CN110237113A - 一种抗大肠杆菌与球虫混合感染的植物提取物添加剂及应用 - Google Patents

一种抗大肠杆菌与球虫混合感染的植物提取物添加剂及应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于饲料添加剂领域，具体公开了一种抗大肠杆菌与球虫混合感染的植物提取物添加剂及应用，本发明申请人发现将藤黄果皮提取物能够增强机体对球虫的抵抗力，抑制大肠杆菌。将藤黄果皮提取物、松树皮提取物、百部提取物、蒲公英提取物复配后制得的饲料添加剂，使得植物活性成分更好的发挥药物和营养的双重效果，对柔嫩艾美耳球虫孵化具有抑制作用，同时抑制大肠杆菌，促进免疫相关功能的提升，并且所用添加剂具有无毒害、无药物残留、球虫对其不易产生耐药性等优点，是一种符合安全兽药、保障动物源食品安全的要求的防治肉鸡大肠杆菌与球虫病混合感染的绿色植物提取物添加剂。

Description

一种抗大肠杆菌与球虫混合感染的植物提取物添加剂及应用
技术领域
本发明属于饲料添加剂领域，具体涉及一种抗大肠杆菌与球虫混合感染的植物提取物添加剂及应用。
技术背景
鸡大肠杆菌病是由大肠埃希氏杆菌中的致病性血清型菌株引起的各种禽类的急性或慢性细菌性疾病的总称。球虫病是由球虫引起的一种急性疾病。肉鸡大肠杆菌和球虫混合感染在养鸡业中非常常见，尤其是在鸡舍相对比较潮湿的环境下，极易引发该疾病，一旦爆发，引起肠道屏障严重受损，机体免疫力下降，明显降低生产力，会给养殖户带来非常大的经济损失。当前，防治肉鸡大肠杆菌与球虫混合感染主要有免疫控制法和化学药物防治。由于免疫控制法受各种条件限制，目前防治大肠杆菌与球虫仍以化学药物或抗生素为主，而化学药物或抗生素的长期使用对细菌和球虫产生一种选择压力，不可避免的对药物产生了一定的耐药性，一旦细菌和球虫对一种药物产生耐药性，就可能降低该药物的效应或使这种药物失去作用效果，并可能对其它药物产生交叉耐药性，使鸡群可能暴发球虫病，造成较大的经济损失。并且随着对人们对绿色无公害动物食品的追求，寻找新颖、经济环保的对大肠杆菌和球虫的防治措施备受关注。研究表明，植物提取物在畜禽病的防治中有着显著作用，而且与化学药物或抗生素相比毒副作用小，是目前比较理想的添加剂。
藤黄为藤黄科植物藤黄树的树干被割伤后流出的胶状树脂，主治痈疽肿毒，溃疡，湿疮，肿瘤，顽癣，创伤出血及烫伤，其发挥作用的主要成分为藤黄酸，对革兰氏阳性细菌，如金黄色葡萄球菌、八叠球菌和枯草杆菌有抑制作用。而藤黄果皮提取物是从植物藤黄果的果皮抽出，藤黄果的外壳通常被用来代替罗望子或柠檬作为咖喱的调味剂，也被用作防腐剂和草药滋补剂等。近年来，大量研究结果表明藤黄果提取物具有多种生物学功能，如减肥、降血脂、抗癌等。目前还未有关于藤黄果皮提取物在鸡大肠杆菌与球虫混合感染中的报道。因为植物本身多种多样，组成也非常复杂，因此植物提取物所含化学成分类型也非常多。提取部位、收获时间、土质以及提取方法等都会影响植物提取物的成分及含量，所以就算是同一种植物，其活性成分的含量可以从零到高达85％。植物提取物作为饲料添加剂，为了保证其使用效果，必须明确其中的有效成分，并注重有效成分的提取和纯化，向微量化、专用型方向发展，这样既可保证植物提取物添加剂的药效，又不会影响日粮的适口性。因此，提高筛选的科学性和解决有效成分的提纯等问题并正确使用为肉鸡大肠杆菌与球虫混合感染的防治提供了新的选择。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种藤黄果皮提取物，将藤黄果皮用乙醇溶液混合后超声提取即得。
本发明的另一个目的在于提供了一种藤黄果皮提取物的应用，该提取物对于大肠杆菌和鸡球虫具有抑制作用，可用于畜禽，特别是鸡的饲料添加物。
为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
一种藤黄果皮提取物，是将藤黄果皮用乙醇溶液混合后超声提取即得；
以上所述的提取物，具体的，提取方法如下：
