CN110294802A - 一种单克隆抗体10g12及其应用 - Google Patents

一种单克隆抗体10g12及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种单克隆抗体10G12及其应用。本发明提供了一种单克隆抗体，包括重链可变区和轻链可变区；所述重链可变区包括三个互补决定区HCDR1、HCDR2和HCDR3；所述轻链可变区包括三个互补决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3；所述HCDR1、HCDR2和HCDR3依次如序列表的序列2自N端第26‑33位、第51‑66位、第97‑109位所示；所述LCDR1、LCDR2和LCDR3依次如序列表的序列4自N端第27‑37位、第55‑57位、第94‑102位所示。本发明的发明人基于临床需求，发现了抗人7型腺病毒抗体10G12，用于腺病毒感染的防治，具有重要的生物学和医学意义。

Description

一种单克隆抗体10G12及其应用
技术领域
本发明涉及一种单克隆抗体10G12及其应用。
背景技术
人腺病毒属于腺病毒科哺乳动物腺病毒属，人腺病毒最早发现于1953年，分离培养自健康人萎缩的扁桃腺样组织；病毒的基因组为双股DNA，全长约36kb，这些双链DNA与病毒结构蛋白结合组成病毒核心，病毒无包膜，核心外面包被有衣壳，该衣壳由252个壳粒组成，其中240个为六邻体蛋白，12个五邻体蛋白，外壳呈规则的20面体结构，直径大约70～90nm。
目前已发现的腺病毒有A-G共7个亚群，67个不同的血清型，其中能感染人并致病的有55个亚型。腺病毒感染人最常见的是感染呼吸道并引发呼吸系统疾病，此外部分病毒还可以引起泌尿和胃肠等系统感染，研究表明能引起呼吸道感染的腺病毒有A、C、E和B1组，其中主要是B1亚组，B2亚组可感染人的泌尿系统，F、D组分别可感染人的胃肠系统和结膜系统。目前已知世界上引起呼吸道感染的腺病毒有B1亚组的1、2、3、4、7、14和55型，其中3型、4型、7型、14型为最常见的引起暴发疫情的型别，曾引起我国江苏和台湾省，以及韩国、新加坡、马来西亚等呼吸道腺病毒暴发疫情。自2008年以来，我国不同地区先后发生多起经呼吸道传播的暴发传染病疫情，疫情波及面广，传染性强，经实验室病原检测鉴定分别为B组7型、55型和14型腺病毒。
一般情况下，病毒感染人体时，人体免疫系统能够激发体液免疫和细胞免疫反应并逐渐控制感染、清除病毒，大部分病毒在感染人体引起发病后3天左右，患者体内的IgM开始产生，IgG产生稍晚，大部分在7～10d开始产生，随后逐渐升高，一般1个月左右达到顶峰。因此中和抗体在病毒感染康复中一直扮演者重要的角色，腺病毒感染人体也可诱发较强的体液免疫反应，产生特异性抗体。研究表明机体对同型腺病毒再次感染可产生有效免疫，且可以产生较长时间的免疫保护(可达10年以上)，康复后一般不会再次感染，而其中起作用的就是腺病毒感染过程成诱导机体产生的中和抗体，据研究发现我国40％～60％的6～15岁的人具有12和5型腺病毒中和抗体，而且母亲的抗体能保护婴儿免除严重的腺病毒感染。因此腺病毒中和抗体被认为是可以作为一种有效而特异的抗腺病毒治疗手段，腺病毒中和抗体的研制应该是未来腺病毒感染治疗的一个主要发展方向。
目前世界上尚没有针对腺病毒的特异性治疗药物用于临床，药物研发也多限于化药——抗DNA病毒的核苷类似物，而针对腺病毒的特异性生物药研究还是空白。
发明内容
本发明的目的是提供一种单克隆抗体10G12及其应用。
本发明首先提供了一种单克隆抗体，包括重链可变区和轻链可变区；所述重链可变区包括三个互补决定区HCDR1、HCDR2和HCDR3；所述轻链可变区包括三个互补决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3；
所述HCDR1的氨基酸序列为如下(a1)或(a2)或(a3)：
(a1)序列表的序列2自N端第26-33位所示的氨基酸序列；
(a2)将序列表的序列2自N端第26-33位所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的氨基酸序列；
(a3)与序列表的序列2自N端第26-33位所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的氨基酸序列；
所述HCDR2的氨基酸序列为如下(a4)或(a5)或(a6)：
(a4)序列表的序列2自N端第51-66位所示的氨基酸序列；
(a5)将序列表的序列2自N端第51-66位所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的氨基酸序列；
(a6)与序列表的序列2自N端第51-66位所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的氨基酸序列；
所述HCDR3的氨基酸序列为如下(a7)或(a8)或(a9)：
(a7)序列表的序列2自N端第97-109位所示的氨基酸序列；
(a8)将序列表的序列2自N端第97-109位所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的氨基酸序列；
(a9)与序列表的序列2自N端第97-109位所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的氨基酸序列；
所述LCDR1的氨基酸序列为如下(b1)或(b2)或(b3)：
(b1)序列表的序列4自N端第27-37位所示的氨基酸序列；
