CN110230058A - 促进骨髓间充质干细胞生长分化的医用钛合金表面构建的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种促进骨髓间充质干细胞生长分化的医用钛合金表面构建的方法，包括如下步骤：S1、对试样表面进行机械抛光和去油污处理后，采用紫外纳米激光对表面进行沟槽化处理；S2、采用硅烷偶联剂和多巴胺双过渡层，在基底表面组装氧化石墨烯涂层。在步骤S2中将试样在强酸强碱溶液中处理后，紫外灯照射一定时间；放入硅烷偶联剂水溶液中组装硅烷过渡层；取出后放入多巴胺溶液中组装聚多巴胺过渡层；取出清洗后，浸入氧化石墨烯水溶液中，制备氧化石墨烯涂层。与现有技术相比，该方法提高了钛合金表面的粗糙度和润湿性，增强了涂层与基底间的结合强度。其表面更有利于骨髓间充质干细胞的生长分化。

Description

促进骨髓间充质干细胞生长分化的医用钛合金表面构建的 方法

技术领域

本发明属于医疗器械表面加工及涂层制备领域，涉及一种促进骨髓间充质干细胞生长分化的医用钛合金表面构建的方法，具体地，涉及一种促进医用钛合金材料表面骨髓间充质干细胞粘附增殖分化的表面构建方法。

背景技术

钛及钛合金材料，由于其具有较低的弹性模量、出色的机械性能、优异的耐腐蚀性及生物相容性，已经广泛应用于牙科和整形外科领域，是理想的骨植入物材料。钛种植体的表面特性是快速稳定骨组织整合的关键因素，骨结合不良导致种植体无菌性松动，进一步缩短其使用寿命。由于钛合金表面的生物活性较差，体内骨髓间充质干细胞很难黏附在钛合金材料的表面，并进行增殖分化，从而使其在体内形成再生骨和实现骨整合变的非常困难。这一致命的缺点限制了其在生物医学工程中的应用，同时也成为国内外研究人员关注的热点和亟待解决的难点。因此，优化处理钛合金材料表面的生物惰性，使其能进一步促进骨髓间充质干细胞的黏附生长就显得非常重要。迄今为止，已经提出了许多钛合金表面处理以改善它们的骨整合能力，包括表面化学涂层设计和表面微结构设计。

表面涂层法是改善材料表面性质的一种重要且直接的方法。一些研究表明，生物活性涂层的沉积可以促进骨髓间充质干细胞的增殖和分化。氧化石墨烯具有二维的蜂窝状结构，主要是由石墨烯改性制得。由于氧化石墨烯具有优异的生物相容性，其在生物医学领域引起了极大的关注。与石墨烯相比，氧化石墨烯中含氧基团的存在可使其具有较好的亲水性。根据国内外对氧化石墨烯材料在生物医学领域的研究发现，经氧化石墨烯改性的材料可以有效的改善骨细胞的附着、增殖及分化，从而进一步改善基底的生物活性。因此，在钛合金表面制备氧化石墨烯涂层将在一定程度上改善钛合金表面的生物活性，可促进表面骨细胞的生长分化。常用的制备涂层的方法主要包括喷涂法、气相沉积法，光电耦合化学和化学组装技术等。专利公开号CN105018924A在钛合金基体表面，采用冷喷涂和激光熔覆复合技术的方法制备羟基磷灰石(HA)涂层。但该方法工艺复杂，制备的涂层不均一且易分层。专利公开号CN108546928A采用化学气相沉积制备全沉积碳化硅涂层，但该工艺方法加工条件相对严苛，不适用于医用材料的表面处理。而化学组装技术简单可行，且由于氧化石墨烯表面具有较多的含氧基团，因此可采用无毒友好的过渡层在钛合金表面接枝氧化石墨烯涂层。

