CN116377073A - 一种胃癌生物标志物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种胃癌生物标志物，该生物标志物为PISD。发明人通过实验分析胃癌组织和邻近的正常组织中差异代谢脂质，发现PE在胃癌组织中升高，进而找到调控它的主要代谢差异酶PISD，随后，通过数据库查阅结合实验研究，发现PISD在胃癌中上调，下调PISD可以抑制胃癌的增殖，迁移和侵袭，并影响线粒体的功能，因此推测PISD可作为胃癌生物标志物，可通过测试患者样本中PISD的表达量，实现对胃癌的早期诊断，对临床胃癌诊断、疗效检测评估具有重要意义。

Description

一种胃癌生物标志物及其应用

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种胃癌生物标志物及其应用。

背景技术

胃癌是一个全球性的健康问题，据统计2020年有超过100万人新诊断出患有胃癌和76.9万的死亡病例。该病的危险因素包括幽门螺杆菌感染、年龄、高盐摄入量以及水果和蔬菜含量低的饮食。胃癌在内镜活检后通过组织学诊断，并使用CT，内窥镜超声，PET和腹腔镜分期。它是一种分子和表型高度异质性的疾病。胃癌是一种预后较差的常见恶性肿瘤，一般晚期胃癌采取防化疗的治疗方法。尽管目前在手术技术、放疗、化疗和新辅助治疗方面取得了进步，但胃癌仍然是全球癌症死亡的第三大原因。虽然早期胃癌的5年生存率可达到>90％，但由于早期诊断率低，大多数患者表现为晚期胃癌。因此对于胃癌的预防以及早发现早治疗仍然是一个非常大的难题。

磷脂是大多数生物体内生物膜的主要结构和功能成分，控制着生物膜的稳态。而磷脂酰乙醇胺(PE)是生物体内最丰富的磷脂之一。PE主要通过两条途径合成，其中一条重要途径就是在线粒体中由磷脂酰丝氨酸脱羧酶(PISD)脱羧形成的PE。PISD主要定位于线粒体内膜的磷脂酰丝氨酸脱羧酶，其功能是催化磷脂酰丝氨酸(PS)脱羧成PE。PISD调节线粒体的多个方面，尤其是对于线粒体中的PE合成起着关键的作用。在哺乳动物中沉默PISD会导致线粒体缺陷，线粒体形态变化以响应线粒体PE的缺乏。线粒体是关键的能量产生细胞器和反应性物种的细胞来源。它们负责通过平衡稳态和结构网络来管理细胞的寿命和死亡。线粒体对于能量代谢、细胞凋亡调节和细胞信号传导是必不可少的。线粒体代谢通过为大分子合成提供关键代谢物并产生癌代谢物以维持癌症表型来支持肿瘤合成代谢。此外，还有多项临床试验测试了抑制线粒体代谢作为一种新的癌症治疗方法的功效。线粒体是生物能量和生物合成细胞器，它们从细胞质中吸收底物并利用它们完成一系列代谢工作。恶性细胞中的线粒体在结构和功能上与正常细胞中的线粒体不同，它们在癌症环境中更为重要和有趣，并积极参与代谢重编程。由于线粒体代谢的变化和膜电位的变化，癌细胞更容易受到线粒体靶向治疗的影响。功能性线粒体的丧失可能会导致癌症进展停止或癌细胞死亡。

有文献报道，过表达PISD的乳腺癌细胞在高通量微流体乳腺球装置和小鼠异种移植模型中表现出降低肿瘤的起始潜能。还有文献指出在乳腺癌细胞中下调PISD延迟了自噬。然而，现有技术中，并未有关于PISD在胃癌中的研究报道。

发明内容

本发明的目的在于解决现有技术中胃癌早期诊断技术的不足，提供一种胃癌生物标志物。

技术方案

PISD(磷脂酰丝氨酸脱羧酶)作为生物标志物在制备胃癌诊断试剂中的应用。

本发明人通过临床胃癌组织和癌旁组织进行脂质组学和代谢组学分析(liposomeanalysis)发现其中PE在胃癌组织中表达上调，然后选取了多种胃癌细胞株，验证了PISD在胃癌细胞中相较于胃正常上皮细胞中高表达，并通过裸鼠皮下致瘤实验，发现PISD表达下调可显著抑制胃癌细胞的致瘤性，PISD表达上调可增加了胃癌细胞的致瘤性。

