CN110241210A

CN110241210A - Rit1基因作为治疗脑胶质瘤药物干预靶点的应用

Info

Publication number: CN110241210A
Application number: CN201910502627.XA
Authority: CN
Inventors: 卢大儒; 陈红岩; 王煜棋
Original assignee: Fudan University
Current assignee: Fudan University
Priority date: 2019-06-11
Filing date: 2019-06-11
Publication date: 2019-09-17
Anticipated expiration: 2039-06-11
Also published as: CN110241210B

Abstract

本发明属于生物医疗技术领域，具体为一种RIT1基因作为治疗脑胶质瘤药物干预靶点的应用。本发明通过CGGA数据库中的数据对RIT1在中国脑胶质瘤人群样本中的表达量及其高低表达对脑胶质瘤病人预后的影响进行分析发现，RIT1随着脑胶质瘤级别的升高呈现逐渐增加的趋势，并且其高表达可以预测病人更差的生存期，提示RIT1可以作为脑胶质瘤的生物及预后标志物；机制研究显示，RIT1基因的过表达导致MAPK信号通路的过度激活，促进了MAPK信号通路上MEK、ERK以及下游丝裂原应激活化蛋白激酶MSK1的磷酸化。据此，本发明还提供RIT1基因的siRNA序列，可有效消减内源RIT1基因的表达，并可通过多种体内递送方式用以脑胶质瘤的临床治疗。

Description

RIT1基因作为治疗脑胶质瘤药物干预靶点的应用

技术领域

本发明属于生物医疗技术领域，具体涉及一种RIT1基因作为治疗脑胶质瘤药物干预靶点的应用。

背景技术

胶质瘤是神经上皮细胞源性肿瘤，起源于胶质细胞或前体细胞，是脑及中枢神经系统最常见的原发性肿瘤。虽然原发性脑肿瘤与转移性脑肿瘤相比更少见，但是它们是发病率和死亡率的重要来源。尽管神经影像学诊断、手术切除技术、神经肿瘤的放化疗治疗在过去的50年里取得了较大的进步，但最常见的恶性胶质瘤-多形性胶质母细胞瘤(GBM) 的生存率依然较低。因此，寻找具有生物标志物意义的预后因子，并阐明其在胶质瘤发生发展过程中的功能及机制将会对胶质瘤的诊断和治疗提供新的思路和途径，这也是目前国内外研究的热点和前沿问题。

RIT1蛋白为RAS超家族RIT亚家族成员之一，与其它RAS家族成员一样具有小GTP酶活性，其通过在活性（结合GTP）及非活性（结合GDP）状态之间转变而控制细胞内的信号转导。目前关于RIT1在肿瘤中的功能及机制研究并不多。文献报道，RIT1基因在肝细胞癌及Noonan综合征中存在一定频率的CNVs及体细胞突变，其在肝细胞癌中发生拷贝数扩增，且拷贝数扩增可能是RIT1在HCC中主要的激活方式，很可能与肝癌的发生相关，并且发生RIT1拷贝数扩增组肝癌病人其生存期显著短于未发生RIT1拷贝数扩增组病人，其扩增与否与肝癌的病理分级及肝坏死范围的大小有显著的相关性；类似的，研究者发现RIT1在子宫内膜癌样本中显著上调表达，并且其表达量高低与患者的生存期显著相关，可作为子宫内膜癌患者独立的预后因子。另外，研究指出，RIT1在发育过程中对于神经元形态发生、神经元分化及细胞存活具有重要的作用，其通过p38-MK2-HSP27和mTORC2-Akt信号通路调控细胞存活，并通过下游的细胞表面受体调控MEK-ERK通路的信号转导。但是，RIT1在脑胶质瘤发生发展过程中的作用及机制至今为止未有研究报道过。

发明内容

本发明的目的在于提供RIT1基因作为治疗脑胶质瘤药物干预靶点的应用。

本发明提供的RIT1基因作为治疗脑胶质瘤药物干预靶点的应用。

进一步地，具体包括：

首先，利用CGGA数据库中的数据对RIT1基因在中国脑胶质瘤人群样本中的表达量及其高低表达对脑胶质瘤病人预后的影响进行分析，结果显示，RIT1基因在脑胶质瘤中显著上调表达，并且其高低表达与胶质瘤患者的生存期显著相关，即RIT1基因的mRNA表达水平随着脑胶质瘤级别的升高呈现逐渐增加的趋势，并且其高表达可以预测病人更差的生存期；

