CN110249995A - 一种在常温下长期保存紫菜纯系种质资源的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于紫菜养殖领域，公开了一种在常温下长期保存紫菜纯系种质资源的方法，包括：将培养器皿高温消毒，配制紫菜丝状体培养基，制备纯系自由丝状体，将纯系自由丝状体接种至经高温消毒后的培养器皿中，盖上瓶盖，在紫菜丝状体培养基中于温度18～25℃、光强1～20Lx、光暗周期(6～18)L:(6～18)D的条件下长期静置培养，每1～3个月更换30～70％的新鲜培养基，更换时检查是否有污染，如有杂藻污染，将丝状体置于黑暗中1～3个月以杀死杂藻。本发明提供的方法能够简单有效杀死污染单细胞杂藻，但对紫菜丝状体没有影响，不会造成杂藻污染或品系混杂，可以大幅度降低工作量，减少污染发生的几率，操作简单方法。本发明提供的方法可用于长期保存种质资源，为紫菜的育种工作提供种质保障。

Description

一种在常温下长期保存紫菜纯系种质资源的方法
技术领域
本发明属于紫菜养殖领域，具体涉及一种在常温下长期保存紫菜纯系种质资源的方法。
背景技术
紫菜是日本、韩国以及我国的重要经济藻类，紫菜产业年产值超过13亿美元。紫菜产业的发展得益于高产、生长速度快以及抗逆性强的优良品系不断被选育出来。而紫菜优良品系选育的核心就是建立和管理种质资源库，确保种质资源不被污染，并保持纯系。一般种质资源库包含数百个品系，其维护管理工作量大，对操作的要求严格。实践发现紫菜的纯系保存主要面临两个问题：一是换水工作量大；二是换水过程容易导致杂藻污染，特别是单细胞杂藻(比如绿藻、硅藻)污染。因此，建立一种简单的紫菜纯系种质资源的长期低成本保存方法已经成为亟待解决的问题。
发明内容
本发明旨在提供一种在常温下长期保存紫菜纯系种质资源的方法。
具体地，本发明提供了一种在常温下长期保存紫菜纯系种质资源的方法，该方法包括：
(1)培养器皿消毒及培养基制备：将培养器皿高温消毒；将海水加热煮沸，之后按照丝状体培养基配方添加营养盐，冷却后得到紫菜丝状体培养基；
(2)纯系自由丝状体制备：
S1、收集紫菜种质样品，取单株叶状体，表面清洗后阴干和冷冻，将冷冻后的藻体取出，再次清洗后静水弱光复苏；
S2、取藻体的营养组织块，置于葡萄糖溶液中浸泡，然后将藻体块剪成小块，放置于海螺酶溶液中于黑暗环境下震荡酶解，酶解期间观察细胞酶解状况，当在显微镜下观察到藻体碎片游离出大量单细胞团或多细胞团时，过滤细胞液，滤液离心后弃上清液保留沉淀，洗涤后再重复离心；
S3、将收集到的细胞依次进行黑暗培养和光照-黑暗交替培养，之后将丝状体吸出，得到纯系自由丝状体；
(3)纯系自由丝状体培养：将所述纯系自由丝状体接种至经高温消毒后的培养器皿中，盖上瓶盖，在所述紫菜丝状体培养基中于温度18～25℃、光强1～20Lx、光暗周期(6～18)L:(6～18)D的条件下长期静置培养，每1～3个月更换30～70％的新鲜培养基，更换时检查是否有污染，如有杂藻污染，将丝状体置于黑暗中1～3个月以杀死杂藻。
进一步的，所述紫菜选自坛紫菜、条斑紫菜、长紫菜、圆紫菜和半叶紫菜中的至少一种。
进一步的，步骤(1)中，所述培养器皿为磨口玻璃瓶。
进一步的，步骤(1)中，将所述培养器皿高温消毒的条件包括温度为100～200℃且时间为20～40min。
进一步的，步骤(1)中，将所述海水加热煮沸的时间为3～10min。
进一步的，步骤(1)中，所述丝状体培养基为Provasoli培养基或其他海水培养基。
进一步的，步骤(2)的S1中，所述冷冻的温度为-16℃～-20℃；所述再次清洗所采用的溶液为消毒海水；所述静水弱光复苏的条件包括温度为20±1℃、光照强度为1000±10Lx，光暗周期为(6～18)L:(6～18)D，复苏时间为20～30h。
