CN110272914A - 一种双荧光GLUTs示踪质粒、其制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种双荧光GLUTs示踪质粒、其制备方法及其应用，双荧光GLUTs示踪质粒，包括GLUTs基因片段、mCherry基因和pEGFP‑C1质粒片段；制备方法包括：将GLUTs基因片段插入线性pEGFP‑C1质粒片段的步骤；以及，将mCherry基因插入线性pEGFP‑C1质粒片段的步骤；其应用将双荧光GLUTs示踪质粒转染细胞，然后以激发光激发，观察其显色情况，得到GLUTs在细胞中的定位；双荧光GLUTs示踪质粒，是一种荧光稳定融合、细胞毒性小、定位准确、特异性高、应用简单、价格低廉并能无限扩增的质粒，可示踪GLUTs在细胞亚结构的动态定位。

Description

一种双荧光GLUTs示踪质粒、其制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及一种双荧光GLUTs示踪质粒、其制备方法及其应用，属于生物检测技术领域。

背景技术

GLUT蛋白家族(GLUTs)由SLC2基因编码，属于主要协助转运蛋白超家族(MFS)成员。在结构上，GLUTs具有12个跨膜区段，一个单一的N端连接糖基化位点，以及一个相对较大的中央细胞质接头结构域。目前已知GLUTs包含14种GLUT蛋白，基于序列同源性和结构相似性分成三个主要类别：I类包括GLUTs(1-4和14)，对葡萄糖具有相对高的特异性；II类包括GLUTs(5,7,9和11)，对果糖具有相对高的特异性；III类包括GLUTs(6,8,10,12和13)，为GLUTs结构非典型成员。GLUTs在人各种类型细胞普遍表达，其分布具有组织特异性和对葡萄糖亲和力的可变性。在功能上，GLUTs通过不依赖能量方式介导细胞内外以及细胞亚结构之间的葡萄糖跨膜双向转运，维持正常细胞代谢。由于葡萄糖转运在细胞代谢和信号传导的关键作用，GLUTs的功能异常与各种疾病密切相关，例如GLUT1缺乏综合征(GLUT1-DS)，Fanconi-Bickel综合征，2型糖尿病和阿尔茨海默病等。值得注意的是，由于Warburg效应，GLUTs在不同类型的实体肿瘤中高表达，进而促进葡萄糖摄取急剧增加，以补偿肿瘤糖酵解产生的低效能ATP；针对潜在癌症诊断或抗癌治疗开发的GLUTs过表达已引起越来越多的关注。基于GLUTs在糖代谢研究中的重要地位，其在不同条件刺激下细胞定位及表达是目前代谢相关研究的热点。目前对GLUTs在细胞内定位及表达水平的研究多采用免疫荧光、质膜分离等技术检测，由于GLUTs的是一种多次跨膜转运蛋白，以上检测技术存在定位模糊、非特异性着色、分离难度大、实验周期长和费用昂贵等缺点；此外，单一荧光蛋白标记质粒只能观察G LUTs在细胞的大体分布而不能直观反映其在细胞的定位改变，因而限制了GL UTs在细胞糖代谢及相关信号传导的深入研究；而现有的双荧光蛋白标记技术仅实现靶基因表达的精准定量检测，无法实现mCherry、EGFP与目的蛋白三者的融合表达，无法示踪GLUTs在细胞亚结构的动态定位。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的第一个目的在于提供一种双荧光GLU Ts示踪质粒，是一种荧光稳定融合、细胞毒性小、定位准确、特异性高、应用简单、价格低廉并能无限扩增的质粒，可示踪GLUTs在细胞亚结构的动态定位。

本发明的第二个目的在于提供一种上述双荧光GLUTs示踪质粒的制备方法，该制备方法简单，稳定性高，可系统化生产。

本发明的第三个目的在于提供一种上述双荧光GLUTs示踪质粒的应用，在转染含GLUTs基因片段的双荧光GLUTs示踪质粒，观察其显色情况，可以得知GLUTs在细胞中的定位。

实现本发明的第一个目的可以通过采取如下技术方案达到：一种双荧光GL UTs示踪质粒，包括GLUTs基因片段、mCherry基因和pEGFP-C1质粒片段；mCherry基因的序列如SEQID NO.1所示；pEGFP-C1质粒片段如SEQ ID NO.2所示。

进一步地，GLUTs基因片段为GLUT1基因片段或GLUT3基因片段；GLU T1基因片段的序列如SEQ ID NO.3所示；GLUT3基因片段的序列如SEQ ID NO.4所示。

实现本发明的第二个目的可以通过采取如下技术方案达到：一种如上所述的双荧光GLUTs示踪质粒的制备方法，包括：

将GLUTs基因片段插入线性pEGFP-C1质粒片段的步骤；以及，将mCher ry基因插入线性pEGFP-C1质粒片段的步骤。

进一步地，将GLUTs基因片段插入线性pEGFP-C1质粒片段的步骤为：将GLUTs基因进行Xhol及KpnI双酶切，得到GLUTs基因片段；将GLUTs基因片段插入pEGFP-C1质粒片段中，得到pEGFP-GLUTs质粒。