其次，为了研究RIT1基因在脑胶质瘤发生发展过程中的功能，本发明开展了CCK-8检测、细胞周期检测、EdU检测、细胞迁移实验、TMZ敏感性检测以及裸鼠胶质瘤原位成瘤实验，分别从增殖、周期、迁移以及体内水平考察RIT1基因在脑胶质瘤发生发展过程中的功能；结果显示，RIT1基因的高表达促进了胶质瘤细胞的体外增殖，加速了细胞周期进程，促进了细胞迁移，降低了胶质瘤细胞对TMZ的敏感性，并促进了胶质瘤细胞在体内的成瘤以及加速了体内瘤体的生长速度，显著缩短了实验鼠的生存期；说明，RIT1在脑胶质瘤中异常高表达，与脑胶质瘤细胞的增殖、周期及迁移生物学过程密切相关，而RIT1的过表达促进可脑胶质瘤细胞的增殖及迁移，对RIT1基因的表达量进行干扰后会增强脑胶质瘤细胞对替莫唑胺的敏感性；

最后，为了探讨RIT1基因促进胶质瘤发生发展的机制，我们构建了RIT1基因过表达及敲除的胶质瘤细胞系，检测了不同细胞系在EGF刺激下MAPK信号通路的活性状态；结果显示，RIT1基因的过表达导致MAPK信号通路的过度激活，促进了MAPK信号通路上MEK、ERK以及下游丝裂原应激活化蛋白激酶MSK1的磷酸化。

本发明还涉及，RIT1基因的mRNA表达检测以及RIT1蛋白表达检测可作为脑胶质瘤的生物标志物和预后标志物。

本发明还涉及，筛选到的RIT1基因的靶向抑制剂或特异性siRNA可以用于干扰RIT1基因的表达，可为制备脑胶质瘤分子靶向药物，进行联合治疗提供新的路径。

本发明中，RIT1基因特异性的siRNA序列，可用于消减内源RIT1基因的表达，并可通过多种体内递送方式（直接溶解于简单溶液、对siRNA进行共价修饰、脂质体和脂质复合物、纳米多聚颗粒、蛋白与多肽复合物、抗体靶向）用以脑胶质瘤的临床治疗。此外，由siRNA衍生得到的shRNA亦可通过病毒载体递送（腺病毒载体与腺相关病毒载体、逆转录病毒载体与慢病毒载体）用以胶质瘤的临床治疗。

RIT1基因特异性siRNA序列如下：

siRIT1#1: 5’-AGAATTCAGCTGTCCCTTT-3’ （SEQ.ID.NO.1）

siRIT1#2: 5’-TCGAAGTTTCCATGAAGTT-3’ （SEQ.ID.NO.2）。

本发明中，开发的RIT1基因靶点的抑制剂，进而起到下调RIT1基因的mRNA表达，从而改善患者的生活质量并降低死亡率。

附图说明

图1为RIT1基因的 mRNA 表达量随着脑胶质瘤级别的升高而呈现逐渐上升的趋势。其中，（a）分别在 II 级、III 级和 IV 级脑胶质瘤样本中分析RIT1 基因 mRNA 表达量差异；（b）分别在高级别和低级别脑胶质瘤样本中分析RIT1 基因 mRNA 的表达量差异；统计学显著性:***， P<0.001，**，P<0.01。

图2为RIT1基因mRNA的高低表达对脑胶质瘤患者生存期影响的Kaplan-Meier曲线。在 CGGA 数据库中分析RIT1基因mRNA的高低表达对全部脑胶质瘤患者(a、b)和高级别脑胶质瘤患者(c、d)的总生存期(a、c)及无进展生存期(b、d)的影响。P值由log-rank估计得到。

