CN110214010A - 组合疗法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供I型蛋白质精氨酸甲基转移酶(I型PRMT)抑制剂和II型蛋白质精氨酸甲基转移酶(II型PRMT)抑制剂的组合。本发明还提供在需要的人中治疗癌症的方法，所述方法包括向人施用I型PRMT抑制剂和II型PRMT抑制剂的组合，以及以下至少一种：药学上可接受的载体和药学上可接受的稀释剂，从而治疗人的癌症。本发明进一步提供包含治疗有效量的I型PRMT抑制剂的药物组合物和治疗有效量的II型PRMT抑制剂的第二药物组合物。

Description

组合疗法
技术领域
本发明涉及治疗哺乳动物癌症的方法且涉及可用于这种治疗的组合。特别是，本发明涉及I型蛋白质精氨酸甲基转移酶(I型PRMT)抑制剂和II型蛋白质精氨酸甲基转移酶(II型PRMT)抑制剂的组合。
背景技术
有效治疗过度增生性疾病，包括癌症，是肿瘤学领域的持续目标。通常，癌症由控制细胞分裂、分化和凋亡细胞死亡的正常过程的失调引起，并且其特征在于恶性细胞的增殖，其具有无限生长、局部扩张和全身转移的潜力。正常过程的失调包括信号转导途径的异常和对与正常细胞中发现的因子不同的因子的响应。
精氨酸甲基化是对参与多种细胞过程的蛋白质的重要翻译后修饰，例如基因调控、RNA加工、DNA损伤应答和信号转导。含有甲基化精氨酸的蛋白质存在于细胞核和胞质组分中，这表明催化甲基转移到精氨酸上的酶也存在于这些亚细胞腔隙中(综述于Yang,Y.&Bedford,M.T.Protein arginine methyltransferases and cancer.Nat Rev Cancer13,37-50,doi:10.1038/nrc3409(2013)；Lee,Y.H.&Stallcup,M.R.Minireview:proteinarginine methylation of nonhistone proteins in transcriptional regulation.MolEndocrinol23,425-433,doi:10.1210/me.2008-0380(2009))。在哺乳动物细胞中，甲基化精氨酸以三种主要形式存在：ω-NG-单甲基-精氨酸(MMA)、ω-NG,NG-不对称二甲基精氨酸(ADMA)或ω-NG,N’G-对称的二甲基精氨酸(SDMA)。每种甲基化状态都可以以不同方式影响蛋白质-蛋白质相互作用，因此有可能为底物的生物活性赋予不同的功能性后果(Yang,Y.&Bedford,M.T.Protein arginine methyltransferases and cancer.Nat Rev Cancer13,37-50,doi:10.1038/nrc3409(2013))。
精氨酸甲基化主要在富含甘氨酸、精氨酸(GAR)基序的情况下通过蛋白质精氨酸甲基转移酶(PRMT)家族的活性发生，所述蛋白质精氨酸甲基转移酶将甲基从S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)转移至底物精氨酸侧链，产生S-腺苷-高半胱氨酸(SAH)和甲基化精氨酸。该蛋白质家族由10个成员组成，其中9个已被证明具有酶活性(Bedford,M.T.&Clarke,S.G.Protein arginine methylation in mammals:who,what,and why.Mol Cell33,1-13,doi:10.1016/j.molcel.2008.12.013(2009))。根据酶促反应的产物，PRMT家族分为四种亚型(I-IV型)。IV型酶甲基化内部胍基氮并且仅在酵母中描述(Fisk,J.C.&Read,L.K.Protein arginine methylation in parasitic protozoa.Eukaryot Cell10,1013-1022,doi:10.1128/EC.05103-11(2011))；I-III型酶通过单一甲基化事件产生单甲基-精氨酸(MMA，Rme1)。MMA中间体被认为是相对低丰度的中间体，然而，PRMT7的主要III型活性的选择底物可以保持单甲基化，而I型和II型酶分别催化从MMA向不对称二甲基精氨酸(ADMA，Rme2a)或对称的二甲基精氨酸(SDMA，Rme2s)的进展。II型PRMT包括PRMT5和PRMT9，然而，PRMT5是负责形成对称二甲基化的主要酶。I型酶包括PRMT1、PRMT3、PRMT4、PRMT6和PRMT8。PRMT1、PRMT3、PRMT4和PRMT6普遍表达，而PRMT8主要限于脑(综述于Bedford,M.T.&Clarke,S.G.Protein arginine methylation in mammals:who,what,and why.MolCell33,1-13,doi:10.1016/j.molcel.2008.12.013(2009))。
PRMT1的错误调节和过表达与许多实体和造血系统癌症有关(Yang,Y.&Bedford,M.T.Protein arginine methyltransferases and cancer.Nat Rev Cancer13,37-50,doi:10.1038/nrc3409(2013)；Yoshimatsu,M.等人，Dysregulation of PRMT1and PRMT6,Type I arginine methyltransferases,is involved in various types of humancancers.Int J Cancer128,562-573,doi:10.1002/ijc.25366(2011))。PRMT1与癌症生物学之间的联系主要是通过调节相关底物上发现的精氨酸残基的甲基化。在几种肿瘤类型中，PRMT1可以通过组蛋白H4的甲基化驱动异常致癌程序的表达(Takai,H.等人，5-Hydroxymethylcytosine plays a critical role in glioblastomagenesis byrecruiting the CHTOP-methylosome complex.Cell Rep9,48-60,doi:10.1016/j.celrep.2014.08.071(2014)；Shia,W.J.等人，PRMT1interacts with AML1-ETO topromote its transcriptional activation and progenitor cell proliferativepotential.Blood119,4953-4962,doi:10.1182/blood-2011-04-347476(2012)；Zhao,X.等人，Methylation of RUNX1by PRMT1abrogates SIN3A binding and potentiates itstranscriptional activity.Genes Dev22,640-653,doi:10.1101/gad.1632608(2008),以及通过其对非组蛋白底物的活性驱动异常致癌程序的表达(Wei,H.,Mundade,R.,Lange,K.C.&Lu,T.Protein arginine methylation of non-histone proteins and its rolein diseases.Cell Cycle13,32-41,doi:10.4161/cc.27353(2014))。在许多这些实验系统中，其底物的PRMT1依赖性ADMA修饰的破坏降低了癌细胞的增殖能力(Yang,Y.&Bedford,M.T.Protein arginine methyltransferases and cancer.Nat Rev Cancer13,37-50,doi:10.1038/nrc3409(2013))。