公开号为104141124A的发明专利申请中公开了一种利用多巴胺连接氧化石墨烯改善纯钛表面生物活性的方法，该方法包括：纯钛片表面粗糙度Ra不大于1μm，先后采用丙酮超声清洗，去离子水超声清洗；用硝酸对其进行酸处理、去离子水清洗后，利用氢氧化钠在40-80℃下对试样碱处理；配置多巴胺-三羟甲基氨基甲烷溶液为pH＝8.5；将处理的纯钛试样浸泡在配置的多巴胺溶液中，室温静置12h-24h；将试样取出，并用去离子水清洗，室温干燥，制备得到钛/多巴胺试样；将钛/多巴胺试样浸泡在氧化石墨烯水溶液中，室温静置12h-24h；取出后用去离子水清洗，室温干燥，制得钛/多巴胺/氧化石墨烯试样。涂层与基底之间的结合力是材料表面改性的重要考虑因素。但该方法中多巴胺过渡层与钛表面之间的化学共价结合力还有待提高。另外，由于该专利方法在钛合金表面所制备的氧化石墨烯涂层并没有较好的改善其表面的粗糙度和润湿性能，这将会在一定程度上影响骨髓间充质干细胞在表面的生长分化。而改善表面的粗糙度和润湿性对医用钛材也是非常重要的。

发明内容

针对现有技术中的缺陷，本发明的目的是提供一种促进骨髓间充质干细胞生长分化的医用钛合金表面构建的方法。以提供一种促进骨髓间充质干细胞生长分化、无毒环保、精准可控的医用钛合金表面构建方法。本发明通过激光沟槽技术有效改善钛合金基底表面的粗糙度和润湿性。在沟槽化的基底表面通过化学组装法接枝氧化石墨烯涂层，其中选用硅烷偶联剂与多巴胺双过渡层增强涂层与基底的结合强度。进一步改善表面的生物活性，促进骨髓间充质干细胞其在表面的黏附，增殖及分化等行为。本发明中提到的表面构建方法具有较好的理论研究价值，为有效提高钛合金表面的生物活性、促进骨髓间充质干细胞在表面的生长分化提供了一条全新的思路，从而也将进一步拓宽该构建方法在骨科医学领域的应用前景。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

本发明提供一种医用钛合金表面构建的方法，包括如下步骤：

S1、对钛合金样品表面进行抛光和去油污处理，利用紫外纳米激光对钛合金样品表面进行沟槽化处理，得到具有沟槽化表面的钛合金样品；

S2、在所述沟槽化表面采用化学组装法接枝氧化石墨烯涂层。

表面激光沟槽技术利用高能密度的激光束扫描工件的表面，精准有序在表面加工出规整的微沟槽结构，本发明通过调整加工参数有效控制钛合金表面的粗糙度。而且表面微沟槽结构可通过储存水分进一步降低表面水的接触角，从而改善表面的润湿性。

优选地，步骤S1中，所述紫外纳米激光的参数为：波长为355nm，脉冲频率为1～100kHz，激光速度为100～500mm/s，激光功率为0.1～10W。

优选地，步骤S1中，所述沟槽的宽度为10～70μm，深度为1～40μm，相邻沟槽之间的间距为10～100μm。由于沟槽的尺寸与表面粗糙度及表面润湿性有关，该沟槽尺寸范围下，表面的润湿性相对较好，表面粗糙度有利于细胞的黏附。

优选地，步骤S2中，所述采用化学组装法接枝氧化石墨烯涂层的具体步骤为：

A1、将所述具有沟槽化表面的钛合金样品经强酸活化、碱液浸泡后，进行紫外灯照射处理，得到表面羟基化的钛合金样品；

A2、将所述表面羟基化的钛合金样品经清洗、吹干后置于硅烷水溶液中，得到表面组装有硅烷薄膜的钛合金样品；

A3、将所述表面组装有硅烷薄膜的钛合金样品经清洗、吹干后置于多巴胺溶液中，得到带有双过渡层的钛合金样品；

A4、将所述带有双过渡层的钛合金样品置于氧化石墨烯水溶液中，加热数小时后，得到带有氧化石墨烯涂层的钛合金样品。

优选地，步骤A1中，所述强酸活化的时间为1～60min；所述碱液为1～5mol/L的氢氧化钾溶液；所述浸泡的时间为1～12h。

优选地，步骤A1中，所述紫外灯照射处理的具体步骤为：采用254nm的紫外灯照射处理1～12h。

将具有沟槽化表面的钛合金样品在强酸性溶液中活化1～60min，然后放入1～5mol/L的氢氧化钾溶液中浸泡1～12h，以对表面进行羟基化处理，随后继续用波长为254nm的紫外灯照射处理1～12h，进一步增加表面的羟基数目。