进一步的，步骤(2)的S2中，所述藻体的营养组织块的大小为0.1～1cm2；所述葡萄糖溶液的摩尔浓度为1～3mol/L；所述浸泡的时间为5～15min。
进一步的，步骤(2)的S2中，所述海螺酶溶液的配方为：0.12g海螺酶、1.27g甘露醇、2.2mg无水CaCl2、2.4mg MgSO4、10ml盐度为37的消毒海水，pH值为6～6.2。
进一步的，步骤(2)的S2中，所述震荡酶解的条件包括：酶解温度为25～30℃，酶解时间为1～2h；所述酶解期间每隔30min观察细胞解离状况；所述过滤采用250～350目筛绢过滤；所述滤液离心的条件包括转速为1000～2000r/min，时间为2～5min；所述洗涤所采用的溶液为盐度为37的消毒海水；所述重复离心的次数为2～4次。
进一步的，步骤(2)的S3中，所述黑暗培养的方法包括：每隔12h更换1/2培养基，连续更换3～4次；所述光照-黑暗交替培养的条件包括：光照强度为1000～2000Lx，光暗周期为(6～18)L:(6～18)D，培养温度为20±1℃，每7d更换一次培养基。
进一步的，步骤(2)的S3中，所述黑暗培养所采用的培养基为消毒海水。
进一步的，步骤(2)的S3中，所述光照-黑暗交替培养所采用的培养基为Provasoli培养基或其他海水培养基。
本发明的关键在于利用紫菜丝状体耐受黑暗，生长温度范围广，而单细胞杂藻不耐超低光的特点，建立了操作简单的能在常温下长期低成本保存紫菜纯系种质资源的方法，该方法能够非常简单而有效地杀死污染单细胞杂藻，但对紫菜丝状体没有影响，不会造成杂藻污染或品系混杂，可以大幅度降低工作量，减少污染发生的几率，操作简单方法。本发明提供的方法可用于长期保存种质资源，为紫菜的育种工作提供种质保障。
具体实施方式
在本发明中，所述紫菜可以为现有的各种具有重要经济应用和研究价值的品种，其具体实例包括但不限于：坛紫菜、条斑紫菜、长紫菜、圆紫菜和半叶紫菜等中的至少一种。
在本发明中，步骤(1)中，对培养器皿和培养基进行消毒的目的是为了防止杂藻污染或者不同品系间的混杂。
在本发明中，步骤(1)中，所述丝状体培养基可以为Provasoli培养基或其他海水培养，具体组成为本领域技术人员公知，在此不作赘述。
在本发明中，步骤(2)中，所制备的纯系自由丝状体以自由丝状体的形式长期保存，具有取用方便、能快速大量扩大培养的特点。自由丝状体广泛应用于小规模的贝壳丝状体采苗，以及科学研究和新品种选育等工作。
在本发明中，步骤(3)中，所设置的生长温度、光强和光暗周期非常容易达到，日常主要工作只需在冬季低温期和夏季高温期，采取调温和控光措施就好。
在本发明中，步骤(3)中，用黑暗培养的方法能够杀死杂藻，保持纯系。
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1：管理维护福建省厦门市集美大学坛紫菜种质资源库
(1)培养器皿消毒及培养基制备：备好干净磨口玻璃瓶，高温消毒半小时。紫菜丝状体培养基以天然海水为基础，加热沸腾5min后，按照Provasoli海水培养基配方添加营养盐，冷却后待用。
(2)纯系自由丝状体制备：
S1、收集紫菜种质样品，取单株叶状体，表面清洗后阴干和冷冻保存(-18℃)，将冷冻后的藻体取出，采用消毒海水再次清洗后于温度20±1℃、光照强度1000±10Lx，光暗周期为12L:12D的条件下静水弱光复苏24h；
S2、用消毒过的剪刀剪取0.5～1cm2的藻体营养组织块，置于浓度为2mol/L的葡萄糖溶液中浸泡10min，然后用剪刀将藻体块剪成小块，放置于海螺酶溶液(配方为0.12g海螺酶、1.27g甘露醇、2.2mg无水CaCl2、2.4mg MgSO4、10ml盐度为37的消毒海水，pH值为6～6.2)中于黑暗环境中且于27℃下震荡酶解2小时，酶解期间每隔30min观察细胞酶解状况，当在显微镜下观察到藻体碎片游离出大量单细胞团或多细胞团时，用300目筛绢过滤细胞液，滤液于1500r/min下离心3min后弃上清液保留沉淀，用盐度37的消毒海水洗涤后再重复离心两次；