进一步地，GLUTs基因片段为GLUT1基因片段；

GLUT1基因片段进行Xhol及KpnI双酶切的引物为：

GULT1-Xhol-F：TAAACTCGAGACATGGAGCCCAGCAGCAAGAAG；

GULT1-KpnI-R：CTGGTACCTGGTGATCTGGGGCGACTCAC。

进一步地，GLUTs基因片段为GLUT3基因片段；

GLUT3基因片段进行Xhol及KpnI双酶切的引物为：

GLUT3-XhoI-F：TAAACTCGAGCGATGGGGACACAGAAGGT；

GLUT3-KpnI-R：CTGGTACCGAGGTGGAAGGAGGCACGACT。

进一步地，将pEGFP-C1质粒进行Xhol及KpnI双酶切，回收4700bp的质粒片段，得到pEGFP-C1质粒片段。

进一步地，将mCherry基因插入线性pEGFP-C1质粒片段的步骤为：将mC herry基因插入含有GLUTs基因片段的线性pEGFP-C1质粒片段中，得到双荧光GLUTs示踪质粒。

实现本发明的第三个目的可以通过采取如下技术方案达到：一种双荧光GL UTs示踪质粒的应用，双荧光GLUTs示踪质粒包括GLUTs基因片段、mCherr y基因和pEGFP-C1质粒片段；将双荧光GLUTs示踪质粒转染细胞，然后以激发光激发，观察其显色情况，得到GLUTs在细胞中的定位。

进一步地，显色情况为绿色或黄色，为GLUTs在细胞的质膜或内吞体定位；显色情况为红色，为GLUTs在细胞的溶酶体定位。

本发明的设计原理如下：

本发明设计一种双荧光GLUTs示踪质粒，由pH敏感型荧光蛋白(EGFP)和酸性稳定荧光蛋白(mCherry)示踪GLUTs的在细胞内定位。EGFP通过对野生型GFP蛋白进行S65T和F64L的突变而获得稳定激发峰488nm/发射峰509n m(绿色)，且在37℃稳定折叠的增强型GFP，在细胞的溶酶体内部酸性环境可导致其淬灭。mCherry为第二代单体荧光蛋白，较其他红色荧光蛋白具有光稳定性、细胞毒性低等特点，是很好的示踪标签。以上两种荧光蛋白均能融合其他目的蛋白而不影响荧光基团的表达，因此通过融合表达mCherry、EGFP和G LUTs构建双荧光示踪质粒，用于标记及示踪GLUTs在细胞内定位及表达。其原理在于当GLUTs定位在细胞膜和细胞质等非酸性环境中，通过荧光显微镜能检测来自mCherry表达的红色荧光和来自EGFP表达的绿色荧光，当GLUTs定位在溶酶体等酸性环境时，由于EGFP发生淬灭，而mCherry仍然稳定表达，因此荧光显微镜只能检测红色荧光。基于此，本发明构建双荧光GLUTs示踪质粒，能直观、简便、快速示踪GLUTs在细胞内“质膜-内吞体-溶酶体”或“质膜-内吞体-质膜”定位及表达的动态改变，为GLUTs相关基础研究及GLUTs靶向药物研究提供新的研究工具。

相比现有技术，本发明的有益效果在于：

1、本发明双荧光GLUTs示踪质粒可以清晰得知GLUTs在细胞中的定位及表达水平的改变，操作简单、特异性高；

2、本发明双荧光GLUTs示踪质粒的制备方法简单，稳定性高，可系统化生产；

3、本发明双荧光GLUTs示踪质粒应用操作简单，观察其显色情况，可以得知GLUTs在细胞中的定位。

附图说明

图1为实施例5对照组EGFP绿色荧光的细胞定位分布；

图2为实施例5试验组EGFP绿色荧光的细胞定位分布；

图3为实施例5对照组mCherry红色荧光的细胞定位分布；

图4为实施例5试验组mCherry红色荧光的细胞定位分布；

图5为实施例5对照组的荧光图像叠加；

图6为图5方框处的放大图；

图7为实施例5试验组的荧光图像叠加；

图8为图7方框处的放大图；

图9为实施例6无糖细胞培养基下的EGFP绿色荧光的细胞定位分布；

图10为实施例6完全培养基下的EGFP绿色荧光的细胞定位分布；

图11为实施例6无糖细胞培养基下的mCherry红色荧光的细胞定位分布；

图12为实施例6完全培养基下的mCherry红色荧光的细胞定位分布；

图13为实施例6无糖细胞培养基下的荧光图像叠加；

图14为实施例6完全培养基下的荧光图像叠加。

具体实施方式

下面，结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述：

一种双荧光GLUTs示踪质粒，包括GLUTs基因片段、mCherry基因和pE GFP-C1质粒片段；mCherry基因的序列如SEQ ID NO.1所示；pEGFP-C1质粒片段如SEQ ID NO.2所示；

其中GLUTs基因片段为GLUT1基因片段或GLUT3基因片段，GLUT1基因片段的序列如SEQ ID NO.3所示；GLUT3基因片段的序列如SEQ ID NO.4所示。

目前已知GLUTs家族包含14种GLUT蛋白，其中GLUT1和GLUT3为I型经典葡萄糖转运蛋白。在广泛的GLUT1和GLUT3研究中发现，GLUT1在大多数细胞的均有表达，已经发现肿瘤的沃伯格效应、阿尔茨海默病、癫痫、脑缺血、骨关节炎及巨噬细胞极化等均与其在细胞的细胞膜-溶酶体转位或表达水平的改变导致糖代谢异常有关。GLUT3目前广受关注的葡萄糖转运蛋白，据文献报导，妊娠糖尿病、子痫前期、脑缺血及胰岛素瘤均能检测GLUT3表达水平的改变，此现象与其在细胞内的定位是否有关是亟待探讨的问题。