所述胃癌诊断试剂包含用于检测生物标志物PISD表达水平的特异性引物，其序列为：

前引物：5'-CTTTGTACAAGTCAGTGCCAAC-3'，

后引物：5'-CCAGATGTACAGGCTGTAGAC-3'。

本发明的有益效果：

发明人通过实验分析胃癌组织和邻近的正常组织中差异代谢脂质，发现PE在胃癌组织中升高，进而找到调控它的主要代谢差异酶PISD，随后，通过数据库查阅结合实验研究，发现PISD在胃癌中上调，下调PISD可以抑制胃癌的增殖，迁移和侵袭，并影响线粒体的功能，因此推测PISD可作为胃癌生物标志物，可通过测试患者样本中PISD的表达量，实现对胃癌的早期诊断；也可以基于PISD作为潜在靶点开发分子靶向剂用于临床胃癌的治疗；也基于PISD作为分子探针来探究线粒体功能异常与胃癌相关研究的一个分子工具，提高了患者的生存率。

附图说明

图1为胃癌组织和癌旁组织中脂质组学分析结果；

图2为胃癌样本和正常胃上皮组织中PISD的表达水平的测试数据；

图3为PISD表达水平与胃癌癌患者总生存期的关系；

图4为临床胃癌组织样本和胃癌旁组织样本的免疫组织化学实验结果；

图5为PISD在人正常胃上皮细胞GES-1和人胃癌细胞系MGC-803、SGC-7901、AGS、HGC-27、MKN28和MKN45中的蛋白表达水平的Western blot测试结果；

图6为构建的稳定低表达PISD的AGS和MKN45胃癌细胞株中PISD表达水平的Western blot定量分析结果；

图7为敲低PISD的胃癌细胞株的增殖活力实验结果；

图8为敲低PISD的胃癌细胞株的平板克隆实验结果；

图9为敲低PISD的AGS胃癌细胞株的体外穿膜迁移侵袭能力测试结果；

图10为敲低PISD的MKN45胃癌细胞株的体外穿膜迁移侵袭能力测试结果；

图11为qRT-PCR检测转染过表达PISD的MGC-803和MGC-803细胞中的PISD的mRNA水平结果；

图12为Western Blot检测转染过表达PISD的MGC-803和MGC-803细胞中的PISD蛋白水平的实验结果；

图13为过表达PISD的胃癌细胞株的增殖能力实验结果；

图14为过表达PISD的胃癌细胞株的平板克隆实验结果；

图15为过表达PISD的胃癌细胞株体外穿膜迁移侵袭能力测试结果；

图16为活体实时成像系统监测裸鼠体内肿瘤形成得到的图像；

图17为过表达PISD组和阴性对照组肿瘤生长30天后的肿瘤重量测试结果；

图18为过表达PISD组和阴性对照组的胃癌皮下移植瘤模型裸鼠的移植瘤标本的组织病理染色和免疫组化染色图；

图19为过表达PISD组和阴性对照组的MGC-803细胞的透射电镜图。

具体实施方式

下面结合附图具体实施例对本发明的技术方案作进一步说明。

实施例1磷脂酰乙醇胺(PE)在胃癌组织和胃癌旁组织中的变化

临床标本来源：安徽医科大学第一附属医院29例临床胃癌肿瘤组织和29例临床癌旁正常组织。

为了研究胃癌组织中脂质代谢的变化，对标本中胃癌组织和癌旁组织进行了基于UPLC-MS/MS的脂质组学分析。图1为胃癌组织和癌旁组织中脂质组学分析结果，其中，颜色与代谢物的变化成正比(红色，上调，正相关；蓝色，下调，负相关；行：代谢物，列：样品)，可以看出，胃癌组织中PE相关代谢物发生明显变化。

实施例2

为了进一步探讨PISD在胃癌中的相关性，我们根据TCGA数据集检测了415例胃癌样本和34例正常胃上皮组织中PISD的表达水平，并根据这些检测数据进行了统计分析，结果见图2。