(b2)将序列表的序列4自N端第27-37位所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的氨基酸序列；
(b3)与序列表的序列4自N端第27-37位所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的氨基酸序列；
所述LCDR2的氨基酸序列为如下(b4)或(b5)或(b6)：
(b4)序列表的序列4自N端第55-57位所示的氨基酸序列；
(b5)将序列表的序列4自N端第55-57位所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的氨基酸序列；
(b6)与序列表的序列4自N端第55-57位所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的氨基酸序列；
所述LCDR3的氨基酸序列为如下(b7)或(b8)或(b9)：
(b7)序列表的序列4自N端第94-102位所示的氨基酸序列；
(b8)将序列表的序列4自N端第94-102位所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的氨基酸序列；
(b9)与序列表的序列4自N端第94-102位所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的氨基酸序列。
所述重链可变区的氨基酸序列为如下(c1)-(c5)中的任一种:
(c1)序列表的序列2所示的氨基酸序列；
(c2)序列表的序列6所示的氨基酸序列；
(c3)序列表的序列8所示的氨基酸序列；
(c4)将(c1)或(c2)或(c3)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的氨基酸序列；
(c5)与(c1)或(c2)或(c3)具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的氨基酸序列；
所述轻链可变区的氨基酸序列为如下(c6)-(c9)中的任一种:
(c6)序列表的序列4所示的氨基酸序列；
(c7)序列表的序列10所示的氨基酸序列；
(c8)将(c6)或(c7)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的氨基酸序列；
(c9)与(c6)或(c7)具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的氨基酸序列。
本发明还保护编码所述抗体的基因。
编码所述抗体的重链可变区的基因为如下(d1)-(d5)中的任一种:
(d1)序列表的序列1所示的DNA分子；
(d2)序列表的序列5所示的DNA分子；
(d3)序列表的序列7所示的DNA分子；
(d4)与(d1)或(d2)或(d3)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同源性，且编码所述重链可变区的DNA分子；
(d5)在严格条件下与(d1)或(d2)或(d3)或(d4)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述重链可变区的DNA分子；
编码所述抗体的轻链可变区的基因为如下(d6)-(d9)中的任一种:
(d6)序列表的序列3位所示的DNA分子；
(d7)序列表的序列9所示的DNA分子；
(d8)与(d6)或(d7)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同源性，且编码所述轻链可变区的DNA分子；
(d9)在严格条件下与(d6)或(d7)或(d8)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述轻链可变区的DNA分子。
本发明还保护以上任一所述单克隆抗体在制备用于预防和/或治疗腺病毒感染引起的疾病的药物中的应用。
本发明还保护以上任一所述单克隆抗体在制备产品中的应用；所述产品的用途为如下(e1)和/或(e2)：
(e1)抑制腺病毒；
(e2)中和腺病毒。
本发明还保护一种用于预防和/或治疗腺病毒感染引起的疾病的药物，其活性成分为以上任一所述单克隆抗体。
本发明还保护一种产品，其活性成分为以上任一所述的单克隆抗体；所述产品的用途为如下(e1)和/或(e2)：
(e1)抑制腺病毒；
(e2)中和腺病毒。
以上任一所述所述腺病毒为人腺病毒。所述人腺病毒为人7型腺病毒。
本发明的发明人基于临床需求，发现了抗人7型腺病毒单链抗体10G12，用于腺病毒感染的防治，具有重要的生物学和医学意义。
附图说明
图1为10G12的表达与纯化。
图2为HAdV7的SDS-PAGE电泳检测。
图3为HAdV7的电镜检测。
图4为10G12的抗原特异性分析。
图5为10G12的EC50曲线。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
HAdV7病毒：human/CHN/GZ6965/2001，记载于文献：Yu Z,Zeng Z,Zhang J,etal.Fatal Community-acquired Pneumonia in Children Caused by Re-emergent HumanAdenovirus 7d Associated with Higher Severity of Illness and Fatality Rate[J].Scientific Reports,2016,6:37216.；公众可以从中国人民解放军军事科学院军事医学研究院获得。