双荧光GLUTs示踪质粒的制备方法如下：

1)将pEGFP-C1质粒进行Xhol及KpnI双酶切，回收4700bp的质粒片段，得到pEGFP-C1质粒片段；

2)将GLUTs基因进行Xhol及KpnI双酶切，得到GLUTs基因片段；将G LUTs基因片段插入pEGFP-C1质粒片段中，得到线性pEGFP-GLUTs质粒；

3)将mCherry基因插入线性pEGFP-GLUTs质粒中，得到双荧光GLUTs示踪质粒。

上述双荧光GLUTs示踪质粒的应用方式为：将双荧光GLUTs示踪质粒转染细胞，然后以激发光激发，观察其显色情况，显色情况为绿色或黄色，为GL UTs在细胞的质膜或内吞体定位；显色情况为红色，为GLUTs在细胞的溶酶体定位。

实施例1：

GLUT1基因片段和GLUT3基因片段的获得：

1)合成引物：

设计带酶切位点引物：

GULT1-Xhol-F：TAAACTCGAGACATGGAGCCCAGCAGCAAGAAG，

GULT1-KpnI-R：CTGGTACCTGGTGATCTGGGGCGACTCAC，

GLUT3-XhoI-F：TAAACTCGAGCGATGGGGACACAGAAGGT，

GLUT3-KpnI-R：CTGGTACCGAGGTGGAAGGAGGCACGACT，

引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

2)设置PCR扩增体系及程序：

HEK293T细胞cDNA为模板，配制PCR扩增体系，分别扩增目的基因GU LT1和GLUT3，PCR扩增体系(100μL)如下：

PCR扩增程序：

95℃5min；

95℃30s，50℃30s，72℃1.5min，共35个循环；

72℃5min；

4℃1h。

3)回收：

PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳(120V，30min)，紫外灯下从电泳胶切下1500bp位置的核酸条带，胶回收试剂盒B518131(生工生物工程(上海)股份有限公司)分别回收目的基因GULT1或GLUT3：

①称量切下的电泳胶为0.3g，加入900μL buffer B2，50℃，8min直至胶溶解；

②将溶胶液移入吸附柱中，8000×g离心30s，倒掉收集管中液体；

③加入500μL Wash Solution(已按说明书加入无水乙醇)，9000×g离心30s，倒掉收集管中液体；

④重复③一次；

⑤空吸附柱于9000×g离心3min；

⑥将吸附柱转移到干净的1.5mL离心管中，静置5min，加入65℃无核酶水50μL，室温静置1min，9000×g离心1min；

⑦nonodrop测定回收的GLUT1或GLUT3基因的浓度。

4)Xhol及KpnI双酶切：

GULT1或GLUT3基因经Xhol及KpnI双酶切反应，经产物回收试剂盒(B518141，生工生物工程(上海)股份有限公司)回收酶切产物，具体操作如下：

①GULT1或GLUT3基因进行Xhol及KpnI双酶切反应(37℃，3h)体系如下：

②待双酶切反应结束后，向体系加入150μL buffer B2充分混匀；

③将上混合液移入吸附柱中，8000×g离心30s，倒掉收集管中液体；

④加入500μL Wash Solution(已按说明书加入无水乙醇)9000×g离心30s，倒掉收集管中液体；

⑤重复上④一次；

⑥空吸附柱于9000×g离心3min；

⑦将吸附柱转移到干净的1.5mL离心管中，静置5min，加入65℃无核酶水30μL，室温静置1min，9000×g离心1min；

⑧nonodrop测定回收双酶切后的GLUT1或GLUT3基因片段浓度，-20℃暂存待用。

实施例2：

pEGFP-C1质粒片段的获得：

1)pEGFP-C1(Clontech，6084-1)质粒进行Xhol及KpnI双酶切反应(37℃，3h)体系如下：

2)双酶切反应结束后，加入2uL CIP(NEB，M0290V)处理1h，进行载体末端去磷酸化，以防自连。

3)上述反应产物经1％琼脂糖凝胶电泳(120V，30min)，紫外灯下从电泳胶切下约4700bp位置的核酸条带，胶回收试剂盒(B518131，生工生物工程(上海)股份有限公司)回收目的基因具体操作如下：

①称量切下的电泳胶为0.3g，加入900μL buffer B2，50℃，8min直至胶溶解；

②将溶胶液移入吸附柱中，8000×g离心30s，倒掉收集管中液体；

③加入500μL Wash Solution(已按说明书加入无水乙醇)9000×g离心30s，倒掉收集管中液体；

④重复③一次；

⑤空吸附柱于9000×g离心3min；

⑥将吸附柱转移到干净的1.5mL离心管中，静置5min，加入65℃无核酶水50μL，室温静置1min，9000×g离心1min；

⑦nonodrop测定线性化pEGFP-C1质粒片段浓度为25ng/μL。

实施例3：

绿色单荧光质粒pEGFP-GLUT1或pEGFP-GLUT3的构建：

1)实施例1获得的GLUT1或GLUT3基因片段与实施例2获得的线性化p EGFP-C1质粒片段连接(25℃，1h)，连接反应体系如下：

2)连接产物转化及抗性筛选：

①-80℃冰箱取出大肠杆菌感受态DH5a，置于冰上解冻；

②取100μL大肠杆菌感受态细胞，加入以上步骤1)得到的连接产物，冰上孵育30min；

③42℃热激90s，马上放回冰上，冰浴5min；

④加500μL LB培养基(1％胰蛋白胨，1％氯化钠，0.5％酵母)，于37℃摇床慢摇(150rpm)培养50min；

⑤3000rpm，离心5min，剩100μL培养基，取80μL涂在含卡那霉素的LB固体培养板(1％胰蛋白胨，1％氯化钠，0.5％酵母，细菌Agar1.5％，卡那霉素50mg/mL)上，37℃倒置培养过夜；

