CN110268068B - 用于生产含有异麦芽酮糖晶体和海藻酮糖的固体材料的方法 - Google Patents
用于生产含有异麦芽酮糖晶体和海藻酮糖的固体材料的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了用于生产含有异麦芽酮糖晶体和海藻酮糖的固体材料的方法，其包括以下方法步骤A)使能够催化蔗糖反应为异麦芽酮糖和海藻酮糖的酶复合物与含有蔗糖的溶液接触；B)将所述蔗糖中的至少一些异构化为异麦芽酮糖和海藻酮糖；C)分离所述酶复合物，以得到含有异麦芽酮糖、海藻酮糖和水的溶液；D)通过蒸发部分除去水，同时获得浓缩溶液，基于总溶液，所述浓缩溶液的固体含量为75 wt%至95 wt%、优选80 wt%至93 wt%、尤其优选86 wt%至92 wt%；E)使浓缩溶液达到30℃至63℃、优选45℃至62℃、甚至更优选55℃至60℃的温度，且随后在该温度范围内诱导异麦芽酮糖结晶，随后冷却，同时获得含有异麦芽酮糖晶体和海藻酮糖的固体材料。
Description
技术领域
本发明提供了用于生产含有异麦芽酮糖晶体和海藻酮糖的固体材料的方法，其包括以下方法步骤
A) 使能够催化蔗糖反应为异麦芽酮糖和海藻酮糖的酶复合物与含有蔗糖的溶液接触；
B) 将所述蔗糖中的至少一些异构化为异麦芽酮糖和海藻酮糖；
C) 分离所述酶复合物，以得到含有异麦芽酮糖、海藻酮糖和水的溶液；
D) 通过蒸发部分除去水，同时获得浓缩溶液，基于总溶液，所述浓缩溶液的固体含量为75 wt%至95 wt%，优选80 wt%至93 wt%，尤其优选86 wt%至92 wt%；
E) 使浓缩溶液达到30℃至63℃、优选45℃至62℃、甚至更优选55℃至60℃的温度，且随后在该温度范围内诱导异麦芽酮糖结晶，随后冷却，同时获得含有异麦芽酮糖晶体和海藻酮糖的固体材料。
现有技术
异麦芽酮糖(α-D-吡喃葡萄糖基-1,6-果糖，也称为Palatinose®)是从蔗糖获得的糖替代品。其生产通过蔗糖的异构化进行，所述蔗糖的异构化通常使用异麦芽酮糖合酶(蔗糖葡糖基变位酶，EC 5.4.99.11)酶促实施。DE1049800、DE2217628、EP 28900和EP91063描述了使用固定化细菌细胞来将蔗糖酶促转化为异麦芽酮糖的方法。为此目的，EP0625578使用来自组Protaminobacter rubrum (CBS 574.77)、普城沙雷氏菌(Serratia plymuthica)(ATCC 15928)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)(NCIB 8285)、肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)(NRRL-B 512 F(ATCC 1083a))和大黄欧文氏菌(Erwinia rhapontici)(NCPPB 1578)的细菌菌株。EP 0392556和EP1257638描述了来自组土生克雷伯氏菌(Klebsiella terrigena) JCM 1687、克雷伯氏菌属种(Klebsiella sp.)编号88 (FERM BP-2838)和新加坡克雷伯氏菌(Klebsiella singaporiensis) LX3和LX21的细菌菌株的用途。
这些异构化方法使用活细胞或死细胞，用固定化细胞或游离细胞实施：例如，DE3133123和EP0915986例如描述了使用藻酸钙或离子交换剂的酶催化剂的固定化方法，正如EP0001099中所述，使用游离的活细胞的方法，所述细胞在发酵的背景下可以产生异麦芽酮糖。
在蔗糖的酶促反应中，作为副产物，经常形成海藻酮糖(α-D-吡喃葡萄糖基-1,1-果糖)以及果糖和葡萄糖。
因此，EP483755还描述了一种生产海藻酮糖的方法，其中，通过使用某些假单胞菌属或土壤杆菌属菌株的蔗糖葡糖基变位酶，基本上就海藻酮糖的产物产率而言优化上述方法。
