CN110279664B - 一种氟苯尼考包合物冻干粉针剂及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种氟苯尼考包合物冻干粉针剂及其制备方法，该包合物冻干粉针剂是将氟苯尼考的甲醇溶液加入羟丙基环糊精的水溶液在30～50℃恒温控制pH为4～6并以100r/min转速振摇后，去除溶剂，经微孔滤膜过滤，经‑30℃预冻4～8h，‑50℃冻干16～24h，干燥，获得的；其中，所述氟苯尼考和羟丙基环糊精的摩尔比为1:1～1:3；所述甲醇溶液的浓度为30～50％；所述羟丙基环糊精的质量浓度为10～20％。本发明的包合物冻干粉针剂显著提高了氟苯尼考在水中的溶解度，改善了其药动学特性，使氟苯尼考更为快速的发挥疗效，且具有更小的注射液刺激性，不溶血，可用于静脉注射。

Description

一种氟苯尼考包合物冻干粉针剂及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种粉针剂，具体涉及一种氟苯尼考包合物冻干粉针剂及其制备方法。
背景技术
氟苯尼考(FF)是一种动物专用的酰胺醇类广谱抗生素，目前在兽医临床上被广泛应用到，如水产鱼类、牛、猪、犬、鸡等畜禽细菌性疾病的治疗。自氯霉素禁止用于动物源性食品动物之后，FF作为可替代氯霉素的同类型广谱抗生素，不仅药理活性高、抗菌谱广还更加安全，现已被广泛应用于养殖业和畜牧业。
然而，在常温下，FF在水中的溶解度很低，约为1.25mg/mL，这大大限制了它的广泛应用。近年来，国内外学者们围绕FF增溶的角度，研制出了许多具有一定价值的FF制剂，如临床常见的FF注射剂(30％、10％和5％)、溶液剂(2％)、可溶性粉剂(10％)和预混剂(5％)等，此外也出现了一些氟苯尼考的新剂型，如氟苯尼考超微粉、氟苯尼考纳米乳、原位凝胶、固体分散体以及水溶性复合物等。
虽然现在集约化规模化养殖对氟苯尼考粉剂的需求量很大，但是氟苯尼考注射剂是其使用较早也是发挥疗效更快的一种速效制剂，因此氟苯尼考注射剂在宠物诊疗中仍然发挥着重要作用。目前，市场上FF注射液的主要规格有(2mL：0.6g、5mL：1g、100mL：30g)，常用的30％FF注射液大都以有机溶剂(二甲基甲酰胺、吡咯烷酮、丙二醇等)配制，会引起局部注射刺激及毒性反应，同时，有机溶剂的加入也增加了使用成本，不仅增加了经济负担，也给兽医临床治疗带来麻烦。
基于上述原因，开发水溶性高或者溶出速率更快且便于工业生产的FF新制剂一直是兽药领域研究的热点。
发明内容
本发明的目的是提供一种氟苯尼考包合物冻干粉针剂及其制备方法，该冻干粉针剂解决了现有氟苯尼考制剂溶解性差及会引起局部注射刺激的问题，能够显著提高氟苯尼考在水中的溶解度，改善其药动学特性，使氟苯尼考更为快速的发挥疗效，且具有更小的注射液刺激性，不溶血，可用于静脉注射。
为了达到上述目的，本发明提供了一种氟苯尼考包合物冻干粉针剂，该包合物冻干粉针剂是将氟苯尼考的甲醇溶液加入羟丙基环糊精的水溶液在30～50℃恒温控制pH为4～6并以100r/min转速振摇后，去除溶剂，经微孔滤膜过滤，经-30℃预冻至少4～8h，-50℃冻干至少16～24h，干燥，获得的；其中，所述氟苯尼考和羟丙基环糊精的摩尔比为1:1～1:3；所述甲醇溶液的浓度为30～50％；所述羟丙基环糊精的质量浓度为10～20％。
优选地，所述微孔滤膜的孔径为0.22μm。
优选地，该包合物冻干粉针剂的载药量为6～13％，包封率为57～95％。