PRMT5在细胞质和细胞核中以几种类型的复合物起作用，并且PRMT5的结合配偶体是底物识别和选择性所必需的。甲基体(methylosome)蛋白50(MEP50)是PRMT5的已知辅因子，其是PRMT5结合和对组蛋白和其他底物的活性所必需的(Ho MC等人，Structure of thearginine methyltransferase PRMT5-MEP50reveals a mechanism for substratespecificity.PLoS One.2013；8(2))。
PRMT5对称地甲基化多种蛋白质中的精氨酸，优选在富含精氨酸和甘氨酸残基的区域(Karkhanis V等人，Versatility of PRMT5-induced methylation in growthcontrol and development.Trends Biochem Sci.2011年12月；36(12):633-41)。PRMT5甲基化各种细胞蛋白中的精氨酸，包括剪接因子、组蛋白、转录因子、激酶等(Karkhanis V等人，Versatility of PRMT5-induced methylation in growth control anddevelopment.Trends Biochem Sci.2011年12月；36(12):633-41)。剪接体的多个组分的甲基化是剪接体组装中的关键事件，并且通过敲低或基因敲除减弱PRMT5活性导致细胞剪接的破坏(Bezzi M等人，Regulation of constitutive and alternative splicing byPRMT5 reveals a role for Mdm4pre-mRNA in sensing defects in the spliceosomalmachinery.Genes Dev.2013年9月1日；27(17):1903-16)。PRMT5还甲基化组蛋白精氨酸残基(H3R8，H2AR3和H4R3)，这些组蛋白标志物与肿瘤抑制基因的转录沉默相关，如RB和ST7(Wang L,Pal S,Sif S.Protein arginine methyltransferase 5suppresses thetranscription of the RB family of tumor suppressors in leukemia and lymphomacells.Mol Cell Biol.2008Oct；28(20):6262-77)。另外，H2AR3的对称二甲基化与胚胎干细胞中分化基因的沉默有关(Tee WW,Pardo M,Theunissen TW,Yu L,Choudhary JS,Hajkova P,Surani MA.Prmt5is essential for early mouse development and acts inthe cytoplasm to maintain ES cell pluripotency.Genes Dev.2010年12月15日；24(24):2772-7)。PRMT5还通过EGFR和PI3K的甲基化在细胞信号传导中起作用(Hsu JM,ChenCT,Chou CK,Kuo HP,Li LY,Lin CY,Lee HJ,Wang YN,Liu M,Liao HW,Shi B,Lai CC,Bedford MT,Tsai CH,Hung MC.Crosstalk between Arg 1175methylation and Tyr1173phosphorylation negatively modulates EGFR-mediated ERK activation.NatCell Biol.2011年2月；13(2):174-81；Wei TY,Juan CC,Hisa JY,Su LJ,Lee YC,Chou HY,Chen JM,Wu YC,Chiu SC,Hsu CP,Liu KL,Yu CT.Protein arginine methyltransferase5is a potential oncoprotein that upregulates G1cyclins/cyclin-dependentkinases and the phosphoinositide 3-kinase/AKT signaling cascade.CancerSci.2012年9月；103(9):1640-50)。
越来越多的证据表明PRMT5参与肿瘤发生。PRMT5蛋白在许多癌症类型中过表达，包括淋巴瘤、神经胶质瘤，乳腺癌和肺癌，仅PRMT5过表达足以转化正常成纤维细胞(Pal S,Baiocchi RA,Byrd JC,Grever MR,Jacob ST,Sif S.Low levels of miR-92b/96inducePRMT5 translation and H3R8/H4R3methylation in mantle cell lymphoma.EMBOJ.2007年8月8日；26(15):3558-69；Ibrahim R等人，Expression of PRMT5in lungadenocarcinoma and its significance in epithelial-mesenchymal transition.HumPathol.2014年7月；45(7):1397-405；Powers MA等人，Protein argininemethyltransferase 5accelerates tumor growth by arginine methylation of thetumor suppressor programmed cell death 4.Cancer Res.2011年8月15日；71(16):5579-87；Yan F等人，Genetic validation of the protein argininemethyltransferase PRMT5 as a candidate therapeutic target inglioblastoma.Cancer Res.2014年3月15日；74(6):1752-65)。PRMT5的敲低通常导致癌细胞系中细胞生长和存活的减少。在乳腺癌中，高PRMT5表达与高PDCD4(程序性细胞死亡4)水平一起预测总体不良存活(Powers MA，等人，Cancer Res.2011年8月15日；71(16)：5579-87)。PRMT5甲基化PDCD4改变肿瘤相关功能。PRMT5和PDCD4在乳腺癌的原位模型中的共表达促进肿瘤生长。PRMT5在神经胶质瘤中的高表达与高肿瘤等级和总体较差的存活率相关，并且PRMT5敲低在原位成胶质细胞瘤模型中提供存活益处(Yan F等人，Genetic validationof the protein arginine methyltransferase PRMT5as a candidate therapeutictarget in glioblastoma.Cancer Res.2014年3月15日；74(6):1752-65)。增加的PRMT5表达和活性有助于沉默神经胶质瘤细胞系中的几种肿瘤抑制基因。
目前在PRMT5和癌症之间描述的最强的机制联系是套细胞淋巴瘤(MCL)。PRMT5经常在MCL中过表达，并且在核区室中高度表达，其中它增加组蛋白甲基化水平并沉默肿瘤抑制基因的亚类。最近的研究揭示了miRNA在MCL中上调PRMT5表达中的作用。预计超过50种miRNA退火至PRMT5mRNA的3'未翻译区。据报道，miR-92b和miR-96水平与MCL中的PRMT5水平呈负相关，并且MCL细胞中这些miRNA的下调导致PRMT5蛋白水平的上调。细胞周期蛋白D1是绝大多数MCL患者中易位的癌基因，与PRMT5相关，并通过cdk4依赖性机制增加PRMT5活性(Aggarwal P等人，Nuclear cyclin D1/CDK4 kinase regulates CUL4 expression andtriggers neoplastic growth via activation of the PRMT5methyltransferase.Cancer Cell.2010年10月19日；18(4):329-40)。PRMT5介导负调节DNA复制的关键基因的抑制，从而允许细胞周期蛋白D1依赖性肿瘤生长。PRMT5敲低抑制细胞周期蛋白D1依赖性细胞转化，导致肿瘤细胞死亡。这些数据突出了PRMT5在MCL中的重要作用，并表明PRMT5抑制可用作MCL中的治疗策略。