DE102012216955公开了一种异麦芽酮糖的连续结晶的方法，其包括以下步骤：A)提供含有异麦芽酮糖和水的进料溶液，b)通过蒸发部分除去水以获得异麦芽酮糖晶体的悬浮液，C)将悬浮液分离成含有异麦芽酮糖的固体和母液，和任选地D)洗涤异麦芽酮糖-固体。
EP2674500公开了一种从包含异麦芽酮糖的糖液生产固体材料的方法，其中所述糖液通过使从蔗糖产生异麦芽酮糖的酶作用于蔗糖液体而获得，其中所述方法包括以下步骤：
加热所述糖液以将所述糖液的固体含量调节至77至96质量%，使由上述步骤产生的混合物经受剪切力以产生晶核，同时将产物的温度保持在65至120摄氏度，和冷却混合物，以获得固体材料。
现有技术的缺点是：可获得相当纯的异麦芽酮糖晶体，由此浪费了所包含的海藻酮糖；不是获得结晶固体，而是获得无定形固体；以及在高温范围下工作，这需要大量能量。
因此，本发明的一个目的是提供克服现有技术方法的至少一个缺点的方法。
发明描述
令人惊讶地，现已发现根据权利要求1的方法能够实现该目的。
因此，本发明提供了用于生产含有异麦芽酮糖晶体和海藻酮糖的固体材料的方法，其包括以下方法步骤
A) 使能够催化蔗糖反应为异麦芽酮糖和海藻酮糖的酶复合物与含有蔗糖的溶液接触；
B) 将所述蔗糖中的至少一些异构化为异麦芽酮糖和海藻酮糖；
C) 分离所述酶复合物，以得到含有异麦芽酮糖、海藻酮糖和水的溶液；
D) 通过蒸发部分除去水，同时获得浓缩溶液，基于总溶液，所述浓缩溶液的固体含量为75 wt%至95 wt%，优选80 wt%至93 wt%，尤其优选86 wt%至92 wt%；
E) 使浓缩溶液达到30℃至63℃、优选45℃至62℃、甚至更优选55℃至60℃的温度，且随后在该温度范围内诱导异麦芽酮糖结晶，随后冷却，同时获得含有异麦芽酮糖晶体和海藻酮糖的固体材料。
根据本发明的方法的一个优点是恒定的产物质量。
根据本发明的方法的又一个进一步优点是实现增加的设备特异性的时空产率。
根据本发明的方法的又一个进一步优点是不需要晶种及其复杂的生长。
根据本发明的方法的一个进一步优点是可以节省能量，因为该方法可以在低温下运行。
根据本发明的方法的又一个进一步优点是产率更高，因为与关注纯异麦芽酮糖的单纯结晶方法相比，更多的产物被固化。
本发明的另一个优点是以下事实，获得的产物即可使用，并且不需要延长的时间段用于完成晶体形成。
术语“异麦芽酮糖”应理解为意指6-O-α-D-吡喃葡萄糖苷-D-果糖。
术语“海藻酮糖”应理解为意指1-O-α-D-吡喃葡萄糖苷-D-果糖。
术语“酶复合物”应理解为意指具有至少一种活性酶的组合物或混合物组合物，其本质上也可以是复杂的，诸如例如活细胞。酶复合物的另外的实例是融合蛋白，其中至少一种活性酶与至少一种另外的多肽连接，但纯化的酶本身也可以是用于本发明目的的酶复合物。
关于本发明，术语“固定化的酶复合物”应理解为意指这样的酶复合物，其与基质键合或被基质包封，使得酶复合物在水溶液中其自由扩散或其自由移动方面被限制，例如减慢。
关于本发明，术语“含有异麦芽酮糖晶体和海藻酮糖的固体材料”应理解为意指基于总固体材料含有至少50 wt%、优选至少70 wt%、甚至更优选至少90 wt%的结晶物质的固体材料。适用于测定晶体含量的方法是X-射线衍射。
给定重量值的物质是指无水物质。
除非另有说明，否则给出的所有百分比(%)均为质量百分比。
在根据本发明的方法中，基于总的含有蔗糖的溶液，在方法步骤A)的含有蔗糖的溶液中存在20-80重量%、尤其是30-50重量%的蔗糖浓度。
根据本发明的优选方法特别适用于生产含有异麦芽酮糖晶体和海藻酮糖的固体材料，相对于干燥固体材料的总重量，所述固体材料含有70至90 wt%、特别是72至89 wt%、更特别是74至88 wt%、更特别是75至85wt%的量的异麦芽酮糖。相对于干燥固体材料的总重量，含有异麦芽酮糖晶体和海藻酮糖的固体材料包含5至25 wt%、特别是6至20 wt%的量的海藻酮糖。