优选地，步骤A2中，所述硅烷水溶液为体积分数为1～10％的硅烷偶联剂水溶液；置于所述硅烷水溶液中的时间为1～10h。硅烷偶联剂由于其自身带有硅烷氧基，可与羟基化的表面发生脱水反应，且自身可发生水解形成致密的过渡层，表现出具有极强的胶粘性。

更优选地，所述硅烷偶联剂包括氨丙基三乙氧基硅烷、3-缩水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷、三甲基硅烷丙基丙烯酸脂中的一种。

优选地，步骤A3中，所述多巴胺溶液的浓度为0.05～2g/L；置于所述多巴胺溶液中的时间为6～24h。

优选地，步骤A3中，所述多巴胺溶液的配制步骤包括：先配置pH＝8.5～10的Tris溶液，静置24～48h后加入多巴胺粉末。

优选地，步骤A2和A3中，所述清洗、吹干的步骤具体为：用去离子水清洗多次后，用氮气吹干。

优选地，步骤A4中，所述氧化石墨烯水溶液的浓度为0.05～2g/L。

优选地，步骤A4中，所述加热的温度为40～80℃，所述加热的时间为6～24h。该温度范围内可有效促进化学反应的速率，且不会影响氧化石墨烯本身的结构。

本发明还提供一种根据所述方法得到的医用钛合金材料，所述医用钛合金材料具有沟槽化的表面，所述沟槽化的表面接枝有氧化石墨烯涂层。

优选地，所述沟槽的宽度为10～70μm，深度为1～40μm，相邻沟槽之间的间距为10～100μm。

本发明还提供一种所述医用钛合金材料在作为促进骨髓间充质干细胞生长分化的医用合金中的应用。

本发明提供的一种促进骨髓间充质干细胞生长分化的医用钛合金表面构建方法，包括以下步骤：第一步，对于钛合金样品表面进行机械抛光和去油污处理，利用紫外纳米激光对钛合金表面进行沟槽化处理；第二步，在沟槽化的表面采用化学组装法接枝氧化石墨烯涂层。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：

1、本发明通过对材料基底表面进行激光微沟槽处理，改善了基底表面的粗糙度与表面润湿性。

2、本发明在激光沟槽化的基底表面，选择具有较强胶粘性的硅烷偶联剂作为与基底连接的过渡层，其次连接多巴胺过渡层，通过双过渡层增强了涂层与基底之间的结合强度。

3、沟槽化钛合金表面接枝氧化石墨烯涂层后，更加有利于骨髓间充质干细胞的黏着，增殖和分化。

4、该处理方法简单可行，无生物毒性且无污染，可广泛用于骨科医疗器材的表面改性。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1为未处理钛合金表面的扫描电镜图(a)和三维轮廓图(b)；

图2为激光织构微沟槽的钛合金表面的扫描电镜图(a)和三维轮廓图(b)；

图3为氧化石墨烯涂层组装在微沟槽钛合金表面的扫描电镜图(a)和三维轮廓图(b)；

图4为三种钛合金样品表面润湿性的对比图；

图5为涂层结合强度对比图；

图6为三种钛合金样品表面骨髓间充质干细胞黏附性对比图；

图7为三种钛合金样品表面的骨髓间充质干细胞增殖数目图；

图8为三种钛合金样品表面的骨髓间充质干细胞分化数目图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变化和改进。这些都属于本发明的保护范围。

实施例1

本实施例提供一种促进骨髓间充质干细胞生长分化的医用钛合金表面构建的方法。

本实施例所用钛合金样品为医用钛合金板材，原材料为Ti-6Al-4V合金，所用的氧化石墨烯为采用改性Hummers法改性石墨烯所得。制备方法包括以下步骤：

(1)将Ti-6Al-4V合金表面机械抛光，测其表面粗糙度为0.1μm，在丙酮和水溶液中分别超声清洗30min，清洗三次后用氮气吹干表面，未处理的钛合金表面微结构参照图1；