S3、将收集到的细胞放入盐度为37度的消毒海水中黑暗培养，每隔12h更换1/2培养基，连续更换4次，接着置于Provasoli海水培养基中于光照-黑暗交替条件(光照1000Lx，12L:13D，温度20±1℃)下继续培养，每7d更换一次培养基，培养20d后，将培养皿中的丝状体吸出，得到纯系自由丝状体；
(3)纯系自由丝状体培养：将所述纯系自由丝状体接种至上述经高温消毒后的磨口玻璃瓶中，盖上瓶盖，在所述紫菜丝状体培养基中于温度25℃、光强1Lx、光暗周期12L:12D的条件下长期静置培养，每3个月更换70％的新鲜培养基，更换时检查是否有污染，如有杂藻污染，可将丝状体置于黑暗中3个月以杀死杂藻。
结果表明，该方法成功保存了500多个坛紫菜品系，一些品系已经培养了20多年，并且投入的人力物力成本不高。
实施例2：管理维护江苏省某条斑紫菜育苗企业的种质资源库
(1)同实施例1。
(2)纯系自由丝状体制备：
S1、收集紫菜种质样品，取单株叶状体，表面清洗后阴干和冷冻保存(-18℃)，将冷冻后的藻体取出，采用消毒海水再次清洗后于温度20±1℃、光照强度1000±10Lx，光暗周期为18L:6D的条件下静水弱光复苏30h；
S2、用消毒过的剪刀剪取0.1～1cm2的藻体营养组织块，置于浓度为2mol/L的葡萄糖溶液中浸泡15min，然后用剪刀将藻体块剪成小块，放置于海螺酶溶液(配方为0.12g海螺酶、1.27g甘露醇、2.2mg无水CaCl2、2.4mg MgSO4、10ml盐度为37的消毒海水，pH值为6～6.2)中于黑暗环境中且于25℃下震荡酶解1小时，酶解期间每隔30min观察细胞酶解状况，当在显微镜下观察到藻体碎片游离出大量单细胞团或多细胞团时，用250目筛绢过滤细胞液，滤液于2000r/min下离心2min后弃上清液保留沉淀，用盐度37的消毒海水洗涤后再重复离心两次；
S3、将收集到的细胞放入盐度为37度的消毒海水中黑暗培养，每隔12h更换1/2培养基，连续更换3次，接着置于Provasoli海水培养基中于光照-黑暗交替条件(光照2000Lx，12L:12D，温度20±1℃)下继续培养，每7d更换一次培养基，培养30d后，将培养皿中的丝状体吸出，得到纯系自由丝状体；
(3)纯系自由丝状体培养：将所述纯系自由丝状体接种至上述经高温消毒后的磨口玻璃瓶中，盖上瓶盖，在所述紫菜丝状体培养基中于温度18℃、光强20Lx、光暗周期12L:12D的条件下静置培养，每1个月更换30％的新鲜培养基，更换时检查是否有污染，如有杂藻污染，可将丝状体置于黑暗中1个月以杀死杂藻。
结果表明，该方法成功保存了几百个条斑紫菜品系，一些品系已经培养了20多年，维护简单、成本低廉。
对比例1
按照实施例1的方法管理维护坛紫菜纯系丝状体种质资源库，不同的是，步骤(1)中磨口玻璃瓶未经消毒，其余与实施例1相同。结果表明，坛紫菜自由丝状体杂藻污染严重，严重影响后续工作，并导致工作量增加。
对比例2
按照实施例1的方法管理维护坛紫菜纯系丝状体种质资源库，不同的是，步骤(2)中未按本发明提供的方法制备纯系自由丝状体(具体地，S2和S3同实施例1，步骤S1中藻体未经消毒海水清洗)，导致丝状体不纯，后续育种工作无法开展。
对比例3
按照实施例2的方法管理维护条斑紫菜纯系丝状体种质资源库，不同的是，步骤(3)中，光强为50Lx，其余与实施例1相同。结果表明，自由丝状体生长速度太快，导致日常维护工作大幅增加。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (9)

1.一种在常温下长期保存紫菜纯系种质资源的方法，其特征在于，该方法包括：
(1)培养器皿消毒及培养基制备：将培养器皿高温消毒；将海水加热煮沸，之后按照丝状体培养基配方添加营养盐，冷却后得到紫菜丝状体培养基；
