CN110269130A - 富硒牡蛎小分子蛋白肽的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种富硒牡蛎小分子蛋白肽的制备方法，属于蛋白肽技术领域，包括：S1：采用生物酶对富硒牡蛎蛋白进行酶解；S2：将S1获得的酶解液用脱腥剂脱腥；S3：将S2获得的脱腥酶解液经膜过滤，浓缩，干燥，即得富硒牡蛎小分子蛋白肽；其中，蛋白酶含有碱性蛋白酶、胰蛋白酶和猕猴桃蛋白酶。本发明制备方法能够降低蛋白质和蛋白酶的静电排斥力，暴露出更多富硒牡蛎蛋白的酶结合点，改变酶在活性状态时的构象，提高了富硒牡蛎蛋白和蛋白酶的结合性，同时激活酶分子和提升酶稳定性，利用酶解反应的进行，提高富硒牡蛎小分子蛋白肽的得率，所得富硒牡蛎小分子蛋白肽的风味较好，无腥味，安全性高。
Description
技术领域
本发明属于蛋白肽技术领域，具体涉及富硒牡蛎小分子蛋白肽的制备方法。
背景技术
牡蛎是世界上产量最大的贝类养殖动物。主要生长在海水或咸淡水交界处，以摄食浮游生物为生，主要分布于温带和热带各大洋沿岸水域。中国沿海的牡蛎有20多种，常见种类有4种，分别为近江牡蛎、太平洋牡蛎、大连湾牡蛎和褶牡蛎。中国是丐界养殖大国，对世界养殖总产量的贡献率已达70％。在海水养殖品种中，由于贝类投入成本低、单产高等特点，已成为沿海渔民养殖的主要经济来源，贝类养殖占海水养殖的比例高达80％以上；而贝类养殖中又以牡蛎养殖为主，近几年贝类养殖产量中40％左右是牡蛎。牡蛎味道鲜美，营养丰富，是我国第一批被列为药食同源的食品之一。牡蛎干物质中蛋白质含量最高，氨基酸组成完善，根据世界粮农组织评定结果，牡蛎中必需氨基酸的完全程度和品质优亍人乳和牛乳，牛磺酸含量明显高亍其他动物来源食品。牛磺酸是非蛋白含硫氨基酸，可参不人体内多种代谢，是保护视力和新生儿大脑发育的必要物质，具有增强机体免疫力、抗疲劳、降血压、降血脂等生物活性。牡蛎所含糖分为糖原，具有抗氧化、降血脂、抗凝血等重要生理作用。此外，牡蛎富含二十二碳六烯酸(DHA)、二十碳五烯酸(EPA)等不饱和脂肪酸、维生素以及硒和锌等矿物质。综上可知，牡蛎是一种高蛋白、低脂肪、矿物质含量丰富的营养食品。
生物活性肽是一类分子量小于6000Da、对生物体的生命活动有益或具有生理作用的肽类化合物。活性肽一般含3-40个氨基酸残基，且活性取决于氨基酸组成和排列顺序。现代营养学研究发现，人体摄取的蛋白质经消化道各种酶水解后，不只以氨基酸形式吸收，更多是以蛋白小分子活性肽形式被直接吸收。食物是人体摄入硒的主要来源，全球有2/3的地区约40多个国家属亍低硒和缺硒地区，在我国72％的县(市)属于低硒和缺硒地区，单靠普通食物的硒进进不能满足人类尤其是潜在硒缺乏地区的人们生长发育的需要，缺硒会造成人体免疫力低下和易疲劳。由于硒的需要量不中毒量之间范围较小，补硒时有量的要求。同时免疫力低下人群和易疲劳人群的消化酶中的蛋白酶会减少很多，无法分解食物中大分子蛋白，因而就无法吸收蛋白质，造成人体蛋白质缺乏，而蛋白肽作为小分子蛋白，能被人体直接吸收。植物和动物来源的有机硒因其高效安全、易于吸收等优点，日益受到人们的关注。因牡蛎的捕食主要依靠滤水作用，固牡蛎具有较强的富集水体中无机硒的能力。因此，以牡蛎为原料研制开发出一种富硒牡蛎小分子蛋白肽具有良好的发展前景。
