CN110251457A - 一种具有强粘附与止血功能的抗肿瘤缓释植入剂及其制备方法 - Google Patents

一种具有强粘附与止血功能的抗肿瘤缓释植入剂及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种具有强粘附与止血功能的抗肿瘤缓释植入剂及其制备方法，受贻贝粘附机理和儿茶酚与铁离子鳌合机制的启发，通过仿生设计，成功开发了一种基于贻贝粘附机理衍生的术后热化疗水凝胶，作为多功能手术组织黏附和治疗剂，其主要成分包括壳聚糖、没食子酸、Fe3+螯合剂和药物，是将壳聚糖和没食子酸共价交联并冷冻干燥，再在临用前溶解并加入抗癌药物，然后利用Fe3+螯合剂进行交联，超声混匀后成胶，便可进行创口的涂覆与治疗。本发明的植入剂具有对创口进行粘附、止血、抗菌、消炎、热化疗等多种功能，通过对肿瘤不规则创口涂覆植入剂，同时进行温和的热化疗，可以实现对实体肿瘤术后的复发预防。

Description

一种具有强粘附与止血功能的抗肿瘤缓释植入剂及其制备 方法
技术领域
本发明属于纳米材料制备及生物医药领域，具体涉及一种具有强粘附与止血功能的抗肿瘤缓释植入剂及其制备方法。
背景技术
目前，虽然各种新兴的癌症治疗方法在动物模型上已经取得了良好的治疗效果，但外科手术仍然是临床癌症治疗的主要手段之一，其主要通过切除原发性甚至转移性肿瘤来挽救病人的生命。然而，肿瘤边缘的不规则、正常组织与肿瘤组织边界的模糊以及肿瘤生长和侵袭的重要组织区域难以分辨，都会使得肿瘤切除不完整，进一步导致肿瘤复发。其次，手术切除创口处易出血、易感染、癌细胞易转移，这也是造成肿瘤切除的患者不能像手术预期那样，继续存活的重要原因之一。因此，亟待开发一种兼具药物递送、抗炎和止血的组织粘附缓释植入剂用于肿瘤术后的抗复发治疗。
壳聚糖是一种天然碱性聚合电解质多糖，具有良好的生物相容性和抗菌活性，并且价格低廉。壳聚糖表面带有正电荷，能够吸附带负电的红细胞而诱导其聚集，进一步促进血小板凝血，因此被广泛应用于伤口止血和抗菌领域。但由于其水溶性较差，一般选用盐酸或醋酸进行溶解，且抗菌止血活性受壳聚糖的种类、分子量、润湿性等诸多物理化学性质的影响，临床应用受到了极大限制。因此，设计一种水溶性壳聚糖复合材料有潜在的应用价值，不仅能提高其生物相容性，还能显著改善其抗菌活性。
组织粘附剂注射填充在充斥着大量血液、组织液的创口处，因此需要极强的粘附性。贻贝在高盐度的海水中有着非常强的粘附力，这是由于其足丝吸盘中富含Mefp3、Mefp5两种足丝蛋白。通过对两种足丝蛋白的进一步的成分分析发现，类似于多巴的儿茶酚结构对于足丝的粘附性起着关键作用。没食子酸是工业上重要的多酚类化合物，因其具有类儿茶酚的结构，可将其用作界面粘附材料，用于肿瘤创口处的粘合作用。同时，没食子酸溶解后呈酸性，能显著改善壳聚糖的水溶性，酚羟基具有良好的抗氧化性，能够显著清除细胞内产生的自由基，起到抗菌消炎的作用，从而保护术后创口的生理环境。没食子酸的酚羟基具有良好的金属离子螯合性，能够在不同pH值条件下与Fe3+可逆性螯合，螯合后的产物具有低毒性、良好的光热转化能力与pH值响应性药物释放能力。
受贻贝粘附机理和儿茶酚与Fe3+鳌合机制的启发，本发明成功开发了一种基于贻贝粘附机理衍生的术后热化疗水凝胶，作为多功能手术组织黏附剂，表现出了良好的止血、抗炎、抗肿瘤等性能。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有强粘附与止血功能的抗肿瘤缓释植入剂，从而解决传统癌症手术治疗中创口易出血、易感染、易发炎、癌细胞易转移等诸多难题，通过对肿瘤不规则创口涂覆植入剂，同时进行温和的热化疗，实现对肿瘤术后的复发预防。