优选地，该包合物冻干粉针剂是将氟苯尼考的甲醇溶液加入羟丙基环糊精的水溶液在30℃恒温控制pH为5.0并以100r/min转速振摇后，去除溶剂，经微孔滤膜过滤，经-30℃预冻至少4h，-50℃冻干至少16h，干燥，获得的；其中，所述氟苯尼考和羟丙基环糊精的摩尔比为1:2；所述甲醇溶液的浓度为50％；所述羟丙基环糊精的质量浓度为20％。
优选地，该包合物冻干粉针剂在37℃时的饱和溶解度为78.93±0.42mg/mL。
优选地，该包合物冻干粉针剂的X射线粉末衍射在2θ为15～20°有宽衍射峰带。
本发明还提供了一种氟苯尼考包合物冻干粉针剂的制备方法，该方法包含：
(1)将氟苯尼考用浓度为30～50％的甲醇溶解，羟丙基环糊精用水溶解，羟丙基环糊精的质量浓度为10～20％，将氟苯尼考的甲醇溶液加入到羟丙基环糊精的水溶液中，得到混合溶液；其中，所述氟苯尼考和羟丙基环糊精的摩尔比为1:1～1:3；
(2)将混合溶液在30～50℃恒温，控制pH为4～6，并以100r/min转速振摇；
(3)将步骤(2)的溶液去除溶剂，经微孔滤膜过滤；
(4)将经过过滤的滤液进行冷冻干燥：-30℃预冻至少4～8h，-50℃冻干至少16～24h，30℃干燥，得到氟苯尼考包合物冻干粉针剂。
优选地，在步骤(3)中，所述微孔滤膜的孔径为0.22μm。
优选地，在步骤(1)中，所述甲醇浓度为50％；所述羟丙基环糊精的质量浓度为20％；所述氟苯尼考和羟丙基环糊精的摩尔比为1:2；在步骤(2)中，所述温度为30℃；在步骤(3)中，所述-30℃预冻4h，-50℃冻干16h，30℃干燥4h。
优选地，所述氟苯尼考包合物冻干粉针剂在37℃时的饱和溶解度为78.93±0.42mg/mL，其载药量为10.87％±0.04，包封率为94.66％±0.39％。
本发明的氟苯尼考包合物冻干粉针剂及其制备方法，解决了现有氟苯尼考制剂溶解性差及会引起局部注射刺激的问题，具有以下优点：
(1)本发明的冻干粉针剂，显著提高了原药在37℃水中的溶解度，能够达到原药的35.4倍，物理混合物的4.5倍，而且改善了FF的药动学特性，其在体内达峰时间显著性早于市售的注射液，其分布半衰期显著快于市售的注射液，且消除半衰期显著性慢于市售的注射液，可以使氟苯尼考更为快速的发挥疗效，且持效更久，提高了生物利用度，具有较强的临床应用价值；
(2)本发明的冻干粉针剂，与市售10％FF普通注射液相比，具有更小的注射液刺激性，可以减轻注射时对动物产生疼痛，降低了给药难度，方便宠物临床使用，可以肌肉注射；而市售10％FF普通注射液因为含有有机溶剂会引起肌肉充血，且有明显坏死灶出现；
(3)本发明的冻干粉针剂，不会引起溶血和红细胞凝聚，可以静脉注射，而市售10％FF普通注射液会发生明显溶血；
(4)本发明的冻干粉针剂，既可以肌肉注射，也可以静脉注射，目前的氟苯尼考环糊精包合物大多只以可溶性粉进行口服使用，没有本品药效迅速；
(5)本发明的冻干粉针剂，按照《中国兽药典》2015版热原检查法检测，热原检查符合规定；
(6)本发明的冻干粉针剂的制备方法，其冻干工艺无需支架剂即可获得溶解迅速的氟苯尼考冻干粉；
(7)本发明的冻干粉针剂的制备方法，工艺简单，适合工业化生产，且经该工艺制备的包合物冻干粉针剂溶解度得到极大改善，该包合物冻干粉针显著增加了氟苯尼考的饱和溶解度，是氟苯尼考原药的35.4倍，是氟苯尼考与环糊精物理混合物的4.5倍；
附图说明
图1为FF、HPCD、PM和冻干粉的1H-NMR谱图。
图2为FF、HPCD、PM以及FF/HPCD包合物的红外光谱图。
图3为FF、HPCD、PM以及FF/HPCD包合物的X射线粉末衍射图谱。