在其他肿瘤类型中，已假定PRMT5在分化、细胞死亡、细胞周期进展、细胞生长和增殖中起作用。虽然将PRMT5与肿瘤发生联系起来的主要机制尚不清楚，但新出现的数据表明PRMT5有助于调节基因表达(组蛋白甲基化，转录因子结合或启动子结合)、剪接改变和信号转导。转录因子E2F1的PRMT5甲基化降低其抑制细胞生长和促进细胞凋亡的能力(Zheng S等人，Arginine methylation-dependent reader-writer interplay governs growthcontrol by E2F-1.Mol Cell.2013年10月10日；52(1):37-51)。PRMT5也甲基化p53(Jansson M等人，Arginine methylation regulates the p53response.Nat CellBiol.2008年12月；10(12):1431-9)以响应DNA损伤并降低p53诱导细胞周期停滞的能力，同时增加p53依赖性细胞凋亡。这些数据表明，PRMT5抑制可通过诱导p53依赖性细胞凋亡使细胞对DNA损伤剂敏感。
除了直接甲基化p53外，PRMT5还通过剪接相关机制上调p53途径。小鼠神经祖细胞中的PRMT5敲除导致细胞剪接的改变，包括MDM4基因的同工型转换(Bezzi M等人，Regulation of constitutive and alternative splicing by PRMT5 reveals a rolefor Mdm4 pre-mRNA in sensing defects in the spliceosomal machinery.GenesDev.2013年9月1日；27(17):1903-16)。Bezzi等人，发现PRMT5敲除细胞具有降低的长MDM4同工型的表达(导致功能性p53泛素连接酶)和增加的MDM4短同工型的表达(导致无活性的连接酶)。MDM4剪接的这些变化导致MDM4的失活，增加p53蛋白的稳定性，并随后激活p53途径和细胞死亡。在PRMT5敲低的癌细胞系中也观察到MDM4可变剪接。这些数据表明PRMT5抑制可以激活p53途径的多个节点。
除了癌细胞生长和存活的调节之外，PRMT5还涉及上皮-间充质转化(EMT)。PRMT5与转录因子SNAIL结合，并作为E-钙粘蛋白表达的关键共抑制因子；PRMT5的敲低导致E-钙粘蛋白水平的上调(Hou Z等人，The LIM protein AJUBA recruits protein argininemethyltransferase 5to mediate SNAIL-dependent transcriptional repression.MolCell Biol.2008年5月；28(10):3198-207)。
尽管在癌症治疗方面已有许多最新进展，但仍需要对患有癌症影响的个体进行更有效和/或增强的治疗。
附图简述
图1：精氨酸残基的甲基化类型。来自Yang,Y.&Bedford,M.T.Protein argininemethyltransferases and cancer.Nat Rev Cancer 13,37-50,doi:10.1038/nrc3409(2013)。
图2：癌症相关PRMT1底物的功能类别。已知的PRMT1底物及其与癌症相关生物学的关联(Yang,Y.&Bedford,M.T.Protein arginine methyltransferases and cancer.NatRev Cancer 13,37-50,doi:10.1038/nrc3409(2013)；Shia,W.J.等人，PRMT1interactswith AML1-ETO to promote its transcriptional activation and progenitor cellproliferative potential.Blood 119,4953-4962,doi:10.1182/blood-2011-04-347476(2012)；Wei,H.,Mundade,R.,Lange,K.C.&Lu,T.Protein arginine methylation of non-histone proteins and its role in diseases.Cell Cycle 13,32-41,doi:10.4161/cc.27353(2014)；Boisvert,F.M.,Rhie,A.,Richard,S.&Doherty,A.J.The GAR motif of53BP1is arginine methylated by PRMT1and is necessary for 53BP1DNA bindingactivity.Cell Cycle 4,1834-1841,doi:10.4161/cc.4.12.2250(2005)；Boisvert,F.M.,Dery,U.,Masson,J.Y.&Richard,S.Arginine methylation of MRE11by PRMT1isrequired for DNA damage checkpoint control.Genes Dev 19,671-676,doi:10.1101/gad.1279805(2005)；Zhang,L.等人，Cross-talk between PRMT1-mediated methylationand ubiquitylation on RBM15controls RNA splicing.Elife 4,doi:10.7554/eLife.07938(2015)；Snijders,A.P.等人，Arginine methylation and citrullinationof splicing factor proline-and glutamine-rich(SFPQ/PSF)regulates itsassociation with mRNA.RNA 21,347-359,doi:10.1261/rna.045138.114(2015)；Liao,H.W.等人，PRMT1-mediated methylation of the EGF receptor regulates signalingand cetuximab response.J Clin Invest 125,4529-4543,doi:10.1172/JCI82826(2015)；Ng,R.K.等人，Epigenetic dysregulation of leukaemic HOX code in MLL-rearranged leukaemia mouse model.J Pathol 232,65-74,doi:10.1002/path.4279(2014)；Bressan,G.C.等人，Arginine methylation analysis of the splicing-associated SR protein SFRS9/SRP30C.Cell MolBiol Lett 14,657-669,doi:10.2478/s11658-009-0024-2(2009))。
图3：用化合物D处理的细胞系的Methylscan评估。具有甲基化变化的蛋白质的百分比(与变化的方向性无关)按照所示的官能团分类。
