CN104383557A - 一种治疗肉鸡腹水征合症的rna干扰药物的制备方法和用途及其药效验证方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种治疗肉鸡腹水征合症的RNA干扰药物的制备方法和用途及其药效验证方法,首先构建慢病毒表达载体-HIF-1α-shRNAi,然后将HIF-1α-shRNAi重组质包装成药剂,再注射粒肉鸡体内,沉默HIF-1α基因,抑制下游基因血管内皮生长因子(VEGF)、体内内皮素-1(ET-1)、胰岛素样生长因子II(IGF-II)等表达,控制肺血管重构(PVR)现象,减少心肺功能损伤与腹水形成,最终实现临床肉鸡腹水征合症治疗。本发明具有特异性、高效性及多能性等治疗方面的优点。
Description
技术领域
本发明涉及基因治疗技术领域,具体是一种治疗肉鸡腹水征合症的RNA干扰药物的研制方法。
背景技术
肉鸡腹水综合征(ascites syndrome,AS)又称肉鸡肺动脉高压综合征(pulmonaryhypertension syndrome,PHS),是在各种因素作用下造成肉鸡相对缺氧或肉鸡生长过快,肺的容积与体重的增加不成正比,在此情况下,由于氧无法满足机体的正常需要,致使其呈现血液黏稠、血容量增加、肝肿大、肺瘀血水肿及肺动脉高压等病理现象,这种在临床上以腹腔积液和右心室肥大、扩张等为主要特征,被视为一种营养代谢病,也是公认的严重危害肉鸡养殖业的疾病之一。该病以肉鸡多发,冬季和早春易发,且分布范围广。北美、玻利维亚、秘鲁、墨西哥、南非、英国、美国、澳大利亚、德国、加拿大、意大利、日本等国家。近年来全球对AS调查发现,其发病率达10%~40%,呈上升趋势,平均发病率为4.2%,年死亡率超过25%,每年约有70亿只肉鸡受到腹水综合征的侵害,经济损失高达100亿美元。显然该病业已成为严重危害肉鸡养殖业发展的全球性问题。
自从肉鸡AS报道以来,不断有国内外学者对其病因进行了大量的研究,他们认为大多数肉鸡AS的诱发原因主要源于生长过快、组织缺氧、饲养密度过高、海拔过高、温度过低、高钠日粮及低硒日粮、低磷、低VC、VE等因素。其原因是这些诱因均可引起机体相对性缺氧,而对氧的消耗量已超过其心肺功能供氧的极限临界点,以致于机体处于缺氧状态,最终导致肺动脉高压而形成腹水。
近年来,有关HIF-1α与肉鸡AS的研究也有些许报道,曾秋凤等采用RT-PCR技术检测正常肉鸡和AS患鸡肺脏HIF-1αmRNA,结果表明,AS患鸡肺脏HIF-1αmRNA表达丰度极显著高于正常肉鸡(P<0.01),揭示了HIF-1α与腹水综合征高度相关性。Zhang等证明了肉鸡食用高盐的饮水可以增加HIF-1αmRNA表达,引起肉鸡腹水发生。Toshiyuki等对鸡胚心室肌细胞中HIF-1α基因进行了cDNA克隆,得到了HIF-1α基因全长cDNA序列等。但是利用阻断HIF-1α基因在肉鸡AS治疗上还未见相关研究,因此,抑制HIF-1α的活性为治疗肉鸡AS提供了新靶点。目前,RNA干扰HIF-1α基因的国内外研究主要在哺乳动物和人的研究较多,在肿瘤疾病中治疗,如Wang等通过HIF-1α-shRNAi转染到人乳腺癌细胞中,发现HIF-1α与VEGF基因表达量分别下降了91.63%、66.8%,从而抑制乳腺癌细胞的生长。Zhou等应用RNA干扰HIF-1α将有效地抑制口腔鳞状细胞癌的发展,特别是抑制和预防癌症细胞的血管生成和生存,因此,它可以作为一种强有力的和特定的治疗口腔癌。Chen等利用RNA干扰HIF-1α在小鼠肿瘤研究中,发现HIF-1α和血管内皮生长因子的表达明显减少,抑制肿瘤血管生成和减毒转移,显著抑制肿瘤的生长。Min等在人肺腺癌多药耐药细胞的RNA干扰HIF-1α实验中发现多药耐药基因及蛋白显著减少。此外,RNA干扰还在肝、呼吸系统及眼科等疾病中也得到广泛应用。以上RNA干扰HIF-1α基因的研究成果为本发明探索RNA干扰HIF-1α基因对肉鸡腹水的形成机理提供了非常重要的思路。