流感病毒抗原：A/swine/Colorado/1/77(H3N2)，记载于文献：Karasin A I,Schutten M M,Cooper L A,et al.Genetic characterization of H3N2 influenzaviruses isolated from pigs in North America,1977-1999:Evidence for whollyhuman and reassortant virus genotypes[J].Virus Research,2000,68(1):71-85.；公众可以从中国人民解放军军事科学院军事医学研究院获得。
实施例1、抗体的发现
采用灭活纯化的人7型腺病毒对小鼠进行免疫并构建小鼠单链抗体噬菌体库，经过大量筛选、分析、验证，得到1个抗体序列，命名为10G12抗体。
10G12抗体的重链可变区的氨基酸序列如序列表的序列2所示(自N端第26-33位氨基酸残基组成CDR1，第51-66位氨基酸残基组成CDR2，第97-109位氨基酸残基组成CDR3)，其编码基因如序列表的序列1所示。
10G12抗体的轻链可变区的氨基酸序列如序列表的序列4所示(其中，自N端第27-37位氨基酸残基组成CDR1，第55-57位氨基酸残基组成CDR2，第94-102位氨基酸残基组成CDR3)，其编码基因如序列表的序列3所示。
实施例2、10G12抗体的制备
一、重组质粒的构建
1、将pMABG1载体(北京百特美博生物有限公司)的SalI和AgeI位点之间的小片段替换为序列表的序列1所示的DNA分子，得到含有重链可变区的重组表达载体(已经测序验证)。
2、将pMABKa载体(北京百特美博生物有限公司)的SalI和AgeI位点之间的小片段替换为序列表的序列3所示的DNA分子，得到含有轻链可变区的重组表达载体(已经测序验证)。
二、10G12抗体的制备
1、转染前一天将FreeStyleTM HEK 293-F细胞(Invitrogen公司，货号：R79007)调整至浓度为1.0×106/ml，接种至培养瓶中，37℃、5％CO2、125rpm细胞摇床中震荡培养24h。
2、完成步骤1后，转染当天，取所述培养瓶，将转染复合物加至培养瓶中，37℃、5％CO2、125rpm细胞摇床中震荡培养，48小时开始监测细胞活度，在细胞活度降到80-85％时1,000rpm离心10min收集培养上清。
转染复合物：将24μl的FectoPRO转染试剂稀释于3ml FreeStyle 293培养基(Gibco 12338-018)，轻轻混匀，加入步骤一制备的含有重链可变区的重组表达载体12μg，含有轻链可变区的重组表达载体12μg，混匀后室温放置10min。
3、完成步骤2后，将上清用0.45μm滤膜过滤以去除杂质，加入10×PB调节离子浓度与结合缓冲液相近；用AKTA纯化系统(GE,AKTA EXPLORER)进行抗体纯化，在AKTA纯化仪器中安装HiTrap MabSelect Xtra纯化柱，设定相应系统参数，用结合缓冲液平衡纯化柱并上样，随后继续平衡，然后用柠檬酸溶液(pH3.0)冲洗预装柱以洗脱抗体蛋白，UV280达到100时开始收集，UV280降至100时结束收集，并将缓冲液置换为柠檬酸盐溶液(pH6.0)。
4、取步骤3纯化的抗体溶液，SDS-PAGE电泳检测抗体表达(图1的泳道2)，并取样用NanoDrop紫外分光光度计(Thermo Scientific)测定蛋白浓度，经检测蛋白浓度为1.60mg/mL。
实施例3、10G12抗体的结合能力检测
一、人7型腺病毒病毒原液、浓缩液与灭活病毒的制备
1、腺病毒病毒液制备
腺病毒培养培养：常规DMEM+10％(体积百分含量)FBS培养基培养A549细胞(北京协和细胞资源中心，货号：25)，接种病毒前一天将A549细胞传代于75cm2细胞瓶中，使第二天接种病毒时细胞密度达到75％～90％；接种当天，缓慢吸出培养瓶内的细胞培养基，加入5ml DMEM轻轻冲洗细胞后弃去，另加入3ml DMEM+2％(体积百分含量)FBS；用微量移液器吸取适量HAdV7病毒于细胞瓶中，按MOI≈0.001进行感染，均匀晃动瓶子数次使病毒分散均匀，置于37℃，5％CO2的培养箱中吸附2h，期间每隔30min左右晃动培养瓶一次；吸附完成后，弃掉病毒培养液，重新加入15ml新的DMEM+2％(体积百分含量)FBS，然后将细胞瓶放置在37℃，5％CO2的培养箱中继续培养；每日观察细胞病变情况(病毒感染增殖后会出现细胞病变，表现为细胞皱缩、脱落等特征)；当75％-100％细胞出现病变时收获，-80℃冻融2次，4,000rpm离心5min，收集上清分装后保存于-80℃，即为病毒原液。
2、腺病毒浓缩液的制备：收获的病毒培养物，4,000rpm离心10分钟去除细胞碎片,上清转入截留分子量为50kD的超滤管(MILIPORE，货号UFC805008)，4,000rpm离心至体积减少至初始体积的1/30，收集截留液，分装后保存于-80℃，即为病毒浓缩液。
3、腺病毒滴度测定
实验前一天取生长状态良好的A549细胞(北京协和细胞资源中心，货号：25)，胰酶消化后DMEM+10％(体积百分含量)FBS调细胞密度至3×105/ml，接种于96孔细胞培养板，每孔100μl，37℃、5％CO2培养；实验当天取出96孔板，弃培养基，无血清培养基洗一遍，加入DMEM+2％(体积百分含量)FBS，100μl/孔；然后用无血清培养基10倍梯度稀释待测的病毒液，10-1～10-8共8个梯度，稀释好的病毒按照10μl/孔加入备好的96孔板中，每个稀释梯度8孔，同时设置空白对照组，操作完成细胞置于37℃、5％CO2的培养箱中培养观察，7天后计数各孔细胞死亡情况，根据下面公式计算病毒原液的TCID50。