(2)采用紫外激光纳米激光器(波长为355nm)对Ti-6Al-4V合金表面进行沟槽织构，织构的沟槽参数为：宽度45μm，深度10μm，间距100μm。织构过程中使用的脉冲频率为30kHz，激光速度为300mm/s，激光功率为3W；测出此表面的粗糙度为6.48μm；

(3)分别用丙酮和去离子水清洗织构化的Ti-6Al-4V合金片三次，氮气吹干，沟槽织构化的Ti-6Al-4V合金表面微结构图参照图2；

(4)将上一步制得的织构化的Ti-6Al-4V合金片放入硝酸(体积分数20％)溶液中活化30min，然后放入5mol/L的氢氧化钾溶液中浸泡12h，对表面进行羟基化处理，随后继续用波长为254nm的紫外灯照射处理12h，进一步增加表面的羟基数目；

(5)将表面羟基化的钛合金片用去离子水清洗3次，并用氮气吹干后，放入体积分数为3％的氨丙基三乙氧基硅烷水溶液中组装硅烷薄膜，时间1h；

(6)取出带有硅烷薄膜的Ti-6Al-4V合金片，并用去离子水清洗3次，氮气吹干，放置在2g/L多巴胺溶液中组装聚多巴胺过渡层，时间为12h；

(7)用去离子水清洗上一步制得的带有多巴胺的Ti-6Al-4V合金片3次，再用氮气吹干后，放入1g/L的氧化石墨烯水溶液中，60℃恒温油浴加热24h。取出Ti-6Al-4V合金清洗并氮气吹干。测出此表面的粗糙度为5.45μm，氧化石墨烯涂层组装在微沟槽Ti-6Al-4V合金表面的微结构图参照图3；

(8)通过接触角的测量，分别对上述表面处理的Ti-6Al-4V合金的润湿性进行表征，润湿性能参照图4；

(9)本发明中制备的涂层与基底之间的结合强度得到有效增强，参照图5。从图5中可以看出，与单过渡层(多巴胺)接枝氧化石墨烯涂层相比，经过氨丙基三乙氧基硅烷和多巴胺双过渡层接枝氧化石墨烯涂层的结合强度提高了约37％。

(10)通过在上述处理的Ti-6Al-4V合金表面培养人骨髓间充质干细胞，结果证明本发明的表面构建方法有效改善了骨髓间充质干细胞的生长分化行为，主要包括改善了细胞的黏附性、增殖和分化。细胞的黏附性可参照图6，从图6中可以看出，氧化石墨烯组装在沟槽化Ti-6Al-4V合金之后，其表面的荧光面积远高于其他组，且该表面生长的细胞伴有大量的丝状伪足，这也提高了表面细胞的粘附。分别对细胞的增殖和分化进行了评价，参照图7、图8，从图7中可以看出，在培养3天后，氧化石墨烯组装在沟槽化Ti-6Al-4V合金表面上的细胞数是空白钛合金片的1.2倍。培养7天后，氧化石墨烯组装在沟槽化Ti-6Al-4V表面的细胞数量也有显着增加的趋势，表明Ti-6Al-4V合金表面微沟槽结构和GO涂层均有助于细胞生长。从图8中可以看出，在培养7天和14天后，通过测量RUNX-2，OPN，BMP-2和ALP四种相关基因的表达，发现这些基因的相对表达结果在第7天和第14天是一致的。与空白组相比，这些基因在氧化石墨烯组装在沟槽化Ti-6Al-4V合金表面的相对表达幅度更高。结果表明，表面微沟槽化的氧化石墨烯可促进骨髓间充质干细胞的相关成骨基因分化。

实施例2

本实施例提供一种促进骨髓间充质干细胞生长分化的医用钛合金表面构建的方法。制备方法包括以下步骤：

(1)将Ti-13Nb-13Zr合金表面机械抛光，测其表面粗糙度为0.5μm，先后用丙酮和水溶液中超声清洗三次后用氮气吹干表面。

(2)采用紫外激光纳米激光器(波长为355nm)对Ti-13Nb-13Zr合金表面进行沟槽织构，织构的沟槽参数为：宽度10μm，深度5μm，间距20μm。织构过程中使用的脉冲频率为70kHz，激光速度为100mm/s，激光功率为0.6W。测出此表面的粗糙度为8.93μm。