图2为胃癌样本和正常胃上皮组织中PISD的表达水平的测试数据，可以看出，胃癌组织中PISD的表达水平高于正常胃上皮组织。

通过分析Kaplan-Meier Plotter数据库(http://kmplot.com/analysis/index.php)，可以得出PISD表达与胃癌患者的(5年生存率)总生存期，见图3。

实施例3

为了证实PISD是否在胃癌中上调，对29例临床胃癌组织样本和29例癌旁正常组织(标本来源于安徽医科大学第一附属医院)进行了免疫组织化学染色，方法步骤如下：

(1)烤片：将切片放在37℃恒温箱里烤片30～60min；

(2)脱蜡：将切好的片子依次浸泡于二甲苯Ⅰ10min→二甲苯Ⅱ10min→无水乙醇Ⅰ5min→无水乙醇Ⅱ5min→90％乙醇5min→80％乙醇2min→70％乙醇2min→ddH₂O(2遍)2min；

(3)抗原修复(微波修复法)：预先配好1L的柠檬酸钠溶液，将切片架垂直置于烧杯中，柠檬酸钠溶液要完全覆盖住切片中的组织，置于微波炉中，高火8min，停2min，再高火2min，自然冷却至室温；

(4)阻断内源性过氧化物酶：加入适量的内源性过氧化物酶阻断剂，室温孵育10分钟；PBS洗3次，每次3min；

(5)滴加一抗：用免疫组化笔在组织周围画圈，根据组织大小，滴加100μL或适量的一抗，将切片放入湿盒中4℃冰箱过夜；

(6)滴加酶标羊抗小鼠/兔IgG聚合物：样本4℃过夜从冰箱拿出后需在室温下孵育15min复温，PBS洗3次，每次3min；滴加100μL或适量的酶标羊抗小鼠/兔IgG聚合物，37℃孵育30min；PBS洗3次，每次3min；

(7)显色：加入适量新鲜配制的DAB显色液，显微镜下观察，阳性信号为棕黄色或棕褐色，时间要控制好，切勿显色过深，用自来水冲洗终止显色；

(8)复染：苏木素染色数秒；盐酸分化、冲洗返蓝；

(9)封片：将中性树胶滴加在组织旁边，再用盖玻片盖上，先放平一侧，然后轻轻放下另一侧，以免产生气泡，封好的切片平躺置于通风橱中晾干；

(10)晾干的切片可以在显微镜下观察或者扫片。

临床胃癌组织样本和胃癌旁组织样本的免疫组织化学实验结果见图4，图4显示：临床胃癌组织样本中PISD蛋白水平明显高于同来源的胃癌旁组织样本。

实施例4

通过Western blot实验检测PISD在人正常胃上皮细胞(GES-1)和人胃癌细胞系(MGC-803、SGC-7901、AGS、HGC-27、MKN28和MKN45)蛋白表达水平。

细胞来源：本实验所用的细胞株为GES-1细胞株：人正常胃粘膜上皮细胞株；AGS：低分化人胃腺癌细胞株；MKN-45：低分化人胃癌细胞株；MGC-803：低分化人胃腺癌细胞株；SGC-7901：中分化人胃腺癌细胞株；HGC-27：未分化人胃癌细胞株；MKN-28：人胃癌高转移细胞株。GES-1、SGC-7901、MGC-803、HGC-27、MKN28、MKN45均购自上海细胞库；AGS来自ATCC。

PISD在人正常胃上皮细胞GES-1和人胃癌细胞系MGC-803、SGC-7901、AGS、HGC-27、MKN28和MKN45中的蛋白表达水平的Western blot测试结果见图5，*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001，可以看出，PISD在胃正常上皮细胞(GES-1)的蛋白表达明显低于其在人源胃癌细胞株(MGC-803、SGC-7901、AGS、HGC-27、MKN28和MKN45)中的表达。

实施例5

为考察PISD对胃癌发展的影响，我们用shRNA慢病毒在AGS和MKN45胃癌细胞株上敲低PISD，构建稳定低表达PISD的胃癌AGS和MKN45胃癌细胞株，方法如下：