为达到上述目的，本发明采取如下技术方案：
本发明首先公开了一种具有强粘附与止血功能的抗肿瘤缓释植入剂，其特点在于：首先通过一步碳二亚胺偶联法将没食子酸接枝到壳聚糖骨架上，透析和冷冻干燥得到没食子酸接枝壳聚糖共聚物，记为CSG前驱体；
将所述CSG前驱体溶解于去离子水中，再与Fe3+螯合剂进行反应，即得到具有强粘附与止血功能的未载药的抗肿瘤缓释植入剂；
或者：先将抗肿瘤药物溶解于去离子水中，再将CSG前驱体溶解于含药物的去离子水溶液中，最后再与Fe3+螯合剂进行反应，即形成具有强粘附与止血功能的包载药物的抗肿瘤缓释植入剂。
进一步地，所述CSG前驱体中，没食子酸与壳聚糖的接枝率在8.1％～21.5％，随着没食子酸含量的增加，所得植入剂的抗氧化性能会提高，光热性能会提高。
进一步地，所述CSG前驱体在去离子水中的浓度在10～40mg/mL，随着CSG前驱体浓度的增加，水凝胶的机械性能和粘附性能会提高，可注射性能会下降。
进一步地，所述Fe3+螯合剂为含Fe3+的无机盐，如FeCl3·6H2O、Fe(NO3)3。
进一步地，所述CSG前驱体中没食子酸与Fe3+螯合剂中Fe3+的摩尔比为3:1。Fe3+浓度太低形成不了凝胶，太高难以扩散均匀。当比例为3:1时，可以形成均一的可注射水凝胶。
本发明还公开了所述具有强粘附与止血功能的抗肿瘤缓释植入剂的制备方法，其特点在于：
将壳聚糖2～8mmol和1-羟基苯并三氮唑一水合物2～8mmol溶于100mL去离子水中，搅拌至溶液澄清透明；将0.05mmol/mL的没食子酸水溶液40mL逐滴加入至壳聚糖溶液中，然后再逐滴加入1mmol/mL 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐的乙醇溶液2mL，所得混合体系在室温、避光条件下反应16～24h；
反应结束后，将反应物倒入14000Da的透析袋中，氮气保护下，37～40℃透析16-24h，透析体系每2h换一次水；透析完成后，所得产物冷冻干燥，即获得没食子酸接枝壳聚糖共聚物，记为CSG前驱体；
称取10～40mg CSG前驱体，溶解于900μL去离子水中，超声至溶解，然后加入100μL的Fe3+螯合剂溶液，超声反应30～60min，得到具有强粘附与止血功能的未载药的抗肿瘤缓释植入剂；
或者：先将抗肿瘤药物溶解于900μL去离子水中，再加入10～40mg CSG前驱体，然后加入100μL的Fe3+螯合剂溶液，超声反应30～60min，得到具有强粘附与止血功能的包载药物的抗肿瘤缓释植入剂。
进一步地，通过改变壳聚糖中氨基葡萄糖单元与没食子酸的摩尔比，可以合成具有不同没食子酸接枝率的没食子酸接枝壳聚糖共聚物。
本发明所述具有强粘附与止血功能的抗肿瘤缓释植入剂是基于贻贝粘附机理和儿茶酚与Fe3+鳌合机制的启发，开发的一种贻贝粘附机理衍生的术后热化疗水凝胶，作为多功能手术组织黏附剂，可用于实体肿瘤注射后的热化疗，亦可用于肿瘤手术创口的粘附、止血、消炎、抗菌以及通过热化疗预防肿瘤再复发。
本发明的热化疗治疗可以用在包括但不限于肿瘤、痤疮及各种炎症等一些病变组织和细胞上。本发明的植入剂可包载多种类型的亲水药物，可根据肿瘤耐药类型进行改变，如双氯芬酸钠、盐酸阿霉素、盐酸多柔比星等。
本发明的植入剂是指CSG前驱体与Fe3+鳌合得到的可植入体内的无菌胶体制剂。植入剂可采用手术切除肿瘤后涂覆，也可用特制的注射器植入肿瘤内部。