相对于干燥固体材料的总重量，含有异麦芽酮糖晶体和海藻酮糖的固体材料可以包含0.1至5 wt%、特别是0.2至4 wt%的量的葡萄糖。
相对于干燥固体材料的总重量，含有异麦芽酮糖晶体和海藻酮糖的固体材料可以包含0.1至5 wt%、特别是0.2至4 wt%的量的果糖。
相对于干燥固体材料的总重量，含有异麦芽酮糖晶体和海藻酮糖的固体材料可以包含0.05至4 wt%、特别是0.1至3 wt%的量的蔗糖。
优选地，含有异麦芽酮糖晶体和海藻酮糖的固体材料含有上述糖中的所有三种。
存在于酶复合物中的酶优选为至少一种酶类型EC 5.4.99.11的蔗糖葡糖基变位酶。在根据本发明的方法中，尤其优选使用来自以下的蔗糖葡糖基变位酶：Protaminobacter rubrum，尤其是菌株Protaminobacter rubrum CBS 574.77；红色精朊杆菌(Protaminobacter ruber) Z12；普城沙雷氏菌，尤其是菌株普城沙雷氏菌 ATCC 15928；气味沙雷氏菌(Serratia odorifera)，尤其是菌株气味沙雷氏菌4Rx13；粘质沙雷氏菌，尤其是菌株粘质沙雷氏菌NCIB 8285；肠膜明串珠菌，尤其是菌株肠膜明串珠菌ATCC 1083 a；大黄欧文氏菌，尤其是菌株大黄欧文氏菌ATCC29283、NCPPB 1578、DSM 4484、NX-5和WAC2928，欧文氏菌属种，尤其是菌株欧文氏菌属种D12；放射形土壤杆菌(Agrobacterium radiobacter)，尤其是菌株放射形土壤杆菌MX-232；土生克雷伯氏菌，尤其是菌株土生克雷伯氏菌JCM 1687；克雷伯氏菌属种，尤其是菌株克雷伯氏菌属种FERM BP-2838、LX3和NK33-98-8；肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)，尤其是菌株肺炎克雷伯氏菌342；新加坡克雷伯氏菌，尤其是菌株新加坡克雷伯氏菌LX21；嗜中酸假单胞菌(Pseudomonas mesoacidophila)，尤其是菌株嗜中酸假单胞菌MX-45；分散泛菌(Pantoea dispersa)，尤其是菌株分散泛菌UQ68J；植生克雷伯氏菌(Klebsiella planticola)，尤其是菌株植生克雷伯氏菌CCRC 19112、MX10和UQ14S；肠杆菌属种，尤其是菌株肠杆菌属种FMB-1 (Seq IDNo.16)、SZ62和Ejp617；维涅兰德固氮菌(Azotobacter vinelandii) DJ，其中尤其优选Protaminobacter rubrum CBS 574.77和红色精朊杆菌Z12。
所述酶可以作为多肽以纯化形式使用。为了易于纯化，这些可以呈融合蛋白的形式，其中，例如，将允许易于纯化的标签，诸如例如His标签、Strep标签、GST标签或MBP标签，与所述酶融合。
在根据本发明的方法中，优选的是，所述酶复合物是全细胞，所述全细胞优选选自以下组：Protaminobacter rubrum，尤其是菌株Protaminobacter rubrum CBS 574.77；红色精朊杆菌Z12；普城沙雷氏菌，尤其是菌株普城沙雷氏菌 ATCC 15928；气味沙雷氏菌(Serratia odorifera)，尤其是菌株气味沙雷氏菌4Rx13；粘质沙雷氏菌，尤其是菌株粘质沙雷氏菌NCIB 8285；肠膜明串珠菌，尤其是菌株肠膜明串珠菌ATCC 1083 a；大黄欧文氏菌，尤其是菌株大黄欧文氏菌ATCC29283、NCPPB 1578、DSM 4484、NX-5和WAC2928，欧文氏菌属种，尤其是菌株欧文氏菌属种D12；放射形土壤杆菌(Agrobacterium radiobacter)，尤其是菌株放射形土壤杆菌MX-232；土生克雷伯氏菌，尤其是菌株土生克雷伯氏菌JCM 1687；克雷伯氏菌属种，尤其是菌株克雷伯氏菌属种FERM