(1)细胞转染实验

第一天，先向六孔板中每孔接种3-5万个细胞，置于37℃孵箱培养，以保证第二天感染细胞时细胞汇合度约20-30％；

第二天，弃去培养基，根据MOI＝10计算好加入病毒的体积，预先混好完全培养基、病毒和增强液，加入到每一个孔中；12h后观察细胞生长状态，给细胞换液，保持细胞活性；

(2)48-72h后，在荧光显微镜下观察细胞的转染效率，可看到大面积的细胞自发绿光荧光；

(3)加入嘌呤霉素，浓度为2μg/mL，筛选出已感染了病毒的细胞。细胞扩大培养，每次换液传代均使用含有2μg/mL嘌呤霉素的培养基。观察细胞状态和荧光强度，约两周后即可获得稳定表达目的基因的多克隆细胞株，待细胞稳定表达后方可使用普通完全培养基培养。

(4)转染效率鉴定：提取细胞的RNA，逆转录后，通过qRT-PCR鉴定PISD mRNA水平，采用Western blot实验鉴定PISD蛋白干扰/过表达效率。

qRT-PCR反应程序：95℃预变性1min，95℃变性20s，60℃1min，循环数：35～45个。20μl反应体系为：ddH₂O6.5μl，DNA模板3μl，引物2μM 3μl，qPCR Super Mix Plus 10μl。qRT-PCR反应体系如表1所示，qRT-PCR使用的引物如表2所示：

表1 qRT-PCR预混体系

表2引物序列信息

图6为构建的稳定低表达PISD的AGS和MKN45胃癌细胞株中PISD表达水平的Western blot定量分析结果，其中，图6A为敲低PISD组的AGS胃癌细胞株中的PISD表达水平，图6B为敲低PISD组的MKN45胃癌细胞株中的PISD表达水平，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，结果显示，敲低PISD组的AGS和MKN45胃癌细胞株中PISD蛋白表达明显降低，敲低效率达到50％以上。

实施例6

一.采用CCK8活力检测法分析敲低PISD的胃癌细胞株的增殖活力情况：

(1)首先摸索细胞的接种个数，根据选择的培养天数，接种2000～3000个细胞接种于96孔板，选择48h-96h后生长占95％左右的细胞个数；

(2)按照常规的方法，把细胞消化、离心下来，然后用计数板计数，取之前摸索好的细胞数，按照每孔100μL培养基含有相同数量的细胞的原则均匀快速的接种在96孔板中，尽量接种均匀。要设置空白对照孔，即调零孔(不加细胞，只加培养液)。相同的孔需设置5～6个复孔；

(3)置37℃，5％CO2培养箱中孵育过夜，孵箱中进行孵育0h、24h、48h和72h。0h、24h、48h和72h后收板。细胞间内避光操作，每100μL的培养基需加入10μL的CCK8溶液，提前算好需要多少体积的CCK8溶液，与培养基提前配好混匀，再加入每个孔中，37℃孵箱避光孵育2h；

(4)每间隔30min，取出96孔板，在酶标仪450nm处测定每一孔的吸光度值。

敲低PISD的胃癌细胞株的增殖活力实验结果见图7，其中，图7A针对的是敲低PISD的胃癌AGS细胞株，图7B针对的是敲低PISD的胃癌MKN45细胞株，可以看出,敲低PISD的胃癌AGS和MKN45细胞株与阴性对照组(Vector组)相比,细胞增殖明显被抑制。

二.对敲低PISD的AGS和MKN45胃癌细胞进行了平板克隆实验：

(1)选择对数生长期的胃癌细胞按照常规方法消化离心计数梯度稀释后，取1000个每孔，接种于六孔板，轻轻晃动转动，使细胞分散均匀；

(2)先放外面沉降数分钟后，放置于37℃，5％CO₂培养箱中培养，最开始的数天不需要挪动，由于细胞非常少，防止挪动让细胞不贴壁，培养2～3周后，按需求换液；

(3)待出现肉眼可见的细胞团后，收板，用PBS洗2遍，福尔马林固定液室温固定30min，0.1％结晶紫染色15min，PBS洗3遍，放置在室温空气中干燥培养板后，拍照记录。

结果如图8所示，其中，图8A针对的是敲低PISD的胃癌AGS细胞株，图8B针对的是敲低PISD的胃癌MKN45细胞株，可以看出，与阴性对照组(Vector组)比较，敲低PISD的胃癌细胞组克隆形成能力较差。与CCK8实验结果一致，说明敲低PISD表达可以抑制胃癌细胞增殖。

