL)萃取,有机相合并,干燥浓缩,残余物经柱层析(二氯甲烷:甲醇=100:2)纯化,得黄色油状液体(360mg,62%)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.58(s,1H),7.73-7.70(m,1H),7.34-7.32(m,1H),7.25-7.22(m,1H),6.57(s,1H),4.40-4.39(m,1H),2.66-2.60(m,1H),2.51-2.46(m,1H),2.14-2.08(m,1H),1.27-1.26(m,3H).
4)中间体C29-5的合成:
C29-4(200mg,1.1mmol)溶于无水的四氢呋喃(5mL)溶液中,于室温下将四氢铝锂(174mg,4.5mmol)分批加入,装置需氮气保护,回流反应过夜。加水(1mL)淬灭,10%(1mL)NaOH溶液,再加1mL水。过滤,将滤液旋干,得黄色油状液体(89mg,50%)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.54(s,1H),7.65-7.62(m,1H),7.28(m,1H),7.18-7.15(m,1H),3.67-3.60(m,1H),3.30-3.21(m,1H),3.10-3.02(m,1H),1.67(s,1H),1.60-1.53(m,1H),1.37-1.33(m,1H),1.07(d,J=6.0Hz,3H).
5)中间体C29-6的合成:
中间体C29-5(89mg,0.55mmol),中间体C12-2(117mg,0.66mmol),碘化钾(9mg,0.05mmol),N,N-二异丙基乙胺(180mg,1.4mmol)于乙腈(4mL),室温反应过夜。旋干反应液,二氯甲烷(3*20mL)萃取,合并有机相,干燥,过滤,旋干。得到液体,经柱层析纯化(二氯甲烷:甲醇:氨水=100:1:1),得无色油状液体(22mg,13%)。
6)产物C29的合成:
中间体C29-6(22mg,0.07mmol),三乙胺(71mg,0.7mmol),N-甲基哌嗪(8mg,0.08mmol)溶于2mL乙醇,80℃搅拌过夜,加入20mL二氯甲烷和20mL碳酸氢钠水溶液分层,水相用二氯甲烷萃取3次。二氯甲烷相合并,干燥旋干,得到液体,经柱层析纯化(二氯甲烷:甲醇:氨水=100:1:1),得产物(15mg,60%),为一无色油状液体。
实施例22
杂环化合物C30,其是由如下方法合成的:
1)中间体C30-2的合成:
将氨基乙腈(5.09g,55mmol)溶于乙醇(250mL)中,加入三乙胺(9.09g,90mmol),搅拌半小时。加入吡啶-2-甲醛(5.36g,50mmol),室温搅拌,反应过夜。减压浓缩干溶剂,加入乙醚(200mL),搅拌10分钟。过滤,滤液减压浓缩干,得棕黄色油状液体(4.8g,粗品)。
2)中间体C30-3的合成:
将C30-2(4.8g,33mmol)溶于甲苯(120mL)中,0℃下加入醋酸银(0.55g,3.3mmol)和碳酸铯(2.15g,66mmol),搅拌5分钟。加入丙烯酸乙酯(3.31g,66mmol),室温搅拌,反应过夜。反应液减压浓缩干溶剂,残余物经硅胶柱层析(二氯甲烷:甲醇=50:1)纯化,得棕黄色油状液体(2.0g,25%)。
3)中间体C30-4的合成:
将C30-3(245mg,1mmol)溶于四氢呋喃(5mL)中,室温下加入1N的硼烷四氢呋喃溶液(2mL,2mmol),于室温下反应20min。冷却至0℃,加入硼氢化钠(76mg,1mmol),保温0℃搅拌3小时,然后自然回复室温过夜。加入水(1mL)淬灭,加入乙酸乙酯(20mL*2)萃取,合并乙酸乙酯相,减压浓缩。重新加入乙醇(20mL)溶解,加入10%的钯碳(0.2g),搅拌过夜。过滤,减压浓缩,残余物经硅胶柱层析(二氯甲烷:甲醇=10:1)纯化,得黄色油状液体(88mg,40%)。
4)中间体C30-5的合成:
将C30-4(88mg,0.4mmol),C12-2(85mg,0.48mmol)和碘化钾(7mg,0.04mmol)溶于乙腈(10mL),室温下加入N,N-二异丙基乙胺(155mg,1.2mmol),室温反应5小时。旋干反应液,加入水(10mL),乙酸乙酯(20mL*2)萃取,合并乙酸乙酯相,减压浓缩。经制备薄层板纯化(二氯甲烷:甲醇=20:1),得无色油状液体(65mg,45%)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.47(d,J=4.8Hz,1H),7.58-7.54(m,1H),7.37(d,J=7.6Hz,1H),7.32(s,1H),7.11-7.08(m,1H),4.17(s,1H),3.75-3.62(m,3H),3.50-3.43(m,3H),3.30(s,1H),2.57(s,3H),2.45(s,1H),2.05(s,1H),0.74(t,J=7.2Hz,3H).