BP-2838、LX3和NK33-98-8；肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)，尤其是菌株肺炎克雷伯氏菌342；新加坡克雷伯氏菌，尤其是菌株新加坡克雷伯氏菌LX21；嗜中酸假单胞菌(Pseudomonas mesoacidophila)，尤其是菌株嗜中酸假单胞菌MX-45；分散泛菌(Pantoea dispersa)，尤其是菌株分散泛菌UQ68J；植生克雷伯氏菌(Klebsiella planticola)，尤其是菌株植生克雷伯氏菌CCRC 19112、MX10和UQ14S；肠杆菌属种，尤其是菌株肠杆菌属种FMB-1、SZ62和Ejp617；维涅兰德固氮菌(Azotobacter vinelandii) DJ，其中尤其优选Protaminobacter rubrum CBS 574.77和红色精朊杆菌Z12。优选包括于根据本发明的优选方法中的全细胞可以呈任何状态，如生长、静息、存活或死亡，其中特别优选静息细胞。
酶复合物的固定化可以例如以CLEAs(不溶性交联酶聚集体)的形式(Cao, L. 等人, 2000, Cross-linked enzyme aggregates: a simple and effective method for the immobilization of penicillin acylase, Org. Lett., 2: 1361-1264)或在天然或合成来源的固体支持材料上进行。天然材料是例如多糖诸如藻酸盐、琼脂糖、sepharose、纤维素及其衍生物(例如DEAE-或CM-纤维素)。也可以使用修饰的sepharose，诸如例如，环氧-活化、溴氰-活化、NHS-活化、硫醇-活化的sepharose。这些sepharose可商业得自例如公司GE Healthcare、BioRad、Sigma和Pierce。
可以使用的合成有机聚合物是聚苯乙烯衍生物，聚丙烯酸酯，尤其是环氧化物活化的丙烯酸树脂珠(Eupergit)，聚甲基丙烯酸酯，聚丙烯酰胺，乙烯基和烯丙基聚合物，聚酯或聚酰胺。
优选的聚(甲基)丙烯酸酯选自丙烯酸C1-C10-烷基酯聚合物，甲基丙烯酸C1-C10-烷基酯聚合物和丙烯酸C1-C10-烷基酯-甲基丙烯酸C1-C10烷基酯共聚物。用于包封的方法和进一步优选使用的聚(甲基)丙烯酸酯聚合物描述于EP3114218中。
可能的无机载体是基于氧化硅或氧化铝或其混合物的材料。
酶复合物的固定化也可以通过包封于聚合多孔凝胶例如RSi(OCH3)3或RSi(OCH3)3和Si(OCH3)4的混合物(Reetz, M.T.; Zonta, A.; Simpelkamp, J.; Rufinska, A.;Tesche, B. J. Sol-Gel Sci. Technol. 1996, 7, p. 35-43)或多孔聚合硅胶(Elgren,T.M.; Zadvorny, O.A.; Brecht, E.; Douglas, T.; Zorin, N.A.; Maroney, M. J. &Peters, J. W.)的疏水性溶胶-凝胶材料中进行。
此外，除了固定化之外，可想到在酶膜反应器中多次使用酶。
在根据本发明的方法中使用的酶复合物，特别是细胞，优选固定化在多糖、诸如藻酸盐、果胶、角叉菜胶、壳聚糖或聚乙烯醇、诸如例如lentikats或其混合物、尤其是藻酸盐中；在这方面，参考例如Shimizu, H., 等人. (1997) Screening of novel microbial enzymes for the production of biologically and chemically useful compounds, in: Advances in biochemical engineering biotechnology, Vol58: New Enzymes for Organic Synthesis (Scheper, T., 编) pp. 45-88, Springer, New York。