综上所述,肺动脉高压是对适应缺氧反应时机体的一种表现,同时在许多疾病中也是一种重要的病理生理症状。目前的研究发现,HIF-1α是调控肺动脉高压的中心环节。
发明内容
本发明的目的在于提供一种治疗肉鸡腹水征合症的RNA干扰药物的研制方法,本发明利用RNA干扰技术来阻断HIF-1α基因在肉鸡PAEC/肉鸡AS中有效作用。主要通过检测HIF-1α、ET-1、VEGF基因表达及生理生化指标情况,进一步研究参与低氧环境中PAEC增殖与凋亡的作用机制等,并更深入地从分子水平上阐明RNA干扰HIF-1α在肉鸡AS发生作用机制,将可能为临床肉鸡AS的预防和治疗提供一种新的途径和方法。
为实现上述目的,本发明提供如下技术方案:
一种治疗肉鸡腹水征合症的RNA干扰药物的制备方法,首先构建慢病毒表达载体-HIF-1α-shRNAi,然后将HIF-1α-shRNAi重组质粒包装成药剂,即为治疗肉鸡腹水征合症的RNA干扰药物。
作为本发明进一步的方案:HIF-1α-shRNAi的慢病毒表达载体的构建:采用DNA重组技术将HIF-1α-RNAi双链定向亚克隆入PU6启动子即可。
作为本发明进一步的方案:所述HIF-1α-shRNAi的慢病毒表达载体的构建:采用pGCSIL-GFP载体,转染细胞为293T细胞。
所述的制备方法制备的治疗肉鸡腹水征合症的RNA干扰药物的应用,将治疗肉鸡腹水征合症的RNA干扰药物注射到粒肉鸡体内,沉默HIF-1α基因,抑制下游基因血管内皮生长因子(VEGF)、体内内皮素-1(ET-1)、胰岛素样生长因子II(IGF-II)的表达。
作为本发明进一步的方案:所述的应用的药效验证方法,包括:(1)RNA干扰HIF-1α基因对肉鸡PAEC生长实验和(2)RNA干扰HIF-1α基因在肉鸡体内对腹水形成实验;
步骤(1)RNA干扰HIF-1α基因对肉鸡PAEC生长实验,具体包括:(1.1)鉴定RNA干扰靶点是否成功连接到慢病毒载体;(1.2)HIF-1α-shRNAi细胞转染;(1.3)模拟缺氧实验;(1.4)细胞的爬片与DAPI染色;(1.5)HIF-1a、VEGF、ET-1基因表达量的检测;
步骤(2)RNA干扰HIF-1α基因在肉鸡体内对腹水形成实验,具体包括:(2.1)人工诱导肉鸡腹水征合症试验;(2.2)动物分组;(2.3)动物接种;(2.4)检测。
作为本发明进一步的方案:步骤(1.2)HIF-1α-shRNAi细胞转染是借助Lipofectamine2000转染细胞,筛选出最佳的干扰靶点。
作为本发明进一步的方案:步骤(2.1)人工诱导肉鸡腹水征合症试验是采用三利用环境低温、饲料添碘甲状腺原氨酸(T3)诱发肉鸡腹水征合症。
作为本发明进一步的方案:步骤(1)RNA干扰HIF-1α基因对肉鸡PAEC生长实验:通过RNA干扰技术、细胞转染进行分组实验,利用RT-PCR、荧光定量PCR、WesternBlot流式细胞仪检测方法对HIF-1α、VEGF、ET-1基因表达进行检测以验证RNA干扰HIF-1α基因在肉鸡PAEC中的效果。
作为本发明进一步的方案:步骤(2)RNA干扰HIF-1α基因在肉鸡体内对腹水形成实验:择用正常肉鸡和人工诱导的腹水征合症肉鸡为实验对象,采用RNA干扰技术进行肉鸡体内实验,以测定肉鸡中右心室重与全心室重的比值(RV/TV)、红细胞总数(PCV)、红细胞压积(HCT)、血红蛋白含量(Hb)、血清中丙二醛(MDA)、胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、乳酸脱氢酶(LDH)指标,从而分析RNA干扰HIF-1α对肉鸡腹水发病过程中生理生化指标的变化;与此同时,再通过RT-PCR、实时荧光定量PCR、WesternBlot、免疫组化方法检测各组织中的HIF-1α、VEGF、ET-1基因mRNA的表达情况;最终结合以上实验结果,验证肉鸡体内RAN干扰HIF-1α对肉鸡腹水形成的影响