将藤黄果皮与70-90％的乙醇溶液按料液比1：15-30(g/mL)的比例加入到超声波提取罐内提取20-40min，减压过滤，并将滤液在3000-4000r/min的条件下离心30-50分钟，取上清液，滤渣再加入到70-90％的乙醇溶液中，按料液比1：10-25(g/mL)的比例加入到超声波提取罐内提取20-30min，收集并合并两次滤液，将滤液浓缩，真空干燥后粉碎过筛，得到藤黄果皮提取物。
以上所述的方案中，优选的，所述的藤黄果皮粉的制备过程是将藤黄果皮清洗干净，并在烘箱内100℃条件下干燥30分钟，取出粉碎，过60目筛，得到干燥藤黄果皮粉。
藤黄果皮提取物的应用，包括将藤黄果提取物作为有效成分或者有效成分之一制备成抗大肠杆菌的药物，或是制备成抗球虫的药物，或是制备成鸡肠道改善剂，或是制备成鸡的免疫增强剂，或是制备成鸡饲料添加剂。
以上所述的应用中，优选的，当藤黄果皮提取物作为有效成分之一时，所述的饲料添加剂的成分包括：藤黄果皮提取物、松树皮提取物、百部提取物、蒲公英提取物。
以上所述的饲料添加剂，优选的，所述的饲料添加剂包括：藤黄果皮提取物30～40份、松树皮提取物20～30份、百部提取物20～30份、蒲公英提取物10～20份。以上均指得是重量份，市购的百部提取物、蒲公英提取物均可完成本发明。
以上所述的饲料添加剂，优选的，所述的松树皮的提取方法包括松树皮用乙醇溶液混合后超声提取即得，具体步骤如下：
将松树皮粉与质量浓度为50-70％的乙醇按料液比1：10-30，g/mL的比例加入到超声波提取罐内，提取温度40-60℃下提取25-40min，减压过滤，并将滤液在3000-4000r/min的条件下离心30-40分钟，取上清液，滤渣再加入到50-70％的乙醇溶液中，按料液比1：10-25，g/mL的比例加入到超声波提取罐内提取20-30min，收集并合并两次滤液，将滤液浓缩，真空干燥后粉碎过筛，得到松树皮提取物。
以上所述的应用中，优选的，所述的饲料添加剂适用于鸡饲料，在鸡饲料中的添加量为250-400g/t。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
1)本发明首次发现藤黄果皮提取物，可用于抑制柔嫩艾美耳球虫或者抑制大肠杆菌，可用于制备成畜禽饲料添加剂。
2)将藤黄果皮提取物与松树皮提取物、百部提取物和蒲公英提取物混配后，可更好的发挥药效。本发明所用提取物全部来自天然植物，无残留，无毒害，无副作用的提高了雏鸡的抗菌、抗球虫能力，大大提高了鸡场的生产效益。
具体实施例
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。本发明所用的球虫为柔嫩艾美耳球虫。
实施例1：
一种藤黄果皮提取物，其制备步骤包括：：
(1)将藤黄果皮在烘箱内100℃条件下干燥30分钟，取出粉碎，过60目筛，得到干燥藤黄果皮粉。
(2)将藤黄果皮与80％的乙醇溶液按料液比1：20，g/mL的比例加入到超声波提取罐内提取40min，减压过滤，并将滤液在3000-4000r/min的条件下离心30分钟，取上清液，滤渣再加入到70％的乙醇溶液中，按料液比1：120，g/mL的比例加入到超声波提取罐内提取30min，收集并合并两次滤液；
(3)将滤浓缩，真空干燥后粉碎过60目筛，得到藤黄果皮提取物，用于以下实施例。
实施例2：
藤黄果皮提取物在制备抗球虫和大肠杆菌的饲料添加剂中的应用：
1、试验动物与试验设计
试验1日龄雏鸡350只，随机分为7组(3个对照组和4个试验组，试验组1-4)，每组50只(具体分组情况见表1)，均放在未被细菌和球虫污染的育雏箱内进行饲养，饲喂基础日粮。
当雏鸡生长到15日龄，除阴性对照组外，其余各组雏鸡15日龄称重，每羽灌服孢子化后球虫卵囊8×104个，24h后每只鸡通过皮下注射接种大肠杆菌液体培养物(0.4m L/只，有效菌浓度是6亿个/ml)，阴性对照组灌服相同体积的生理盐水。感染大肠杆菌与球虫卵囊后，阴性对照组和阳性对照组继续饲喂基础日粮；西药对照组进行药物治疗，每次给药前空腹6h，连续给药3d，每天1次，饲喂基础日粮；试验组1-4不给西药治疗，但饲喂含有本发明提供的添加剂的基础日粮。