图4：化合物A对PRMT1的抑制模式。在18分钟PRMT1反应后测定IC50值，并将数据拟合至3参数剂量响应等式。(A)代表性实验，显示作为[SAM]/Km app的函数绘制的化合物A IC50值与非竞争性抑制的等式IC50＝Ki/(1+(Km/[S]))拟合。(B)代表性实验，显示作为[肽]/Km app的函数绘制的IC50值。插图显示与混合抑制的等式的数据拟合，以评估相对肽H4 1-21底物，化合物A对PRMT1的抑制(v＝Vmax*[S]/(Km*(1+[I]/Ki)+[S]*(1+[I]/K’)))。α值(α＝Ki’/Ki)＞0.1但＜10指示混合抑制剂。
图5：化合物A对PRMT1的效力。使用在平衡条件下(底物浓度等于Km app)运行的放射性测定法监测PRMT1活性，该放射性测定法测量3H从SAM到H4 1-21肽的转移。通过将数据拟合至3参数剂量-响应等式来确定IC50值。(A)作为PRMT1:SAM:化合物A-三-HCl预孵育时间的函数绘制的IC50值。空心圆和实心圆表示两个独立的实验(0.5nM PRMT1)。插图显示60分钟PRMT1:SAM:化合物A-三-HCl预孵育后化合物A-三-HCl抑制PRMT1活性的代表性IC50曲线。(B)通过盐形式分类的PRMT1的化合物A抑制。在60分钟PRMT1:SAM:化合物A预孵育和20分钟反应后测定IC50值。
图6：与化合物A(橙色)和SAH(紫色)复合的PRMT1在处分辨的晶体结构。插图显示该化合物结合在肽结合口袋中并与PRMT1侧链发生关键相互作用。
图7：化合物A对PRMT1直系同源物的抑制。使用在平衡条件下(底物浓度等于Km app)的放射性测定法监测PRMT1活性，该放射性测定法测量3H从SAM到H4 1-21肽的转移。通过将数据拟合至3参数剂量-响应等式来确定IC50值。(A)对于大鼠(○)和狗(●)直系同源物，作为PRMT1:SAM:化合物A预孵育时间的函数绘制的IC50值。(B)作为大鼠(○)、狗(●)或人(□)PRMT1浓度的函数绘制的IC50值。(C)在60分钟PRMT1:SAM:化合物A预孵育和20分钟反应后测定的IC50值。数据是测试化合物A的多种盐形式的平均值。基于对于非竞争性抑制剂的等式Ki＝IC50/(1+(Km/[S]))以及IC50测定代表ESI*构象的假设，计算Ki *app值。
图8：化合物A对PRMT家族成员的效力。在60分钟PRMT:SAM:化合物A预孵育后，使用在平衡条件下(Km app的底物浓度)运行的放射性测试监测PRMT活性。通过将数据拟合至3-参数剂量-响应等式来确定化合物A的IC50值。(A)数据是测试化合物A的多种盐形式的平均值。Ki *app值基于对于非竞争性抑制剂的等式Ki＝IC50/(1+(Km/[S]))以及IC50测定代表ESI*构象的假设计算。(B)作为PRMT3(●)、PRMT4(○)、PRMT6(■)或PRMT8(□):SAM:化合物A预孵育时间的函数绘制IC50值。
图9：MMA细胞中-western。用化合物A-三-HCl(“化合物A-A”)、化合物A-单-HCl(“化合物A-B”)、化合物A-游离碱(“化合物A-C”)和化合物A-二-HCl(“化合物A-D”)处理RKO细胞72小时。固定细胞，用抗Rme1GG染色以检测MMA和抗微管蛋白以使信号归一化，并使用Odyssey成像系统成像。相对于微管蛋白的MMA相对于化合物浓度作图，以使用双相曲线拟合等式在GraphPad中产生曲线拟合(A)。EC50(第一个拐点)、标准偏差和N的总结显示在(B)中。
图10：PRMT1在肿瘤中的表达。mRNA表达水平获自Cancer Genomics的cBioPortal。显示ACTB水平和TYR分别指示对应于普遍表达的基因的水平表达相对于具有受限表达的基因的表达。
图11：化合物A在细胞培养物中的抗增殖活性。在6天的生长测试中评估196种人癌细胞系对化合物A的敏感性。每个细胞系的gIC50值显示为具有预测的人类暴露的条形图，如(A)中所示。在(B)中，Ymin-T0(细胞毒性的量度)绘制为条形图，其中每个细胞系的gIC100值显示为红点。从大鼠14天MTD(150mg/kg，Cave＝2.1μM)计算的Cave用红色虚线表示。
图12：化合物A的时间过程对培养细胞中的精氨酸甲基化标志物的影响。(A)用化合物A处理的Toledo DLBCL细胞中ADMA、SDMA和MMA的变化。显示甲基化的变化相对于微管蛋白+SEM(n＝3)归一化。(B)精氨酸甲基化标志物的代表性蛋白质印迹。定量的区域由凝胶右侧的黑条表示。
图13：化合物A对精氨酸甲基化的剂量响应。(A)来自U2932细胞系中化合物A剂量响应的MMA和ADMA的代表性蛋白质印迹图像。对于(B)定量的区域由凝胶左侧的黑条表示。(B)暴露72小时后5种淋巴瘤细胞系中50％最大诱导MMA或50％最大减少ADMA所需的最小有效化合物A浓度+标准偏差(n＝2)。6天生长死亡测定中的相应gIC50值表示为红色。
图14：响应于淋巴瘤细胞中的化合物A的精氨酸甲基化标志物的耐久性。(A)用化合物A培养的Toledo DLBCL细胞系中ADMA、SDMA和MMA的变化的稳定性。显示甲基化的变化相对于微管蛋白+SEM(n＝3)归一化。(B)精氨酸甲基化标志物的代表性蛋白质印迹。对(A)定量的区域在凝胶侧用黑条表示。
图15：淋巴瘤细胞系的增殖时间过程。在Toledo(A)和Daudi(B)细胞系(每个细胞系n＝2)的10天时间过程中评估细胞生长。显示了单个生物学重复的代表性数据。
图16：化合物A在第6天和第10天在淋巴瘤细胞系中的抗增殖作用。(A)淋巴瘤细胞系中第6天(浅蓝色)和第10天(深蓝色)增殖测定的平均gIC50值。(B)在第6天(浅蓝色)和第10天(深蓝色)的Ymin-T0与相应的gIC100(红点)。
图17：按亚型分类的化合物A在淋巴瘤细胞系中的抗增殖作用。(A)每个细胞系的gIC50值显示为条形图。在(B)中，Ymin-T0(细胞毒性的量度)绘制为条形图，其中每个细胞系的gIC100值显示为红点。从ATCC或DSMZ细胞系储存库收集亚型信息。
图18：人淋巴瘤细胞系中细胞周期的碘化丙啶FACS分析。将3种淋巴瘤细胞系Toledo(A)、U2932(B)和OCI-Ly1(C)用0、1、10、100、1000和10,000nM化合物A处理10天，在处理后第3、5、7、10天取样。数据代表生物重复的平均值±SEM，n＝2。
图19：用化合物A处理的淋巴瘤细胞系中的胱天蛋白酶-3/7活化。在Toledo(A)和Daudi(B)细胞系中，在10天的时间过程中评估细胞凋亡。胱天蛋白酶3/7活化显示为相对于DMSO处理的细胞的倍数诱导。对每种细胞系进行两次独立的重复。显示了每种的代表性数据。
图20：化合物A在携带Toledo异种移植物的小鼠中的功效。在28(A)或24(B)天的期间内，用化合物A口服QD(37.5、75、150、300、450、或600mg/kg)或用75mg/kg(B)BID治疗小鼠，且每周两次测量肿瘤体积。
图21：化合物A在6天和10天时在AML细胞系中的作用。(A)AML细胞系中6天(浅蓝色)和10天(深蓝色)增殖测定的平均gIC50值。(B)在第6天(浅蓝色)和第10天(深蓝色)的Ymin-T0与相应的gIC100(红点)。
图22：使用化合物A的ccRCC细胞系体外增殖时间过程。(A)2种ccRCC细胞系相对于对照(DMSO)的生长。显示了来自单个重复的代表性曲线。(B)在时间过程中对ccRCC细胞系的gIC50和％生长抑制的总结(平均值±SD；每种细胞系n＝2)。
图23：化合物A在ACHN异种移植物中的功效。每天用化合物A口服治疗小鼠28天，每周两次测量肿瘤体积。
图24：化合物A在乳腺癌细胞系中的抗增殖作用。在6天增殖测定中用化合物A处理的乳腺癌细胞系的gIC50和生长抑制(％)(红色圆圈)的条形图。代表三阴性乳腺癌(TNBC)的细胞系以橙色显示；其他亚型是蓝色的。