(2)纯系自由丝状体制备：
S1、收集紫菜种质样品，取单株叶状体，表面清洗后阴干和冷冻，将冷冻后的藻体取出，再次清洗后静水弱光复苏；
S2、取藻体的营养组织块，置于葡萄糖溶液中浸泡，然后将藻体块剪成小块，放置于海螺酶溶液中于黑暗环境下震荡酶解，酶解期间观察细胞酶解状况，当在显微镜下观察到藻体碎片游离出大量单细胞团或多细胞团时，过滤细胞液，滤液离心后弃上清液保留沉淀，洗涤后再重复离心；
S3、将收集到的细胞依次进行黑暗培养和光照-黑暗交替培养，之后将丝状体吸出，得到纯系自由丝状体；
(3)纯系自由丝状体培养：将所述纯系自由丝状体接种至经高温消毒后的培养器皿中，盖上瓶盖，在所述紫菜丝状体培养基中于温度18～25℃、光强1～20Lx、光暗周期(6～18)L:(6～18)D的条件下长期静置培养，每1～3个月更换30～70％的新鲜培养基，更换时检查是否有污染，如有杂藻污染，将丝状体置于黑暗中1～3个月以杀死杂藻。
2.根据权利要求1所述的在常温下长期保存紫菜纯系种质资源的方法，其特征在于，所述紫菜选自坛紫菜、条斑紫菜、长紫菜、圆紫菜和半叶紫菜中的至少一种。
3.根据权利要求1所述的在常温下长期保存紫菜纯系种质资源的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述培养器皿为磨口玻璃瓶，将所述培养器皿高温消毒的条件包括温度为100～200℃且时间为20～40min；将所述海水加热煮沸的时间为3～10min；所述丝状体培养基为Provasoli培养基或其他海水培养基。
4.根据权利要求1～3中任意一项所述的在常温下长期保存紫菜纯系种质资源的方法，其特征在于，步骤(2)的S1中，所述冷冻的温度为-16℃～-20℃；所述再次清洗所采用的溶液为消毒海水；所述静水弱光复苏的条件包括温度为20±1℃、光照强度为1000±10Lx，光暗周期为(6～18)L:(6～18)D，复苏时间为20～30h。
5.根据权利要求1～3中任意一项所述的在常温下长期保存紫菜纯系种质资源的方法，其特征在于，步骤(2)的S2中，所述藻体的营养组织块的大小为0.1～1cm2；所述葡萄糖溶液的摩尔浓度为1～3mol/L；所述浸泡的时间为5～15min。
6.根据权利要求1～3中任意一项所述的在常温下长期保存紫菜纯系种质资源的方法，其特征在于，步骤(2)的S2中，所述海螺酶溶液的配方为：0.12g海螺酶、1.27g甘露醇、2.2mg无水CaCl2、2.4mg MgSO4、10ml盐度为37的消毒海水，pH值为6～6.2。
7.根据权利要求1～3中任意一项所述的在常温下长期保存紫菜纯系种质资源的方法，其特征在于，步骤(2)的S2中，所述震荡酶解的条件包括：酶解温度为25～30℃，酶解时间为1～2h；所述酶解期间每隔30min观察细胞解离状况；所述过滤采用250～350目筛绢过滤；所述滤液离心的条件包括转速为1000～2000r/min，时间为2～5min；所述洗涤所采用的溶液为盐度为37的消毒海水；所述重复离心的次数为2～4次。
8.根据权利要求1～3中任意一项所述的在常温下长期保存紫菜纯系种质资源的方法，其特征在于，步骤(2)的S3中，所述黑暗培养的方法包括：每隔12h更换1/2培养基，连续更换3～4次；所述光照-黑暗交替培养的条件包括：光照强度为1000～2000Lx，光暗周期为(6～18)L:(6～18)D，培养温度为20±1℃，每隔7d更换一次培养基。
9.根据权利要求1～3中任意一项所述的在常温下长期保存紫菜纯系种质资源的方法，其特征在于，步骤(2)的S3中，所述黑暗培养所采用的培养基为消毒海水；所述光照-黑暗交替培养所采用的培养基为Provasoli培养基或其他海水培养基。
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