试验期间每天检查鸡的饮水、采食情况，精神状态和粪便排出状态，并进行血便记分，攻虫后第8天清晨点数、空腹称重，计算各组的成活率、相对增重率；再进行剖检，观察鸡的盲肠病变，记分，同时采取盲肠内容物测定盲肠卵囊数，计算其卵囊值；采取空肠测定屏障功能；以及测定微生物组分；试验结束雏鸡颈部采血，用于测定血清免疫指标。
表1试验分组及处理
数据统计分析
试验数据采用SPSS19.0统计软件进行统计分析，结果见下表。
表2血清免疫指标
测定指标 阴性对照组 阳性对照组 西药对照组 试验组1 试验组2 试验组3 试验组4
IgA(ug/mL) 15.21 10.83 15.15 15.18 15.24 15.61 15.79
IgG(ug/mL) 20.03 11.07 19.58 18.65 19.67 19.72 19.88
IgM(ug/mL) 2.47 1.23 2.45 2.30 2.35 2.26 2.41
由表2结果所示，试验组1-4中血清球蛋白IgA、IgG、IgM相对于阳性对照组都出现了显著的上升，相对于阴性和西药对照组差异不显著，表明试验组1-4中雏鸡的免疫力均提高了，其中以试验组4的效果最优。
表3盲肠微生物组分(1010CFU/g)
测定指标 阴性对照组 阳性对照组 西药对照组 试验组1 试验组2 试验组3 试验组4
大肠杆菌 7.2 15.3 7.5 10.2 9.6 8.4 7.9
梭菌 8.2 7.9 8.0 8.5 8.4 8.4 8.3
乳酸杆菌 8.0 8.2 8.1 8.2 8.3 8.4 8.0
双歧杆菌 7.8 7.9 8.2 7.9 8.0 8.3 8.1
革兰氏阳性菌 7.9 7.9 8.1 8.2 8.3 8.4 8.0
由表3结果所示，试验组1-4中大肠杆菌相对于阳性对照组都出现了显著的下降，同时其他益生菌包括革兰氏阳性菌均无显著变化，表明本发明提供的藤黄果皮提取物特异性的对大肠杆菌有抑制作用，并且其效果随着提取物的含量的增大而增强。
表4肠道屏障功能-紧密连接蛋白表达
由表4结果所示，试验组1-4中紧密连接蛋白的表达相对于阳性对照组都出现了显著的升高，表明改善雏鸡肠道屏障功能，其中以试验组4的效果最优。
表5肠道形态
由表5结果所示，试验组1-4绒毛高度/隐窝深度值相对于阳性对照组都出现了显著的升高，表明显著改善雏鸡肠道形态，其中以试验组4的效果最优。
表6试验综合评定结果
组别 鸡数 血便积分 存活率％ 平均增重 相对增重率％ 病变值 卵囊值 ACI
阴性对照组 50 0 100 27.86 100 0 0 200
阳性对照组 50 3 52 17.68 71.23 30 40 53.23
西药对照组 50 1 95 23.86 91.05 5.1 3 177.95
试验组1 50 1 85 23.21 83.31 7 10 151.31
试验组2 50 0 85 23.15 83.09 10.5 10 147.59
试验组3 50 1 87.5 22.35 80.22 9.6 10 148.12
试验组4 50 0 90 25.64 85.03 6 10 159.03
由表6结果所示，试验组1-4中的ACI指数处于120-160之间，且较之于阳性对照组，乱囊值明显的下降，表明本发明提供的藤黄果皮提取物可特异性的对球虫产生抑制作用，且其抑制力随着提取物添加量的增大而增高。
实施例3：
一种抗球虫的植物提取物添加剂，包括：藤黄果皮提取物30份、松树皮提取物30份、百部提取物20份、蒲公英提取物20份，以上均指得是重量份。
所述松树皮提取物的制备方法为：
(1)将松树皮粉与质量浓度为60％的乙醇按料液比1：25，g/mL的比例加入到超声波提取罐内，提取温度50℃下提取40min，减压过滤，并将滤液在3000-4000r/min的条件下离心30分钟，取上清液，滤渣再加入到60％的乙醇溶液中，按料液比1：20，g/mL的比例加入到超声波提取罐内提取30min，收集并合并两次滤液。