与现有技术相比,本发明的有益效果是:
本发明采用RNA干扰技术,将对肉鸡体内的缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)进行沉默,达到治愈肉鸡腹水综合征效果;通过RNA干扰技术、细胞转染等进行分组实验,利用RT-PCR、荧光定量PCR、Western Blot流式细胞仪等检测方法对HIF-1α、VEGF、ET-1基因表达进行检测以验证RNA干扰HIF-1α基因在肉鸡中的治疗效果;证实了该RNA干扰药物可应用于肉鸡腹水征合症治疗,且具有特导、高效性、多能性及治疗效果好等方面的优点。
附图说明
图1为治疗肉鸡腹水征合症的RNA干扰药物的研制方法的技术路线图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本专利的技术方案作进一步详细地说明。
请参阅图1,一种治疗肉鸡腹水征合症的RNA干扰药物的制备方法,首先构建慢病毒表达载体-HIF-1α-shRNAi,然后将HIF-1α-shRNAi重组质粒包装成药剂,即为治疗肉鸡腹水征合症的RNA干扰药物。
其中,构建慢病毒表达载体-HIF-1α-shRNAi的步骤为:根据Genbank中报道的HIF-1α基因寡核苷酸序列设计并合成引物,通过寡核苷酸序列正、反义链经过变性、复性后形成双链HIF-1α-RNAi。采用DNA重组技术,将HIF-1α-RNAi双链定向亚克隆入PU6启动子,得到慢病毒表达载体pGCSIL-GFP的-HIF-1α-shRNAi。
所述治疗肉鸡腹水征合症的RNA干扰药物在治疗肉鸡腹水征合症中的应用,将治疗肉鸡腹水征合症的RNA干扰药物注射到粒肉鸡体内,沉默HIF-1α基因,抑制下游基因血管内皮生长因子(VEGF)、体内内皮素-1(ET-1)、胰岛素样生长因子II(IGF-II)等表达,控制肺血管重构(PVR)现象,减少心肺功能损伤与腹水形成,最终实现临床肉鸡腹水征合症治疗。
所述治疗肉鸡腹水征合症的RNA干扰药物的药效验证方法,包括以下步骤
(1)RNA干扰HIF-1α基因对肉鸡PAEC生长实验
(1.1)鉴定RNA干扰靶点是否成功连接到慢病毒载体:将HIF-1α-shRNAi重组质粒转化到大肠杆菌感受态细胞中,选择阳性菌落进行PCR扩增和基因测序鉴定RNA干扰靶点是否成功连接到慢病毒载体。采用同样的方法,构建无效干扰序列-HIF-1α-shRNA重组质粒。
(1.2)HIF-1α-shRNAi细胞转染
(1.2.1)肉鸡PAEC的分离及培养:取2周龄的肉鸡肺动脉,用0.25%的胰酶灌注,消化肉鸡肺动脉内皮细胞,经多次冲洗,收集消化的细胞悬液进行培养,在37℃、5%CO2条件下培养3代后的细胞用于实验。
(1.2.2)病毒的包装、浓缩及病毒滴度测定:质粒中抽提试剂盒提取
HIF-1α-shRNAi/HIF-1α-shRNA中质粒DNA,以紫外光吸收法测定其浓度及纯度,保证所提质粒DNA的A260/A280在1.8~2.0之间。用Lipofectamine 2000转染293T细胞,收获重组慢病毒并以0.45μm滤器过滤上清液后超速离心法浓缩。同时,利用ELISA测定病毒滴度,使病毒滴度达到1×108cfu/mL以上可用于转染。
(1.2.3)转染:于第3代PAEC生长至约70%~80%融合时准备转染,采用脂质体(Lipofectamin 2000)法转染细胞,转染后24h在荧光显微镜下观察转染效率,筛选出转染效果达75%的细胞,备用于模拟缺氧实验。
(1.3)模拟缺氧实验
设常氧为对照组,用CoCl2制造细胞缺氧环境为实验组,各组设为3小组:空白组(未转染重组质粒)、阴性组(转染HIF-1α-shRNA重组质粒)、干扰组(转染HIF-1α-shRNAi重组质粒)。各小组6次重复,实验3次。分别在常氧和缺氧环境下培养,间隔3h收集培养上清液,共收集8次,检测收集各组培养上清液及细胞用于HIF-1α、VEGF、ET-1mRNA基因的表达量。
