CN110286221A - 一种用于监测hpv杂交捕获的远程观察系统 - Google Patents

一种用于监测hpv杂交捕获的远程观察系统 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物检测技术领域，具体是涉及一种用于监测HPV杂交捕获的远程观察系统，是由制备系统、检测系统和操作系统组成；所述检测系统包括摄像部、成像部、信息处理部和主控制部；所述操作系统包括现显示终端和输入终端。本发明通过引入成像系统，不仅能依靠荧光强度初步地判断样本中是否存在目标DNA，快速判断病情，而且能够对同一个样品进行连续观察，进一步提供样本中DNA的空间定位信息。除此之外通过统计收集到的样本信息，可快速对样本信息作出分析，对于HPV杂交捕获反应的进一步研究提供了技术支持。

Description

一种用于监测HPV杂交捕获的远程观察系统
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，具体是涉及一种用于监测HPV杂交捕获的远程观察系统。
背景技术
宫颈癌的发病率在女性恶性肿瘤中居第2位，近10年的研究表明，人乳头瘤病毒(HPV)是宫颈癌以及癌前期病变的主要致病因子，尤其是高危型HPV感染。因此，对HPV感染的分型和定量检测是处理宫颈病变的重要依据，是宫颈癌筛查不可缺少的内容。
第二代杂交捕获法(HC-Ⅱ)是目前唯一被美国食品药品监督管理局(FDA)批准的宫颈癌普查的辅助检测，这是一种基于信号放大的酶标板技术化学发光检测法的核酸杂交检测方法。原理为含有目标DNA的标本与一种特殊的HPV RNA探针杂交。反应形成的RNA-DNA杂交体被捕获到有RNA-DNA杂交体对应特异抗体的酶标板小孔杯的表面上。被固定好的杂交体然后与接合了RNA-DNA杂交体对应特异抗体的碱性磷酸酯酶反应，最后再用化学发光底物进行检测。几个碱性磷酸酯酶分子与每一个抗体接合，多个接合抗体结合到每个被捕获到的杂交体上，这些杂交体起到了信号放大作用。发射光出来可以用照度计测量其相对光单位，发出光的强度指出了样本中存在或不存在目标DNA。
第二代杂交捕获法能同时检测13种高危型HPV，具有较高的敏感度和特异性，不要求很高的实验室条件，基层医院可以推广，多用于初筛，可以作为目前其他新方法的对照标准。但这种方法也存在一定的缺陷，只能检测荧光的有无、强度大小，无法提供样本中DNA的空间定位信息，由于样品只被检测一次，因此无法对同一个样品进行连续观察。
发明内容
为了解决以上问题，本发明提供了一种用于监测HPV杂交捕获的远程观察系统，既能够确定样本中是否存在目标DNA，又能够对样本进行连续观察，给出样本中DNA的空间定位信息。
本发明的技术方案如下：
一种用于监测HPV杂交捕获的远程观察系统，所述观察系统包括：
制备系统，所述制备系统用于将原始DNA样本制备成适合检测的杂交体杂交体检测样。
检测系统，所述检测系统不仅能够判断目标DNA的有无，还能够对同一个样品进行连续观察，确定样本中DNA的空间定位信息。
操作系统，所述操作系统为操作人员对于所述观察系统的操作终端，包括且不限于PC端、移动平板端。
所述制备系统流程为：
含有目标DNA的标本与一种特殊的HPV RNA探针杂交。反应形成的RNA-DNA杂交体被捕获到有RNA-DNA杂交体对应特异抗体的酶标板小孔杯的表面上。被固定好的杂交体然后与接合了RNA-DNA杂交体对应特异抗体的碱性磷酸酯酶反应，最后再用化学发光底物进行检测。几个碱性磷酸酯酶分子与每一个抗体接合，多个接合抗体结合到每个被捕获到的杂交体上，这些杂交体起到了信号放大作用。
所述检测系统包括：
摄像部，所述摄像部用于对杂交体检测样的荧光现象进行拍摄，从而记录HPV杂交捕获的具体过程，包括CCD(Charge coupled Device，电荷耦合元件)相机和照度计。