本发明的具有强粘附与止血功能的抗肿瘤缓释植入剂，可先将CSG前驱体冷冻干燥保存，置于密封和避光的包装袋中，临用前再将其溶解并与Fe3+螯合剂混合，制成水凝胶。
与已有技术相比，本发明的有益效果体现在：
1、本发明具有强粘附与止血功能的抗肿瘤缓释植入剂有很好的细胞、动物生物相容性以及抗氧化性能。
2、本发明具有强粘附与止血功能的抗肿瘤缓释植入剂有良好的抗菌性能，当实验选取大肠杆菌(E.coli)和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)为致病菌模型时，CSG前驱体及其制备的水凝胶均表现出显著的抗菌能力。
3、本发明具有强粘附与止血功能的抗肿瘤缓释植入剂有很强的粘附性，通过组织胶粘剂剪切搭接测试，其湿润状态下的组织粘附强度达到7.5Kpa，可粘附在具有大量组织液及血液的不规则手术创面上。
4、本发明具有强粘附与止血功能的抗肿瘤缓释植入剂有非常好的止血性能，大鼠肝脏模型的止血实验证明，所述抗肿瘤缓释植入剂达到有效止血的时间(约5秒)比明胶海绵(约30秒)短得多。
5、本发明具有强粘附与止血功能的抗肿瘤缓释植入剂具有良好的注射性能、自愈合性能和以及稳定的光热性能，非常有利于临床应用。
6、本发明具有强粘附与止血功能的抗肿瘤缓释植入剂具有响应性的药物缓释能力，可以在酸、热等刺激作用下响应性释放药物。
7、本发明具有强粘附与止血功能的抗肿瘤缓释植入剂的制备条件简单而温和，储存运输也极其方便。
附图说明
图1为一种具有强粘附与止血功能的抗肿瘤缓释植入剂的合成及应用示意图。
图2为具体实施方式中得到的CSG前驱体的紫外-可见光谱。
图3为具体实施方式中得到的CSG前驱体的核磁共振氢谱。
图4为具体实施方式中得到的CSG前驱体的抗菌效果图。
图5为实施例1中CSG前驱体在去离子水中的不同浓度在制备未载药的抗肿瘤缓释植入剂时的状态对比。
图6为实施例1得到的具有强粘附与止血功能的抗肿瘤缓释植入剂剂的扫描电镜图及元素分布图。
图7为实施例1得到的具有强粘附与止血功能的抗肿瘤缓释植入剂有良好可注射、自愈合性能的流体动力学表征图。
图8为实施例1得到的具有强粘附与止血功能的抗肿瘤缓释植入剂通过组织胶粘剂剪切搭接测试得到的粘附力拉伸曲线。
图9为实施例1得到的具有强粘附与止血功能的抗肿瘤缓释植入剂应用于大鼠肝脏止血模型的代表性图片及量化数据。
图10为实施例2得到的具有强粘附与止血功能的包载阿霉素的抗肿瘤缓释植入剂在不同激光功率条件下的热成像图片(a)与升温曲线(b)。
图11为实施例2得到的具有强粘附与止血功能的包载阿霉素的抗肿瘤缓释植入剂在37℃，pH分别为5、6、7.4条件的阿霉素累积释放曲线。
图12为实施例2得到的具有强粘附与止血功能的包载阿霉素的抗肿瘤缓释植入剂在pH＝7.4，温度分别为25、37、45℃条件下的阿霉素累积释放曲线。
图13为实施例2得到的具有强粘附与止血功能的包载阿霉素的抗肿瘤缓释植入剂在小鼠4T1肿瘤切缘模型治疗中，利用热化疗协同杀伤的肿瘤体积抑制曲线。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1：制备一种具有强粘附与止血功能的未载药的抗肿瘤缓释植入剂