图4为FF、HPCD、PM以及FF/HPCD包合物的差示扫描量热图谱。
图5为FF/HPCD包合物示意图。
图6为各个样品的溶血实验图。
图7为各组大体解剖结果。
图8为各组的病理学诊断结果。
图9为FF注射液和FF/HPCD包合物水溶液在不同时间点的血药浓度曲线。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种氟苯尼考包合物冻干粉针剂，其制备方法具体如下：
(1)称取FF和HPCD，HPCD与FF的摩尔比为1:1；
(2)采用浓度为30％的甲醇溶解FF，适量的水溶解HPCD，HPCD在水溶液中的质量浓度为10％，将完全溶解的FF甲醇溶液缓慢加入到HPCD水溶液中；
(3)将所得混合溶液于恒温水浴振荡器在30℃下振摇2h，搅拌速度为100r/min，反应溶液pH为5.0；
(4)在旋转蒸发仪上将溶剂蒸发完全，再将包合物水溶液用0.22μm微孔滤膜过滤；
(5)置于真空冷冻干燥机中干燥，-30℃预冻4h，-50℃冻干16h，30℃干燥4h，即得氟苯尼考冻干粉针。
实施例1中，经步骤(4)制备的包合物水溶液的载药量为12.92％，包封率为57.60％；经步骤(5)得到的冻干粉针剂外观和复溶性良好，冻干粉为白色、光滑平整，复溶后溶液澄清透明。
实施例2
一种氟苯尼考包合物冻干粉针剂，与实施例1的制备过程基本相同，区别在于：在步骤(1)中，HPCD与FF的摩尔比为2：1；在步骤(2)中，HPCD在水溶液中的质量浓度为15％；在步骤(3)中，温度为50℃。
实施例2中，经步骤(4)制备的包合物水溶液的载药量为10.07％，包封率为86.95％；经步骤(5)得到的冻干粉针剂外观和复溶性良好，冻干粉为白色、光滑平整，复溶后溶液澄清透明。
实施例3
一种氟苯尼考包合物冻干粉针剂，与实施例1的制备过程基本相同，区别在于：在步骤(1)中，HPCD与FF的摩尔比为2：1；在步骤(2)中，HPCD在水溶液中的质量浓度为20％，甲醇的浓度为40％。
实施例3中，经步骤(4)制备的包合物水溶液的载药量为10.12％，包封率为87.40％；经步骤(5)得到的冻干粉针剂外观和复溶性良好，冻干粉为白色、光滑平整，复溶后溶液澄清透明。
实施例4
一种氟苯尼考包合物冻干粉针剂，与实施例1的制备过程基本相同，区别在于：在步骤(1)中，HPCD与FF的摩尔比为2：1；在步骤(2)中，HPCD在水溶液中的质量浓度为20％，甲醇的浓度为50％。
实施例4中，经步骤(4)制备的包合物水溶液的载药量为10.87％±0.04，包封率为94.66％±0.39％；经步骤(5)得到的冻干粉针剂外观和复溶性良好，冻干粉为白色、光滑平整，复溶后溶液澄清透明。
实施例5
一种氟苯尼考包合物冻干粉针剂，与实施例1的制备过程基本相同，区别在于：在步骤(1)中，HPCD与FF的摩尔比为3：1；在步骤(2)中，HPCD在水溶液中的质量浓度为20％，甲醇的浓度为30％；在步骤(3)中，温度为40℃。
实施例5中，经步骤(4)制备的包合物水溶液的载药量为6.36％，包封率为79.09％；经步骤(5)得到的冻干粉针剂外观和复溶性良好，冻干粉为白色、光滑平整，复溶后溶液澄清透明。
实施例6
一种氟苯尼考包合物冻干粉针剂，与实施例1的制备过程基本相同，区别在于：在步骤(5)中，-30℃预冻8h，-50℃冻干24h，30℃干燥4h。
实施例6中，经步骤(5)得到的冻干粉针剂外观和复溶性良好，冻干粉为白色、光滑平整，复溶后溶液澄清透明。
实验例1结构表征