⑥第二天分别挑取5个单菌落到500μL含卡那霉素的LB液体培养基(卡那霉素50mg/mL，1％胰蛋白胨，1％氯化钠，0.5％酵母)，37℃，200rpm培养3-4h；

⑦菌液送生工生物工程(上海)股份有限公司，以载体通用引物pEGFP-C5，pEGFP-C3进行双向测序；

⑧比对测序结果证实pEGFP-GLUT1或pEGFP-GLUT3质粒已构建成功。

实施例4：

双荧光GLUT1示踪质粒或双荧光GLUT3示踪质粒的构建：

1)mCherry基因的获得：

设计带酶切位点扩增产物：

mCherry-Age1-F：TCACCGGTTGCCACCATGGTGAGCAAGG；

mCherry-Age1-R：TCACCGGTCTTGTACAGCTCGTCCATGCC，以质粒P LVX-T2A-mCherry-Puro为模板，PCR技术扩增mCherry基因，扩增体系和程序参照实施例1。

2)pEGFP-GLUT1或pEGFP-GLUT3质粒进行Age1酶切反应，使用限制性内切酶Agel，酶切反应及胶回收参照实施例2。

3)mCherry基因和pEGFP-GLUT1或pEGFP-GLUT3质粒的连接和验证：

参照实施例3。

4)去内毒素质粒提取(去内毒素质粒提取试剂盒，D6915B，Omega)具体步骤如下：

①菌株扩增：测序结果正确的菌液进行大量扩增，在容积为1L的锥形培养瓶中加入100mL含卡那霉素的LB培养基，加入含目的质粒的单克隆菌100μL，置37℃，200rpm培养培养12-16h；

②菌液裂解：取100mL菌液4,500×g室温离心10min收集菌体沉淀，小心去除上清液，加5mL预冷的SolutionⅠ/RNase A，用移液枪上下吹打重悬菌体。加5 Ml SolutionⅡ，轻柔颠倒10-15次混匀，以得到澄清的裂解液，整个过程不超过3min，加2.5mL预冷的BufferN3，轻轻颠倒充分混匀几次直至白色絮状沉淀出现，室温放置2min，期间偶尔颠倒混合，以使其充分反应；

③质粒的去内毒素处理：将②得到的裂解液及沉淀全部转移至2mL离心管中，12,000×g室温离心10min，将上清液转移至新的15mL离心管中。在上清液中加入0.1体积的冰冷ETR溶液(蓝色)，倒置试管7-10次混合，在冰上孵育10-20min，在孵育过程中，将试管倒置几次。加入ETR溶液后，溶出物应呈浑浊状，但在冰上孵育后应变清，将裂解液在42℃孵育5min，裂解液应再次出现浑浊，以4000×g离心5min，ETR溶液将在管的底部形成一层蓝色，小心地将顶部的水相转移到一个新的15mL管中；

④质粒的纯化与浓缩：向上述溶液中加入0.5体积的无水乙醇，轻轻摇晃6-8次，室温孵育2min，用HiBind DNA Midi柱纯化质粒DNA，将HiBind DN A Midi柱放入15mL的收集管中，在离心柱中加入1mL的平衡缓冲液(GPS)，室温孵育5min，以4500×g，离心3min，将前述的质粒混合溶液加入3.5mL到H iBind DNA Midi柱中，以4500×g离心3min，弃收集管液体，反复此操作，将剩余的质粒混合液溶液加入离心柱中，直到所有质粒混合液都过柱，向DNA Midi柱中加入3mL缓冲液HB，4500×g离心3min，弃收集管液体，DNA Midi柱以3.5mLDNA洗涤缓冲液清洗2次，离心同前，以4500×g离心空柱15min，使柱基质干燥，将DNA Midi柱转移到新的15mL离心管中，室温干燥15min，用300uL预加热(72℃)TE buffer加入离心柱中，室温静置5min，以4000×g离心5min以洗脱DNA；

⑤nanodrop测定双荧光GLUT1示踪质粒或双荧光GLUT3示踪质粒的浓度。

实施例5：

双荧光GLUT1示踪质粒的应用：

据文献报道，BRD4通过转录调控GLUT1的表达，本实施例对调控的方式进行进一步的探讨。

①取对数生长期的SW1353细胞，以2×10⁵个细胞接种于15mm的玻璃皿细胞培养皿(NEST，Cat.No.：801002)中；

②24h后观察细胞融合度达80％，弃培养基，加入900μL无血清DMEM，配制靶向敲低BRD4的小干扰RNA转染体系(100μL DMEM+30pmol siBRD4+6μL Lipo3000)，阴性对照体系(100μL DMEM+30pmol sic+6μL Lipo3000)，质粒转染体系(100μL DMEM+2μg实施例4得到的双荧光GLUT1示踪质粒+6μL Lipo3000)，转染体系慢速震荡混匀后静置孵育20min，对照组为在无血清DMEM中加入阴性对照体系和质粒转染体系，试验组为在无血清DMEM中加入小干扰RNA转染体系和质粒转染体系；