距离比例＝(高于50％病变率的百分数-50％)/(高于50％病变率的百分数-低于50％病变率的百分数)
LgTCID50＝距离比例×稀释度对数之间的差+高于50％病变率的稀释度的对数
经检测和计算，本研究中所用HAdV7病毒原液的病毒滴度＝5.0×108TCID50/ml，病毒浓缩液的病毒滴度＝1.0×1010TCID50/ml。
4、腺病毒的灭活与纯化
取病毒原液转移至500ml样品瓶，用碳酸氢钠调pH至7.6，然后按照1:2000的比例加入β-丙内酯，边加边搅拌，充分混匀后，4℃继续搅拌灭活，24小时后再次调pH至7.6，按照1:2000的比例补加β-丙内酯，4℃继续搅拌灭活24小时，取不少于1‰体积的样品37℃水浴水解4小时(中间观察到样品颜色变黄时用碳酸氢钠调整pH至7.0左右)，水解结束，取前一天传至25cm2细胞瓶的A549细胞，按照1ml样品接种1瓶25cm2A549细胞的比例接种(不足1ml按1ml计算)，同时设置接种未灭活病毒的细胞及未处置空细胞作为对照，置于37℃、5％CO2的培养箱中培养观察，7天后盲传至新的A549细胞，继续观察，如此盲传3代，接种未灭活病毒样品细胞病变而灭活实验组细胞与空白细胞均不病变者，判定为灭活检测结果可信，灭活完全，否则则灭活不完全，需要重新灭活、检测。
经灭活检测证实灭活彻底的病毒原液，4,000rpm离心10分钟去除细胞碎片，用PBS缓冲液平衡Sepharose 4Fast Flow凝胶柱并上样，随后用PBS洗脱，第一个洗脱峰即为目的病毒峰，收集该洗脱峰，然后在Amicon-Ultra-15超滤管(50kD)中加入12.5ml重密度的CsCl溶液【42.23g氯化铯+57.77ml的10mM Tris-HCL(PH 7.9-8)】，再缓慢加入12.5ml轻密度的CsCl溶液【22.39g氯化铯+77.61ml的10mM Tris-HCL(PH 7.9-8)】，再加入15ml的病毒悬浮液，配平，放于超速离心机(Beckman L100-XP)中，25,000rpm，4℃离心2小时。收集在轻密度和重密度氯化铯溶液之间的条带，PBS透析，过滤除菌得到HAdV7灭活病毒。
取样分别进行常规SDS-PAGE检测和电镜观察。电镜样品制备过程如下：取样2.5％戊二醛(0.075％PBS,pH7.4稀释)，4℃固定2小时；然后取15-20ul待检液体，滴至铜网(含碳支持膜)，室温孵育5-10min；滤纸吸干液体；3％磷钨酸(蒸馏水配制)室温染色2min；滤纸吸干液体；上机观察。
SDS-PAGE结果见图2，电镜结果见图3。
二、10G12抗体特异性结合人7型灭活腺病毒
1、取4μl步骤一的4中制备的HAdV7灭活病毒(200ng)，补碳酸盐包被缓冲液(pH9.6)至100ul，按每孔100ul加入到酶标板(Corning 9018)中，设置复孔3个，4℃包被过夜。
2、完成上述步骤后，取所述酶标板，PBST洗板3次，加入含有2％(质量百分含量)BSA的PBS封闭液，37℃孵育2小时。
3、完成上述步骤后，取所述酶标板，弃去封闭液，每孔加入100μl的10G12抗体原液(浓度300μg/ml)，37℃孵育90min，然后PBST(PBS+0.1％Tween20)洗板3次。
4、完成上述步骤后，取上述酶标板，每孔加入100μl的1：4000倍稀释酶标抗体(山羊抗人IgG-HRP，中杉金桥，货号ZB-2304)，37℃孵育45min，然后PBST(PBS+0.1％Tween20)洗板3次。
5、完成上述步骤后，取所述酶标板，每孔加入50μl OPD底物显色液，室温下孵育10分钟。
6、完成上述步骤后，取所述酶标板，每孔加入50μl 1M硫酸溶液终止酶联反应。
7、酶标仪492nm/630nm双波长测定光密度值。
以上步骤同时设置采用灭活流感病毒抗原(将流感病毒A/swine/Colorado/1/77(H3N2)替代HAdV7病毒，按照步骤一的方法制备得到)与合成的口蹄疫病毒多肽抗原(序列，ETQVQRRQHTDVSFILDRFVKVTPKDQINALDLMQTPAHTEPGSRVTNVRGDLQVLAQKAARTLPPGSRHKQKIVAPVKQLL)作为抗原替代HAdV7灭活病毒的对照组。
结果如图4所示。结果表明，10G12抗体可以特异性结合灭活腺病毒而不结合流感病毒(Flu)或口蹄疫病毒多肽抗原(FMDV)。
三、10G12抗体的抗原结合能力分析
1、取4μl步骤一的4中制备的HAdV7灭活病毒(200ng)，补碳酸盐包被缓冲液(pH9.6)至100μl，按每孔100ul加入到酶标板(Corning货号：9018)中，设置复孔3个，4℃包被过夜。
2、完成上述步骤后，取所述酶标板，PBST洗板3次，加入含有2％(质量百分含量)BSA的PBS封闭液，37℃孵育2小时。
3、完成上述步骤后，取所述酶标板，弃去封闭液，每孔加入100μl按照2倍等比稀释的10G12抗体液(起始浓度400μg/ml)，一共设置30个梯度，37℃孵育90min，然后PBST洗板3次。
4、完成上述步骤后，取所述酶标板，每孔加入100μl的1：4000倍稀释HRP标记的抗人IgG抗体(中杉金桥，货号ZB-2304)，37℃孵育45min，PBST洗板3次。
5、完成上述步骤后，取所述酶标板，每孔加入50μl OPD底物显色液，室温下孵育10分钟。
6、完成上述步骤后，取所述酶标板，每孔加入50μl 1M硫酸溶液终止酶联反应。