对实施例4制备的氟苯尼考冻干粉针剂(FF/HPCD包合物)进行表征：
(1)核磁共振氢谱(1H-NMR)
釆用Bruker核磁共振波谱仪测定FF、HPCD、PM(物理混合物，FF：HPCD摩尔比为1:2)以及FF/HPCD包合物中各质子的结构参数，所用溶剂为氘代甲醇(CD3OD)，内标物为四甲基硅烷，观察频率均为400MHz，用于测定样品中氢原子化学位移值。如图1所示，为FF、HPCD、PM和冻干粉的1H-NMR谱图，图中A为FF的核磁谱，B为HPCD的核磁谱，C为PM的核磁谱，D为FF/HPCD包合物的核磁谱。
原药FF的1H-NMR的谱中给出了除溶剂外的14个氢(FF本身14个H)，其中4.79ppm和3.21ppm为甲醇溶剂峰，核磁表征数据具体为：1H-NMR(400MHz，CD3OD)δ：2.98(s，3H，CH3)，4.41(q，J1＝8.0Hz，J2＝4.0Hz，J3＝4.0Hz，2H，CH2)，4.53(m，1H，CH)，4.64(dd，J1＝8.0Hz，J2＝8.0Hz，1H，CH)，5.00(d，J＝4.0Hz，1H，OH)，6.12(s，1H，CHCl2)，7.57～7.59(m，2H，Ar-H3,1)，7.79～7.81(dd，J1＝4.0Hz，J2＝4.0Hz，2H，Ar-H6,4)。
HPCD的核磁氢谱图与文献中使用DMSO作溶剂的结果趋于类似，且HPCD质子信号集中在3.4～5.0ppm之间，对原药FF检测信号没有干扰，表明检测结果可信。
为进一步确定FF与HPCD之间的包合形式，现将FF和HPCD的氢谱图分别与FF/HPCD包合物的谱图对比，将其化学位移差Δδ，发现FF分子结构中8～11位的氢原子均有0.01～0.02ppm的化学位移差变化，而其余位置的氢未检测有明显化学位移值的变化，如下表1，由此可以推测，FF是从含有二氯甲基(-CHCl2)结构一侧被包嵌入HPCD的空腔。同时，这些微小的化学位移变化表明二者间以非共价键的形式结合。
表1FF和HPCD的氢谱图分别与FF/HPCD包合物的谱图对比结果
Figure BDA0002149649520000071
Figure BDA0002149649520000072
Figure BDA0002149649520000081
H-3和H-5是构成环糊精空腔内的两个原子，当FF进入HPCD后，由于芳香环的各向异性屏蔽效应使得FF和HPCD腔内氢原子发生相应变化。从HPCD氢谱归属后与FF/HPCD包合物的化学位移值比较可以看出：除了H-5，其余环糊精位置上所有的质子都有一定的化学位移，结合HPCD分子立体结构，H-5在窄端口，H-3在宽端口，此结果说明了，FF分子从宽口端进入HPCD空腔。
(2)红外扫描(FT-IR)
分别称取干燥后的FF、HPCD、PM以及FF/HPCD包合物冻干粉适量，以质量比1：100与KBr粉末混合压片进行红外光谱分析，分辨率4cm-1，扫描范围4000～500cm-1。
如图2所示，为FF、HPCD、PM以及FF/HPCD包合物的红外光谱图，图中A为FF的红外光谱，B为HPCD的红外光谱，C为PM的红外光谱，D为FF/HPCD包合物的红外光谱。从图中可以看出FF/HPCD包合物冻干粉与物理混合物的红外光谱图明显不同。FF(A)在3456cm-1处有-OH伸缩振动峰，在1683cm-1处有-C＝O伸缩振动峰，在1534cm-1处有C-N的伸缩振动峰和-NH的弯曲振动峰，在1274cm-1处有-NH的伸缩振动峰和C-N的弯曲振动峰；HPCD(B)在3393cm-1处有-OH伸缩振动峰；二者物理混合物(C)的红外光谱图为FF和HPCD光谱的叠加；与物理混合物不同的是，在FF/HPCD包合物(D)的红外图谱中可以看出，FF的四个特征峰发生明显减弱或消失。该红外进一步反映了FF被包嵌入HPCD的内腔，表明了FF/HPCD包合物的形成，结合FF结构式可进一步判定，FF分子含有二氯甲基(-CHCl2)结构一侧被包嵌入HPCD的空腔。