所述CCD是一种半导体器件，它的作用就像胶片一样，能够把光学影像转化为数字信号。CCD上有许多排列整齐的电容，能感应光线，并将影像转变成数字信号。经由外部电路的控制，每个小电容能将其所带的电荷转给它相邻的电容。作为一种光数转化元件，CCD相机已被广泛应用。
所述照度计(或称勒克斯计)是一种专门测量照度的仪器仪表，用于测量物体被照明的程度，也即物体表面所得到的光通量与被照面积之比。照度计通常是由硒光电池或硅光电池配合滤光片和微安表组成。
成像部，所述成像部能够将光学影像转换为数字信号，便于观察记录；
信息处理部，所述信息处理部能够将收集的信息进行统计分析，对不同样本进行分档存储。
主控制部，所述主控制部用于接受输入指令的同时，对摄像部、成像部、信息处理部进行控制。
所述操作系统包括：
显示终端，所述显示终端接收来自所述成像部和所述信息处理部所传来的信息，并显示给操作人员；
输入终端，所述输入终端用于让操作人员对所述主控制部输入指令，从而控制整个观察系统。
进一步地，所述杂交体检测样的制备步骤如下：
1)标本组DNA双链被释放并分解为核苷酸单链；
2)取待测样品滴在小片正电荷尼龙膜上；
3)用缓冲液Ⅰ从下方无DNA一面湿润尼龙膜，含DNA的一面不应有流淌的液体,以防样品扩散，然后用紫外交联仪固定DNA，使DNA单链与RNA探针结合为RNA-DNA杂交体；所述紫外交联仪是一种多用途的254mm紫外辐射系统，主要用于将核酸交联于膜上；
4)用缓冲液Ⅱ封闭膜上没被探针杂交的区域，再用特异性抗体将RNA-DNA杂交体固定在尼龙膜上；
5)将结合有碱性磷酸酶的多个第二抗体与RNA-DNA杂交体结合，以达到放大信号的目的；
6)将用缓冲液Ⅲ平衡后的膜置于洁净的疏水性醋酸膜上，均匀添加发光底物后覆上另一张透明膜，排出膜间气泡，使发光底物均匀分布在整个杂交膜上。碱性磷酸酶使酶底物发光，判读光的强弱可确定碱性磷酸酶的含量，从而确定RNA-DNA杂交体的含量。
进一步地，所述摄像部包括暗箱，所述暗箱底部设置有用于载物的三轴移动平台，顶部设置有CDD相机和照度计，所述CDD相机包括滤色系统，所述暗箱侧面设置有可开关的送物口。所述滤色系统用于提供相应波长范围的荧光。
进一步地，所述缓冲液Ⅰ含0.1mol/L Tris-Cl，0.1mol/L MaCl，调pH为7.5。
进一步地，所述缓冲液Ⅱ为以缓冲液Ⅰ配置的浓度为2％的封闭试剂或同样浓度的脱脂奶粉。
进一步地，所述缓冲液Ⅲ含0.1mol/L Tris，0.1mol/L MaCl，50mmol/L MgCl2，调pH为9.5。
与现有的HPV杂交捕获检测系统相比，本发明的有益效果是：
现有的HPV杂交捕获检测系统只能依靠荧光强度初步地判断样本中是否存在目标DNA，不能更加深入了解HPV杂交捕获时的反应机理和反应进程，本发明通过引入成像系统，不仅能依靠荧光强度初步地判断样本中是否存在目标DNA，快速判断病情，而且能够对同一个样品进行连续观察，进一步提供样本中DNA的空间定位信息。除此之外通过统计收集到的样本信息，可快速对样本信息作出分析，对于HPV杂交捕获反应的进一步研究提供了技术支持。
附图说明
图1是本发明的系统框图；
图2是本发明暗箱的结构示意图；
图3是本发明的检测原理示意图；
图4是本发明发光底物的发光原理示意图。
图中：1、制备系统，2、检测系统，21、摄像部，210、暗箱，211、CDD相机，212、照度计，213、三轴移动平台，214、送物口，22、成像部，23、信息处理部，24、主控制部，3、操作系统。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明所采取的方式和取得的效果，下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚和完整地描述。
实施例一：
如图1所示，一种用于监测HPV杂交捕获的远程观察系统，所述观察系统包括：
制备系统1，所述制备系统1用于将原始DNA样本制备成适合检测的杂交体杂交体检测样。
检测系统2，所述检测系统2不仅能够判断目标DNA的有无，还能够对同一个样品进行连续观察，确定样本中DNA的空间定位信息。