③转染5h后换完全培养基，继续培养36h；

④激光共聚焦显微镜以488nm激发光激发，观察EGFP绿色荧光的细胞定位分布(对照组如图1所示，试验组如图2所示)，激光共聚焦显微镜以580n m激发光激发，观察mCherry红色荧光的细胞定位分布(对照组如图3所示，试验组如图4所示)，图像叠加分析GLUT1在细胞的定位及表达情况(对照组如图5所示，图中方框的放大图如图6所示，试验组如图7所示，图中方框的放大图如图8所示)。质膜及内吞体定位的GLUT1显示为绿色或黄色，而酸性溶酶体定位的GLUT1主要为红色。结果显示，敲低BRD4显著增加细胞内红色点状荧光数量，提示BRD4介导了GLUT1的细胞膜-溶酶体转位。

实施例6：

双荧光GLUT3示踪质粒的应用：

验证无葡萄糖的条件下，细胞自噬激活，这个时候GLUT3的表达受到自噬过程的调控而定位发生变化。

①取对数生长期的SW1353细胞，以2×10⁵个细胞接种2个15mm的玻璃皿细胞培养皿(NEST，Cat.No.:801002)中；

②24h后观察细胞融合度达80％，弃培养基，加入900μL无血清DMEM，配制质粒转染体系(100μL DMEM+2μg实施例4得到的双荧光GLUT3示踪质粒+6μL Lipo3000)，转染体系慢速震荡混匀后静置孵育20min，向无血清DM EM分别加入孵育好的转染体系；

③转染5h后换完全培养基，继续培养24h；

④向其中一个皿加入无糖细胞培养基，另一个皿加入完全培养基，继续培养24小时。

⑤激光共聚焦显微镜以488nm激发光激发，观察EGFP绿色荧光的细胞定位分布(无糖培养基如图9所示，完全培养基如图10所示)，激光共聚焦显微镜以580nm激发光激发，观察mCherry红色荧光的细胞定位分布(无糖培养基如图11所示，完全培养基如图12所示)，图像叠加分析GLUT3(无糖培养基如图13所示，完全培养基如图14所示)在细胞的定位及表达情况。实验观察质膜及内吞体定位的GLUT3显示为绿色或黄色，而酸性溶酶体定位的GLUT3主要为红色。结果显示，在无葡萄糖的条件下，细胞自噬激活，这个时候GLU T3的在细胞膜上表达减少，受到自噬过程的调控而发生细胞膜-内吞体-溶酶体转位变化。

对于本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种相应的改变以及变形，而所有的这些改变以及变形都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。

序列表

<110> 暨南大学

<120> 一种双荧光GLUTs示踪质粒、其制备方法及其应用

<130> 2019

<141> 2019-05-30

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 708

<212> DNA

<213> PLVX-T2A-mCherry-Puro质粒()

<400> 1

atggtgagca agggcgagga ggataacatg gccatcatca aggagttcat gcgcttcaag 60

gtgcacatgg agggctccgt gaacggccac gagttcgaga tcgagggcga gggcgagggc 120

cgcccctacg agggcaccca gaccgccaag ctgaaggtga ccaagggtgg ccccctgccc 180

ttcgcctggg acatcctgtc ccctcagttc atgtacggct ccaaggccta cgtgaagcac 240

cccgccgaca tccccgacta cttgaagctg tccttccccg agggcttcaa gtgggagcgc 300

gtgatgaact tcgaggacgg cggcgtggtg accgtgaccc aggactcctc cctgcaggac 360

ggcgagttca tctacaaggt gaagctgcgc ggcaccaact tcccctccga cggccccgta 420

atgcagaaga agaccatggg ctgggaggcc tcctccgagc ggatgtaccc cgaggacggc 480

gccctgaagg gcgagatcaa gcagaggctg aagctgaagg acggcggcca ctacgacgct 540

gaggtcaaga ccacctacaa ggccaagaag cccgtgcagc tgcccggcgc ctacaacgtc 600

aacatcaagt tggacatcac ctcccacaac gaggactaca ccatcgtgga acagtacgaa 660

cgcgccgagg gccgccactc caccggcggc atggacgagc tgtacaag 708

<210> 2

<211> 4695

<212> DNA

<213> pEGFP-C1质粒()