授权公告号为CN 105363037 B的发明专利提供了一种口服药物组合物，该组合物包含：作为活性成分的苯达莫司汀或其可药用的酯、盐或溶剂化物，以及可药用赋形剂，该可药用赋形剂为选自由聚乙氧基化蓖麻油或其衍生物、以及环氧乙烷与环氧丙烷的嵌段共聚物组成的组中的可药用非离子表面活性剂。授权公告号为CN 104203235 B的发明专利公开了长期储存稳定的含有苯达莫司汀的组合物。所述组合物可包含：苯达莫司汀或其药学上可接受的盐；和药学上可接受的流体，所述流体包含：PEG和PG的混合物，足够量的有机化合物或无机化合物，以获得pH从约6.0到约11的聚乙二醇，按照用于聚乙二醇的USP专论测量；和任选的抗氧剂。在从约5℃到约25℃的温度下至少约15个月的储存之后，含有苯达莫司汀的组合物含有少于约5％的总酯，标准化峰面积响应(“PAR”)通过高效液相色谱(“HPLC”)在223nm波长处进行测定。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能提高富硒牡蛎蛋白和蛋白酶的结合性，激活酶分子和提升酶稳定性，酶解效果佳，富硒牡蛎小分子蛋白肽的得率高的富硒牡蛎小分子蛋白肽的制备方法，所得富硒牡蛎小分子蛋白肽的风味较好，无腥味，安全性高。
本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：
富硒牡蛎小分子蛋白肽的制备方法，包括：
S1：采用生物酶对富硒牡蛎蛋白进行酶解；
S2：将S1获得的酶解液用脱腥剂脱腥；
S3：将S2获得的脱腥酶解液经膜过滤，浓缩，干燥，即得富硒牡蛎小分子蛋白肽；
其中，蛋白酶含有碱性蛋白酶、胰蛋白酶和猕猴桃蛋白酶。
上述蛋白酶科学配方形成复合酶制剂，对全蛋蛋白粉进行催化、降解，所得到的牡蛎酶解液达到较高的水解度，使制得富硒牡蛎小分子蛋白肽的风味较好，无腥味，且糖原、牛磺酸、Zn、Cu、Se等活性物质含量较高，且安全性高。
本发明采用生物酶定向切割技术，选择性地将富硒牡蛎蛋白分解为具有特定功效的小分子蛋白肽，但是脂肪在水解过程中发生脂肪氧化和美拉德反应，出现较多的低分子挥发性醛、酮等物质，导致腥味较大，所以本发明通过脱腥能够除去酶解液中的腥味，提高制得富硒牡蛎小分子蛋白肽的感官效果，制得富硒牡蛎小分子蛋白肽的风味较好，无腥味，且糖原、牛磺酸、Zn、Cu、Se等活性物质含量较高，能被人体直接吸收，快速补充人体所需的优质蛋白和氨基酸，迅速恢复体力，提高机体免疫力，同时有机硒含量的提高能够避免自由基对机体的损伤、延缓衰老，特别符合免疫力低下人群(老年人、吸烟者和熬夜者等)和易疲劳人群(劳心者、肥胖者和体力劳动者等)的健康需求，能够帮助这类人群快速地补充优质蛋白质、氨基酸及有机硒，迅速恢复体力，提高机体免疫力，延缓机体的衰老，且使用安全性高。
优选地，蛋白酶中碱性蛋白酶、胰蛋白酶和猕猴桃蛋白酶的用了分别为4-6万U/g、1-3万U/g和0.2-0.5万U/g。
优选地，酶解pH为7.5-8.5，温度为50-60℃，时间为2-4h。
优选地，酶解是在低频电磁场下进行；富硒牡蛎蛋白中加入亚硒酸钠。
本发明酶解过程中低频电磁场和亚硒酸钠不仅使得富硒牡蛎蛋白和蛋白酶的导电和介电发生改变，降低蛋白质和蛋白酶的静电排斥力，提高了富硒牡蛎蛋白和蛋白酶的结合性，而且通过亚硒酸钠与富硒牡蛎蛋白中氨基酸残基羧基侧的酰胺键发生得作用，能增强富硒牡蛎蛋白的极性，降低富硒牡蛎蛋白的疏水性，进而使得富硒牡蛎蛋白的结构变得疏松，暴露出更多的酶结合点，利用酶解反应的进行，提高富硒牡蛎小分子蛋白肽的得率；本发明酶解过程中低频电磁场和亚硒酸钠还能导致蛋白酶中酪氨酸和色氨酸残基附近的构象发生去折叠化的改变，从而改变酶在活性状态时的构象，进而促进酶与底物的结合，利用酶解反应的进行，提高富硒牡蛎小分子蛋白肽的得率；本发明制备方法还能通过低频电磁场改变带电粒子的运动状态，提高其动能，强化酶解过程中金属离子的扩散，使得金属离子能与酶分子形成盐桥，起到激活酶分子和提升酶稳定性的作用，从而提高酶解效果。