5)产物C30的合成:
将中间体C30-5(65mg,0.18mmol)和N-甲基哌嗪(36mg,0.36mmol)溶于乙醇(10mL),室温下加入N,N-二异丙基乙胺(116mg,0.9mmol),加热80℃搅拌3小时,旋干反应液,加入水(10mL),乙酸乙酯(30mL*5)萃取,合并乙酸乙酯相,减压浓缩。经制备薄层板纯化(二氯甲烷:甲醇:氨水=20:1:1),得产物(60mg,79%),为一淡黄色油状液体。
实施例23
杂环化合物C31,其是由如下方法合成的:
将C30(21mg,0.05mmol)溶于乙醇(20mL),0℃下加入硼氢化钠(60mg,1.59mmol),自然回复室温搅拌过夜。补加硼氢化钠(120mg,3.17mmol),搅拌过夜。减压浓缩,残余物经硅胶柱层析(二氯甲烷:甲醇:氨水=10:1:0.1)纯化,得产物(18mg,94%),为一淡黄色油状液体。
实施例24
杂环化合物C32,其是由如下方法合成的:
1)中间体C32-1的合成:
将C30-3(245mg,1mmol),C12-2(212mg,1.2mmol)和碘化钾(17mg,0.1mmol)溶于乙腈(5mL),室温下加入N,N-二异丙基乙胺(390mg,3mmol),室温反应过夜,然后加热80℃反应过夜。旋干反应液,加入水(10mL),乙酸乙酯(20mL*2)萃取,合并乙酸乙酯相,减压浓缩,残余物经硅胶柱层析(二氯甲烷:甲醇=100:1)纯化,得无色油状液体(210mg,54%)。
2)产物C32的合成:
将中间体C32-1(210mg,0.544mmol)和N-甲基哌嗪(218mg,2.177mmol)溶于乙醇(10mL),室温下加入N,N-二异丙基乙胺(351mg,2.72mmol),加热80℃搅拌3小时。减压浓缩,残余物经制备薄层板纯化(二氯甲烷:甲醇:氨水=50:1:0.5),得产物(190mg,78%),为一淡黄色油状液体。
实施例25
杂环化合物C33,其是由如下方法合成的:
1)中间体C33-1的合成:
将NaH(60%,936mg,23.4mmol)加入到50mL的乙醚中,在常温下滴加氟乙酸乙酯(5g,47.2mmol),然后在40℃下反应4小时。在0℃下将反应液倒入2M H2SO4(15mL)中,接着用乙醚(50mL*3)萃取,合并有机相,无水硫酸钠干燥后,经柱层析(石油醚:乙酸乙酯=10:1到2:1)得黄色油状物(2g,25%)。
2)中间体C33-2的合成:
将中间体C33-1(1.9g,11.4mmol),盐酸甲脒(2.2g,22.8mmol)和乙醇钠(2.3g,34.2mmol)加入到乙醇(40mL)中,在80℃下反应过夜。冷却至常温,加入6N HCl(2mL),减压浓缩,经柱层析纯化(石油醚:乙酸乙酯=3:1到1:1)得黄色固体(800mg,43%)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ13.07(br s,1H),5.35(d,J=46.8Hz,2H),2.53(s,3H).
3)中间体C33-3的合成:
将中间体C33-2(800mg,5mmol),N-甲基哌嗪(750mg,7.5mmol),PyBOP(2.9g,5.5mmol)和三乙胺(1.5g,15mmol)加入到40mL的乙腈中,在80℃下反应过夜,减压浓缩,加入100mL的二氯甲烷,接着用饱和食盐水(50mL*3)洗,无水硫酸钠干燥后,得到液体,经柱层析纯化(乙酸乙酯)得黄色油状物(1g,90%)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.36(d,J=47.2Hz,2H),3.87-3.73(m,4H),2.57-2.50(m,4H),2.49(s,3H),2.33(s,3H).