<400> 2

cgcgggcccg ggatccaccg gatctagata actgatcata atcagccata ccacatttgt 60

agaggtttta cttgctttaa aaaacctccc acacctcccc ctgaacctga aacataaaat 120

gaatgcaatt gttgttgtta acttgtttat tgcagcttat aatggttaca aataaagcaa 180

tagcatcaca aatttcacaa ataaagcatt tttttcactg cattctagtt gtggtttgtc 240

caaactcatc aatgtatctt aacgcgtaaa ttgtaagcgt taatattttg ttaaaattcg 300

cgttaaattt ttgttaaatc agctcatttt ttaaccaata ggccgaaatc ggcaaaatcc 360

cttataaatc aaaagaatag accgagatag ggttgagtgt tgttccagtt tggaacaaga 420

gtccactatt aaagaacgtg gactccaacg tcaaagggcg aaaaaccgtc tatcagggcg 480

atggcccact acgtgaacca tcaccctaat caagtttttt ggggtcgagg tgccgtaaag 540

cactaaatcg gaaccctaaa gggagccccc gatttagagc ttgacgggga aagccggcga 600

acgtggcgag aaaggaaggg aagaaagcga aaggagcggg cgctagggcg ctggcaagtg 660

tagcggtcac gctgcgcgta accaccacac ccgccgcgct taatgcgccg ctacagggcg 720

cgtcaggtgg cacttttcgg ggaaatgtgc gcggaacccc tatttgttta tttttctaaa 780

tacattcaaa tatgtatccg ctcatgagac aataaccctg ataaatgctt caataatatt 840

gaaaaaggaa gagtcctgag gcggaaagaa ccagctgtgg aatgtgtgtc agttagggtg 900

tggaaagtcc ccaggctccc cagcaggcag aagtatgcaa agcatgcatc tcaattagtc 960

agcaaccagg tgtggaaagt ccccaggctc cccagcaggc agaagtatgc aaagcatgca 1020

tctcaattag tcagcaacca tagtcccgcc cctaactccg cccatcccgc ccctaactcc 1080

gcccagttcc gcccattctc cgccccatgg ctgactaatt ttttttattt atgcagaggc 1140

cgaggccgcc tcggcctctg agctattcca gaagtagtga ggaggctttt ttggaggcct 1200

aggcttttgc aaagatcgat caagagacag gatgaggatc gtttcgcatg attgaacaag 1260

atggattgca cgcaggttct ccggccgctt gggtggagag gctattcggc tatgactggg 1320

cacaacagac aatcggctgc tctgatgccg ccgtgttccg gctgtcagcg caggggcgcc 1380

cggttctttt tgtcaagacc gacctgtccg gtgccctgaa tgaactgcaa gacgaggcag 1440

cgcggctatc gtggctggcc acgacgggcg ttccttgcgc agctgtgctc gacgttgtca 1500

ctgaagcggg aagggactgg ctgctattgg gcgaagtgcc ggggcaggat ctcctgtcat 1560

ctcaccttgc tcctgccgag aaagtatcca tcatggctga tgcaatgcgg cggctgcata 1620

cgcttgatcc ggctacctgc ccattcgacc accaagcgaa acatcgcatc gagcgagcac 1680

gtactcggat ggaagccggt cttgtcgatc aggatgatct ggacgaagag catcaggggc 1740

tcgcgccagc cgaactgttc gccaggctca aggcgagcat gcccgacggc gaggatctcg 1800

tcgtgaccca tggcgatgcc tgcttgccga atatcatggt ggaaaatggc cgcttttctg 1860

gattcatcga ctgtggccgg ctgggtgtgg cggaccgcta tcaggacata gcgttggcta 1920

cccgtgatat tgctgaagag cttggcggcg aatgggctga ccgcttcctc gtgctttacg 1980

gtatcgccgc tcccgattcg cagcgcatcg ccttctatcg ccttcttgac gagttcttct 2040

gagcgggact ctggggttcg aaatgaccga ccaagcgacg cccaacctgc catcacgaga 2100

tttcgattcc accgccgcct tctatgaaag gttgggcttc ggaatcgttt tccgggacgc 2160

cggctggatg atcctccagc gcggggatct catgctggag ttcttcgccc accctagggg 2220

gaggctaact gaaacacgga aggagacaat accggaagga acccgcgcta tgacggcaat 2280

aaaaagacag aataaaacgc acggtgttgg gtcgtttgtt cataaacgcg gggttcggtc 2340

ccagggctgg cactctgtcg ataccccacc gagaccccat tggggccaat acgcccgcgt 2400

ttcttccttt tccccacccc accccccaag ttcgggtgaa ggcccagggc tcgcagccaa 2460

cgtcggggcg gcaggccctg ccatagcctc aggttactca tatatacttt agattgattt 2520

aaaacttcat ttttaattta aaaggatcta ggtgaagatc ctttttgata atctcatgac 2580

caaaatccct taacgtgagt tttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa 2640

aggatcttct tgagatcctt tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc 2700

accgctacca gcggtggttt gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt 2760

aactggcttc agcagagcgc agataccaaa tactgtcctt ctagtgtagc cgtagttagg 2820

ccaccacttc aagaactctg tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc 2880

agtggctgct gccagtggcg ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt 2940

accggataag gcgcagcggt cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga 3000

gcgaacgacc tacaccgaac tgagatacct acagcgtgag ctatgagaaa gcgccacgct 3060

tcccgaaggg agaaaggcgg acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg 3120

cacgagggag cttccagggg gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca 3180

cctctgactt gagcgtcgat ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa 3240

cgccagcaac gcggcctttt tacggttcct ggccttttgc tggccttttg ctcacatgtt 3300

ctttcctgcg ttatcccctg attctgtgga taaccgtatt accgccatgc attagttatt 3360

aatagtaatc aattacgggg tcattagttc atagcccata tatggagttc cgcgttacat 3420

aacttacggt aaatggcccg cctggctgac cgcccaacga cccccgccca ttgacgtcaa 3480

taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa tagggacttt ccattgacgt caatgggtgg 3540

agtatttacg gtaaactgcc cacttggcag tacatcaagt gtatcatatg ccaagtacgc 3600

cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc ccgcctggca ttatgcccag tacatgacct 3660