图25：化合物A在第7天和第12天在乳腺癌细胞系中的作用。在具有相应gIC50(红点)的乳腺癌细胞系中，7天(浅蓝色)和10天(深蓝色)增殖测试的平均生长抑制(％)值。在用乳腺癌而非淋巴瘤或AML细胞系的长期增殖测定中观察到的效力和抑制百分比的增加表明某些肿瘤类型需要更长时间暴露于化合物A以充分显示抗增殖活性。
图26：PRMT催化的四种蛋白质精氨酸甲基化。
图27：已知的PRMT5底物。PRMT5对称地甲基化多种蛋白质中的精氨酸，优选在富含精氨酸和甘氨酸残基的区域(Karkhanis V等人，Versatility of PRMT5-inducedmethylation in growth control and development.Trends Biochem Sci.2011年12月；36(12):633-41)。绝大多数这些底物是通过它们与PRMT5相互作用的能力来鉴定的。
图28：PRMT5/MEP50复合物活性与细胞周期蛋白D1致癌基因驱动途径之间的分子关系。MEP50，一种PRMT5共调节因子，是cdk4底物，MEP50磷酸化增加PRMT5/MEP50活性。增加的PRMT5活性介导与细胞周期蛋白D1依赖性肿瘤生长相关的关键事件，包括CUL4(Cullin4)抑制、CDT1过表达和DNA再复制(改编自Aggarwal P等人，Nuclear cyclin D1/CDK4kinase regulates CUL4 expression and triggers neoplastic growth viaactivation of the PRMT5methyltransferase.Cancer Cell.2010年10月19日；18(4)：329-40)。
图29：针对PRMT5/MEP50的化合物IC50值。在平衡条件下(Km表观的底物浓度)使用放射性测定监测PRMT5/MEP50(4nM)活性，其测量用化合物C、化合物F、化合物B或化合物E处理后3H从SAM至H4肽的转移。通过将数据拟合至3参数剂量-响应方程来确定IC50值。
图30：与化合物C和西奈芬净复合的PRMT5/MEP50在处分辨的晶体结构。插图显示该化合物结合在肽结合口袋中并与PRMT5骨架进行关键相互作用。
图31：系统发生树突出显示在选择性组中测试的甲基转移酶。对于PRMT5(10- 8M)，化合物C显示出比任何其他测试酶(＞10-5M)更高的效力。PRMT9仅出于关系目的而在家族树中显示，未在组中进行评估。图改编自Richon VM.等人。
图32：来自一组癌细胞系中的6天生长/死亡测定的化合物C gIC50值。DLBCL-弥漫性大B细胞淋巴瘤、GBM-成胶质细胞瘤、MCL-套细胞淋巴瘤、MM-多发性骨髓瘤
图33：来自一组癌细胞系中的6天生长/死亡测定的化合物C gIC100(黑色方块)和Ymin-T0(条)值(该测定中使用的顶部浓度为30μM)。DLBCL弥漫性大B细胞淋巴瘤、GBM-成胶质细胞瘤、MCL-套细胞淋巴瘤、MM多发性骨髓瘤
图34：来自10天2D生长测定的癌细胞系(n＝240)中的化合物B gIC50值。ALL-急性成淋巴细胞性白血病、AML-急性骨髓性白血病、CML-慢性骨髓性白血病、DLBCL-弥漫型大B-细胞淋巴瘤、HL-霍奇金淋巴瘤、HN-头颈癌、MM-多发性骨髓瘤、NHL-非霍奇金淋巴瘤、NSCLC-非小细胞肺癌、PEL-原发性渗出性淋巴瘤、SCLC-小细胞肺癌、TCL-T-细胞淋巴瘤。
图35：在患者衍生的和细胞系肿瘤模型中进行的8-13天集落形成测定的化合物E相对IC50值。
图36：化合物C对SDMA的抑制。(A)第3天(上图)的代表性SDMA剂量-响应曲线(归一化为GAPDH的总SDMA)和第1天和第3天(下图)的Z138细胞的IC50值。(B)一组MCL细胞系中的SDMA IC50值(EPIZYME数据，第4天)。
图37：用PRMT5抑制剂处理的淋巴瘤细胞系中的基因表达变化。A.化合物B(0.1和0.5μM)处理(第2天和第4天)后淋巴瘤细胞系中差异表达(DE)基因的定量。B.跨淋巴瘤细胞系的DE基因的重叠。
图38：通过RNA测序鉴定的11个基因的组中的化合物C基因表达EC50值。CDKN1A(第2天和第4天，左图)和基因组EC50汇总表(右图，第4天)的代表性剂量-响应曲线。
图39：化合物B减弱淋巴瘤细胞系中内含子亚类的剪接。A.调节细胞剪接的机制(改编自Bezzi M.等人)。B.用0.1或0.5μM化合物B处理的淋巴瘤细胞系中内含子表达的分析。
图40：化合物B诱导淋巴瘤细胞系中基因亚类的同工型转换。A.用化合物B(0.1和0.5μM)处理2和4天的4种淋巴瘤细胞系中同工型转换的定量。B.4种淋巴瘤细胞系中同工型转换的重叠。C.在所有4种淋巴瘤细胞系中经历可变剪接的基因列表(4种细胞系的重叠)。
图41：用化合物C处理的MCL细胞系中的MDM4可变剪接和p53活化。A.在用10和200nM化合物C或5μM Nutlin-3处理2天和3天(MDM4-FL-长；MDM4-S-短)的4种套细胞淋巴瘤细胞系组中的MDM4同工型表达分析。B.用10和200nM化合物C或5μM Nutlin-3处理3天的MCL细胞系中p53和p21表达的Western分析。
图42：化合物C诱导Z138细胞中MDM4RNA(A)剪接和SDMA/p53/p21水平的剂量依赖性变化(B)。
图43：PRMT5抑制剂和依鲁替尼作为单一药物和组合在MCL细胞系中的活性。A.6天生长/死亡CTG测定中化合物C和依鲁替尼的gIC50值。B.化合物B和依鲁替尼的组合在REC1细胞中的代表性生长曲线(第6天，1：1比例)。C.在6天生长/死亡CTG测定中以指定比率的化合物B:依鲁替尼的组合指数(CI)。
图44：Z138异种移植模型中的化合物C功效和PD。化合物C在Z138异种移植模型中的21天功效研究。B.在功效研究结束时(最后一次给药后3小时)从收集的肿瘤中量化SDMAwestern数据。
图45：Maver-1异种移植模型中的化合物C功效和PD。A.在Maver-1异种移植模型中的化合物C 21天功效研究。B.在功效研究结束时(最后一次给药后3小时)从收集的肿瘤中量化SDMA western数据。
图46：来自7天生长2D测定(TNBC-三阴性乳腺癌，HER2-Her2阳性，HR-激素受体阳性)的一组乳腺癌细胞系中的化合物B生长IC50值。
图47：使用PRMT5候选物、化合物C和PRMT5工具分子、化合物B，在乳腺和MCL细胞系中10-12天生长/死亡测定的Ymin-T0值。
图48：用30、200和1000nM化合物C处理不同时间段的乳腺癌细胞系的碘化丙锭FACS分析(第2天、第7天和第10天，生物学n＝2，误差棒代表标准偏差)。
图49：在一组乳腺癌细胞系中1μM化合物B处理后SDMA抑制的时间过程。将细胞用DMSO或1μM化合物B处理指定的时间段，并通过蛋白质印迹用SDMA和肌动蛋白抗体分析细胞裂解物。每个印迹的最后一个泳道是DMSO对照的1/2。
图50：MDA-MB-468异种移植模型中的化合物C功效(左)和PK/PD(右)。
图51：使用PRMT5候选物、化合物C和PRMT5工具分子化合物B(Ymin-T0)在GBM细胞系中的14天生长/死亡CTG测定。
图52：化合物B(1μM)降低SDMA水平(B)，诱导MDM4(A)的可变剪接，并激活GBM和淋巴瘤细胞系中的p53(B)。
图53：淋巴瘤、乳腺癌和黑素瘤癌细胞系中的化合物A和化合物B组合。使用化合物A、化合物B(PRMT5抑制剂)或两种化合物的固定比例(1：1)的组合的6天增殖测试的gIC50、gIC100、Ymin-T0。
图54：在用化合物B与顺铂、卡铂、多柔比星、BET抑制剂、MEK抑制剂和化合物D的固定比例的组合处理的多种三阴性乳腺癌(TNBC)细胞系中相对于单一药物(化合物B)处理的gIC50和gIC100倍数变化。
图55：用化合物B与顺铂、卡铂、多柔比星、BET抑制剂、MEK抑制剂和化合物D的固定比例的组合处理的各种膀胱癌细胞系中相对于单一药物(化合物B)处理的gIC50和gIC100倍数变化。