(3)X射线粉末衍射(XRD)
X射线粉末衍射分析是检测晶型和非晶型态物质的常用手段，分别称取干燥后的FF、HPCD、PM以及FF/HPCD包合物冻干粉适量进行X射线粉末衍射分析，衍射条件为：室温，铜靶，石墨单色器，光源为CuKα放射线，波长为
Figure BDA0002149649520000082
DS与SS为1°，RS为0.3mm，管电压40kV，管电流25mA，扫描角度为0～50°，扫描速度为0.03°/s。
如图3所示，为FF、HPCD、PM以及FF/HPCD包合物的X射线粉末衍射图谱。从图中可以看出：原药FF在7.92°、16.03°和26.72°的不同衍射角(2θ)处具有高强度特征衍射峰，表明了FF的晶型态；HPCD的衍射结果显示没有明显的特征衍射峰，只是在10°和20°附近有两个较宽衍射峰带，表明了HPCD的无定型态；二者的物理混合物显示为FF和HPCD的叠加，只是因为混合后FF相对含量较低导致特征衍射峰强度下降，说明二者的物理形态没有发生变化；相比之下，FF/HPCD包合物冻干粉显示出与HPCD类似的衍射峰，FF典型的特征衍射峰完全消失，属于无定型态，这可能与FF被包嵌入HPCD的内腔有关。
(4)差示扫描量热(DSC)
称取干燥后的FF、HPCD、PM以及FF/HPCD包合物冻干粉各5mg，置于铝制坩埚内，以氮气为保护，流速：40mL/min，升温速度10℃/min，升温范围0～300℃。
如图4所示，为FF、HPCD、PM以及FF/HPCD包合物的差示扫描量热图谱，从中可以看出，FF在154.64℃有一特征吸热峰(熔点峰)，HPCD在279.71℃有一吸热峰；物理混合物在附近温度有2个吸热峰，为二者吸热峰的叠加；而FF/HPCD包合物冻干粉与物理混合物不同，在154℃附近没有FF的特征吸热峰，只有HPCD的一个特征吸热峰。结果表明：FF与HPCD形成了包合物，成为了一种新的无定型态物相。
结合上述各项表征结果可知，FF被成功包嵌入HPCD的空腔内，且FF分子的二氯甲基(-CHCl2)结构一侧是从HPCD的宽口端(H-3)进入内腔，而FF磺酰基一侧在环糊精的腔外，二者经包合形成的FF/HPCD包合物示意图如图5所示。
实验例2溶解度测定
对实施例4制备的氟苯尼考冻干粉针剂(FF/HPCD包合物)进行溶解度测定，具体如下：
将过量的FF/HPCD包合物冻干粉制剂样品加入到含有适量超纯水的西林瓶中，置于37℃水浴振荡器中振摇48h，采用0.45μm微孔滤膜过滤上清液，稀释合适倍数后按照HPLC法测定包合物溶液中FF的饱和溶解度。
同时，以FF原料药和PM物理混合物(FF：HPCD摩尔比为1:2)为对照，各批次样品在37℃时的饱和溶解度如表2所示。由表可知，FF、物理混合和包合物冻干粉的饱和溶解度分别为2.23±0.04mg/mL、17.75±0.22mg/mL和78.93±0.42mg/mL。结果表明，FF/HPCD包合物冻干粉制剂显著增加了FF的饱和溶解度，是原药的35.4倍，是物理混合物的4.5倍。
表2氟苯尼考、物理混合物和包合物冻干粉在纯水中的饱和溶解度(n＝3)
Figure BDA0002149649520000101