图3为RIT1基因特异性siRNA消减效果的验证。

具体实施方式

为了更清楚地说明本发明实施例，下面将对实施例或现有技术描述中所得到的结果作简单地介绍，显而易见地，描述中的附图仅仅是本发明的实施例。

实施例：

一、CGGA数据库分析

CGGA 数据库为基于中国人群建立的中国脑胶质瘤基因组数据库。数据库中共包含了325 例脑胶质瘤病人的 17527 个基因的表达谱数据及临床随访数据。 325 例样本中共有109 例 II 级样本，72 例 III 级样本及 144 例 IV 级样本。我们从数据库中分别下载了表达谱数据及临床随访数据，并将两部分数据整合用以后续的分析。

二、细胞功能及体内实验

1、CCK-8检测：

将待检测的细胞按照 1000-2000 个细胞/100 𝜇L/孔接种于 96 孔细胞培养板中，每组细胞每天各设置 6 个复孔，待其贴壁后将第一个时间点的一组细胞的完全培养基换为含有 10% CCK-8 的完全培养基，并同时同样处理一组不含细胞的孔作为空白对照，37 ℃CO2 培养箱中培养 1 h 后置于酶标仪中检测其在 OD₄₅₀/OD₆₃₀ 处的吸光值，记录为 0 天细胞的吸光值，此后 1~6 天重复以上操作，并记录为 1~6 天细胞的吸光值，以每组细胞OD₄₅₀ 的值减掉空白对照组 OD₄₅₀ 的值作为每组细胞每天的绝对吸光值，再分别以 1~6 天不同实验组细胞的绝对吸光值除以 0 天对应实验组的绝对吸光值作为此组实验组细胞的相对生长速率，绘制细胞生长曲线，间接反映不同组细胞增殖速率的差异。

2、细胞周期检测：

将待检测的细胞接种于 6 孔板中，待其长至 90%汇合度时将细胞从 6 孔板中消化下来，于常温离心机中 1500 rpm 离心 5 min，弃去上清，用 1 mL 1× PBS 洗涤细胞沉淀，离心后弃去上清，用提前配制好的含有 0.03% TritonX-100 的 1×PBS 稀释 PI 存储液至其终浓度为 50 𝜇g/mL，向细胞沉淀中加入 400 𝜇L 上述 PI 染液重悬细胞，避光反映30 min，用 200 目滤网过滤细胞后上机检测。

3、EdU检测 (依据锐博生物提供的 Cell-Light^TM EdU Apollo®567 In VitroImaging Kit(100T)试剂盒的步骤进行)。

4、细胞迁移：

诱导迁移：将 transwell 小室置于 24 孔细胞培养板内，用无血清的 DMEM 高糖培养基饥饿处理待检测的细胞 24~36 h 后，消化细胞，常温离心机中 1000 rpm 离心 5 min后弃去上清，用无血清的 DMEM 高糖培养基洗涤细胞沉淀 2 遍后，用无血清的培养基重悬细胞并计数，以 10000~30000 个细胞/200 𝜇L/小室接种细胞至小室内，并于小室外(下室)加入 600 𝜇L 完全培养基，37°C CO2 培养箱中培养 24~36 h，以诱导细胞迁移。

染色及结果分析：培养结束后，将 transwell 小室取出，于 1×PBS 中浸泡洗净小室膜下残留的完全培养基，并将洗净的小室置于 500 𝜇L 4%的 PFA 中固定 30 min，再次于 1×PBS 中浸泡洗涤后，用提前配制好的结晶紫染色 1 h，染色结束后用去离子水清洗数次并用酒精棉球拭去小室内的细胞，将小室置于 24 孔板中晾干，显微镜下观察小室下表面并拍照，用 image J 处理图像并进行统计分析。

5、TMZ 敏感性检测

TMZ 原药浓度为 0.1 M；

接种：将目的细胞消化重悬，以 2000 个细胞/孔接种于 96 孔细胞培养板中，每组设置 6 个复孔；

加药：接种后 48 小时将完全培养基替换为含有不同浓度 TMZ 的完全培养基，  放置于 37 ℃ CO2 培养箱中培养，共设置 0 𝜇M，100 𝜇M，200 𝜇M，400 𝜇M， 600 𝜇M，800 𝜇M，1000 𝜇M，1200 𝜇M，1400 𝜇M，1600 𝜇M，1800 𝜇M，2000 𝜇M 十二个药物浓度分别检测；