图56：用各种浓度的化合物B、化合物D和化合物B与化合物D的组合处理的膀胱癌细胞系(T24)的增殖测定结果。
图57：用化合物B和化合物D单独和组合处理的膀胱癌细胞系SW-780和T24的增殖测定(Ymin-T0％)的结果。
图58：用化合物B和化合物D的组合处理的10个膀胱癌细胞系和7个TNBC细胞系的增殖测定结果。显示了经历细胞毒性(负Ymin-T0％)和细胞抑制响应的膀胱癌和TNBC细胞系的百分比。
发明内容
在一个实施方案中，本发明提供I型蛋白质精氨酸甲基转移酶(I型PRMT)抑制剂和II型蛋白质精氨酸甲基转移酶(II型PRMT)抑制剂的组合。
在一个实施方案中，提供药物组合物，其包含治疗有效量的I型蛋白质精氨酸甲基转移酶(I型PRMT)抑制剂和第二药物组合物，该第二药物组合物包含治疗有效量的II型蛋白质精氨酸甲基转移酶(II型PRMT)抑制剂。
在一个实施方案中，提供在需要的人中治疗癌症的方法，所述方法包括向人施用I型蛋白质精氨酸甲基转移酶(I型PRMT)抑制剂和II型蛋白质精氨酸甲基转移酶(II型PRMT)抑制剂的组合，以及以下至少一种：药学上可接受的载体和药学上可接受的稀释剂，从而治疗所述人的癌症。
在一个实施方案中，提供在需要的人中治疗癌症的方法，该方法包括向人施用治疗有效量的包含I型蛋白质精氨酸甲基转移酶(I型PRMT)抑制剂的药物组合物和包含II型蛋白质精氨酸甲基转移酶(II型PRMT)抑制剂的第二药物组合物，从而治疗所述人的癌症。
发明详述
定义
如本文所用，“I型蛋白质精氨酸甲基转移酶抑制剂”或“I型PRMT抑制剂”是指抑制以下任意一种或多种的试剂：蛋白质精氨酸甲基转移酶1(PRMT1)、蛋白质精氨酸甲基转移酶3(PRMT3)、蛋白质精氨酸甲基转移酶4(PRMT4)、蛋白质精氨酸甲基转移酶6(PRMT6)和蛋白质精氨酸甲基转移酶8(PRMT8)。在一些实施方案中，所述I型PRMT抑制剂为小分子化合物。在一些实施方案中，所述I型PRMT抑制剂选择性抑制以下任意一种或多种：蛋白质精氨酸甲基转移酶1(PRMT1)、蛋白质精氨酸甲基转移酶3(PRMT3)、蛋白质精氨酸甲基转移酶4(PRMT4)、蛋白质精氨酸甲基转移酶6(PRMT6)和蛋白质精氨酸甲基转移酶8(PRMT8)。在一些实施方案中，所述I型PRMT抑制剂为PRMT1、PRMT3、PRMT4、PRMT6和PRMT8的选择性抑制剂。
如本文所用，“II型蛋白质精氨酸甲基转移酶抑制剂”或“II型PRMT抑制剂”是指抑制蛋白质精氨酸甲基转移酶5(PRMT5)和/或蛋白质精氨酸甲基转移酶9(PRMT9)的试剂。在一些实施方案中，所述II型PRMT抑制剂为小分子化合物。在一些实施方案中，所述II型PRMT抑制剂选择性抑制蛋白质精氨酸甲基转移酶5(PRMT5)和/或蛋白质精氨酸甲基转移酶9(PRMT9)。在一些实施方案中，所述II型PRMT抑制剂为PRMT5的抑制剂。在一些实施方案中，所述II型PRMT抑制剂为PRMT5的选择性抑制剂。
鉴于它们在调节多种生物过程中的作用，精氨酸甲基转移酶是调节的有吸引力的靶标。现已发现，本文所述的化合物及其药学上可接受的盐和组合物作为精氨酸甲基转移酶的抑制剂是有效的。
以下更具体地描述具体官能团和化学术语的定义。化学元素是根据Handbook ofChemistry and Physics,75版内页的CAS版本元素周期表所定义，且总体来说具体官能团也根据其中所述而定义。此外，在Thomas Sorrell，Organic Chemistry，UniversityScience Books，Sausalito，1999；Smith和March，March’s Advanced Organic Chemistry，第5版，John Wiley&Sons，Inc.，New York，2001；Larock，Comprehensive OrganicTransformations，VCH Publishers，Inc.，New York，1989；和Carruthers，Some ModernMethods of Organic Synthesis，第3版，Cambridge University Press，Cambridge，1987中描述了有机化学的一般原则以及具体官能团和反应性。
本文所述的化合物可包含一个或多个不对称中心，并因此可以不同异构体形式存在，如对映异构体和/或非对映异构体。例如，本文所述的化合物可为单一对映异构体、非对映异构体或几何异构体的形式，或可为立体异构体混合物的形式，包括外消旋混合物和富含一种或多种立体异构体的混合物。可通过本领域技术人员已知的方法将异构体从混合物中分离，包括手性高效液相色谱(HPLC)以及手性盐的形成和结晶；或者可通过不对称合成制备优选的异构体。例如参见：Jacques等人，Enantiomers，Racemates和Resolutions(Wiley Interscience，New York，1981)；Wilen等人，Tetrahedron 33:2725(1977)；Eliel，Stereochemistry of Carbon Compounds(McGraw–Hill，NY，1962)；以及Wilen，Tables ofResolving Agents and Optical Resolutions p.268(E.L.Eliel，Ed.，Univ.of NotreDame Press，Notre Dame，IN 1972)。本发明还包括本文所述的作为单个异构体的化合物，其基本不含其它异构体，或者包括作为不同异构体混合物的化合物。
应理解，本发明的化合物可描绘为不同的互变异构体。还应当理解，当化合物具有互变异构形式时，所有互变异构形式都包括在本发明的范围内，并且本文所述任何化合物的命名不排除任何互变异构形式。
除非另有说明，否则本文描述的结构也意味着包括仅在一个或多个同位素富集原子的存在方面不同的化合物。例如，具有本发明结构的化合物，不同的是用氘或氚替代氢，用18F替代19F，或用富含13C-或14C-的碳替代碳，都在本发明的范围内。这些化合物可用作例如生物测定中的分析工具或探针。
术语"脂族基团"，如本文所述，包括饱和和不饱和、非芳族、直链(即，非支链的)、支链、非环状和环状(即，碳环的)。在一些实施方案中，脂族基团任选取代有一个或多个官能团。本领域技术人员应理解，"脂族基团"在此预期包括烷基、烯基、炔基、环烷基和环烯基部分。
列出一系列值时，它旨在包含该范围内的每个值和子范围。例如"C1-6烷基"预期包括，C1；C2、C3、C4、C5、C6、C1-6、C1-5、C1-4、C1-3、C1-2、C2-6、C2-5、C2-4、C2-3、C3-6、C3-5、C3-4、C4-6、C4-5和C5-6烷基。
"基(Radical)"是指特定基团上的连接点。基包括特定基团上的二价自由基。
“烷基”是指具有1至20个碳原子的直链或支链饱和烃基基团(“C1–20烷基”)。在一些实施方案中，烷基具有1至10个碳原子("C1-10烷基")。在一些实施方案中，烷基具有1至9个碳原子("C1-9烷基")。在一些实施方案中，烷基具有1至8个碳原子("C1-8烷基")。在一些实施方案中，烷基具有1至7个碳原子("C1-7烷基")。在一些实施方案中，烷基具有1至6个碳原子("C1-6烷基")。在一些实施方案中，烷基具有1至5个碳原子("C1-5烷基")。在一些实施方案中，烷基具有1至4个碳原子("C1-4烷基")。在一些实施方案中，烷基具有1至3个碳原子("C1-3烷基")。在一些实施方案中，烷基具有1至2个碳原子("C1-2烷基")。在一些实施方案中，烷基具有1个碳原子("C1烷基")。在一些实施方案中，烷基具有2至6个碳原子("C2-6烷基")。C1-6烷基基团的实例包括甲基(C1)、乙基(C2)、正丙基(C3)、异丙基(C3)、正丁基(C4)、叔丁基(C4)、仲丁基(C4)、异丁基(C4)、正戊基(C5)、3-戊基(C5)、戊基(C5)、新戊基(C5)、3-甲基-2-丁基(C5)、叔戊基(C5)、和正己基(C6)。烷基的其它实例包括正庚基(C7)、正辛基(C8)等。在某些实施方案中，烷基的每种情况独立地为任选取代的，例如，未取代的(“未取代的烷基")或取代有一个或多个取代基(“取代的烷基")。在某些实施方案中，烷基为未取代的C1-10烷基(例如，-CH3)。在某些实施方案中，烷基为取代的C1-10烷基。