将壳聚糖(1.3104g，8mmol)和1-羟基苯并三氮唑一水合物(1.1480g，8mmol)溶于100mL去离子水中，搅拌过夜，直至溶液澄清透明。将40mL没食子酸溶液(0.3872g，2mmol)逐滴加入至壳聚糖溶液中，然后再逐滴加入2mL 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐的乙醇溶液(0.3437g，2mmol)。混合体系在室温(25℃)、避光条件下反应24h。反应结束后，将反应物倒入透析袋(MWCO 14000Da)中，氮气保护下，37℃条件透析16h，透析体系每2h换一次水。透析完成后，所得产物进行冷冻干燥，即获得没食子酸接枝壳聚糖共聚物，记为CSG前驱体。最后称取30mg冻干的CSG前驱体，溶解于900μL去离子水中，超声搅拌10min以后，向其中加入100μL的FeCl3·6H2O(25mM)溶液(此时，没食子酸与Fe3+螯合剂中Fe3+的摩尔比为3:1，CSG前驱体在去离子水中浓度为30mg/mL)，超声30min后得到这种具有强粘附与止血功能的未载药的抗肿瘤缓释植入剂。
利用大肠杆菌(E.coli)和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)为致病菌模型评价CSG前体的抗菌性能。将100μL不同浓度(0、100、250、500、1000μg mL-1)的CSG前驱体与100μL稀释细菌悬液分别(106CFU/毫升)进行孵育，然后转移到Luria-Bertani固体培养基培养。37℃孵育24h后通过测量菌落数来评价CSG前驱体的抗菌效果。如图4所示，100μg mL-1的CSG前驱体对于大肠杆菌与耐药金黄色葡萄球菌的抑制率分别高达55.3±5.4％和44±6.5％。当CSG前驱体浓度达到500μg mL-1时，两种细菌抑制率甚至达到了99.6±6.1％和96.4±4.3％，显示出CSG前驱体具有良好的抗菌应用前景。
调整CSG前驱体的用量，从而调整其在去离子水中的浓度，然后按相同方法制得未载药的抗肿瘤缓释植入剂。图5为不同浓度CSG前驱体在制备未载药的抗肿瘤缓释植入剂时的状态对比，从图中可以看出，Fe3+浓度太低形成不了凝胶，太高难以均匀扩散。当比例为3:1时，可以形成均一的可注射水凝胶。
图6为本实施例所得具有强粘附与止血功能的抗肿瘤缓释植入剂(对应CSG前驱体在去离子水中浓度为30mg/mL)的扫描电镜图(最左图)及元素分布图(中图为C元素分布，右图为Fe元素分布)，可以看出凝胶中C和Fe元素的存在，证明Fe3+成功交联到了CSG前驱体上。
利用TA Discovery DHR-3型旋转流变仪对所述抗肿瘤缓释植入剂(1mL)进行可注射性能与自愈合性能评价：测试温度为25℃，测试间隙为1000μm。将1mL样品在时间扫描模式下以1％的压力下测试5分钟(图中I部分)，然后在100％压力下测试3分钟(图中II部分)，最后再恢复到1％的压力下测试5分钟(图中III部分)，即得到该植入剂储能模量与损耗模量的变化图。由图7可以看出，该植入剂在较高压力下储能模量与损耗模量实现反转，植入剂由胶体变为液体，在恢复1％的压力后又转变为胶体，回复的储能模量高达90％，证明该植入剂具有较好的可注射与自愈合能力。
利用组织粘合剂强度特性的标准试验方法ASTM F2255-2005(2015)测定搭接剪切状态下未载药的抗肿瘤缓释植入剂的拉伸载荷。采用医药行业标准YY/T 0729.1-2009所规定的新鲜猪皮移植片制备程序，猪皮长度为20mm、宽度为10mm、厚度为2mm。采用Instronmodel5943型万能试验机进行测试，测定时温度为25℃，剪切拉伸速度为5mm/min，每组样品至少重复测定三次以上，并记录其对应的F拉伸载荷。如图8所示，随着CSG前驱体浓度的增大，所述抗肿瘤缓释植入剂的粘附力逐渐增强，但拉伸应变却显著下降，CSG前驱体的浓度为30mg mL-1时，粘附力可达7.5Kpa，展现出良好的粘附性。