更优选地，低频电磁场的频率为30-50Hz。
更优选地，亚硒酸钠加入量为富硒牡蛎蛋白重量的
优选地，S2用脱腥剂为活性炭和/或β-环糊精和/或酵母和/或壳聚糖。活性炭的多孔结构和特殊的表面可以产生更加有效的吸附作用，活性炭的稳定性好，对多种腥臭成分都有很高的吸附力；β-环糊精空穴内壁具疏水性，环的外侧具亲水性，加到蛋白质水解液中，一些疏水小肽和疏水性氨基酸被包络到β-CD的空穴内部，从而起到脱腥苦的作用；利用酵母的新陈代谢作用使小分子的腥味物质参与代谢转变成无腥味的物质，从而达到脱腥的目的；壳聚糖线性分子链上具有游离氨基，其氮原子上还有一对未结合电子，使其呈现弱碱性，能从溶液中结合一个氢原子，从而使壳聚糖成为带阳电荷的聚电解质，与酶解液中所含的大量带负电荷的悬浮物相互作用，使酶解液中的悬浮物缠绕于具有线性分子结构的壳聚糖分子中，使微小颗粒变为大颗粒而沉降，从而展示出优异的絮凝作用，进而达到脱腥的目的。
更优选地，脱腥条件为：添加量0.5-1.2％、温度25-35℃、时间10-30min。
优选地，蛋白肽的分子量分布在389-980Da。
本发明还提供一种富硒牡蛎小分子蛋白肽在制备增强免疫力产品中的用途。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明制备方法能够降低蛋白质和蛋白酶的静电排斥力，暴露出更多富硒牡蛎蛋白的酶结合点，改变酶在活性状态时的构象，提高了富硒牡蛎蛋白和蛋白酶的结合性，利用酶解反应的进行，提高富硒牡蛎小分子蛋白肽的得率；本发明制备方法还能通过低频电磁场改变带电粒子的运动状态，提高其动能，强化酶解过程中金属离子的扩散，使得金属离子能与酶分子形成盐桥，起到激活酶分子和提升酶稳定性的作用，从而提高酶解效果；本发明制备方法还能通过脱腥能够除去酶解液中的腥味，提高制得富硒牡蛎小分子蛋白肽的感官效果，制得富硒牡蛎小分子蛋白肽的风味较好，无腥味，且糖原、牛磺酸、Zn、Cu、Se等活性物质含量较高，安全性高。
本发明采用了上述技术方案提供富硒牡蛎小分子蛋白肽的制备方法，弥补了现有技术的不足，设计合理，操作方便。
附图说明
图1为本发明试验例1中富硒牡蛎蛋白的紫外吸收光谱图；
图2为本发明试验例1中蛋白酶的荧光光谱图。
具体实施方式
本发明实施例提供了一种富硒牡蛎小分子蛋白肽的制备方法，包括：
S1：将富硒牡蛎蛋白按照1:2-3的比例加水，调节pH后与蛋白酶混合，酶解，在90-100℃下灭酶15-25min，然后在4000-10000rpm下离心10-20min，分离得到上清液，即为酶解液；
S2：将S1获得的酶解液中加入脱腥剂，脱腥，过滤除去脱腥剂；
S3：将S2获得的脱腥酶解液经0.22μ膜过滤，然后经1k的超滤组件进行超滤，进而得到1k以下的组分，然后在0.03-0.08MPa、60-80℃的真空条件下浓缩至固形物含量为30-50％，干燥，即得富硒牡蛎小分子蛋白肽；
其中，蛋白酶含有碱性蛋白酶、胰蛋白酶和猕猴桃蛋白酶。上述蛋白酶科学配方形成复合酶制剂，对全蛋蛋白粉进行催化、降解，所得到的牡蛎酶解液达到较高的水解度，使制得富硒牡蛎小分子蛋白肽的风味较好，无腥味，且糖原、牛磺酸、Zn、Cu、Se等活性物质含量较高，且安全性高。本实施例采用生物酶定向切割技术，选择性地将富硒牡蛎蛋白分解为具有特定功效的小分子蛋白肽，但是脂肪在水解过程中发生脂肪氧化和美拉德反应，出现较多的低分子挥发性醛、酮等物质，导致腥味较大，所以本实施例通过脱腥能够除去酶解液中的腥味，提高制得富硒牡蛎小分子蛋白肽的感官效果，制得富硒牡蛎小分子蛋白肽的风味较好，无腥味，且糖原、牛磺酸、Zn、Cu、Se等活性物质含量较高，能被人体直接吸收，快速补充人体所需的优质蛋白和氨基酸，迅速恢复体力，提高机体免疫力，同时有机硒含量的提高能够避免自由基对机体的损伤、延缓衰老，特别符合免疫力低下人群(老年人、吸烟者和熬夜者等)和易疲劳人群(劳心者、肥胖者和体力劳动者等)的健康需求，能够帮助这类人群快速地补充优质蛋白质、氨基酸及有机硒，迅速恢复体力，提高机体免疫力，延缓机体的衰老，且使用安全性高。