7、酶标仪492nm/630nm双波长测定光密度值。
结果如图5所示。分析显示10G12抗体与人7型腺病毒的结合能力为EC50＝0.14nM。
实施例4、10G12抗人7型腺病毒感染的药效
1、实验前一天取生长状态良好的A549的细胞，胰酶消化，DMEM+10％(体积百分含量)FBS调细胞密度至3×105/ml，接种于96孔细胞培养板，每孔100μl，37℃5％CO2培养。
2、完成步骤1后，实验当天取出96孔板，弃培养基，无血清培养基洗一遍，加入DMEM+2％(体积百分含量)FBS，每孔100μl；然后分组进行如下操作：
实验组(10G12)：将实施例2制备的10G12抗体用无血清培养基稀释，得到含有不同浓度(50μg/ml、25μg/ml、12.5μg/ml、6.25μg/ml、3.2μg/ml、1.6μg/ml、0.8μg/ml、0.4μg/ml、0.2μg/ml)10G12抗体的待测抗体溶液；将待测抗体溶液与实施例3步骤一的1中制备的HAdV7病毒原液(用无血清培养基稀释至病毒浓度为2×103TCID50/mL)按照体积比1:1混合，37℃孵育1.5h后加至孔内,100μl/孔，继续置于37℃，5％CO2的培养箱中孵育1h。
无关抗体对照组(Anti-DENV1)：将Anti-DENV1抗体(记载于文献：PotentNeutralization Ability of a Human Monoclonal Antibody Against Serotype1Dengue Virus。Frontiers in Microbiology，1June2018，Volume 9，Article 1214；公众可以从中国人民解放军军事科学院军事医学研究院获得)用无血清培养基稀释，得到含有不同浓度(50μg/ml、25μg/ml、12.5μg/ml、6.25μg/ml、3.2μg/ml、1.6μg/ml、0.8μg/ml、0.4μg/ml、0.2μg/ml)Anti-DG抗体的待测抗体溶液；将待测抗体溶液与与实施例3步骤一的1中制备的HAdV7病毒原液(用无血清培养基稀释至病毒浓度为2×103TCID50/mL)按照体积比1:1混合，37℃孵育1.5h后加至孔内，100μl/孔，继续置于37℃，5％CO2的培养箱中孵育1h。
无关抗体对照组(Anti-EGF)：将Anti-EGFR抗体(记载于发明专利专利CN102993305B)用无血清培养基稀释，得到含有不同浓度(50μg/ml、25μg/ml、12.5μg/ml、6.25μg/ml、3.2μg/ml、1.6μg/ml、0.8μg/ml、0.4μg/ml、0.2μg/ml)Anti-EGFR抗体的待测抗体溶液；将待测抗体溶液与实施例3步骤一的1中制备的HAdV7病毒原液(用无血清培养基稀释至病毒浓度为2×103CID50/mL)按照体积比1:1混合，37℃孵育1.5h后加至孔内，100μl/孔，继续置于37℃，5％CO2的培养箱中孵育1h。
空细胞对照组(CELL)：无血清培养基，37℃孵育1.5h后加至孔内，100μl/孔，继续置于37℃，5％CO2的培养箱中孵育1h。
病毒组(VIRUS)：将无血清培养基与实施例3步骤一的1中制备的HAdV7病毒原液(用无血清培养基稀释至病毒浓度为2×103TCID50/mL)按照体积比1:1混合，37℃孵育1.5h后加至孔内，100μl/孔，继续置于37℃，5％CO2的培养箱中孵育1h。
3、完成步骤2后，取96孔板，弃上清，加入DMEM+2％(体积百分含量)FBS培养基(100μl/孔)，37℃，5％CO2继续培养1周，直至细胞出现明显病变；取出培养板，镜下观察，计数未病变、部分病变和完全病变的细胞孔数，利用Graphpad Prism软件计算抗体对腺病毒感染的抑制率(表1)。
表1 10G12抗HAdV7感染细胞检测结果
*浓度单位：μg/mL；
结果表明本发明制备抗体10G12可以有效抑制HAdV7的增殖，EC50＝0.2μg/mL。
实施例5、10G12人源化改造及检测
一、10G12人源化改造
将10G12抗体进行人源化改造，得到两个版本的抗体重链和一个版本的抗体轻链，获得抗体轻链和两个重链分别配对，得到10G12-h1抗体和10G12-h2抗体。
10G12-h1抗体的重链可变区的氨基酸序列如序列表的序列6所示(自N端第26-33位氨基酸残基组成CDR1，第51-66位氨基酸残基组成CDR2，第97-109位氨基酸残基组成CDR3)，其编码基因如序列表的序列5所示。
10G12-h2的重链可变区的氨基酸序列如序列表的序列8所示(其中，自N端第26-33位氨基酸残基组成CDR1，第51-66位氨基酸残基组成CDR2，第97-109位氨基酸残基组成CDR3)，其编码基因如序列表的序列7所示。
10G12-h1和10G12-h2抗体的轻链可变区相同，如序列表的序列10所示(其中，自N端第27-37位氨基酸残基组成CDR1，第55-57位氨基酸残基组成CDR2，第94-102位氨基酸残基组成CDR3)，其编码基因如序列表的序列9所示。
二、10G12-h1重组质粒的构建
1、将pTSE-G1n载体(北京百特美博生物有限公司)的SalI和PmlI位点之间的小片段分别替换为序列表的序列5所示的DNA分子，得到含有10G12-h1重链可变区的重组表达载体(已经测序验证)。
2、将pTSE-K载体(北京百特美博生物有限公司)的SalI和PmlI位点之间的小片段替换为序列表的序列9所示的DNA分子，得到含有10G12-h1轻链可变区的重组表达载体(已经测序验证)。
三、10G12-h2重组质粒的构建