(1.4)细胞的爬片与DAPI染色
转染成功的细胞进行细胞爬片、固定、DAPI染色、封片与观察等方法,并在荧光显微镜下计数并了解转染效率。
(1.5)HIF-1a、VEGF、ET-1基因表达量的检测
(1.5.1)RT-PCR检测:收集细胞提取细胞总RNA,进行HIF-1α、VEGF、ET-1基因RT-PCR扩增,将其反应物进行凝胶电泳检测。
(1.5.2)荧光定量PCR检测:提取的细胞中总RNA通过荧光PCR溶解曲线判断扩增特异性、扩增曲线计算目的基因相对表达量,比较各组之间差异。
(1.5.3)Western Blot检测:收集细胞提取总蛋白后,进行Western Blot检测细胞内HIF-1α及VEGF基因的蛋白水平。并以稳定表达的基因β-actin为内参照。
(1.5.4)ELASA检测:取细胞培养上清液作为检测定样本,取等体积样本及检测试剂加入酶标板孔中,TMBE溶液显色,酶标仪650nm波长下读取数值,测出ET-1表达量。
(1.5.5)流式细胞仪检测:将各组细胞培养72小时后,用0.25%胰酶消化,收集细胞,进行流式细胞仪检测各组细胞周期和凋亡情况。
(1.6)统计学处理
实验数据应用SPSS 18.0软件处理,计量资料以均数±标准差(M±SD)表示,方差分析进行组间比较,P<0.05表示差异显著性。
(2)RNA干扰HIF-1α基因在肉鸡体内对腹水形成实验
(2.1)人工诱导肉鸡AS试验
取2周龄肉鸡利用环境低温、饲料添加三碘甲状腺原氨酸(T3)诱发肉鸡AS;从2周龄开始试验,随后进行的临床病理学变化规律观察,统计腹水发病率,选出腹水发病肉鸡用于干扰实验。
(2.2)动物分组
选择2周龄的正常肉鸡/人工诱导AS的肉鸡将随机分别分为空白组、阴性组、干扰组。每小组10只,各小组重复6次,实验3批。
(2.3)动物接种
采用肉鸡翼下静脉注射法,干扰组将注射HIF-1α-shRNAi重组质粒悬液,空白组和阴性组分别注射等量的生理盐水和无效干扰HIF-1α-shRNA重组质粒悬液。在常氧/缺氧环境下饲喂数天后,采血样进行生化指标检测,同时从各组中抽取鸡样进行处死,取组织进行检测。
(2.4)检测
(2.4.1)生化指标检测:用称量法测定各组鸡的右心室与全心室的比值(RV/TV),血液分析仪法测定PCV、HCT、Hb,用生化试剂盒测定血清中MDA、GSH-Px、LDH生化指标,监测肉鸡腹水发病过程中生理生化指标的变化情况。
(2.4.2)RT-PCR检测:分批处死各实验组肉鸡,取组织样本(肺、肺动脉、心脏、肝器官)提取组织中总RNA,进行HIF-1α、VEGF、ET-1基因RT-PCR扩增,将其反应物进行凝胶电泳检测比较各组之间差异。
(2.4.3)荧光定量PCR检测:提取的组织中总RNA通过荧光定量PCR溶解曲线判断扩增特异性、扩增曲线计算目的基因相对表达量,比较各组之间差异。
(2.4.4)Western Blot检测:取各实验组肉鸡内脏器官(肺、肺动脉、心脏、肝)提取组织中总蛋白并做Biofrad法定量,进行Western Blot检测细胞内HIF-1α、VEGF、ET-1基因的蛋白水平。并以稳定表达的基因β-actin为内参照。
(2.4.5)免疫组织化学染色:取各实验组肉鸡的内脏器官(肺、肺动脉、心脏、肝),用常规石蜡切片制片,3,3′-二氨基联苯胺(DAB)显色,苏木素复染,脱水、透明、封片,各组均设阴性对照。采用IMS细胞图像分析系统进行分析。
上面对本专利的较佳实施方式作了详细说明,但是本专利并不限于上述实施方式,在本领域的普通技术人员所具备的知识范围内,还可以在不脱离本专利宗旨的前提下做出各种变化。
Claims (9)