蛋白酶中碱性蛋白酶、胰蛋白酶和猕猴桃蛋白酶的用了分别为4-6万U/g(例如万4.1U/g、4.25万U/g、4.32万U/g、4.5万U/g、4.8万U/g、5.1万U/g、5.4万U/g等)、1-3万U/g(例如1.2万U/g、1.34万U/g、1.45万U/g、1.6万U/g、1.8万U/g、2.2万U/g、2.7万U/g等)和0.2-0.5万U/g(例如0.25万U/g、0.3万U/g、0.32万U/g、0.35万U/g、0.4万U/g、0.42万U/g、1.48万U/g等)。
酶解pH为7.5-8.5(例如7.6、7.7、7.8、8.1、8.2、8.3等)，温度为50-60℃(例如52℃、53.5℃、54℃、56℃、57.5℃、58℃、59℃等)，时间为2-4h(例如2.2h、2.5h、3.5h、3.8h等)。
酶解是在低频电磁场下进行；富硒牡蛎蛋白中加入亚硒酸钠。本实施例酶解过程中低频电磁场和亚硒酸钠不仅使得富硒牡蛎蛋白和蛋白酶的导电和介电发生改变，降低蛋白质和蛋白酶的静电排斥力，提高了富硒牡蛎蛋白和蛋白酶的结合性，而且通过亚硒酸钠与富硒牡蛎蛋白中氨基酸残基羧基侧的酰胺键发生得作用，能增强富硒牡蛎蛋白的极性，降低富硒牡蛎蛋白的疏水性，进而使得富硒牡蛎蛋白的结构变得疏松，暴露出更多的酶结合点，利用酶解反应的进行，提高富硒牡蛎小分子蛋白肽的得率；本发明酶解过程中低频电磁场和亚硒酸钠还能导致蛋白酶中酪氨酸和色氨酸残基附近的构象发生去折叠化的改变，从而改变酶在活性状态时的构象，进而促进酶与底物的结合，利用酶解反应的进行，提高富硒牡蛎小分子蛋白肽的得率；本发明制备方法还能通过低频电磁场改变带电粒子的运动状态，提高其动能，强化酶解过程中金属离子的扩散，使得金属离子能与酶分子形成盐桥，提高富硒牡蛎小分子蛋白肽的得率，起到激活酶分子和提升酶稳定性的作用，从而提高酶解效果。为了进一步提高酶解效果，低频电磁场的频率为30-50Hz，例如32Hz、35.5Hz、36Hz、38Hz、40.5Hz、42Hz、44Hz、45Hz、46Hz、48Hz、49Hz等；亚硒酸钠加入量为富硒牡蛎蛋白重量的例如 等。
S2用脱腥剂为活性炭和/或β-环糊精和/或酵母和/或壳聚糖。活性炭的多孔结构和特殊的表面可以产生更加有效的吸附作用，活性炭的稳定性好，对多种腥臭成分都有很高的吸附力；β-环糊精空穴内壁具疏水性，环的外侧具亲水性，加到蛋白质水解液中，一些疏水小肽和疏水性氨基酸被包络到β-CD的空穴内部，从而起到脱腥苦的作用；酵母的疏松结构对腥臭物质具有一定的吸附作用，酵母体内含有的醇脱氢酶、醛脱氢酶能将醛类以及烯醛类等腥味物质氧化或还原为风味较柔和的醇和酸，亦即利用酵母的新陈代谢作用使小分子的腥味物质参与代谢转变成无腥味的物质，从而达到脱腥的目的；壳聚糖线性分子链上具有游离氨基，其氮原子上还有一对未结合电子，使其呈现弱碱性，能从溶液中结合一个氢原子，从而使壳聚糖成为带阳电荷的聚电解质，与酶解液中所含的大量带负电荷的悬浮物相互作用，使酶解液中的悬浮物缠绕于具有线性分子结构的壳聚糖分子中，使微小颗粒变为大颗粒而沉降，从而展示出优异的絮凝作用，进而达到脱腥的目的。