4)终产物C3的合成:
将C25-4(24.3mg,0.15mmol)、C33-3(24.2mg,0.1mmol)、2-乙基-2-(羟甲基)-1,3-丙二醇(53mg,0.3mmol)、碘化钾(8mg,0.05mmol)依次溶于水中(2mL),于120℃下回流过夜。冷至室温后,抽干溶剂。残留物通过硅胶柱纯化(二氯甲烷:甲醇:氨水=100:1:1-30:1:1)得无色油状产物(20mg,35%)。
实施例26
杂环化合物C34,其是由如下方法合成的:
1)中间体C34-2的合成:
将C34-1(9.2g,50mmol),盐酸乙脒(7.6g,80mmol)和碳酸钾(20.7g,150mmol)加入到乙醇(150mL)中,常温搅拌过夜。减压浓缩除去乙醇,加入3N HCl调PH=5,用正丁醇萃取(50mL*6),得淡黄色固体(3.5g,70%)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ13.30(s,1H),2.39(s,3H),3.03(s,3H).
2)中间体C34-3的合成:
将C34-2(1.5g,9.7mmol),N-Boc哌嗪(3.6g,19.5mmol),PyBOP(5.5g,10.7mmol)和三乙胺(2.9g,29.1mmol)加入到60mL的乙腈中,在80℃下反应过夜。减压浓缩,残余物经柱层析纯化(石油醚:乙酸乙酯=5:1-3:1),得黄色固体(2.5g,74%)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ3.94(s,4H),3.55(s,4H),2.57(s,3H),2.50(s,3H),1.47(s,9H).
3)中间体C34-4的合成:
将C34-3(2.15g,6.1mmol)溶于CH2Cl2(100mL),冰水浴下分批加入三氯异氰尿酸(1.56g,6.7mmol),搅拌反应1h,然后升至常温,反应6h。加入饱和硫代硫酸钠水溶液淬灭反应,过滤除去固体。滤液分层,水相用二氯甲烷萃取(50mL*3)。有机相合并,用饱和食盐水洗,经无水Na2SO4干燥,减压浓缩。残余物经柱层析纯化(石油醚:乙酸乙酯=10:1-5:1),得淡黄色固体(1.5g,71%)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.58(s,2H),3.99(s,4H),3.57(s,4H),2.56(s,3H),1.48(s,9H).
4)中间体C34-5的合成:
中间体C34-4(70mg,0.2mmol),中间体C25-4(32g,0.2mmol),碘化钾(5mg,0.02mmol)和N,N-二异丙基乙胺(52mg,0.4mmol)溶于10mL乙腈,常温搅拌过夜。减压浓缩,残余物经柱层析纯化(石油醚:乙酸乙酯=1:1-0:1),得淡黄色液体(60mg,63%)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.46(s,1H),7.44(s,1H),7.09(s,1H),4.25-3.64(m,7H),3.63-3.37(m,5H),2.60-2.29(m,7H),2.12-1.90(m,4H).
5)终产物CXC-224的合成:
中间体C34-5(57mg,0.12mmol)溶于二氯甲烷(2mL),三氟乙酸(1mL)加入,常温反应2h。减压浓缩,得红褐色油状物(700mg,粗品),再将此油状物溶于甲醇(1mL),次序加入37%甲醛水溶液(1mL)和氰基硼氢化钠(15mg,0.24mmol)。常温反应2h,加入饱和NaHCO3水溶液(1mL),二氯甲烷萃取(10mL*3)。有机相合并,用饱和食盐水洗,经无水Na2SO4干燥,减压浓缩。残余物经柱层析(碱性氧化铝)纯化(石油醚:乙酸乙酯=5:1-1:10),得淡黄色固体(30mg,64%)。
实施例27
杂环化合物C35,其是由如下方法合成的:
将中间体C25-5(50mg,0.17mmol)与2-吗啉乙胺(65mg,0.5mmol)溶于乙醇中(5ml)。加入三乙胺(103mg,1mmol)后于85℃下回流反应3h。冷却至室温后旋干,再用硅胶柱色谱(二氯甲烷:甲醇:氨水=100:1:1-30:1:1)纯化得无色油状液体(25mg,37%)。
实施例28
杂环化合物C36,其是由如下方法合成的:
将C25-4(30mg,0.10mmol),N-甲基高哌嗪(57mg,0.50mmol),三乙胺(100mg,0.99mmol)于10mL乙醇溶液中于85℃下回流反应6h。旋干溶剂,经过柱层析纯化(二氯甲烷:甲醇=30:1)得到黄色油状物(26mg,67%)。
实施例29
杂环化合物C37,其是由如下方法合成的:
将中间体C25-5(50mg,0.17mmol)与N,N-二甲基哌啶-4-胺(64mg,0.5mmol)溶于乙醇中(5ml)。加入三乙胺(103mg,1mmol)后于85℃下回流反应3h。冷却至室温后旋干,再用硅胶柱色谱(二氯甲烷:甲醇:氨水=100:1:1-30:1:1)纯化得无色油状液体(30mg,60%)。
实施例30
杂环化合物C38,其是由如下方法合成的:
1)中间体C38-2的合成
中间体C38-1(1.72g,10mmol),3-溴丙酮酸乙酯(2.34g,12mmol)溶于25mL无水乙醇。冷却至室温并过滤,得滤饼(2.8g,粗品)。
2)中间体C38-3的合成
中间体C38-2(1.5g,5.6mmol)溶于20mL,常温搅拌并缓慢加入硼氢化钠(1.0g,28mmol),回流搅拌过夜。旋干乙醇,得到固体。经过柱层析纯化(二氯甲烷:甲醇=40:1),得白色固体(500mg,39%)1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.84(s,1H),7.59(d,J=8.8Hz,1H),7.31(d,J=6.8Hz,1H),7.25(t,J=7.8Hz,1H),5.27(s,1H),4.64(s,2H).