待用于根据本发明的方法中使用的任何形式的酶复合物的特别优选的固定化是EP2011865中描述的方法，其中固定化在惰性支持物上的酶复合物提供有通过氢化硅烷化获得的硅酮涂层。
根据本发明优选的是，在方法步骤B)中，存在4至9.5的pH。该pH有利地在酸、尤其是无机酸(优选选自硫酸、盐酸或乙酸)的帮助下建立。
根据本发明还优选的是，在方法步骤B)中，存在在含有蔗糖的溶液中测量的20至40℃、优选25至35℃的温度。
在方法步骤C)中，将酶复合物和最终包含的固体杂质与异麦芽酮糖分离；这例如通过过滤、沉降、离子交换色谱或离心进行。由于酶复合物的固定物(immobilizate)特征，与非固定化的酶相比，这种分离易于进行。
出于工艺经济的原因，根据本发明优选固定化酶复合物以固体床的形式使用，含有蔗糖的溶液通过所述固体床流动(H. Schiweck, Zuckerind. (1990), 115 (7), 555-565)。相应的固体床方法描述于A. Liese, 等人 Processes in A. Liese, K. Seelbach,C. Wandrey (Eds.), Industrial Biotransformations 第2版 (2006), Wiley-VCH,Weinheim。
可能有利的是最终包含的固体杂质通过沉降与异麦芽酮糖分离。这优选通过以下来实现，经2天至60天、优选10天至50天、更优选20天至40天的时间段、优选在2℃至30℃、优选3℃至25℃、尤其优选4℃至12℃的温度范围内储存，同时最终包含的固体杂质沉入含有异麦芽酮糖、海藻酮糖和水的溶液的底部。
这具有令人惊讶的技术效果，即可以在低至30℃的温度下诱导异麦芽酮糖结晶的诱导。因此；根据本发明的一种替代优选方法的特征在于，在方法步骤C)中，通过经2天至60天的时间段内储存，将酶复合物和最终包含的固体杂质与异麦芽酮糖分离，优选一起具有以下特征：在步骤D)中，通过蒸发除去水，同时获得浓缩溶液，基于总溶液，所述浓缩溶液具有86 wt%至92 wt%的固体含量，并且在步骤E)中，使浓缩溶液达到30℃至50℃的温度。
通过改变蒸发程度，可以实现不同的固体含量；例如，这可以经由方法步骤D)中的停留时间来控制。
根据本发明优选的方法的特征在于，方法步骤D)在50℃至80℃、优选60℃至75℃、特别优选63℃至68℃的温度范围内和70毫巴至200毫巴、优选100毫巴至180毫巴、尤其优选130毫巴至160毫巴的压力范围内实施。具体而言，在该上下文中优选的是，在根据本发明的方法中，方法步骤D)在63℃至68℃的温度范围内和在130毫巴至160毫巴的压力范围内实施。
根据本发明的一个替代优选方法的特征在于，方法步骤D)在50℃至80℃、优选60℃至75℃、特别优选63℃至68℃的温度范围内和250毫巴至500毫巴、优选275毫巴至450毫巴、尤其优选300毫巴至400毫巴的压力范围内实施。具体而言，在该上下文中优选的是，在根据本发明的方法中，方法步骤D)在63℃至68℃的温度范围内和在300毫巴至400毫巴的压力范围内实施。
根据本发明的又进一步替代优选方法的特征在于，方法步骤D)在95℃至130℃、优选106℃至121℃、特别优选108℃至118℃的温度范围内和250毫巴至500毫巴、优选275毫巴至450毫巴、尤其优选300毫巴至400毫巴的压力范围内实施。具体而言，在该上下文中优选的是，在根据本发明的方法中，方法步骤D)在108℃至118℃的温度范围内和在300毫巴至400毫巴的压力范围内实施。
通过改变蒸发程度，可以实现不同的固体含量和/或产率；例如，这可以经由方法步骤D)中的停留时间、压力和温度来控制。蒸发可以在连续或间歇蒸发器中进行。
根据本发明优选的是，在方法步骤D)中，存在3.5至9.5的pH。
在方法步骤E)中，使浓缩溶液达到30℃至63℃、优选45℃至62℃、甚至更优选55℃至60℃的温度，优选在环境压力下。