三.采用Transwell迁移、侵袭实验检测敲低PISD的胃癌细胞株的体外穿膜迁移侵袭能力。实验方法如下：

1)提前一天，细胞用无血清培养基饥饿培养12h，进一步去除血清的影响；

2)将分装好的储存在-20℃Matrigel基质胶提前3-4个小时拿出来在4℃冰箱融化，提前1个小时把黄枪头放在-20℃冰箱里预冷。用预冷的枪头将Matrigel基质胶按照1:8的比例用无血清培养基稀释，整个过程在冰上操作。在每个Transwell小室底部膜的上室中加入稀释好的基质胶40μL，覆盖住整个聚酯酸脂膜，置于细胞培养箱中培养1～4h，使Matrigel胶凝固。Matrigel基质胶，4℃是液体，37℃会逐渐凝固成胶状，是不可逆的。切记一定要在冰上操作；

3)第二天，细胞常规消化离心，最后用无血清培养基中止消化，PBS洗2遍，再离心，用无血清的培养基再重悬，调整细胞浓度为1×10⁵/mL；

4)在24孔板下室中加入500μL含血清的完全培养基，形成一个血清浓度差，可以适当将血清浓度提高；将Transwell小室放入24孔板中，确保小室底层薄膜与下层的完全培养基之间无气泡；

5)取200μL提前配好的细胞悬液加入Transwell小室的上室中，尽量滴在中间；

6)置37℃，5％CO₂培养箱中静置培养24h～48h(具体穿膜的时间根据自己的实验来摸索)；

7)24-48h后，弃24孔板及小室内的培养基，用PBS清洗2次，稍稍晾干小室；

8)24孔板每孔中加入500μL福尔马林溶液固定30min，将小室放入24孔板，(风干或PBS洗三次)0.1％结晶紫染色15min。回收染色液，小室内使用棉花蘸PBS轻轻擦净，小室在PBS中轻轻漂洗，室温干燥后拍照，计数。

图9为敲低PISD的AGS胃癌细胞株的体外穿膜迁移侵袭能力测试结果，其中，图9A为迁移能力测试结果，图9B为侵袭能力测试结果，图10为敲低PISD的MKN45胃癌细胞株的体外穿膜迁移侵袭能力测试结果，其中，图10A为迁移能力测试结果，图10B为侵袭能力测试结果，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，可以看出，敲低PISD的胃癌细胞AGS穿过小室基底膜的平均细胞数较阴性对照组(Vetor组)明显减少，说明敲低PISD胃癌细胞迁移能力明显被抑制，在MKN45胃癌细胞株中也得到了相同的结果。两种实验结果一致，证明下调PISD的表达可以抑制胃癌细胞的迁移和侵袭能力。

实施例7

为了证实PISD的上调可促进胃癌的发展，我们在MGC-803胃癌细胞株使用慢病毒载体转染过表达PISD：

(1)细胞转染实验

第一天，先向六孔板中每孔接种3～5万个细胞，置于37℃孵箱培养，以保证第二天感染细胞时细胞汇合度约20-30％；

第二天，弃去培养基，根据MOI＝10计算好加入病毒的体积，预先混好完全培养基、病毒和增强液，加入到每一个孔中；12h后观察细胞生长状态，给细胞换液，保持细胞活性；

(2)48-72h后，在荧光显微镜下观察细胞的转染效率，可看到大面积的细胞自发绿光荧光；

(3)加入嘌呤霉素，浓度为2μg/mL，筛选出已感染了病毒的细胞。细胞扩大培养，每次换液传代均使用含有嘌呤霉素的培养基。观察细胞状态和荧光强度，约两周后即可获得稳定表达目的基因的多克隆细胞株，待细胞稳定表达后方可使用普通完全培养基培养；

(4)转染效率鉴定：分别收集各自细胞并提取总RNA后，qRT-PCR鉴定PISD mRNA水平，提取总蛋白后，Western Blot检测PISD蛋白干扰/过表达效率。

qRT-PCR检测转染过表达PISD的MGC-803和MGC-803细胞中的PISD的mRNA水平结果如图11所示，与阴性对照组(Vector组)相比，过表达PISD的胃癌MGC-803细胞系中mRNA水平表达明显升高。