1.一种治疗肉鸡腹水征合症的RNA干扰药物的制备方法,其特征在于,首先构建慢病毒表达载体-HIF-1α-shRNAi,然后将HIF-1α-shRNAi重组质粒包装成药剂,即为治疗肉鸡腹水征合症的RNA干扰药物。
2.根据权利要求1所述的治疗肉鸡腹水征合症的RNA干扰药物的制备方法,其特征在于,HIF-1α-shRNAi的慢病毒表达载体的构建:采用DNA重组技术将HIF-1α-RNAi双链定向亚克隆入PU6启动子即可。
3.根据权利要求1或2所述的治疗肉鸡腹水征合症的RNA干扰药物的制备方法,其特征在于,所述HIF-1α-shRNAi的慢病毒表达载体的构建:采用pGCSIL-GFP载体,转染细胞为293T细胞。
4.一种如权利要求1或2所述的制备方法制备的治疗肉鸡腹水征合症的RNA干扰药物的应用,其特征在于,将治疗肉鸡腹水征合症的RNA干扰药物注射到粒肉鸡体内,沉默HIF-1α基因,抑制下游基因血管内皮生长因子(VEGF)、体内内皮素-1(ET-1)、胰岛素样生长因子II(IGF-II)的表达。
5.一种如权利要求4所述的应用的药效验证方法,其特征在于,包括:(1)RNA干扰HIF-Iα基因对肉鸡PAEC生长实验和(2)RNA干扰HIF-1α基因在肉鸡体内对腹水形成实验;
步骤(1)RNA干扰HIF-1α基因对肉鸡PAEC生长实验,具体包括:(1.1)鉴定RNA干扰靶点是否成功连接到慢病毒载体;(1.2)HIF-1α-shRNAi细胞转染;(1.3)模拟缺氧实验;(1.4)细胞的爬片与DAPI染色;(1.5)HIF-1a、VEGF、ET-1基因表达量的检测;
步骤(2)RNA干扰HIF-1α基因在肉鸡体内对腹水形成实验,具体包括:(2.1)人工诱导肉鸡腹水征合症试验;(2.2)动物分组;(2.3)动物接种;(2.4)检测。
6.根据权利要求5所述的药效验证方法,其特征在于,步骤(1.2)HIF-1α-shRNAi细胞转染是借助Lipofectamine 2000转染细胞,筛选出最佳的干扰靶点。
7.根据权利要求5所述的药效验证方法,其特征在于,步骤(2.1)人工诱导肉鸡腹水征合症试验是采用三利用环境低温、饲料添碘甲状腺原氨酸(T3)诱发肉鸡腹水征合症。
8.根据权利要求5-7之一所述的药效验证方法,其特征在于,步骤(1)RNA干扰HIF-1α基因对肉鸡PAEC生长实验:通过RNA干扰技术、细胞转染进行分组实验,利用RT-PCR、荧光定量PCR、Western Blot流式细胞仪检测方法对HIF-1α、VEGF、ET-1基因表达进行检测以验证RNA干扰HIF-1α基因在肉鸡PAEC中的效果。
9.根据权利要求5-7之一所述的药效验证方法,其特征在于,步骤(2)RNA干扰HIF-1α基因在肉鸡体内对腹水形成实验:择用正常肉鸡和人工诱导的腹水征合症肉鸡为实验对象,采用RNA干扰技术进行肉鸡体内实验,以测定肉鸡中右心室重与全心室重的比值(RV/TV)、红细胞总数(PCV)、红细胞压积(HCT)、血红蛋白含量(Hb)、血清中丙二醛(MDA)、胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、乳酸脱氢酶(LDH)指标,从而分析RNA干扰HIF-1α对肉鸡腹水发病过程中生理生化指标的变化;与此同时,再通过RT-PCR、实时荧光定量PCR、Western Blot、免疫组化方法检测各组织中的HIF-1α、VEGF、ET-1基因mRNA的表达情况;最终结合以上实验结果,验证肉鸡体内RAN干扰HIF-1α对肉鸡腹水形成的影响。
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C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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Application publication date: 20150304 |