实验例3热原检查
对实施例4制备的氟苯尼考冻干粉针剂(FF/HPCD包合物)进行热原检查，具体如下：
按照《中国兽药典》2015版热原检查法中的家兔法进行本品的热原检查。热原检查法测定家兔的体温变化情况如表3所示，从表中数据可以看出，静脉注射规定剂量的供试品溶液后，3只家兔体温升高均低于0.6℃，且三只家兔体温升高总和为1.1℃，低于《中国兽药典》2015年版热原检查法中规定的1.3℃，结合上述结果判定该制剂的热原检查符合规定。
表3本发明的包合物冻干粉的热原检查结果
Figure BDA0002149649520000102
实验例4溶血性检查
对实施例4制备的氟苯尼考冻干粉针剂(FF/HPCD包合物)进行溶血性检查，具体如下：
精密称取FF/HPCD包合物冻干粉用生理盐水配制成含FF 5mg/mL的溶液，作为供试品。另配制FF 5mg/mL的氟苯尼考普通注射液作为阳性对照。取洁净试管7只，进行编号，其中1～5号为FF/HPCD包合物供试品管，6号为阴性对照管(只加生理盐水)，7号为氟苯尼考普通注射液(5mg/mL)，按表4所示依次加入2％红细胞悬液、0.9％氯化钠溶液或蒸馏水，混匀后，立即将各试管置于37℃的恒温箱中进行温育。开始每隔15min肉眼观察一次，1h以后，每隔1h观察一次，持续观察3h。
表4溶血性试验设计
Figure BDA0002149649520000111
如图6所示，为各个样品的溶血实验图，7号管氟苯尼考普通注射液发生明显溶血，6号管阴性对照既没有发生溶血现象也没有发生红细胞凝聚现象，1～5号管为滴加了不同浓度FF/HPCD包合物溶液的供试品管，肉眼观察3h，各管均无溶血现象和红细胞凝聚现象发生。本试验结果表明，FF/HPCD包合物冻干粉较普通注射液具有更好的安全性，不会引起溶血，可以作为静脉注射使用。
实验例5肌肉注射刺激性试验
对实施例4制备的氟苯尼考冻干粉针剂(FF/HPCD包合物)进行肌肉注射刺激性试验，具体如下：
取体重2.5±0.2kg的实验兔6只，随机分成A、B两组。采用单次给药刺激后同体自身对照法，按照含氟苯尼考20mg/mL的剂量，在A组实验兔左侧肌肉注射FF/HPCD包合物的水溶液，右侧肌肉注射等体积无菌生理盐水；B组实验兔左侧肌肉注射普通市售10％FF普通注射液，右侧肌肉注射等体积无菌生理盐水。每天给药一次，连续给药三天，末次给药后48h处死各实验兔，解剖腿部肌肉。肉眼观察注射部位刺激反应，并取出肌肉组织做病理学检查。
剖检观察：观察注射部位及其周围组织的变化，是否有红肿、变性、充血、坏死等局部刺激症状，按照“肌肉剖检评分标准”(见表5)进行评分，初步判断刺激等级。
病理学检查：4％多聚甲醛固定股四头肌，垂直横切肌纤维，脱水，石蜡包埋，切片，HE染色，光镜下观察有无肌纤维变性或坏死、炎性细胞浸润、间质水肿或出血等显著性刺激反应。
表5肌肉刺激反应评级标准
Figure BDA0002149649520000121
如图7所示，为各组大体解剖结果，从图中可以看出：注射了无菌生理盐水(图中A)和包合物冻干粉针水溶液(图中B)的肌肉可见轻度充血的注射位点，其余无明显的刺激反应；而注射了市售10％FF普通注射液(图中C)的肌肉充血明显，且有明显坏死灶出现，范围在0.5×1.0cm以上，根据肌肉刺激评级标准判定为2级。
如图8所示，为各组的病理学诊断结果，图中A-1为生理盐水组(×100)，图中A-2为生理盐水组(×400)，图中B-1为冻干粉针组(×100)，图中B-2为冻干粉针组(×400)，图中C-1为普通注射液组(×100)，图中C-2为普通注射液组(×400)，结果如下：