特别优选的是，根据本发明，在方法步骤D)中，获得浓缩溶液，基于总溶液，所述浓缩溶液具有86 wt%至92 wt%的固体含量，并且在方法步骤E)中，使浓缩溶液达到55℃至60℃的温度。
根据本发明优选的方法的特征在于，在方法步骤E)中，使浓缩溶液达到30℃至63℃、优选45℃至62℃、甚至更优选55℃至60℃的温度，并且随后通过选自以下中的至少一种的方式诱导异麦芽酮糖结晶：添加异麦芽酮糖晶种、剪切力、搅拌、摩擦、辐射和超声波，其中尤其优选剪切力。在该上下文中，特别优选的是，通过选自剪切力的方式诱导异麦芽酮糖结晶，但不添加异麦芽酮糖晶种。
根据本发明优选的方法的特征在于，如果在方法步骤E)中添加异麦芽酮糖晶种，则基于浓缩溶液中含有的异麦芽酮糖的总量，这些以0.01重量%-10重量%且尤其优选0.1重量%-1重量%的量添加。
根据本发明优选的方法的特征在于，在方法步骤E)中，剪切力通过剪切力施加装置诱导异麦芽酮糖晶体，优选不添加异麦芽酮糖晶种。
在本发明中，“剪切力施加装置”是在材料上施加剪切力的装置。这可以是例如能够捏合高粘性材料的装置，因此是经其在一个方向和相反方向上施加移动材料的力以研磨、捏合或混合材料的装置。这尤其可以是具有作为捏合机的功能的装置，更特别是可以加热和刮擦材料、使得加工材料不会留在、粘附至装置的容器的装置。该装置可以是捏合机、挤出机、捏合机、搅拌机和通用混合搅拌机，其中优选使用挤出机。
这些剪切力施加装置可以是小型实验室捏合机，其具有体积为100-300 ml的双壁容器。该装置优选具有10-40 rpm、更优选20-40 rpm的的旋转速度。该装置可以具有带有两个同向旋转捏合叶片的水平捏合槽，并且该装置的最大扭矩可以是40 Nm或30 Nm。产物的温度可以经由双壁夹套中的热流体调节。作为实例，提及IKA HKD-T 06。该装置中的产物以圆周运动移动并且在捏合叶片之间剪切。在该装置中，完全结晶和形成白色固体产物所需的时间段(下文称为“加工时间”)可以是1-40 min，优选3-15 min。在加工时间期间，通过捏合和搅拌将剪切力连续施加至异麦芽酮糖混合物。捏合装置以分批模式操作。在完成加工时间之后，将产物从捏合槽中取出。
作为连续剪切力施加装置，可以采用实验室挤出机，特别是同向旋转双螺杆挤出机，例如Haake PolyLab OS。螺杆的长径比(L/D)可以是25。螺杆可以构造成含有运输和捏合元件。材料从进料口水平运输至挤出机的出料端。将产物在螺杆中，且尤其是在捏合元件之间剪切。该装置的最大扭矩可以是130 Nm或100 Nm。挤出机可以具有挤出机筒体的电加热。挤出机的旋转速度可以是5-100 rpm，优选10-50 rpm。挤出机中的加工时间可以是20sec至5 min，优选30 sec至2 min。
作为较大规模的剪切力施加装置，可以使用捏合机-挤出机，特别是具有单个旋转进料螺杆的捏合机。螺杆可以含有运输和捏合元件。材料从进料口水平运输至挤出机的出料端。将产物在螺杆中，且尤其是在捏合元件之间剪切。
根据本发明优选的方法的特征在于，在方法步骤E)中，通过超声波诱导异麦芽酮糖结晶通过声处理实现，所述声处理具有20 W/cm²至400 W/cm²、尤其是80 W/cm² -300 W/cm²、尤其是120 W/cm²-180 W/cm²范围内的比表面功率密度。
根据本发明优选的是，在方法步骤E)中，存在3.5至9.5的pH。
下面列出的实施例通过实例的方式描述本发明，但并不意图限制本发明，本发明的范围由整个说明书和权利要求书至实施例中所述的实施方案得出。
实施例：
实施例1：含有蔗糖的溶液的异构化
对于所有实验，异构化如下实施：