操作系统3，所述操作系统3为操作人员对于所述观察系统的操作终端，包括且不限于PC端、移动平板端。
所述制备系统1流程为：
含有目标DNA的标本与一种特殊的HPV RNA探针杂交。反应形成的RNA-DNA杂交体被捕获到有RNA-DNA杂交体对应特异抗体的酶标板小孔杯的表面上。被固定好的杂交体然后与接合了RNA-DNA杂交体对应特异抗体的碱性磷酸酯酶反应，最后再用化学发光底物进行检测。几个碱性磷酸酯酶分子与每一个抗体接合，多个接合抗体结合到每个被捕获到的杂交体上，这些杂交体起到了信号放大作用。
所述检测系统2包括：
摄像部21，所述摄像部21用于对杂交体检测样的荧光现象进行拍摄，从而记录HPV杂交捕获的具体过程，包括CCD(Charge coupled Device，电荷耦合元件)相机和照度计。
所述CCD是一种半导体器件，它的作用就像胶片一样，能够把光学影像转化为数字信号。CCD上有许多排列整齐的电容，能感应光线，并将影像转变成数字信号。经由外部电路的控制，每个小电容能将其所带的电荷转给它相邻的电容。作为一种光数转化元件，CCD相机已被广泛应用。
所述照度计(或称勒克斯计)是一种专门测量照度的仪器仪表，用于测量物体被照明的程度，也即物体表面所得到的光通量与被照面积之比。照度计通常是由硒光电池或硅光电池配合滤光片和微安表组成。
成像部22，所述成像部22能够将光学影像转换为数字信号，便于观察记录；
信息处理部23，所述信息处理部23能够将收集的信息进行统计分析，对不同样本进行分档存储。
主控制部24，所述主控制部24用于接受输入指令的同时，对摄像部21、成像部22、信息处理部23进行控制。
所述操作系统3包括：
显示终端，所述显示终端接收来自所述成像部22和所述信息处理部23所传来的信息，并显示给操作人员；
输入终端，所述输入终端用于让操作人员对所述主控制部24输入指令，从而控制整个观察系统。
具体的操作流程如下：
材料准备
DIG(Digoxigein，地高辛)多克隆抗体(Fab片断)碱性磷酸酶(AP)复合物；DIG-11-dUTP和dNTP；DIG-标记的对照DNA；Klenow酶；六聚寡核昔酸随机引物混合液；封闭试剂(Blockinger reagent)；化学发光底物Lumigen PPD(一种磷酸苯酚基取代的二氧丁环衍生物，含有单一的金刚烷基adamantyl基，分子结构如图4所示)，正电荷尼龙膜(德国Bochringer Mannheim公司)。
杂交体检测样制备
1)标本组DNA双链被释放并分解为核苷酸单链，制备DIG标记的DNA探针和寡核苷酸-AP偶合物；
2)取待测样品滴在小片正电荷尼龙膜上。
3)用缓冲液Ⅰ(0.1mol/L Tris-Cl，0.1mol/L MaCl，调pH为7.5)从下方无DNA一面湿润尼龙膜，含DNA的一面不应有流淌的液体,以防样品扩散，然后用紫外交联仪固定DNA，使DNA单链与RNA探针结合为RNA-DNA杂交体；
4)用缓冲液Ⅱ(为以缓冲液Ⅰ配置的浓度为2％的封闭试剂或同样浓度的脱脂奶粉)封闭膜上没被探针杂交的区域，室温摇匀30min后倾去液体，再用特异性抗体将RNA-DNA杂交体固定在尼龙膜上；
5)用1：7000稀释的DIG抗体-AP偶联物(用缓冲液Ⅰ处理)处理后摇匀30min，使抗体与膜上含有DIG的DNA探针充分混合；
6)将用缓冲液Ⅲ(0.1mol/L Tris，0.1mol/L MaCl，50mmol/L MgCl2，调pH为9.5)平衡2min后，将膜置于洁净的疏水性醋酸膜上，均匀添加发光底物后覆上另一张透明膜，排出膜间气泡，使发光底物均匀分布在整个杂交膜上。
杂交体检测样检测
1)如图2所示，打开暗箱210的送物口214，将待测样品膜放置在三轴移动平台213的载物台上，关闭送物口214，保证暗箱内为无光环境。
如图3所示，通过CCD相机211可观察HPV基因杂交捕获过程中的荧光现象，从而了解具体反应进程和HPV病毒的空间位置。