为了提高脱腥效果，S2中脱腥条件为：添加量0.5-1.2％(例如0.55％、0.6％、0.64％、0.7％、0.74％、0.78％、0.8％、0.9％、1.0％等)、温度25-35℃(例如25.5℃、26℃、27.2℃、28℃、29℃、31.5℃、33℃、34℃等)、时间10-30min(例如12min、15.5min、16min、18min、20.5min、24min、25min、28min、29min等)；S2用脱腥剂为酿酒酵母。酵母细胞壁表面含有大量的羟基、氨基、羧基、磷酰基等官能团，且在水溶液中具有良好的悬浮性能，能够与酶解液中的各成分充分接触，吸附一些阈值较低的腥味物质；酵母中含有多种酶，可有效将腥味物质分解为无异味物质，且反应过程中还会生成其有特殊香味的中间产物对腥味物质一步修饰，转化成为无腥味成分，实现脱腥。
为了进一步优化脱腥过程，S2为：
将S1获得的酶解液中加入酿酒酵母和原花青素，脱腥，过滤除去脱腥剂。
原花青素具有较强的活性基团-OH，它能同一些阈值较低的腥味物质发生中和、缩合、结合、包荚等反应，和酿酒酵母发挥协同作用，提高脱腥过程的脱腥效果；此外，原花青素能增加酿酒酵母代谢生成酶等物质，和酿酒酵母发挥增益作用，加强对腥味物质的转化利用；另一方面，原花青素的加入还能有效刺激酿酒酵母尿素代谢和转运相关的基因，促进尿素水解酶的活性，提高菌株的尿素代谢能力，将精氨酸代谢产生的尿素在酿酒酵母细胞内降解为二氧化碳和氨，避免酶解液在脱腥过程中出现尿素，进而避免酶解液中出现氨基甲酸乙酯，提高富硒牡蛎小分子蛋白肽的使用安全性。
更优地，原花青素的添加量为酿酒酵母菌重量的2-10％，例如2.2％、3％、4.5％、5％、6.2％、7％、8％、9％、9.6％等。
蛋白肽的分子量分布在389-980Da。
实际应用中，可以将富硒牡蛎小分子蛋白肽与果蔬等天然物质，制备出具有增强免疫力的产品。该产品一方面保留了富硒牡蛎中的蛋白成分和活性物质，另一方面由于复配了果蔬等天然物质，因此富含维生素和膳食纤维等成分，产品具有营养丰富、功能特性明显的健康饮品。
下面，结合具体实施例对本发明实施方式作进一步说明。
实施例1：
一种富硒牡蛎小分子蛋白肽的制备方法，包括：
S1：将富硒牡蛎蛋白按照1:2.5的比例加水，调节pH至8.0后与蛋白酶混合，然后在温度为55℃下酶解3h，在温度为100℃下灭酶20min，然后在6000rpm下离心18min，分离得到上清液，即为酶解液；
S2：将S1获得的酶解液中加入0.8％的酿酒酵母，在温度为30℃下脱腥18min，过滤除去脱腥剂；
S3：将S2获得的脱腥酶解液经0.22μ膜过滤，然后经1k的超滤组件进行超滤，进而得到1k以下的组分，然后在0.05MPa、70℃的真空条件下浓缩至固形物含量为37％，干燥，即得富硒牡蛎小分子蛋白肽；
其中，蛋白酶含有5.2万U/g、2万U/g和0.3万U/g的碱性蛋白酶、胰蛋白酶和猕猴桃蛋白酶。
采用凝胶渗透色谱法测定富硒牡蛎小分子蛋白肽的分子量分布；测得蛋白肽的分子量分布在400-970Da。
其中，凝胶渗透色谱测定条件：色谱柱：SB-802.5HQ；流动相：硝酸钠水溶液；流速：1mL/min；柱温：40℃；进样体积：50μL；样品制备：以流动相为溶剂，配制质量浓度3mg/mL的样品溶液，样品溶液用微孔膜(0.45μm)过滤，取样品溶液3mL供进样。
实施例2：
一种富硒牡蛎小分子蛋白肽的制备方法，包括：
S1：将富硒牡蛎蛋白按照1:2.5的比例加水，调节pH至8.0后与蛋白酶混合，再加入富硒牡蛎蛋白重量的亚硒酸钠，然后在低频电磁场频率为40Hz、温度为55℃下酶解3h，在100℃下灭酶20min，然后在6000rpm下离心158min，分离得到上清液，即为酶解液；