将来自菌株Protaminobacter rubrum (CBS574.77)的传代培养物的细胞用1-5ml无菌营养培养基淘洗，所述无菌营养培养基由50 g/kg蔗糖、15 g/kg玉米溶胀水、7 g/kg硫酸铵、0.5 g/kg酵母提取物、1 g/kg硫酸二氢钾(potassium dihydrogensulphate)、0.41g/kg氯化镁七水合物、0.004 g/kg氯化锰四水合物、0.047 g/kg柠檬酸铁一水合物和926g/kg水组成，如果必要，将其调节至pH 7.2。该悬浮液充当预培养的接种物，所述预培养在1l摇瓶中包含200 ml上述营养溶液。
在30℃下培养20小时后，向具有1升无菌生产培养基的2升发酵罐中以使得初始光密度(OD600)为1的方式接种预培养物，所述无菌生产培养基由50 g/kg蔗糖、15 g/kg玉米溶胀水、3 g/kg硫酸铵、4 g/kg磷酸氢铵、0.5 g/kg酵母提取物、1 g/kg硫酸二氢钾、0.41 g/kg氯化镁七水合物、0.004 g/kg氯化锰四水合物、0.047 g/kg柠檬酸铁一水合物和926 g/kg水组成，其被调节至pH 7.2。
发酵在30℃、pH 7(经调节的)和30%的pO2(级联搅拌器，Airflow)下进行。在发酵期间进料蔗糖。15-20 h后，发酵过程完成，并且可以收获生物质用于固定化。
为此目的，将所得悬浮液与水和4%强度的藻酸盐溶液以体积比1:1混合。然后将该悬浮液通过滴入2%强度的CaCl2溶液来固定化。将所得珠粒用聚乙烯亚胺和戊二醛后固化。所得的生物催化剂可以在4-10℃下储存几周。
将获得的固定化细胞引入可加热的柱反应器中并加热至20-35℃，并且基于总浓汁，将具有含量为41重量%的蔗糖的来自甜菜的稀释的浓汁以连续流通过。
异构化后的组成可以见于表1。
表1 异构化浓汁的组成。
实施例2：沉降
对于一些实验，最终包含的固体杂质通过在20℃下经30天的时间段的储存通过沉降来从异麦芽酮糖分离。
实施例3：浓缩
将含有异麦芽酮糖、海藻酮糖和水的溶液在旋转蒸发器中在65℃和130毫巴下浓缩至85至98%的期望的固体含量。在蒸发过程期间将压力降低至110毫巴，以补偿浓缩溶液的蒸汽压下降。在蒸发过程结束时，将温度在150毫巴下上升至95℃以获得可倾倒的糖浆。
下文以百分比计的给定水含量值等于100 wt% - wt%固体含量。
实施例4：结晶
在具有捏合和运输元件的Thermo Fischer连续双螺杆挤出机(Haake PolyLab OSPTW 16/25)中诱导结晶。将浓缩的糖浆转移至挤出机的加热的(~140℃)进料漏斗中。
在较高温度下的结晶诱导产生不易处理的产物且需要较高的能量额(C1和C2)。过于高度浓缩的溶液不能正确结晶(C3)。在根据本发明的温度下形成的非常有用的结晶块可以非常容易地进一步加工并且提供外观令人愉悦的即用、非常均匀的产物。
Claims (20)
1.用于生产含有异麦芽酮糖晶体和海藻酮糖的固体材料的方法，其包括以下方法步骤
A) 使能够催化蔗糖反应为异麦芽酮糖和海藻酮糖的酶复合物与含有蔗糖的溶液接触；
B) 将所述蔗糖中的至少一些异构化为异麦芽酮糖和海藻酮糖；
C) 分离所述酶复合物，以得到含有异麦芽酮糖、海藻酮糖和水的溶液；
D) 通过蒸发部分除去水，同时获得浓缩溶液，基于总溶液，所述浓缩溶液的固体含量为75 wt%至95 wt%；
E) 使所述浓缩溶液达到30℃至63℃的温度，且随后在该温度范围内诱导异麦芽酮糖结晶，随后冷却，同时获得含有异麦芽酮糖晶体和海藻酮糖的固体材料，其特征在于
存在于所述酶复合物中的酶是至少一种酶类型EC 5.4.99.11的蔗糖葡糖基变位酶。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于
基于总溶液，方法步骤D）中的所述浓缩溶液具有80 wt%至93 wt%的固体含量。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于
基于总溶液，方法步骤D）中的所述浓缩溶液具有86 wt%至92 wt%的固体含量。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于