1、将pTSE-G1n载体(北京百特美博生物有限公司)的SalI和PmlI位点之间的小片段替换为序列表的序列7所示的DNA分子，得到含有10G12-h2重链可变区的重组表达载体(已经测序验证)。
2、轻链质粒同10G12-h1轻链质粒。
四、10G12-h1和10G12-h2抗体的制备
参照实施例2的步骤二制备得到10G12-h1抗体溶液和10G12-h2抗体溶液。
五、10G12-h1和10G12-h2抗体抗人7型腺病毒感染的药效
参照实施例4的方法进行检测。
结果如表2所示。
表2人源化抗体10G12-h1、10G12-h2抗HAdV7感染细胞检测结果
*浓度单位：μg/mL；
结果表明本发明制备抗体10G12-h1和10G12-h2都可以有效抑制HAdV7的感染，其中10G12-h1EC50＝0.18μg/mL，10G12-h2 EC50＝0.28μg/mL。
序列表
<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院
<120> 一种单克隆抗体10G12及其应用
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 351
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
caggtgcagc tgaagcagcc tggggctgag ctggtgaggc ctggagcttc agtgaagctg 60
tcctgcaagg cttctggtta ctcattcacc aactactgga tgcactggat gaagcagagg 120
cctggacaag gtcttgagtg gattggcatg attgatcctt ccgatagtga aactaggtta 180
aatcagaagt tcaaggacaa ggccacattg actgtagaca aatcctccag tatagcctac 240
atgcaactca gcagcccgac atctgaggac tctgcggtct attactgtgc aagagatagg 300
tacgacggag gggcctggtt tgattactgg agccaaggga ctctggtcac t 351
<210> 2
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Gln Val Gln Leu Lys Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Met Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Met Ile Asp Pro Ser Asp Ser Glu Thr Arg Leu Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Ile Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Pro Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Arg Tyr Asp Gly Gly Ala Trp Phe Asp Tyr Trp Ser Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr
115
<210> 3
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gatgttgtga tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc 60
atctcttgca gatctagtca gagccttgta cacagtaatg gaaacaccta tttacattgg 120
tacctgcaga agccaggcca gtctccaaag ctcctgatct acaaagtttc caaccgattt 180
tctggggtcc cagacaggtt cagcgtcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc 240
agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tatttctgct ctcaaagtac acatgttcct 300
ccgacgttcg gtggaggcac caagctggaa atcaaa 336
<210> 4
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Val Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser
85 90 95
Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 5
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
caggttcagc tggttcagtc tggcgccgaa gtgaagaaac ctggcgcctc tgtgaaggtg 60
tcctgcaagg ccagcggcta cagcttcacc aactactgga tgcactgggt ccgacaggcc 120
cctggacaag gacttgagtg gatgggcatc atcgacccca gcgacagcga gacaaggctg 180