tatgggactt tcctacttgg cagtacatct acgtattagt catcgctatt accatggtga 3720

tgcggttttg gcagtacatc aatgggcgtg gatagcggtt tgactcacgg ggatttccaa 3780

gtctccaccc cattgacgtc aatgggagtt tgttttggca ccaaaatcaa cgggactttc 3840

caaaatgtcg taacaactcc gccccattga cgcaaatggg cggtaggcgt gtacggtggg 3900

aggtctatat aagcagagct ggtttagtga accgtcagat ccgctagcgc taccggtcgc 3960

caccatggtg agcaagggcg aggagctgtt caccggggtg gtgcccatcc tggtcgagct 4020

ggacggcgac gtaaacggcc acaagttcag cgtgtccggc gagggcgagg gcgatgccac 4080

ctacggcaag ctgaccctga agttcatctg caccaccggc aagctgcccg tgccctggcc 4140

caccctcgtg accaccctga cctacggcgt gcagtgcttc agccgctacc ccgaccacat 4200

gaagcagcac gacttcttca agtccgccat gcccgaaggc tacgtccagg agcgcaccat 4260

cttcttcaag gacgacggca actacaagac ccgcgccgag gtgaagttcg agggcgacac 4320

cctggtgaac cgcatcgagc tgaagggcat cgacttcaag gaggacggca acatcctggg 4380

gcacaagctg gagtacaact acaacagcca caacgtctat atcatggccg acaagcagaa 4440

gaacggcatc aaggtgaact tcaagatccg ccacaacatc gaggacggca gcgtgcagct 4500

cgccgaccac taccagcaga acacccccat cggcgacggc cccgtgctgc tgcccgacaa 4560

ccactacctg agcacccagt ccgccctgag caaagacccc aacgagaagc gcgatcacat 4620

ggtcctgctg gagttcgtga ccgccgccgg gatcactctc ggcatggacg agctgtacaa 4680

gtccggactc agatc 4695

<210> 3

<211> 1496

<212> DNA

<213> HEK293T细胞()

<400> 3

atggagccca gcagcaagaa gctgacgggt cgcctcatgc tggccgtggg aggagcagtg 60

cttggctccc tgcagtttgg ctacaacact ggagtcatca atgcccccca gaaggtgatc 120

gaggagttct acaaccagac atgggtccac cgctatgggg agagcatcct gcccaccacg 180

ctcaccacgc tctggtccct ctcagtggcc atcttttctg ttgggggcat gattggctcc 240

ttctctgtgg gccttttcgt taaccgcttt ggccggcgga attcaatgct gatgatgaac 300

ctgctggcct tcgtgtccgc cgtgctcatg ggcttctcga aactgggcaa gtcctttgag 360

atgctgatcc tgggccgctt catcatcggt gtgtactgcg gcctgaccac aggcttcgtg 420

cccatgtatg tgggtgaagt gtcacccaca gcccttcgtg gggccctggg caccctgcac 480

cagctgggca tcgtcgtcgg catcctcatc gcccaggtgt tcggcctgga ctccatcatg 540

ggcaacaagg acctgtggcc cctgctgctg agcatcatct tcatcccggc cctgctgcag 600

tgcatcgtgc tgcccttctg ccccgagagt ccccgcttcc tgctcatcaa ccgcaacgag 660

gagaaccggg ccaagagtgt gctaaagaag ctgcgcggga cagctgacgt gacccatgac 720

ctgcaggaga tgaaggaaga gagtcggcag atgatgcggg agaagaaggt caccatcctg 780

gagctgttcc gctcccccgc ctaccgccag cccatcctca tcgctgtggt gctgcagctg 840

tcccagcagc tgtctggcat caacgctgtc ttctattact ccacgagcat cttcgagaag 900

gcgggggtgc agcagcctgt gtatgccacc attggctccg gtatcgtcaa cacggccttc 960

actgtcgtgt cgctgtttgt ggtggagcga gcaggccggc ggaccctgca cctcataggc 1020

ctcgctggca tggcgggttg tgccatactc atgaccatcg cgctagcact gctggagcag 1080

ctaccctgga tgtcctatct gagcatcgtg gccatctttg gctttgtggc cttctttgaa 1140

gtgggtcctg gccccatccc atggttcatc gtggctgaac tcttcagcca gggtccacgt 1200

ccagctgcca ttgccgttgc aggcttctcc aactggacct caaatttcat tgtgggcatg 1260

tgcttccagt atgtggagca actgtgtggt ccctacgtct tcatcatctt cactgtgctc 1320

ctggttctgt tcttcatctt cacctacttc aaagttcctg agactaaagg ccggaccttc 1380

gatgagatcg cttccggctt ccggcagggg ggagccagcc aaagtgacaa gacacccgag 1440

gagctgttcc atcccctggg ggctgattcc caagtgtgag tcgccccaga tcacca 1496

<210> 4

<211> 1511

<212> DNA

<213> HEK293T细胞()