在方法步骤E）中，使所述浓缩溶液达到45℃至62℃的温度。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于
在方法步骤E）中，使所述浓缩溶液达到55℃至60℃的温度。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于
基于总的含有蔗糖的溶液，在方法步骤A)的含有蔗糖的溶液中存在20-80重量%的蔗糖浓度。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于
基于总的含有蔗糖的溶液，在方法步骤A)的含有蔗糖的溶液中存在30-50重量%的蔗糖浓度。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其特征在于
在方法步骤B)中，存在3.5至9.5的pH。
9.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其特征在于
在方法步骤C)中，通过过滤、沉降或离心将所述酶复合物和最终包含的固体杂质与异麦芽酮糖分离。
10.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其特征在于
方法步骤D)在63℃至68℃的温度范围内和在130毫巴至160毫巴的压力范围内实施。
11.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其特征在于
在方法步骤D)中，获得浓缩溶液，基于总溶液，所述浓缩溶液具有86 wt%至92 wt%的固体含量，并且在方法步骤E)中，使浓缩溶液达到55℃至60℃的温度。
12.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其特征在于
通过选自以下中的至少一种的方式诱导异麦芽酮糖结晶：添加异麦芽酮糖晶种、剪切力、搅拌、摩擦、辐射和超声波。
13.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其特征在于
相对于干燥固体材料的总重量，含有异麦芽酮糖晶体和海藻酮糖的固体材料包含
70至90 wt%的量的异麦芽酮糖，
5至25 wt%的量的海藻酮糖，
0.1至5 wt%的量的葡萄糖，
0.1至5 wt%的量的果糖，和
0.05至4 wt%的量的蔗糖。
14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于
相对于干燥固体材料的总重量，含有异麦芽酮糖晶体和海藻酮糖的固体材料包含72至89 wt%的量的异麦芽酮糖。
15.根据权利要求13所述的方法，其特征在于
相对于干燥固体材料的总重量，含有异麦芽酮糖晶体和海藻酮糖的固体材料包含74至88 wt%的量的异麦芽酮糖。
16.根据权利要求13所述的方法，其特征在于
相对于干燥固体材料的总重量，含有异麦芽酮糖晶体和海藻酮糖的固体材料包含75至85 wt%的量的异麦芽酮糖。
17.根据权利要求13所述的方法，其特征在于
相对于干燥固体材料的总重量，含有异麦芽酮糖晶体和海藻酮糖的固体材料包含6至20 wt%的量的海藻酮糖。
18.根据权利要求13所述的方法，其特征在于
相对于干燥固体材料的总重量，含有异麦芽酮糖晶体和海藻酮糖的固体材料包含0.2至4 wt%的量的葡萄糖。
19.根据权利要求13所述的方法，其特征在于
相对于干燥固体材料的总重量，含有异麦芽酮糖晶体和海藻酮糖的固体材料包含0.2至4 wt%的量的果糖。
20.根据权利要求13所述的方法，其特征在于
相对于干燥固体材料的总重量，含有异麦芽酮糖晶体和海藻酮糖的固体材料包含0.1至3 wt%的量的蔗糖。
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