CCK-8 检测：加药培养 48 小时后，将上层培养基替换为含有 10% CCK-8 的完全培养基，并同时设置一组不含细胞的空白对照，于 37 ℃ CO₂ 培养箱中孵育 1 h 后置于酶标仪中检测细胞在 OD₄₅₀ 处的吸光值；

计算 IC₅₀：对得到的 OD₄₅₀ 值进行校正及转换处理最终得到 TMZ 在不同组细胞中的IC₅₀，反映不同组细胞对 TMZ 的敏感性变化。

6、裸鼠脑胶质瘤原位成瘤实验

细胞准备

本发明中所选用的用于原位成瘤的细胞系为人脑胶质瘤U87-MG细胞系。将 U87-MG以30%的密度接种于 10 cm dish 中，并同时用吉凯公司包装浓缩的LUC病毒对细胞进行感染，感染所选用的 MOI 值为 2~3；感染 48 小时后，用嘌呤霉素对感染后的细胞进行筛选，富集感染成功的阳性细胞；筛选 2~3 天后，将富集到的阳性细胞传代扩大培养，并在扩大培养后以合适的密度接种 U87-MG-LUC 细胞，并同时感染目的基因过表达/敲减/敲除的病毒，感染成功并扩大培养后用以后续原位注射。

原位注射

从斯莱克公司购买的裸鼠需在实验所在的饲养室饲养适应 2~4 周，待其长至 7~8 周时准备进行原位注射，每组实验需设置 7-10 重复，依据实验设计购买裸鼠；将之前扩大培养的目的细胞消化下来，用 1×PBS 洗涤细胞 2 遍后，细胞计数，按照每 1*10^7 个细胞用 90 𝜇L 1×PBS 及 60 𝜇L 高浓度 matrigel 的比例低温重悬细胞，低温存放待用；

麻醉：术前需对准备进行手术的裸鼠进行麻醉，本实验所选用的麻醉剂为含有2%戊巴比妥钠的生理盐水，使用剂量为20~40mg/kg，需准确测量每只裸鼠的体重，严格按照剂量范围使用麻醉剂；

手术：待裸鼠被完全麻醉后，用手术刀在需要注射的位置小范围的切开头皮及覆盖在颅骨外的筋膜，直至暴露出需要观测的解剖学结构，在左侧或右侧杏仁核上方用 1 mL 注射器的针头钻出可以进针大小的孔，并将裸鼠的头部固定在小鼠三维脑立体定向仪上；

细胞注射：按照每只裸鼠 5*10^5~1*10^6 个细胞的量进行细胞注射。本实验选用每只裸鼠注射 1*10^6 个细胞。用提前预冷的微量进样器准确量取含有 1*10^6 个细胞的细胞悬液，将其置于小鼠三维脑立体定向仪上，在之前钻孔的位置进针至颅骨下 3.5 mm，设置注射时间为 1 min，仪器自动注射进样；缝皮及苏醒:注射后缓慢退针，对创口进行消毒后，将头皮缝合，采取一些保暖措施使裸鼠体温及心跳尽快回复至麻醉前的状态，待其可以自主活动后将其放回 IVC 笼继续饲养，并在术后 24 小时密切关注裸鼠的状态；

活体成像拍摄及结果分析

拍照时间选择：可在原位注射后 7-14 天之内对裸鼠进行第一次活体成像的拍摄，观察是否在注射的部位有肿瘤形成，后续可每隔 7-10 天重复进行拍摄，每组裸鼠可设置 3~4 个时间点进行图像采集；

活体成像底物配制：底物购买于 promega 公司生产的 D-luciferin，Potassium Salt(D-荧光素钾盐)。用无菌的 1×PBS 溶解 D-荧光素钾盐粉末使其终浓度为 15 mg/mL，用0.22 𝜇m 滤器过滤除菌后分装，并于-20 ℃冰箱避光保存；