<400> 4

atggggacac agaaggtcac cccagctctg atatttgcca tcacagttgc tacaatcggc 60

tctttccaat ttggctacaa cactggggtc atcaatgctc ctgagaagat cataaaggaa 120

tttatcaata aaactttgac ggacaaggga aatgccccac cctctgaggt gctgctcacg 180

tctctctggt ccttgtctgt ggccatattt tccgtcgggg gtatgatcgg ctccttttcc 240

gtcggactct tcgtcaaccg ctttggcagg cgcaattcaa tgctgattgt caacctgttg 300

gctgtcactg gtggctgctt tatgggactg tgtaaagtag ctaagtcggt tgaaatgctg 360

atcctgggtc gcttggttat tggcctcttc tgcggactct gcacaggttt tgtgcccatg 420

tacattggag agatctcgcc tactgccctg cggggtgcct ttggcactct caaccagctg 480

ggcatcgttg ttggaattct ggtggcccag atctttggtc tggaattcat ccttgggtct 540

gaagagctat ggccgctgct actgggtttt accatccttc ctgctatcct acaaagtgca 600

gcccttccat tttgccctga aagtcccaga tttttgctca ttaacagaaa agaagaggag 660

aatgctaagc agatcctcca gcggttgtgg ggcacccagg atgtatccca agacatccag 720

gagatgaaag atgagagtgc aaggatgtca caagaaaagc aagtcaccgt gctagagctc 780

tttagagtgt ccagctaccg acagcccatc atcatttcca ttgtgctcca gctctctcag 840

cagctctctg ggatcaatgc tgtgttctat tactcaacag gaatcttcaa ggatgcaggt 900

gttcaagagc ccatctatgc caccatcggc gcgggtgtgg ttaatactat cttcactgta 960

gtttctctat ttctggtgga aagggcagga agaaggactc tgcatatgat aggccttgga 1020

gggatggctt tttgttccac gctcatgact gtttctttgt tattaaagga taactataat 1080

gggatgagct ttgtctgtat tggggctatc ttggtctttg tagccttctt tgaaattgga 1140

ccaggcccca ttccctggtt tattgtggcc gaactcttca gccagggccc ccgcccagct 1200

gcgatggcag tggccggctg ctccaactgg acctccaact tcctagtcgg attgctcttc 1260

ccctccgctg ctcactattt aggagcctac gtttttatta tcttcaccgg cttcctcatt 1320

accttcttgg cttttacctt cttcaaagtc cctgagaccc gtggcaggac ttttgaggat 1380

atcacacggg cctttgaagg gcaggcacac ggtgcagata gatctggaaa ggacggcgtc 1440

atggagatga acagcatcga gcctgctaag gagaccacca ccaatgtcta agtcgtgcct 1500

ccttccacct c 1511

Claims (10)

1.一种双荧光GLUTs示踪质粒，其特征在于包括GLUTs基因片段、mCherry基因和pEGFP-C1质粒片段；所述mCherry基因的序列如SEQ ID NO.1所示；所述pEGFP-C1质粒片段如SEQID NO.2所示。

2.如权利要求1所述的双荧光GLUTs示踪质粒，其特征在于，所述GLUTs基因片段为GLUT1基因片段或GLUT3基因片段；所述GLUT1基因片段的序列如SEQ ID NO.3所示；所述GLUT3基因片段的序列如SEQ ID NO.4所示。

3.一种如权利要求1所述的双荧光GLUTs示踪质粒的制备方法，其特征在于包括：

将GLUTs基因片段插入线性pEGFP-C1质粒片段的步骤；以及，将mCherry基因插入线性pEGFP-C1质粒片段的步骤。

4.如权利要求3所述的双荧光GLUTs示踪质粒的制备方法，其特征在于，

将GLUTs基因片段插入线性pEGFP-C1质粒片段的步骤为：将GLUTs基因进行Xhol及KpnI双酶切，得到GLUTs基因片段；将GLUTs基因片段插入pEGFP-C1质粒片段中，得到pEGFP-GLUTs质粒。

5.如权利要求4所述的双荧光GLUTs示踪质粒的制备方法，其特征在于，所述GLUTs基因片段为GLUT1基因片段；

所述GLUT1基因片段进行Xhol及KpnI双酶切的引物为：

GULT1-Xhol-F：TAAACTCGAGACATGGAGCCCAGCAGCAAGAAG；

GULT1-KpnI-R：CTGGTACCTGGTGATCTGGGGCGACTCAC。

6.如权利要求4所述的双荧光GLUTs示踪质粒的制备方法，其特征在于，所述GLUTs基因片段为GLUT3基因片段；

所述GLUT3基因片段进行Xhol及KpnI双酶切的引物为：

GLUT3-XhoI-F：TAAACTCGAGCGATGGGGACACAGAAGGT；

GLUT3-KpnI-R：CTGGTACCGAGGTGGAAGGAGGCACGACT。

7.如权利要求3所述的双荧光GLUTs示踪质粒的制备方法，其特征在于，将pEGFP-C1质粒进行Xhol及KpnI双酶切，回收4700bp的质粒片段，得到pEGFP-C1质粒片段。

8.如权利要求3所述的双荧光GLUTs示踪质粒的制备方法，其特征在于，

将mCherry基因插入线性pEGFP-C1质粒片段的步骤为：将mCherry基因插入含有GLUTs基因片段的线性pEGFP-C1质粒片段中，得到双荧光GLUTs示踪质粒。

9.一种双荧光GLUTs示踪质粒的应用，其特征在于，所述双荧光GLUTs示踪质粒包括GLUTs基因片段、mCherry基因和pEGFP-C1质粒片段；将双荧光GLUTs示踪质粒转染细胞，然后以激发光激发，观察其显色情况，得到GLUTs在细胞中的定位。

10.如权利要求9所述的双荧光GLUTs示踪质粒的应用，其特征在于，显色情况为绿色或黄色，为GLUTs在细胞的质膜或内吞体定位；显色情况为红色，为GLUTs在细胞的溶酶体定位。