2)CCD相机211在记录HPV基因杂交捕获过程的同时可以将荧光现象的影像转变成数字信号，输送给信息处理部23。
3)信息处理部23记录存储成像部22输送的信息，按照不同样本分档记录，利于病情判断的同时，利用SPSS22.0统计软件计算检测结果的一致性指数(Kappa指数)，方便HPV杂交捕获的后期研究。
操作人员可通过PC端输入指令，控制观察系统，也可通过显示终端在不打开暗箱210的前提下了解HPV杂交捕获反应的进程。
实施例二：
实施例二与实施例一不同之处在于：
如图2所示，将待测样品膜放置在三轴移动平台213的载物台上，关闭送物口214。
如图3所示，碱性磷酸酶使酶底物发光，通过照度计212判读光的强弱可确定碱性磷酸酶的含量，从而确定RNA-DNA杂交体的含量，在此基础上，可以初步判断样品主人是否患病。
最后应说明的是：以上实施例仅用于说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明实施例技术方案的精神和范围。

Claims (6)

1.一种用于监测HPV杂交捕获的远程观察系统，其特征在于，所述观察系统包括：
制备系统(1)，所述制备系统(1)用于将原始DNA样本制备成适合检测的杂交体杂交体检测样；
检测系统(2)，所述检测系统(2)不仅能够判断目标DNA的有无，还能够对同一个样品进行连续观察，确定样本中DNA的空间定位信息；
操作系统(3)，所述操作系统(3)为操作人员对于所述观察系统的操作终端；
所述检测系统(2)包括：
摄像部(21)，所述摄像(21)部用于对杂交体检测样的荧光现象进行拍摄，从而记录HPV杂交捕获的具体过程；
成像部(22)，所述成像部(22)能够将光学影像转换为数字信号，便于观察记录；
信息处理部(23)，所述信息处理部(23)能够将收集的信息进行统计分析，对不同样本进行分档存储和统计；
主控制部(24)，所述主控制部(24)用于接受输入指令的同时，对摄像部(21)、成像部(22)、信息处理部(23)进行控制；
所述操作系统(3)包括：
显示终端，所述显示终端接收来自所述成像部(22)和所述信息处理部(23)所传来的信息，并显示给操作人员；
输入终端，所述输入终端用于让操作人员对所述主控制部(24)输入指令，从而控制整个观察系统。
2.如权利要求1所述的一种观察系统，其特征在于，所述杂交体检测样的制备步骤如下：
1)标本组DNA双链被释放并分解为核苷酸单链；
2)取待测样品滴在小片正电荷尼龙膜上；
3)用缓冲液Ⅰ从下方无DNA一面湿润尼龙膜，用紫外交联仪固定DNA，使DNA单链与RNA探针结合为RNA-DNA杂交体；
4)用缓冲液Ⅱ封闭膜上没被探针杂交的区域，再用特异性抗体将RNA-DNA杂交体固定在尼龙膜上；
5)将结合有碱性磷酸酶的多个第二抗体与RNA-DNA杂交体结合；
6)将用缓冲液Ⅲ平衡后的膜置于洁净的疏水性醋酸膜上，均匀添加发光底物后覆上另一张透明膜，排出膜间气泡，使发光底物均匀分布在整个杂交膜上。
3.如权利要求1所述的一种观察系统，其特征在于，所述摄像部(21)包括暗箱(210)，所述暗箱(210)底部设置有用于载物的三轴移动平台(213)，顶部设置有CDD相机(211)和照度计(212)，所述CDD相机(211)包括滤色系统，所述暗箱(210)侧面设置有可开关的送物口(214)。
4.如权利要求2所述的一种观察系统，其特征在于，所述缓冲液Ⅰ含0.1mol/L Tris-Cl，0.1mol/L MaCl，调pH为7.5。
5.如权利要求2所述的一种观察系统，其特征在于，所述缓冲液Ⅱ为以缓冲液Ⅰ配置的浓度为2％的封闭试剂或同样浓度的脱脂奶粉。
6.如权利要求2所述的一种观察系统，其特征在于，所述缓冲液Ⅲ含0.1mol/L Tris，0.1mol/L MaCl，50mmol/L MgCl2，调pH为9.5。
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