S2：将S1获得的酶解液中加入0.8％的酿酒酵母，在温度为30℃下脱腥18min，过滤除去脱腥剂；
S3：将S2获得的脱腥酶解液经0.22μ膜过滤，然后经1k的超滤组件进行超滤，进而得到1k以下的组分，然后在0.05MPa、70℃的真空条件下浓缩至固形物含量为37％，干燥，即得富硒牡蛎小分子蛋白肽；
其中，蛋白酶含有5.2万U/g、2万U/g和0.3万U/g的碱性蛋白酶、胰蛋白酶和猕猴桃蛋白酶。
测得蛋白肽的分子量分布在389-980Da。
实施例3：
一种富硒牡蛎小分子蛋白肽的制备方法，包括：
S1：将富硒牡蛎蛋白按照1:2的比例加水，调节pH至7.5后与蛋白酶混合，再加入富硒牡蛎蛋白重量的亚硒酸钠，然后在低频电磁场频率为30Hz、温度为50℃下酶解2h，在90℃下灭酶15min，然后在4000rpm下离心10min，分离得到上清液，即为酶解液；
S2：将S1获得的酶解液中加入0.5％的酿酒酵母，在温度25℃下脱腥10min，过滤除去脱腥剂；
S3：将S2获得的脱腥酶解液经0.22μ膜过滤，然后经1k的超滤组件进行超滤，进而得到1k以下的组分，然后在0.03MPa、60℃的真空条件下浓缩至固形物含量为30％，干燥，即得富硒牡蛎小分子蛋白肽；
其中，蛋白酶含有4万U/g、1万U/g和0.2万U/g的碱性蛋白酶、胰蛋白酶和猕猴桃蛋白酶。
测得蛋白肽的分子量分布在381-975Da。
实施例4：
一种富硒牡蛎小分子蛋白肽的制备方法，包括：
S1：将富硒牡蛎蛋白按照1:3的比例加水，调节pH至8.5后与蛋白酶混合，再加入富硒牡蛎蛋白重量的亚硒酸钠，然后在低频电磁场频率为50Hz、温度为60℃下酶解4h，在100℃下灭酶25min，然后在10000rpm下离心20min，分离得到上清液，即为酶解液；
S2：将S1获得的酶解液中加入1.2％的酿酒酵母，在温度35℃下脱腥30min，过滤除去脱腥剂；
S3：将S2获得的脱腥酶解液经0.22μ膜过滤，然后经1k的超滤组件进行超滤，进而得到1k以下的组分，然后在0.08MPa、80℃的真空条件下浓缩至固形物含量为50％，干燥，即得富硒牡蛎小分子蛋白肽；
其中，蛋白酶含有6万U/g、3万U/g和0.5万U/g的碱性蛋白酶、胰蛋白酶和猕猴桃蛋白酶。
测得蛋白肽的分子量分布在385-980Da。
实施例5：
一种富硒牡蛎小分子蛋白肽的制备方法，包括：
S1：将富硒牡蛎蛋白按照1:2.5的比例加水，调节pH至8.0后与蛋白酶混合，再加入富硒牡蛎蛋白重量的亚硒酸钠，然后在低频电磁场频率为40Hz、温度为55℃下酶解3h，在100℃下灭酶20min，然后在6000rpm下离心158min，分离得到上清液，即为酶解液；
S2：将S1获得的酶解液中加入0.8％的酿酒酵母和酿酒酵母菌重量的2-10％的原花青素，在温度为30℃下脱腥18min，过滤除去脱腥剂；
S3：将S2获得的脱腥酶解液经0.22μ膜过滤，然后经1k的超滤组件进行超滤，进而得到1k以下的组分，然后在0.05MPa、70℃的真空条件下浓缩至固形物含量为37％，干燥，即得富硒牡蛎小分子蛋白肽；
其中，蛋白酶含有5.2万U/g、2万U/g和0.3万U/g的碱性蛋白酶、胰蛋白酶和猕猴桃蛋白酶。
测得蛋白肽的分子量分布在378-965Da。
对比例1：
与实施例2的区别在于：S1中未加入亚硒酸钠。
对比例2：
与实施例2的区别在于：S1中未在低频电磁场下进行。
试验例1：
1.紫外光谱扫描
富硒牡蛎蛋白紫外吸收光谱的测定采用UV-VIS 2510PC紫外可见分光光度计，扫描范围为200-400nm。结果如图1所示，其中：