(2)将滤液浓缩，真空干燥后粉碎过60目筛，得到松树皮提取物，用于本实施例以及以下实施例。
本实施例中制备的饲料添加剂在鸡饲料中的添加量为250g/t。
实施例4：
一种抗球虫的植物提取物添加剂，包括：藤黄果皮提取物30份、松树皮提取物25份、百部提取物25份、蒲公英提取物20份，以上均指得是重量份。
本实施例制备的饲料添加剂在鸡饲料中的添加量为300g/t。
实施例5：
一种抗球虫的植物提取物添加剂，包括：藤黄果皮提取物35份、松树皮提取物30份、百部提取物20份、蒲公英提取物15份，以上均指得是重量份。
本实施例制备的饲料添加剂在鸡饲料中的添加量为350g/t。
实施例6：
一种抗球虫的植物提取物添加剂，包括：藤黄果皮提取物40份、松树皮提取物30份、百部提取物20份、蒲公英提取物10份，以上均指得是重量份。
本实施例制备的饲料添加剂在鸡饲料中的添加量为400g/t。
实施例7：
藤黄果皮提取物与其他组分复配获得的饲料添加剂在制备鸡饲料添加剂中的应用：
1、试验动物与试验设计
试验1日龄鸡雏350只，随机分为7组(3个对照组和4个试验组，试验组1-4)，每组50只(具体分组和给药情况如下表)，放在未被球虫污染的育雏箱内进行饲养，饲喂基础日粮。
当鸡雏生长到15日龄，除阴性对照组外，其余各组雏鸡15日龄称重，每羽灌服孢子化后球虫卵囊8×104个，24h后每只鸡通过皮下注射接种大肠杆菌液体培养物(0.4m L/只，有效菌浓度是6亿个/ml)，阴性对照组灌服相同体积生理盐水。感染球虫卵囊后，阴性对照组和阳性对照组继续饲喂基础日粮；西药对照组进行药物治疗，每次给药前空腹6h，连续给药3d，每天1次，饲喂基础日粮；试验组1-4不给西药治疗，但试验组1-4的基础日粮中依次添加有实施例3-6中的添加剂，添加剂量见各实施例。
试验期间每天检查鸡的饮水、采食情况，精神状态和粪便排出状态，并进行血便记分，攻虫后第8天清晨点数、空腹称重，计算各组的成活率、相对增重率；再进行剖检，观察鸡的盲肠病变，记分，同时采取盲肠内容物测定盲肠卵囊数，计算其卵囊值；采取空肠测定屏障功能；以及测定微生物组分；试验结束雏鸡颈部采血，用于测定血清免疫指标。
表7试验分组及处理
数据统计分析
试验数据采用SPSS19.0统计软件进行统计分析，结果见下表。
表8血清免疫指标
测定指标 阴性对照组 阳性对照组 西药对照组 试验组1 试验组2 试验组3 试验组4
IgA(ug/mL) 15.21 10.83 15.15 15.83 15.72 15.94 16.94
IgG(ug/mL) 20.03 11.07 19.58 20.85 20.42 20.15 21.13
IgM(ug/mL) 2.47 1.23 2.45 2.52 2.47 2.51 2.65
由表8结果所示，试验组1-4中血清球蛋白IgA、IgG、IgM相对于阳性对照组都出现了显著的上升，相对于阴性和西药对照组也有一定的上升，表明试验组1-4中雏鸡的免疫力提高了，其中以试验组4的效果最优，同时与单独添加藤黄果皮相比，本实施例添加复配制剂后，效果更好。
表9盲肠微生物组分(1010CFU/g)
测定指标 阴性对照组 阳性对照组 西药对照组 试验组1 试验组2 试验组3 试验组4
大肠杆菌 7.2 15.3 7.5 8.9 8.2 7.6 7.4
梭菌 8.2 7.9 8.0 7.9 8.0 7.9 8.1
乳酸杆菌 8.0 8.2 8.1 7.8 8.2 7.9 7.8
双歧杆菌 7.8 7.9 8.2 8.3 8.0 7.9 8.0
革兰氏阳性菌 7.9 7.9 8.1 7.8 8.3 8.0 8.1
由表9结果所示，试验组1-4中大肠杆菌相对于阳性对照组都出现了显著的下降，相对于阴性和西药对照组差异不显著，同时其他益生菌包括革兰氏阳性菌均无显著变化，表明本发明提供的藤黄果皮提取物复配制剂特异性的对大肠杆菌有抑制作用，并且其效果随着提取物的含量的增大而增强，同时与单独添加藤黄果皮相比，本实施例添加复配制剂后，效果更好。