(3)将沟槽化的Ti-13Nb-13Zr合金用丙酮和去离子水清洗三次，氮气吹干；放入硝酸溶液(体积分数50％)中活化40min。水洗后，将试样浸入40℃，1mol/L的氢氧化钾溶液中处理10h。取出后，用波长为254nm的紫外灯照射处理10h。将表面羟基化的Ti-13Nb-13Zr合金片用去离子水清洗3次，氮气吹干。制得羟基化Ti-13Nb-13Zr合金试样。

(4)将上一步得到的试样放入体积分数为5％的3-缩水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷水溶液中处理5h。取出后，用去离子水清洗3次，氮气吹干。

(5)将带有硅烷薄膜的Ti-13Nb-13Zr合金片，浸入1g/L多巴胺溶液中，搅拌状态下处理6h。取出后，用去离子水清洗3次，并用氮气吹干。

(6)将带有多巴胺的Ti-13Nb-13Zr合金片，放入2g/L的氧化石墨烯水溶液中，80℃恒温油浴加热24h。取出清洗3次，并氮气吹干。

(7)表面水的接触角测试结果表明，该方法有效的改善了Ti-13Nb-13Zr合金表面的润湿性。

(8)本发明增强了氧化石墨烯涂层与基底之间的结合力。

(9)通过在上述处理的Ti-13Nb-13Zr合金片表面培养人骨髓间充质干细胞，结果证明本发明的表面构建方法有效改善了Ti-13Nb-13Zr合金片表面骨髓间充质干细胞的生长分化行为，主要包括改善了细胞的黏附性、增殖和分化。

实施例3

本实施例提供一种促进骨髓间充质干细胞生长分化的医用钛合金表面构建的方法。制备方法包括以下步骤：

(1)机械抛光Ti-6Al-7Nb合金表面，其表面粗糙度约为0.9μm，先后用丙酮和去离子水中超声清洗三次后用氮气吹干表面。

(2)采用激光微加工系统在Ti-6Al-7Nb合金表面加工出微沟槽图案，参数为：宽度70μm，深度20μm，间距100μm。织构过程中使用的脉冲频率为30kHz，激光速度为300mm/s，激光功率为1.8W。测出此表面的粗糙度为7.74μm。

(3)将沟槽化的Ti-6Al-7Nb合金用丙酮和去离子水清洗三次，室温干燥；放入食人鱼酸(V_浓硫酸/V_过氧化氢＝7:3)中活化5min。水洗后，将试样浸入40℃，3mol/L的氢氧化钠溶液中处理2h。取出后，用紫外灯照射处理6h。将表面羟基化的Ti-6Al-7Nb合金用去离子水清洗，室温干燥。

(4)将制得的羟基化Ti-6Al-7Nb合金试样浸入体积分数为2％的氨丙基三乙氧基硅烷水溶液中处理2h。取出后，用去离子水清洗，室温干燥。

(5)将上述试样浸入1.5g/L多巴胺溶液中，搅拌状态下处理8h。取出后，用去离子水清洗，室温干燥。

(6)取带有多巴胺过渡层的Ti-6Al-7Nb合金片，放入1.5g/L的氧化石墨烯水溶液中，40℃恒温水浴加热16h。取出清洗3次，并氮气吹干。

(7)表面水的接触角测试结果表明，经该构建方法处理后，Ti-6Al-7Nb合金片表面的润湿性得到了较好的改善。

(8)本发明增强了氧化石墨烯涂层与基底之间的结合力。

(9)通过在上述处理的Ti-6Al-7Nb合金片表面培养人骨髓间充质干细胞，结果证明本发明的表面构建方法有效改善了Ti-6Al-7Nb合金表面骨髓间充质干细胞的生长分化行为。

实施例4

本实施例提供一种促进骨髓间充质干细胞生长分化的医用钛合金表面构建的方法。具体步骤与实施例1基本一致，不同之处仅在于：本实施例的步骤(2)中，采用紫外激光纳米激光器的波长为266nm。