试验组用富硒牡蛎蛋白经过如下处理：将富硒牡蛎蛋白按照1:2.5的比例加水，调节pH至8.0后，再加入富硒牡蛎蛋白重量的亚硒酸钠，然后在低频电磁场频率为40Hz、温度为55℃下处理1h，然后干燥；
对照组1用富硒牡蛎蛋白经过如下处理：将富硒牡蛎蛋白按照1:2.5的比例加水，调节pH至8.0后，然后在低频电磁场频率为40Hz、温度为55℃下处理1h，然后干燥；
对照组2用富硒牡蛎蛋白经过如下处理：将富硒牡蛎蛋白按照1:2.5的比例加水，调节pH至8.0后，再加入富硒牡蛎蛋白重量的亚硒酸钠，然后在温度为55℃下处理1h，然后干燥；
空白组用富硒牡蛎蛋白经过如下处理：将富硒牡蛎蛋白按照1:2.5的比例加水，调节pH至8.0后，在温度为55℃下处理1h，然后干燥。
从图1中可以看出，空白组吸收强度最高，对照组1的吸收强度几乎没有什么变化，而对照组2和试验组的吸收强度降低明显，这说明亚硒酸钠的存在能够降低富硒牡蛎蛋白的疏水性，进而使得富硒牡蛎蛋白的结构变得疏松，暴露出更多的酶结合点，利用酶解反应的进行。
2.荧光光谱分析
采用F-4500荧光光度计公司，激发光波长为280nm，狭缝宽度为5nm，记录300-400波长范围内的发射光谱。结果如图2所示，其中：
试验组用蛋白酶经过如下处理：配置浓度为1mg/mL的蛋白酶溶液，调节pH至8.0后，再加入富硒牡蛎蛋白重量的亚硒酸钠，然后在低频电磁场频率为40Hz、温度为55℃下处理1h，然后干燥；
对照组1用蛋白酶经过如下处理：配置浓度为1mg/mL的蛋白酶溶液，调节pH至8.0后，然后在低频电磁场频率为40Hz、温度为55℃下处理1h，然后干燥；
对照组2用蛋白酶经过如下处理：配置浓度为1mg/mL的蛋白酶溶液，调节pH至8.0后，再加入富硒牡蛎蛋白重量的亚硒酸钠，然后在温度为55℃下处理1h，然后干燥；
空白组用蛋白酶经过如下处理：配置浓度为1mg/mL的蛋白酶溶液，调节pH至8.0后，在温度为55℃下处理1h，然后干燥。
从图1中可以看出，空白组吸收强度最高，对照组1和对照组2最大峰的位置几乎没有什么变化，而试验组最大峰的位置发生变化，这说明低频电磁场和亚硒酸钠能导致蛋白酶中酪氨酸和色氨酸残基附近的构象发生去折叠化的改变，从而改变酶在活性状态时的构象，进而促进酶与底物的结合，利用酶解反应的进行，提高富硒牡蛎小分子蛋白肽的得率。
3.水解度的测定
选用pH-stat法进行测定
水解度计算公式如下：
DH(％)＝(B×Nb)/(α×MP×htot)×100；
公式中，
B-消耗碱液体积(L)；
Nb-碱液浓度(mol/L)；
α-氨基解离度；
MP-所用蛋白质质量(g)；
htot-底物蛋白肽键含量(mmol/g)。
实施例1-4，对比例1-2水解度的测定结果表1所示，可以看出实施例2-4的水解度高于实施例1、对比例1-2，这说明本发明实施例2-4制备方法利用酶解反应的进行。
表1水解度的测定结果
| 类别 | 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 | 实施例4 | 对比例1 | 对比例2 |
| DH(％) | 52.1 | 65.3 | 63.2 | 64.2 | 58.1 | 56.7 |
试验例2：
1.感官评价
由8名具有一定感官评定经验的食品专业同学组成评定小组。将腥味感官评分分为五个等级：无腥味0-2分；微有腥味2-4分；腥味一般4-6分；腥味偏重6-8分；腥味较重8-10分。
其中空白对照为实施例2中未经S2处理的富硒牡蛎小分子蛋白肽，其感官评分定为10分。对实施例2和实施例5富硒牡蛎小分子蛋白肽进行嗅闻打分，根据对每组脱腥后样品的评分得出平均分即为该组样品的感官评分，根据实际情况保留一位小数点，每组三个重复试验，感官评分越低则表明腥味越轻，感官评分越高则表明腥味越重。实施例2富硒牡蛎小分子蛋白肽的感官评分为0.8，实施例5富硒牡蛎小分子蛋白肽的感官评分为0.4，这表明实施例5的脱腥效果好于实施例2，原花青素能和酿酒酵母发挥增益作用，加强对腥味物质的转化利用，提高脱腥过程的脱腥效果。