表10肠道屏障功能-紧密连接蛋白表达
测定指标 阴性对照组 阳性对照组 西药对照组 试验组1 试验组2 试验组3 试验组4
ZO-1 0.044 0.013 0.042 0.036 0.042 0.041 0.047
Occludin 0.076 0.031 0.071 0.068 0.062 0.073 0.072
Claudin-1 0.059 0.026 0.052 0.049 0.052 0.048 0.055
由表10结果所示，试验组1-4中紧密连接蛋白的表达相对于阳性对照组都出现了显著的升高，表明改善雏鸡肠道屏障功能，其中以试验组4的效果最优。
表11肠道形态
由表11结果所示，试验组1-4找那个绒毛高度/隐窝深度值相对于阳性对照组都出现了显著的升高，表明显著改善雏鸡肠道形态，其中以试验组4的效果最优。
表12试验综合评定结果
组别 鸡数 血便积分 存活率％ 平均增重 相对增重率％ 病变值 卵囊值 ACI
阴性对照组 50 0 100 27.86 100 0 0 200
阳性对照组 50 3 52 17.68 71.23 30 40 53.23
西药对照组 50 1 95 23.86 91.05 5.1 3 177.95
试验组1 50 1 95 23.21 88.12 8.7 9 165.42
试验组2 50 0 96 25.64 89.56 8.2 5 172.36
试验组3 50 1 95 22.35 90.69 5.8 3 176.89
试验组4 50 0 95 23.15 92.43 4.6 1 181.83
由表12结果所示，试验组1-3的ACI指数处于160-180之间，试验组4的ACI指数大于180，表明本发明提供的藤黄果皮提取物可特异性的对球虫产生抑制作用，且其抑制力随着提取物添加量的增大而增高，同时与单独添加藤黄果皮相比，本实施例添加复配制剂后，效果更好。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而己，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。

Claims (9)

1.一种藤黄果皮提取物，是将藤黄果皮用乙醇溶液混合后超声提取即得。
2.根据权利要求1所述的提取物，所述提取物的提取方法包括：
将藤黄果皮与70-90%的乙醇溶液按料液比1：15-30，g/mL的比例加入到超声波提取罐内提取20-40min，减压过滤，并将滤液在3000-4000r/min的条件下离心30-50分钟，取上清液，滤渣再加入到70-90%的乙醇溶液中，按料液比1：10-25，g/mL的比例加入到超声波提取罐内提取20-30min，收集并合并两次滤液，将滤液浓缩，真空干燥后粉碎过筛，得到藤黄果皮提取物。
3.一种含有权利要求1所述藤黄果皮提取物的制剂，包括：藤黄果皮提取物30~40份、松树皮提取物20~30份、百部提取物20~30份、蒲公英提取物10~20份；所述的松树皮提取物是将松树皮与乙醇混合后超声提取得到。
4.权利要求1所述的藤黄果皮提取物或权利要求3所述的制剂在制备抗大肠杆菌药物中的应用。
5.权利要求1所述的藤黄果皮提取物或权利要求3所述的制剂在制备抗球虫药物中的应用。
6.权利要求1所述的藤黄果皮提取物或权利要求3所述的制剂在制备鸡肠道改善剂中的应用。
7.权利要求1所述的藤黄果皮提取物或权利要求3所述的制剂在制备鸡的免疫增强剂中的应用。
8.权利要求1所述的藤黄果皮提取物或权利要求3所述的制剂在制备鸡的饲料添加剂中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，应用时，在鸡饲料中的添加量为250-400g/t。
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