3)中间体C38-4的合成
中间体C38-3(400mg,1.7mmol),三溴化硼(480mg,1.7mmol)溶于50mL二氯甲烷中,0℃搅拌。加入10mL饱和碳酸氢钠水溶液调PH至8,加入100mL二氯甲烷进行萃取,无水硫酸钠干燥后浓缩。剩余物经过柱层析纯化(二氯甲烷:甲醇=40:1),得白色固体(260mg,50%)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.85(s,1H),7.59(s,1H),7.14(s,1H),7.07(s,1H),4.67(s,2H).
4)中间体C38-5的合成
中间体C38-4(48mg,0.17mmol),C254-4(30mg,0.12mmol),碘化钾(2.79mg,0.017mmol),碳酸钾(46mg,0.34mmol)溶于15mL乙腈溶液中,于常温下搅拌过夜。冷却至室温后,过滤掉多余的碳酸钾,旋干溶剂。经过柱层析纯化(二氯甲烷:甲醇=50:1),得无色油状物(40mg,78%)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.48(s,1H),7.61(s,1H),7.48(d,J=8Hz,1H),7.31(d,J=7.6Hz,1H),6.95-7.03(m,3H),3.96(d,J=14.0Hz,2H),3.74(s,1H),3.43(s,1H),.2.55(s,1H),2.37(s,3H),2.20(s,1H),1.95-2.04(m,3H).
5)产物C38的合成
中间体C38-5(40mg,0.11mmol)溶于3mL的N-甲基哌嗪溶液中,于170℃微波加热1.5h。旋干溶剂,剩余物经过柱层析纯化(二氯甲烷:甲醇=60:1)得无色油状物(20mg,47.6%)。
实施例31
杂环化合物C39,其是由如下方法合成的:
产物C38(46mg,0.12mmol)溶于5mL的甲醛水溶液(37%)中,于封管中加热搅拌2天。加入10mL碳酸氢钠水溶液与30mL二氯甲烷溶液进行分层,萃取,无水硫酸钠干燥,旋干有机相,经过柱层析纯化(二氯甲烷:甲醇=50:1)得无色油状物(35mg,71%)。
表1杂环化合物C1-C39的解析结构和波谱数据
实施例32
本实施例对实施例1-24制备得到的杂环化合物C1-C32对CXCR4的结合能力进行测定。
HPB-ALL细胞培养在含有10%热灭活胎牛血清(Hyclone)+1X青霉素/链霉素+1X非必须氨基酸+1X丙酮酸钠+50μMβ-巯基乙醇的RPMI-1640培养基中。将HPB-ALL细胞用冰冷的测定缓冲液(杜氏磷酸缓冲液+10%热灭活胎牛血清)洗一次,然后再将细胞悬浮到测定缓冲液中,最终浓度为1x106/ml。取95μl/孔的上述细胞悬浮液加入到96孔板中,然后在孔2-12中加入接有APC荧光标记的人源CXCR4单克隆抗体12G5(SungeneH31841-11H),在孔1中加入相应量的接有APC荧光标记的鼠源IgG抗体作为对照。被测化合物用DMSO逐级稀释,然后再用测定缓冲液稀释到所要浓度。将5μl不同浓度的被测化合物溶液加入到孔2-11中,在孔1和孔12中加入相应量的测定缓冲液,然后避光于4℃孵化3h。每孔中加入100μl 4%多聚甲醛溶液,再于冰中避光孵化10分钟。将细胞用测试缓冲液洗涤,然后再悬浮在测试缓冲液中,用流式细胞仪(GuavaSoft6/8HT,Millipore)检测荧光信号,根据不同浓度化合物对发光信号的抑制结果计算出化合物的IC50值。以说明书附图1为例,当浓度>1000nM时,杂环化合物C5对12G5的荧光信号抑制率将近100%,表明化合物C5已经将近完全将12G5从CXCR4蛋白上替换下来;当浓度为1nM时,杂环化合物C5对12G5的荧光信号抑制率将近0%,表明化合物C5已经近乎不能将12G5从CXCR4蛋白上替换下来;从曲线上可以读出,当浓度为20nM时,杂环化合物C5对12G5的荧光信号抑制率为50%,表明在该浓度时杂环化合物C5正好将一半的12G5从CXCR4蛋白上替换下来,则该浓度即为杂环化合物C5的半数抑制浓度(IC50)。IC50值越低,代表该杂环化合物对CXCR4的结合能力越高,活性越好。结果如表2(杂环化合物C1-C32对CXCR4的结合能力测定实验的结果)所示。