本实验设计了空白组、明胶止血海绵组以及所述抗肿瘤缓释植入剂(对应CSG前驱体在去离子水中浓度为30mg/mL)三个实验组，每组6只大鼠作为平行对照。将大鼠麻醉固定后逐层打开腹腔，暴露出肝脏，并用无菌棉签吸干肝脏表面的的组织液和血液。然后用手术剪在肝左中叶末缘下端划出一条0.5cm的伤口，待自由出血3s后，立即将明胶止血海绵和200μL CSG前驱体分别涂覆于对照组与实验组大鼠肝脏创口表面，在其下方铺垫好无菌滤纸，对于实验组则继续喷涂无菌FeCl3溶液，使其凝血。开始计时后，需每隔5s对创口进行拍照录像，记录凝血时间。实验结束后分别称量无菌滤纸用于止血前后的质量差，计算出大鼠肝脏出血量。该实验操作应重复三次以上。如图9所示，所述抗肿瘤缓释植入剂达到有效止血的时间(约5秒)比明胶海绵(约30秒)短得多。不进行处理的空白组伤口在1min内的流血量达到了2.25±0.28g，而使用商用止血明胶海绵组的流血量为1.06±0.14g，实验组则表现出了超强的止血性能，流血量仅为0.06±0.02g，表明该凝胶在止血方面展现出极大地应用价值.
实施例2：制备一种具有强粘附与止血功能的包载阿霉素的抗肿瘤缓释植入剂
按实施例1相同的方法制备CSG前驱体。
称取30mg冻干的CSG前驱体，溶解于360μg/mL的盐酸阿霉素溶液900μL中，超声搅拌10min以后，向其中加入100μL的FeCl3·6H2O(25mM)溶液，超声30min后得到具有强粘附与止血功能的包载阿霉素的抗肿瘤缓释植入剂。
利用MDL-III-808-2激光器和Fluke TI400IR型热成像仪对本实施例具有强粘附与止血功能的包载阿霉素的抗肿瘤缓释植入剂(1mL)进行光热性能评价，同时以水溶液作为对照，由图10可以看出，该植入剂具有良好的光热转化能力，并呈现出功率响应性。
图11为本实施例具有强粘附与止血功能的包载阿霉素的抗肿瘤缓释植入剂在体外模拟阿霉素累积释放曲线。其具体表征方式为：将1mL载有360μg阿霉素的植入剂放置于透析袋，并浸入pH值分别为5.0、6.0、7.4的30mL磷酸盐缓冲液中，每隔一段时间取3mL溶液用于检测，并补充3mL对应pH值的磷酸盐缓冲液。如图11所示，包载阿霉素的所述植入剂在较低pH条件下表现出更好的阿霉素释放效果，显示出极好的酸响应药物释放性能。
图12为本实施例具有强粘附与止血功能的包载阿霉素的抗肿瘤缓释植入剂在温度值为25、37、45℃条件下阿霉素累积释放曲线。其具体表征方式为：将1mL载有360μg阿霉素的植入剂放置于透析袋，并浸入保温在25、37、45℃的磷酸盐缓冲液中，每隔一段时间取3mL溶液用于检测，并补充3mL对应温度值的磷酸盐缓冲液。如图12所示，植入剂在较高温度条件下表现出更好的阿霉素释放效果，显示出极好的热响应药物释放性能。
图13为本实施例具有强粘附与止血功能的包载阿霉素的抗肿瘤缓释植入剂在小鼠4T1切缘肿瘤模型治疗中，利用热化疗协同杀伤的肿瘤体积抑制曲线。其具体表征方式为：将40只肿瘤为60mm3的4T1模型肿瘤鼠进行切缘处理后，平均分为5个实验组，即磷酸盐缓冲液注射组、未载药的所述抗肿瘤缓释植入剂组、载阿霉素的所述抗肿瘤缓释植入剂组、未载药的所述抗肿瘤缓释植入剂组+激光组和载阿霉素的载药的所述抗肿瘤缓释植入剂组+激光组。然后对每组小鼠给予名称所对应的注射和激光照射处理，其中注射剂量为100μL(阿霉素含量为120μg/mL)，激光照射为10min、激光功率为0.5W/cm2，注射处理后，用游标卡尺量取在不同天数(0，2，4，6，8，10，12，14，16)各组中老鼠肿瘤的体积。如图13所示，从肿瘤体积变化可以看出，载药的所述抗肿瘤缓释植入剂组+激光组小鼠肿瘤体积明显减小并消失，表现出极好的协同杀伤效果，体现了包载阿霉素的植入剂具有较好的预防肿瘤复发的能力。