Western Blot检测转染过表达PISD的MGC-803和MGC-803细胞中的PISD蛋白水平的实验结果如图12所示,与阴性对照组(Vector组)相比，过表达PISD的MGC-803胃癌细胞株中PISD的蛋白表达明显升高。

实施例8

1.采用CCK8实验检测过表达PISD的胃癌细胞株的增殖能力。

过表达PISD的胃癌细胞株的增殖能力实验结果见图13,过表达PISD的MGC-803胃癌细胞株与阴性对照组(Vector组)相比,细胞增殖能力增加。

2.对过表达PISD的胃癌细胞株进行平板克隆实验。

克隆平板实验结果见图14，与阴性对照组(Vector组)比较，过表达PISD的MGC-803胃癌细胞株的克隆形成能力增强。与CCK8实验结果一致，说明过表达PISD表达可以促进胃癌细胞的增殖。

3.采用Transwell实验检测过表达PISD的胃癌细胞株体外穿膜迁移侵袭能力。

过表达PISD的胃癌细胞株体外穿膜迁移侵袭能力实验结果见图15，其中，图15A为迁移能力测试结果，图15B为侵袭能力测试结果，可以看出，过表达PISD的MGC-803胃癌细胞株的穿膜细胞数相较于阴性对照组(Vetor组)明显增多，说明过表达PISD的MGC-803胃癌细胞迁移侵袭能力增强。

实施例9

裸鼠皮下移植瘤实验：

选取BALB/c雄性裸鼠12只，每组6只，购自江苏集萃药康生物有限公司，鼠龄6周，SPF条件下饲养，随机分成2组(过表达PISD组和阴性对照组)，每组6只。收集胰酶消化的对数生长期的Vector/LV-PISD的稳定表达的MGC-803胃癌细胞，800r/min离心3min弃上清液。在无菌环境中，按照0.1ml/只接种于裸鼠背部，每只接种6×10⁶个，放回笼中继续饲养，观察裸鼠的状态。预计1周后12只裸鼠皮下会出现5mm左右结节，表明胃癌模型建立成功。每3天测量肿瘤大小，给裸鼠称体重。肿瘤体积大小根据V＝0.5×长径×短径的平方计算。一个月之后处死裸鼠，取出肿瘤及相应的脏器拍照，一部分根据冻入﹣80℃，一部分泡在福尔马林里以备后续实验使用。

图16为活体实时成像系统监测裸鼠体内肿瘤形成得到的图像，可以看出，PISD过表达组在肿瘤处的荧光强度明显强于对照组。

图17为过表达PISD组和阴性对照组肿瘤生长30天后的肿瘤重量测试结果，可以看出，过表达PISD组的肿瘤重量略高于对照组。

应用过表达PISD的胃癌细胞构建的裸鼠皮下移植瘤模型(同时设阴性空载对照的胃癌细胞构建的裸鼠皮下移植瘤模型为对照组)的移植瘤标本进行免疫组化染色，图18为过表达PISD组和阴性对照组的胃癌皮下移植瘤模型裸鼠的移植瘤标本的组织病理染色(H&E)和免疫组化染色(IHC)图。可以看出，PISD过表达组胃癌细胞动物移植瘤模型的移植瘤细胞增殖指标Ki67表达量明显升高。

实施例10

为了进一步考察PISD促进肿瘤发展的潜在分子机制，采用透射电镜观察过表达PISD组和阴性对照组(Vector组)的MGC-803细胞内的超微结构。

图19为过表达PISD组和阴性对照组(Vector组)的MGC-803细胞的透射电镜图，可以看出，过表达PISD的MGC-803细胞的线粒体嵴、膜更加完整丰富。

Claims (2)

1.PISD作为生物标志物在制备胃癌诊断试剂中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述胃癌诊断试剂包含用于检测生物标志物PISD表达水平的特异性引物，其序列为：

前引物：5'-CTTTGTACAAGTCAGTGCCAAC-3'，

后引物：5'-CCAGATGTACAGGCTGTAGAC-3'。

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