aaccagaaat tcaaggaccg cgtgaccatg accagagaca ccagcacctc caccgtgtac 240
atggaactga gcagcctgag aagcgaggac accgccgtgt actactgcgc cagagacaga 300
tatgatggcg gcgcttggtt tgactactgg ggccagggaa cactggtcac cgttagctct 360
<210> 6
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Asp Pro Ser Asp Ser Glu Thr Arg Leu Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Arg Tyr Asp Gly Gly Ala Trp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 7
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
caggttcagc tggttcagtc tggcgccgaa gtgaagaaac ctggcgcctc tgtgaaggtg 60
tcctgcaagg ccagcggcta cagcttcacc aactactgga tgcactgggt ccgacaggcc 120
cctggacaag gacttgagtg gatgggcatc atcgacccca gcgacagcga gacaaggctg 180
aaccagaaat tcaaggaccg cgtgaccata accgcagaca agagcacctc caccgcgtac 240
atggaactga gcagcctgag aagcgaggac accgccgtgt actactgcgc cagagacaga 300
tatgatggcg gcgcttggtt tgactactgg ggccagggaa cactggtcac cgttagctct 360
<210> 8
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Asp Pro Ser Asp Ser Glu Thr Arg Leu Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Arg Tyr Asp Gly Gly Ala Trp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 9
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gacgtggtca tgacacagag ccctctgagc ctgcctgtga cacttggaca gcctgccagc 60
atcagctgca gatctagcca gagcctggtg cacagcaacg gcaacaccta cctgaactgg 120
ttccagcaga ggcccggaca gtctcctaga cggctgatct acaaggtgtc caacagagac 180
agcggcgtgc ccgatagatt ttctggcagc ggctctggca ccgacttcac cctgaagatc 240
agcagagtgg aagccgagga cgtgggcgtg tactactgta gccagtctac ccatgtgcct 300
ccaacctttg gcggaggcac caaggtggaa atcaag 336
<210> 10
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Asp Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser
85 90 95
Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110

Claims (10)

1.一种单克隆抗体，包括重链可变区和轻链可变区；所述重链可变区包括三个互补决定区HCDR1、HCDR2和HCDR3；所述轻链可变区包括三个互补决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3；
所述HCDR1的氨基酸序列为如下(a1)或(a2)或(a3)：
(a1)序列表的序列2自N端第26-33位所示的氨基酸序列；
(a2)将序列表的序列2自N端第26-33位所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的氨基酸序列；
(a3)与序列表的序列2自N端第26-33位所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的氨基酸序列；
所述HCDR2的氨基酸序列为如下(a4)或(a5)或(a6)：
(a4)序列表的序列2自N端第51-66位所示的氨基酸序列；
(a5)将序列表的序列2自N端第51-66位所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的氨基酸序列；
(a6)与序列表的序列2自N端第51-66位所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的氨基酸序列；
所述HCDR3的氨基酸序列为如下(a7)或(a8)或(a9)：