表2杂环化合物C1-C32对CXCR4的结合能力测定实验的结果
编号 |
IC<sub>50</sub>(nM) |
编号 |
IC<sub>50</sub>(nM) |
编号 |
IC<sub>50</sub>(nM) |
C1 |
93 |
C2 |
9000 |
C3 |
9000 |
C4 |
2324 |
C5 |
20 |
C6 |
3235 |
C7 |
9000 |
C8 |
6957 |
C9 |
9000 |
C10 |
248 |
C11 |
142 |
C12 |
165 |
C13 |
62 |
C14 |
8105 |
C15 |
500 |
C16 |
7.74 |
C17 |
9000 |
C18 |
429 |
C19 |
1709 |
C20 |
9000 |
C21 |
82 |
C22 |
9000 |
C23 |
144 |
C24 |
9000 |
C25 |
68 |
C26 |
206 |
C27 |
279 |
C28 |
2283 |
C29 |
1200 |
C30 |
9000 |
C31 |
9000 |
C32 |
9000 |
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实施例33
本实施例对实施例25-31制备得到的杂环化合物C33-C40对SDF-1α诱导T细胞钙离子流的抑制能力进行测定。
从人全血中分离人CD4+T细胞,随后使用CD3/CD28扩增试剂盒(LifeTechnologies)活化和扩增备用。取预先培养的细胞悬浮于含有20mM HEPES、HEPES/0.005%的平衡盐溶液中,使细胞浓度达到5x106细胞/mL。在384孔板中,每孔加入20μM细胞(5x106细胞/mL),使细胞在室温中平衡10min后,每孔加入20μM Fluo-4荧光钙指示剂染料,再在室温中平衡10min,于37℃,5%O2/CO2下培养30min。每孔加入25μL(40nM)SDF-1α刺激钙流出,随后使用FLIPR Tetra将待测化合物(测试浓度范围为10μM-0.035nM)加入测试板的孔洞中。将测试板转移到荧光集成相板读取器(FLIPR)上,检测待测化合物对钙离子了改变,以测定化合物对CXCR4收到的拮抗能力。测试值相对于未处理的对照孔将荧光测试值进行归一法处理,以化合物C33为例(图3),50%抑制浓度(IC50值)被定义为相对于未处理的对照孔,抑制SDF-1诱导的钙离子达到50%所需的待测化合物浓度。结果如表3(杂环化合物C33-C39对SDF-1α诱导的T细胞钙离子流的抑制实验结果)所示。
表3杂环化合物C33-C39对SDF-1α诱导的T细胞钙离子流的抑制实验结果
编号 |
IC<sub>50</sub>(nM) |
编号 |
IC<sub>50</sub>(nM) |
编号 |
IC<sub>50</sub>(nM) |
C33 |
1.1 |
C34 |
1.8 |
C35 |
2.7 |
C36 |
0.5 |
C37 |
12 |
C38 |
0.2 |
C39 |
0.1 |
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由表2,3可见,本发明中的杂环化合物,有很好的与CXCR4结合的能力,并且对SDF-1α诱导的T细胞钙离子流的抑制效果也很强,是有效的CXCR4抑制剂,能够用于治疗或预防应答于CXCR4受体抑制的病症。