底物注射：成像前每只裸鼠腹腔注射 100 𝜇L 15 mg/mL 的荧光素钾盐溶液，注射底物5 min 内便可吸收；

麻醉：底物吸收后 3~5 分钟内便可用 2% 的戊巴比妥钠对裸鼠按照合适的剂量进行麻醉，完全麻醉后尽快进行活体成像的拍摄；

裸鼠苏醒：拍摄完成后迅速对裸鼠采取保暖措施使裸鼠体温及心跳尽快回复至麻醉前的状态，待其可以自主活动后将其放回 IVC 笼继续饲养；

小鼠脑组织剥取：在肿瘤形成后密切关注小鼠的生长状况，若出现明显的神经症状或发生死亡应尽快采取人道主义手段对实验鼠处以安乐死，并开颅完整剥取整个脑组织，并放于 4%的 PFA 中 4 ℃固定，以便后续进行免疫组化及病理分析，同时准确记录小鼠死亡时间，以便后续进行生存期统计分析。

表1 在CGGA数据库中分析RIT1基因mRNA的高低表达对脑胶质瘤患者总生存期及无进展生存期的影响

。

本发明通过利用CGGA数据库中的数据对RIT1在中国脑胶质瘤人群样本中的表达量及其高低表达对脑胶质瘤病人预后的影响进行分析发现，RIT1随着脑胶质瘤级别的升高呈现逐渐增加的趋势，并且其高表达可以预测病人更差的生存期；功能研究结果提示，RIT1基因的高表达促进了胶质瘤细胞的体外增殖，加速了细胞周期进程，促进了细胞迁移，降低了胶质瘤细胞对TMZ的敏感性并促进了胶质瘤细胞在体内的成瘤以及加速了体内瘤体的生长速度，显著缩短了实验鼠的生存期。进一步的机制研究结果显示，RIT1基因的过表达导致MAPK信号通路的过度激活，促进了MAPK信号通路上MEK、ERK以及下游丝裂原应激活化蛋白激酶MSK1的磷酸化。

以上实验结果提示，筛选到RIT1基因的靶向抑制剂可为脑胶质瘤的临床治疗提供了新的理论基础及分子靶标。

序列表

<110> 复旦大学

<120> RIT1基因作为治疗脑胶质瘤药物干预靶点的应用

<130> 001

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

agaattcagc tgtcccttt 19

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tcgaagtttc catgaagtt 19

Claims

1.RIT1基因作为治疗脑胶质瘤药物干预靶点的应用。

2.根据权利要求1所述的RIT1基因作为治疗脑胶质瘤药物干预靶点的应用，其特征在于，RIT1基因在脑胶质瘤中显著上调表达，并且其高低表达与胶质瘤患者的生存期显著相关，即RIT1基因的mRNA表达水平随着脑胶质瘤级别的升高呈现逐渐增加的趋势，并且其高表达可以预测病人更差的生存期。

3.根据权利要求1所述的RIT1基因作为治疗脑胶质瘤药物干预靶点的应用，其特征在于，RIT1基因的高表达可促进胶质瘤细胞的体外增殖，加速细胞周期进程，促进细胞迁移，降低胶质瘤细胞对TMZ的敏感性，并促进胶质瘤细胞在体内的成瘤以及加速体内瘤体的生长速度，显著缩短实验鼠的生存期；即，RIT1在脑胶质瘤中异常高表达，与脑胶质瘤细胞的增殖、周期及迁移生物学过程密切相关，而RIT1的过表达促进可脑胶质瘤细胞的增殖及迁移，对RIT1基因的表达量进行干扰后会增强脑胶质瘤细胞对替莫唑胺的敏感性。

4.根据权利要求1所述的RIT1基因作为治疗脑胶质瘤药物干预靶点的应用，其特征在于，RIT1基因的过表达导致MAPK信号通路的过度激活，促进MAPK信号通路上MEK、ERK以及下游丝裂原应激活化蛋白激酶MSK1的磷酸化。

5.RIT1基因的mRNA表达检测以及RIT1蛋白表达检测作为脑胶质瘤的生物标志物和预后标志物。

6. RIT1基因的靶向抑制剂或特异性siRNA通过干扰RIT1基因的表达在制备脑胶质瘤分子靶向药物中的用途。

7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，RIT1基因特异性siRNA的序列如下：

siRIT1#1: 5’-AGAATTCAGCTGTCCCTTT-3’；

siRIT1#2: 5’-TCGAAGTTTCCATGAAGTT-3’。