生理盐水组：如图8中A-1和A-2所示，肌肉组织内肌纤维排列整齐、肌束结构清晰、边界分明、细胞核呈圆形或椭圆形、染色质少、核仁明显；未见明显的肌纤维萎缩、肥大、坏死、纤维组织增生及炎性细胞浸润。
包合物冻干粉针组：如图8中B-1和B-2所示，肌肉组织内肌纤维排列整齐、肌束结构清晰、边界分明、细胞核呈圆形或椭圆形、染色质少、核仁明显，偶见部分肌纤维胞质染色不均；其中1例(1/3)可见少量肌纤维发生萎缩、坏死(图中箭头)；未见明显的纤维组织增生及炎细胞浸润。
普通注射液组：如图8中C-1和C-2所示，肌肉出现不同程度的局灶性的刺激性反映，肌束结构模糊，边界不清，部分肌肉坏死(图中箭头)，其中可见细胞核固缩、残存的红色淡染的细胞浆、肌肉片状坏死区域内有大量成纤维细胞增生；坏死区域和周围的肌肉间质间未见明显的炎细胞浸润，可见少量嗜酸性粒细胞浸润(图中箭头)。
实验例6药代动力学研究
对实施例4制备的氟苯尼考冻干粉针剂(FF/HPCD包合物)进行体内药代动力学研究，具体如下：
将12只比格犬，随机分成两组，雌雄各半，分别对后肢肌肉注射市售10％FF普通注射液和FF/HPCD包合物冻干粉水溶液，给药剂量为20mg/kg(均以FF计)。一次性给药后，采用带有肝素钠的真空管按0h、0.167h、0.333h、0.5h、0.75h、1h、1.5h、2h、3h、4h、6h、8h、10h、12h和24h分别进行犬臂头静脉采血，将血液置于SC-3614型低速离心机中离心5min，转速为4000r/min，取上层血浆进行样品处理测定氟苯尼考的含量。
比格犬肌肉注射市售10％FF注射液和FF/HPCD包合物水溶液后，不同时间点所对应的血药浓度见表6和图9，由表和图可知，比格犬给药后血药浓度迅速上升，两组均在0.5h左右达到峰值，但是包合物组的达峰时间早于市售组，且达峰浓度和药时曲线下面积均大于市售组。
表6比格犬肌注FF注射液和FF/HPCD包合物水溶液后不同时间点的血药浓度
Figure BDA0002149649520000131
Figure BDA0002149649520000141
将所得到的药代动力学数据经DAS 2.0软件进行处理，得到适合模拟FF在犬体内的药代动力学特性的模型，并计算相关的药代动力学参数，并采用SPSS 20.0对各个参数进行方差分析，多重比较采用LSD法。
经药动学软件DAS 2.0对数据进行拟合后表明本实验的药动学数据符合一级吸收二室模型，两种药物的主要药动学参数及其差异显著性检验结果见表7。由表可知包合物组的达峰浓度(Cmax)为15.896±3.147mg/L，显著性高于市售组的11.559±1.544mg/L(P＜0.05)；包合物组的达峰时间(Tmax)为0.444±0.086h，显著性早于市售组的0.583±0.129h(P＜0.05)；二者的分布半衰期(t1/2α)分别为0.288±0.070H和0.773±0.080H，说明两种制剂在比格犬体内的分布均较快，但市售组显著性慢于包合物组(P＜0.05)；两种制剂的消除半衰期(t1/2β)分别为1.923±0.151H和0.982±0.188H，表明包合物组消除半衰期显著性慢于市售组(P＜0.05)。
表7氟苯尼考注射液组和FF/HPCD包合物冻干粉组的药代动力学参数
Figure BDA0002149649520000142
Figure BDA0002149649520000151