在一些实施方案中，烷基取代有一个或多个卤素。"全卤代烷基"为其中所有氢原子独立地被卤素，例如，氟、溴、氯或碘代替的本文定义的取代的烷基。在一些实施方案中，烷基部分具有1至8个碳原子("C1-8全卤代烷基")。在一些实施方案中，烷基部分具有1至6个碳原子("C1-6全卤代烷基")。在一些实施方案中，烷基部分具有1至4个碳原子("C1-4全卤代烷基")。在一些实施方案中，烷基部分具有1至3个碳原子("C1-3全卤代烷基")。在一些实施方案中，烷基部分具有1至2个碳原子("C1-2全卤代烷基")。在一些实施方案中，所有氢原子都被氟代替。在一些实施方案中，所有氢原子都被氯代替。全卤代烷基基团的实例包括-CF3、-CF2CF3、-CF2CF2CF3、-CCl3、-CFCl2、-CF2Cl等。
"烯基"是指具有2至20个碳原子和一个或多个碳-碳双键(例如，1、2、3或4个双键)，和任选一个或多个三键(例如，1、2、3或4个三键)的直链或支链的烃基基团("C2-20烯基")。在某些实施方案中，烯基不包含三键。在一些实施方案中，烯基具有2至10个碳原子("C2-10烯基")。在一些实施方案中，烯基具有2至9个碳原子("C2-9烯基")。在一些实施方案中，烯基具有2至8个碳原子("C2-8烯基")。在一些实施方案中，烯基具有2至7个碳原子("C2-7烯基")在一些实施方案中，烯基具有2至6个碳原子("C2-6烯基")。在一些实施方案中，烯基具有2至5个碳原子("C2-5烯基")。在一些实施方案中，烯基具有2至4个碳原子("C2-4烯基")。在一些实施方案中，烯基具有2至3个碳原子("C2-3烯基")。在一些实施方案中，烯基具有2个碳原子("C2烯基")。一个或多个碳-碳双键可为内部的(如在2-丁烯基中)或末端的(如在1-丁烯基中)。C2-4烯基基团的实例包括乙烯基(C2)、1-丙烯基(C3)、2-丙烯基(C3)、1-丁烯基(C4)、2-丁烯基(C4)、丁二烯基(C4)等。C2-6烯基基团的实例包括上述C2-4烯基以及戊烯基(C5)、戊二烯基(C5)、己烯基(C6)，等。烯基的其它实例包括庚烯基(C7)、辛烯基(C8)、辛三烯基(C8)，等。在某些实施方案中，烯基的每种情况独立地为任选取代的，例如，未取代的(“未取代的烯基")或取代有一个或多个取代基(“取代的烯基")。在某些实施方案中，烯基为未取代的C2-10烯基。在某些实施方案中，烯基为取代的C2-10烯基。
"炔基"是指具有2至20个碳原子和一个或多个碳-碳三键(例如，1、2、3或4个三键)，和任选一个或多个双键(例如，1、2、3或4个双键)的直链或支链的烃基基团("C2-20炔基")。在某些实施方案中，炔基不包含双键。在一些实施方案中，炔基具有2至10个碳原子("C2-10炔基")。在一些实施方案中，炔基具有2至9个碳原子("C2-9炔基")。在一些实施方案中，炔基具有2至8个碳原子("C2-8炔基")。在一些实施方案中，炔基具有2至7个碳原子("C2-7炔基")。在一些实施方案中，炔基具有2至6个碳原子("C2-6炔基")。在一些实施方案中，炔基具有2至5个碳原子("C2-5炔基")。在一些实施方案中，炔基具有2至4个碳原子("C2-4炔基")。在一些实施方案中，炔基具有2至3个碳原子("C2-3炔基")。在一些实施方案中，炔基具有2个碳原子("C2炔基")。一个或多个碳碳三键可为内部的(如在2-丁炔基中)或末端的(如在1-丁炔基中)。C2-4炔基基团的实例包括，但不限于，乙炔基(C2)、1-丙炔基(C3)、2-丙炔基(C3)、1-丁炔基(C4)、2-丁炔基(C4)，等。C2-6烯基基团的实例包括上述C2-4炔基以及戊炔基(C5)、己炔基(C6)，等。炔基的其他实例包括庚炔基(C7)、辛炔基(C8)，等。在某些实施方案中，炔基的每种情况独立地为任选取代的，例如，未取代的(“未取代的炔基")或取代有一个或多个取代基(“取代的炔基")。在某些实施方案中，炔基为未取代的C2-10炔基。在某些实施方案中，炔基为取代的C2-10炔基。
“稠合”或“邻位稠合”在本文中可互换使用，并且是指具有共同的两个原子和一个键的两个环，例如，
萘。
“桥接”是指以下环系统，其包含(1)桥头原子或原子团，所述桥头原子或原子团连接同一环的两个或更多个非相邻位置；或(2)桥头原子或原子团，所述桥头原子或原子团连接环系统的不同环的两个或多个位置，并且因此不形成邻位稠合的环，例如，
“螺”或“螺稠合”是指连接到碳环或杂环系统的相同原子的一组原子(偕位连接)，从而形成环，例如，
还考虑了桥头原子处的螺环融合。
"碳环基"或"碳环的"是指在非芳环体系中具有3至14个环碳原子("C3-14碳环基")和0个杂原子的非芳族环状烃基基团。在某些实施方案中，碳环基是指在非芳环体系中具有3至10个环碳原子(C3-10碳环基")和0个杂原子的非芳族环状烃基基团。在一些实施方案中，碳环基具有3至8个环碳原子("C3-8碳环基”)。在一些实施方案中，碳环基具有3至6个环碳原子("C3-6碳环基”)。在一些实施方案中，碳环基具有3至6个环碳原子("C3-6碳环基”)。在一些实施方案中，碳环基具有5至10个环碳原子("C5-10碳环基")。示例性C3-6碳环基包括，但不限于，环丙基(C3)、环丙烯基(C3)、环丁基(C4)、环丁烯基(C4)、环戊基(C5)、环戊烯基(C5)、环己基(C6)、环己烯基(C6)、环己二烯基(C6)，等。示例性C3-8碳环基包括，但不限于，上述C3-6碳环基以及环庚基(C7)、环庚烯基(C7)、环庚二烯基(C7)、环庚三烯基(C7)、环辛基(C8)、环辛烯基(C8)、双环[2.2.1]庚基(C7)、双环[2.2.2]辛基(C8)，等。示例性C3-10碳环基包括，但不限于，上述C3_8碳环基以及环壬基(C9)、环壬烯基(C9)、环癸基(C10)、环癸烯基(C10)、八氢-lH-茚基(C9)、十氢萘基(C10)、螺[4.5]癸基(C10)，等。如此前实例所述，在一些实施方案中，碳环基基团为单环(“单环碳环基”)或为稠合、桥接或螺环稠合的系统(如二环系统(“二环碳环基”))，并且可为饱和的或可为部分不饱和的。“碳环基”也包括环系统，其中如上所述的碳环基环与一个或多个芳基或杂芳基基团稠合，其中连接点位于碳环基环上，且在该情况下，碳的数目继续被指定为碳环环系统中的碳数目。在某些实施方案中，碳环基的每种情况独立地为任选取代的，例如，未取代的(“未取代的碳环基")或取代有一个或多个取代基(“取代的碳环基")。在某些实施方案中，所述碳环基为未取代的C3-10碳环基。在某些实施方案中，所述碳环基为取代的C3-10碳环基。
在一些实施方案中，"碳环基"为具有3至14个环碳原子的单环、饱和碳环基("C3-14环烷基")。在一些实施方案中，"碳环基"为具有3至10个环碳原子的单环、饱和碳环基("C3-10环烷基")。在一些实施方案中，环烷基具有3至8个环碳原子("C3-8环烷基")。在一些实施方案中，环烷基具有3至6个环碳原子("C3-6环烷基")。在一些实施方案中，环烷基具有5至6个环碳原子("C5-6环烷基")。在一些实施方案中，环烷基具有5至10个环碳原子("C5-10环烷基")。C5-6环烷基基团的实例包括环戊基(C5)和环己基(C5)。C3-6环烷基基团的实例包括上述C5-6环烷基以及环丙基(C3)和环丁基(C4)。C3-8环烷基基团的实例包括上述C3-6环烷基以及环庚基(C7)和环辛基(C8)。在某些实施方案中，环烷基的每种情况独立地为未取代的(“未取代的环烷基")或取代有一个或多个取代基(“取代的环烷基")。在某些实施方案中，环烷基为未取代的C3-10环烷基。在某些实施方案中，环烷基为取代的C3-10环烷基。