2.氨基甲酸乙酯的检测
氨基甲酸乙酯检测按照文献(Leca J M,Pereira V,Pereira A C,et al.Rapidand sensitive methodology for determination of ethyl carbamate in fortifiedwines using microextraction by packed sorbent and gas chromatography withmass spectrometric detection[J],Anal Chim Acta,2014,811:29-35)中描述的方法进行。测得实施例2获得的脱腥酶解液中氨基甲酸乙酯的含量为56.3μg/g，实施例2获得的脱腥酶解液中氨基甲酸乙酯的含量为5.2μg/g，这表明原花青素的加入能有效避免酶解液中出现氨基甲酸乙酯，提高富硒牡蛎小分子蛋白肽的使用安全性。
上述实施例中的常规技术为本领域技术人员所知晓的现有技术，故在此不再详细赘述。
以上实施方式仅用于说明本发明，而并非对本发明的限制，本领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此，所有等同的技术方案也属于本发明的范畴，本发明的专利保护范围应由权利要求限定。
Claims (10)
1.富硒牡蛎小分子蛋白肽的制备方法，其特征在于：包括：
S1：采用生物酶对富硒牡蛎蛋白进行酶解；
S2：将S1获得的酶解液用脱腥剂脱腥；
S3：将S2获得的脱腥酶解液经膜过滤，浓缩，干燥，即得富硒牡蛎小分子蛋白肽；
所述蛋白酶含有碱性蛋白酶、胰蛋白酶和猕猴桃蛋白酶。
2.根据权利要求1所述的富硒牡蛎小分子蛋白肽的制备方法，其特征在于：所述蛋白酶中碱性蛋白酶、胰蛋白酶和猕猴桃蛋白酶的用了分别为4-6万U/g、1-3万U/g和0.2-0.5万U/g。
3.根据权利要求1所述的富硒牡蛎小分子蛋白肽的制备方法，其特征在于：所述酶解pH为7.5-8.5，温度为50-60℃，时间为2-4h。
4.根据权利要求1或2或3所述的富硒牡蛎小分子蛋白肽的制备方法，其特征在于：所述酶解是在低频电磁场下进行；所述富硒牡蛎蛋白中加入亚硒酸钠。
5.根据权利要求4所述的富硒牡蛎小分子蛋白肽的制备方法，其特征在于：所述低频电磁场的频率为30-50Hz。
6.根据权利要求4所述的富硒牡蛎小分子蛋白肽的制备方法，其特征在于：所述亚硒酸钠加入量为富硒牡蛎蛋白重量的
7.根据权利要求1所述的富硒牡蛎小分子蛋白肽的制备方法，其特征在于：所述S2用脱腥剂为活性炭和/或β-环糊精和/或酵母和/或壳聚糖。
8.根据权利要求1或7所述的富硒牡蛎小分子蛋白肽的制备方法，其特征在于：所述脱腥条件为：添加量0.5-1.2％、温度25-35℃、时间10-30min。
9.根据权利要求1所述的富硒牡蛎小分子蛋白肽的制备方法，其特征在于：所述蛋白肽的分子量分布在389-980Da。
10.权利要求1-9任一项所述的富硒牡蛎小分子蛋白肽在制备增强免疫力产品中的用途。
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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Application publication date: 20190924 |