备注：*表示与市售组相比差异显著(P＜0.05)，**表示与市售组相比差异极显著(P＜0.01)，未标注表示与市售组相比差异不显著。
综上所述，与市售普通注射液组相比，包合物组显著性加快了FF的吸收速率(P＜0.05)，显著增加了FF的达峰浓度(P＜0.05)，这说明将FF制成包合物冻干粉针剂以后，可以达到增加原药吸收速率和达峰浓度的目的，且从一定程度上增加了市售注射液的相对生物利用度。
尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。

Claims (10)

1.一种氟苯尼考包合物冻干粉针剂，其特征在于，该包合物冻干粉针剂是将氟苯尼考的甲醇溶液加入羟丙基环糊精的水溶液在30~50℃恒温控制pH为5并以100r/min转速振摇后，去除溶剂，经微孔滤膜过滤，经-30℃预冻4~8h，-50℃冻干16~24h，干燥，获得的；其中，所述氟苯尼考和羟丙基环糊精的摩尔比为1:2；所述甲醇溶液的浓度为30~50%；所述羟丙基环糊精的质量浓度为10~20%。
2.根据权利要求1所述的氟苯尼考包合物冻干粉针剂，其特征在于，所述微孔滤膜的孔径为0.22μm。
3.根据权利要求1所述的氟苯尼考包合物冻干粉针剂，其特征在于，该包合物冻干粉针剂的载药量为6~13%，包封率为57~95%。
4.根据权利要求1所述的氟苯尼考包合物冻干粉针剂，其特征在于，该包合物冻干粉针剂是将氟苯尼考的甲醇溶液加入羟丙基环糊精的水溶液在30℃恒温控制pH为5.0并以100r/min转速振摇后，去除溶剂，经微孔滤膜过滤，经-30℃预冻至少4h，-50℃冻干至少16h，干燥，获得的；其中，所述氟苯尼考和羟丙基环糊精的摩尔比为1:2；所述甲醇溶液的浓度为50%；所述羟丙基环糊精的质量浓度为20%。
5.根据权利要求4所述的氟苯尼考包合物冻干粉针剂，其特征在于，该包合物冻干粉针剂在37℃时的饱和溶解度为78.93±0.42 mg/mL。
6.根据权利要求1~5中任意一项所述的氟苯尼考包合物冻干粉针剂，其特征在于，该包合物冻干粉针剂的X射线粉末衍射在2θ为15~20°有宽衍射峰带。
7.一种氟苯尼考包合物冻干粉针剂的制备方法，其特征在于，该方法包含：
（1）将氟苯尼考用浓度为30~50%的甲醇溶解，羟丙基环糊精用水溶解，羟丙基环糊精的质量浓度为10~20%，将氟苯尼考的甲醇溶液加入到羟丙基环糊精的水溶液中，得到混合溶液；其中，所述氟苯尼考和羟丙基环糊精的摩尔比为1:2；
（2）将混合溶液在30~50℃恒温，控制pH为5，并以100r/min转速振摇；
（3）将步骤（2）的溶液去除溶剂，经微孔滤膜过滤；
（4）将经过过滤的滤液进行冷冻干燥：-30℃预冻4~8h，-50℃冻干16~24h，30℃干燥，得到氟苯尼考包合物冻干粉针剂。
8.根据权利要求7所述的氟苯尼考包合物冻干粉针剂的制备方法，其特征在于，在步骤（3）中，所述微孔滤膜的孔径为0.22μm。
9.根据权利要求7所述的氟苯尼考包合物冻干粉针剂的制备方法，其特征在于，在步骤（1）中，所述甲醇浓度为50%；所述羟丙基环糊精的质量浓度为20%；在步骤（2）中，所述温度为30℃；在步骤（3）中，所述-30℃预冻4h，-50℃冻干16h，30℃干燥4h。
10.根据权利要求9所述的氟苯尼考包合物冻干粉针剂的制备方法，其特征在于，所述氟苯尼考包合物冻干粉针剂在37℃时的饱和溶解度为78.93±0.42 mg/mL，其载药量为10.87%±0.04，包封率为94.66%±0.39%。
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