对比例1

本对比例提供一种医用钛合金表面构建的方法，具体步骤与实施例1基本一致，不同之处仅在于：本对比例中不对合金表面进行沟槽织构，即省略第(2)和(3)步骤。

对比例2

本对比例提供一种医用钛合金表面构建的方法，具体步骤与实施例1基本一致，不同之处仅在于：本对比例中将表面羟基化的钛合金片不进行硅烷薄膜组装，即省略第(5)步骤。

对比例3

本对比例提供一种医用钛合金表面构建的方法，具体步骤与实施例1基本一致，不同之处仅在于：本对比例的步骤(5)中，采用丙烯酸和丙稀酰胺光偶联剂代替氨丙基三乙氧基硅烷水溶液。

性能结果

对上述各实施例和各对比例制得的合金材料进行表面润湿性、涂层与基底之间的结合强度，以及对细胞的增殖和分化作用的表征。结果如下表1所示。

表1

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变化或修改，这并不影响本发明的实质内容。在不冲突的情况下，本申请的实施例和实施例中的特征可以任意相互组合。

Claims (10)

1.一种医用钛合金表面构建的方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、对钛合金样品表面进行抛光和去油污处理，利用紫外纳米激光对钛合金样品表面进行沟槽化处理，得到具有沟槽化表面的钛合金样品；

S2、在所述沟槽化表面采用化学组装法接枝氧化石墨烯涂层。

2.根据权利要求1所述的医用钛合金表面构建的方法，其特征在于，步骤S1中，所述紫外纳米激光的参数为：波长为355nm，脉冲频率为1～100kHz，激光速度为100～500mm/s，激光功率为0.1～10W。

3.根据权利要求1所述的医用钛合金表面构建的方法，其特征在于，步骤S1中，所述沟槽的宽度为10～70μm，深度为1～40μm，相邻沟槽之间的间距为10～100μm。

4.根据权利要求1所述的医用钛合金表面构建的方法，其特征在于，步骤S2中，所述采用化学组装法接枝氧化石墨烯涂层的具体步骤为：

A1、将所述具有沟槽化表面的钛合金样品经强酸活化、碱液浸泡后，进行紫外灯照射处理，得到表面羟基化的钛合金样品；

A2、将所述表面羟基化的钛合金样品经清洗、吹干后置于硅烷水溶液中，得到表面组装有硅烷薄膜的钛合金样品；

A3、将所述表面组装有硅烷薄膜的钛合金样品经清洗、吹干后置于多巴胺溶液中，得到带有双过渡层的钛合金样品；

A4、将所述带有双过渡层的钛合金样品置于氧化石墨烯水溶液中，加热数小时后，得到带有氧化石墨烯涂层的钛合金样品。

5.根据权利要求4所述的医用钛合金表面构建的方法，其特征在于，步骤A1中，所述强酸活化的时间为1～60min；所述碱液为1～5mol/L的氢氧化钾溶液；所述浸泡的时间为1～12h。

6.根据权利要求4所述的医用钛合金表面构建的方法，其特征在于，步骤A1中，所述紫外灯照射处理的具体步骤为：采用254nm的紫外灯照射处理1～12h。

7.根据权利要求4所述的医用钛合金表面构建的方法，其特征在于，步骤A2中，所述硅烷水溶液为体积分数为1～10％的硅烷偶联剂水溶液；置于所述硅烷水溶液中的时间为1～10h。

8.根据权利要求4所述的医用钛合金表面构建的方法，其特征在于，步骤A3中，所述多巴胺溶液的浓度为0.05～2g/L；置于所述多巴胺溶液中的时间为6～24h。

9.根据权利要求4所述的医用钛合金表面构建的方法，其特征在于，步骤A4中，所述氧化石墨烯水溶液的浓度为0.05～2g/L；

所述加热的温度为40～80℃，所述加热的时间为6～24h。

10.一种根据权利要求1所述的方法得到的医用钛合金材料，所述医用钛合金材料具有沟槽化的表面，所述沟槽化的表面接枝有氧化石墨烯涂层。