(a7)序列表的序列2自N端第97-109位所示的氨基酸序列；
(a8)将序列表的序列2自N端第97-109位所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的氨基酸序列；
(a9)与序列表的序列2自N端第97-109位所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的氨基酸序列；
所述LCDR1的氨基酸序列为如下(b1)或(b2)或(b3)：
(b1)序列表的序列4自N端第27-37位所示的氨基酸序列；
(b2)将序列表的序列4自N端第27-37位所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的氨基酸序列；
(b3)与序列表的序列4自N端第27-37位所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的氨基酸序列；
所述LCDR2的氨基酸序列为如下(b4)或(b5)或(b6)：
(b4)序列表的序列4自N端第55-57位所示的氨基酸序列；
(b5)将序列表的序列4自N端第55-57位所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的氨基酸序列；
(b6)与序列表的序列4自N端第55-57位所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的氨基酸序列；
所述LCDR3的氨基酸序列为如下(b7)或(b8)或(b9)：
(b7)序列表的序列4自N端第94-102位所示的氨基酸序列；
(b8)将序列表的序列4自N端第94-102位所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的氨基酸序列；
(b9)与序列表的序列4自N端第94-102位所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的氨基酸序列。
2.如权利要求1所述的抗体，其特征在于：
所述重链可变区的氨基酸序列为如下(c1)-(c5)中的任一种:
(c1)序列表的序列2所示的氨基酸序列；
(c2)序列表的序列6所示的氨基酸序列；
(c3)序列表的序列8所示的氨基酸序列；
(c4)将(c1)或(c2)或(c3)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的氨基酸序列；
(c5)与(c1)或(c2)或(c3)具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的氨基酸序列；
所述轻链可变区的氨基酸序列为如下(c6)-(c9)中的任一种:
(c6)序列表的序列4所示的氨基酸序列；
(c7)序列表的序列10所示的氨基酸序列；
(c8)将(c6)或(c7)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的氨基酸序列；
(c9)与(c6)或(c7)具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的氨基酸序列。
3.编码权利要求1或2所述抗体的基因。
4.如权利要求3所述的基因，其特征在于：
编码所述抗体的重链可变区的基因为如下(d1)-(d5)中的任一种:
(d1)序列表的序列1所示的DNA分子；
(d2)序列表的序列5所示的DNA分子；
(d3)序列表的序列7所示的DNA分子；
(d4)与(d1)或(d2)或(d3)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同源性，且编码权利要求1或2中所述的重链可变区的DNA分子；
(d5)在严格条件下与(d1)或(d2)或(d3)或(d4)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1或2中所述的重链可变区的DNA分子；
编码所述抗体的轻链可变区的基因为如下(d6)-(d9)中的任一种:
(d6)序列表的序列3位所示的DNA分子；
(d7)序列表的序列9所示的DNA分子；
(d8)与(d6)或(d7)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同源性，且编码权利要求1或2中所述的轻链可变区的DNA分子；
(d9)在严格条件下与(d6)或(d7)或(d8)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1或2中所述的轻链可变区的DNA分子。
5.权利要求1或2所述的抗体在制备用于预防和/或治疗腺病毒感染引起的疾病的药物中的应用。
6.权利要求1或2所述的抗体在制备产品中的应用；所述产品的用途为如下(e1)和/或(e2)：
(e1)抑制腺病毒；
(e2)中和腺病毒。
7.一种用于预防和/或治疗腺病毒感染引起的疾病的药物，其活性成分为权利要求1或2所述的抗体。
8.一种产品，其活性成分为权利要求1或2所述的抗体；所述产品的用途为如下(e1)和/或(e2)：
(e1)抑制腺病毒；
(e2)中和腺病毒。
9.如权利要求5或6所述的应用，或，权利要求7所述的药物，或，权利要求8所述的产品，其特征在于：所述腺病毒为人腺病毒。
10.如权利要求9所述的应用或药物或产品，其特征在于：所述人腺病毒为人7型腺病毒。
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