Claims (8)

1.一种具有强粘附与止血功能的抗肿瘤缓释植入剂，其特征在于：首先通过一步碳二亚胺偶联法将没食子酸接枝到壳聚糖骨架上，透析和冷冻干燥得到没食子酸接枝壳聚糖共聚物，记为CSG前驱体；
将所述CSG前驱体溶解于去离子水中，再与Fe3+螯合剂进行反应，即得到具有强粘附与止血功能的未载药的抗肿瘤缓释植入剂；
或者：先将抗肿瘤药物溶解于去离子水中，再将CSG前驱体溶解于含药物的去离子水溶液中，最后再与Fe3+螯合剂进行反应，即形成具有强粘附与止血功能的包载药物的抗肿瘤缓释植入剂。
2.根据权利要求1所述的一种具有强粘附与止血功能的抗肿瘤缓释植入剂，其特征在于：所述CSG前驱体中，没食子酸与壳聚糖的接枝率在8.1％～21.5％。
3.根据权利要求1所述的一种具有强粘附与止血功能的抗肿瘤缓释植入剂，其特征在于：所述CSG前驱体在去离子水中的浓度在10～40mg/mL。
4.根据权利要求1所述的一种具有强粘附与止血功能的抗肿瘤缓释植入剂，其特征在于：所述Fe3+螯合剂为含Fe3+的无机盐。
5.根据权利要求1所述的一种具有强粘附与止血功能的抗肿瘤缓释植入剂，其特征在于：所述CSG前驱体中没食子酸与Fe3+螯合剂中Fe3+的摩尔比为3:1。
6.一种权利要求1～5中任意一项所述抗肿瘤缓释植入剂的制备方法，其特征在于：
将壳聚糖2～8mmol和1-羟基苯并三氮唑一水合物2～8mmol溶于100mL去离子水中，搅拌至溶液澄清透明；将0.05mmol/mL的没食子酸水溶液40mL逐滴加入至壳聚糖溶液中，然后再逐滴加入1mmol/mL 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐的乙醇溶液2mL，所得混合体系在室温、避光条件下反应16～24h；
反应结束后，将反应物倒入14000Da的透析袋中，氮气保护下，37～40℃透析16-24h，透析体系每2h换一次水；透析完成后，所得产物冷冻干燥，即获得没食子酸接枝壳聚糖共聚物，记为CSG前驱体；
称取10～40mg CSG前驱体，溶解于900μL去离子水中，超声至溶解，然后加入100μL的Fe3 +螯合剂溶液，超声反应30～60min，得到具有强粘附与止血功能的未载药的抗肿瘤缓释植入剂；
或者：先将抗肿瘤药物溶解于900μL去离子水中，再加入10～40mg CSG前驱体，然后加入100μL的Fe3+螯合剂溶液，超声反应30～60min，得到具有强粘附与止血功能的包载药物的抗肿瘤缓释植入剂。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：通过改变壳聚糖中氨基葡萄糖单元与没食子酸的摩尔比，合成具有不同没食子酸接枝率的没食子酸接枝壳聚糖共聚物。
8.一种权利要求1～5中任意一项所述具有强粘附与止血功能的抗肿瘤缓释植入剂的应用，其特征在于：用于制备术后热化疗水凝胶，作为多功能手术组织黏附剂。
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