"杂环基"或"杂环的"是指具有环碳原子和1至4个环杂原子的3-至14-元非芳环体系的基团，其中各杂原子独立地选自氮、氧和硫("3-14元杂环基")。在某些实施方案中，杂环基或杂环的是指具有环碳原子和1-4个环杂原子的3-10元非芳环体系的基团，其中各杂原子独立地选自氮、氧和硫("3-10元杂环基")。在包含一个或多个氮原子的杂环基中，连接点可为碳或氮原子，只要化合价允许。杂环基可为单环("单环杂环基")或稠合、桥接或螺环稠合的的环体系，如双环体系("双环杂环基")，且可为饱和或可为部分不饱和的。杂环基二环环系统可在一个或两个环中包含一个或多个杂原子。“杂环基”还包括环系统，其中如上所定义的杂环基环，与一个或多个碳环基基团稠合，其中连接点位于碳环基上或杂环基环上，或者包括环系统，其中如上所定义的杂环基环与一个或多个芳基或杂芳基基团稠合，其中连接点位于杂环基环上，且在该情况下，环成员的数目继续被指定为杂环基环系统中的环成员数目。在某些实施方案中，杂环基的每种情况独立地为任选取代的，例如，未取代的(“未取代的杂环基")或取代有一个或多个取代基(“取代的杂环基")。在某些实施方案中，杂环基为未取代的3-10元杂环基。在某些实施方案中，杂环基为取代的3-10元杂环基。
在一些实施方案中，杂环基为具有环碳原子和1-4个环杂原子的5-10元非芳环体系，其中各杂原子独立地选自氮、氧和硫("5-10元杂环基")。在一些实施方案中，杂环基为具有环碳原子和1-4个环杂原子的5-8元非芳环体系，其中各杂原子独立地选自氮、氧和硫("5-8元杂环基")。在一些实施方案中，杂环基为具有环碳原子和1-4个环杂原子的5-6元非芳环体系，其中各杂原子独立地选自氮、氧和硫("5-6元杂环基")。在一些实施方案中，所述5-6元杂环基具有1-3个独立选自氮、氧和硫的环杂原子。在一些实施方案中，所述5-6元杂环基具有1-2个独立选自氮、氧和硫的环杂原子。在一些实施方案中，所述5-6元杂环基具有一个选自氮、氧和硫的环杂原子。
示例性的包含一个杂原子的3元杂环基基团包括但不限于氮杂环丙烷基、氧杂环丙烷基、硫杂环丙烷基。示例性的包含一个杂原子的4元杂环基基团包括但不限于氮杂环丁烷基、氧杂环丁烷基和硫杂环丁烷基。包含一个杂原子的示例性的5元杂环基基团包括但不限于四氢呋喃基、二氢呋喃基、四氢噻吩基、二氢噻吩基、吡咯烷基、二氢吡咯基和吡咯基-2,5–二酮。示例性的包含两个杂原子的5元杂环基基团包括但不限于二氧杂环戊烷基、氧杂硫杂环戊烷基(oxasulfuranyl)、二硫杂环戊烷基(disulfuranyl)和噁唑烷-2-酮。示例性的包含三个杂原子的5元杂环基基团包括但不限于三唑啉基、噁二唑啉基和噻二唑啉基。示例性的包含一个杂原子的6元杂环基基团包括但不限于哌啶基、四氢吡喃基、二氢吡啶基和硫杂环己基。示例性的包含两个杂原子的6元杂环基基团包括但不限于哌嗪基、吗啉基、二硫杂环己基、二氧杂环己烷基。示例性的包含三个杂原子的6元杂环基基团包括但不限于三氮杂环己烷基(triazinanyl)。示例性的包含一个杂原子的7元杂环基基团包括但不限于氮杂环庚烷基、氧杂环庚烷基和硫杂环庚烷基。示例性的包含一个杂原子的8元杂环基基团包括但不限于氮杂环辛烷基、氧杂环辛烷基和硫杂环辛烷基。示例性的与C6芳基环稠合的5元杂环基基团(本文也称为5,6-二环杂环)包括但不限于二氢吲哚基、异二氢吲哚基、二氢苯并呋喃基、二氢苯并噻吩基、苯并噁唑啉酮基(benzoxazolinonyl)等。示例性的与芳基环稠合的6元杂环基基团(本文也称为6,6-二环杂环)包括但不限于四氢喹啉基、四氢异喹啉基等。
“芳基”是指单环或多环(如二环或三环)的4n+2芳香环系统(如具有6、10或14个在环形排列中共享的π电子)并在该芳香环系统中具有6-14个环碳原子和0个杂原子的基团(“C6–14芳基”)。在一些实施方案中，芳基基团具有六个环碳原子(“C6芳基”；如苯基)。在一些实施方案中，芳基基团具有十个环碳原子(“C10芳基”；如萘基如1–萘基和2–萘基)。在一些实施方案中，芳基基团具有十四个环碳原子(“C14芳基”；如蒽基)。“芳基”还包括环系统，其中芳基环，如上所定义，与一个或多个碳环基或杂环基基团稠合，其中连接基团或连接点位于芳基环上，且在该情况下，碳原子的数目继续被指定为芳基环系统中的碳原子数目。在某些实施方案中，芳基的每种情况独立地为任选取代的，例如，未取代的(“未取代的芳基")或取代有一个或多个取代基(“取代的芳基")。在某些实施方案中，芳基为未取代的C6-14芳基。在某些实施方案中，芳基为取代的C6-14芳基。
"杂芳基"是指5-14元单环或多环(如二环或三环)的4n+2芳香环系统(如具有6或10个在环形排列中共享的π电子)并在该芳香环系统中具有环碳原子和1-4个环杂原子的基团，其中各杂原子独立地选自氮、氧和硫("5-14元杂芳基")。在某些实施方案中，杂芳基是指具有环碳原子和在芳环体系中的1-4个环杂原子的5-10元单环或双环的4n+2芳环体系的基团，其中各杂原子独立地选自氮、氧和硫("5-10元杂芳基")。在含有一个或多个氮原子的杂芳基基团中，只要原子价允许，连接点可为碳或氮原子。杂芳基二环系统可在一个或两个环内包含一个或多个杂原子。“杂芳基”包括这样的环系统，其中如上所定义的杂芳基环与一个或多个碳环基或杂环基基团稠合，其中连接点位于杂芳基环上，且在该情况下，环成员的数目继续被指定为杂芳基环系统中环成员的数目。“杂芳基”还包括这样的环系统，其中如上所定义的杂芳基环与一个或多个芳基基团稠合，其中连接点位于芳基或杂芳基环上，且在该情况下，环成员的数目继续被指定为稠合(芳基/杂芳基)环系统中环成员的数目。二环杂芳基基团中的一个环不含有杂原子(如吲哚基，喹啉基，咔唑基等)，连接点可位于两环之一上，例如位于具有杂原子的环(如2–吲哚基)上或位于不含有杂原子的环(如5–吲哚基)上。
在一些实施方案中，杂芳基为具有环碳原子和设置在芳环体系中的1-4个环杂原子的5-14元芳环体系，其中各杂原子独立地选自氮、氧和硫("5-14元杂芳基")。在一些实施方案中，杂芳基为具有环碳原子和设置在芳环体系中的1-4个环杂原子的5-10元芳环体系，其中各杂原子独立地选自氮、氧和硫("5-10元杂芳基")。在一些实施方案中，杂芳基为具有环碳原子和设置在芳环体系中的1-4个环杂原子的5-8元芳环体系，其中各杂原子独立地选自氮、氧和硫("5-8元杂芳基")。在一些实施方案中，杂芳基为具有环碳原子和设置在芳环体系中的1-4个环杂原子的5-6元芳环体系，其中各杂原子独立地选自氮、氧和硫("5-6元杂芳基")。在一些实施方案中，所述5-6元杂芳基具有1-3个独立选自氮、氧和硫的环杂原子。在一些实施方案中，所述5-6元杂芳基具有1-2个独立选自氮、氧和硫的环杂原子。在一些实施方案中，所述5-6元杂芳基具有1个选自氮、氧和硫的环杂原子。在某些实施方案中，杂芳基的每种情况独立地为任选取代的，例如，未取代的("未取代的杂芳基")或取代有一个或多个取代基("取代的杂芳基")。在某些实施方案中，杂芳基为未取代的5-14元杂芳基。在某些实施方案中，杂芳基为取代的5-14元杂芳基。
包含一个杂原子的示例性5-元杂芳基包括，但不限于，吡咯基，呋喃基和噻吩基。包含2个杂原子的示例性5-元杂芳基包括，但不限于，咪唑基、吡唑基、噁唑基、异噁唑基、噻唑基和异噻唑基。包含3个杂原子的示例性5-元杂芳基包括，但不限于，三唑基、噁二唑基和噻二唑基。包含4个杂原子的示例性5-元杂芳基包括，但不限于，四唑基。包含1个杂原子的示例性6-元杂芳基包括，但不限于，吡啶基。包含2个杂原子的示例性6-元杂芳基包括，但不限于，哒嗪基，嘧啶基和吡嗪基。包含3或4个杂原子的示例性6-元杂芳基分别包括，但不限于，三嗪基和四嗪基。包含1个杂原子的示例性7-元杂芳基包括，但不限于，氮杂环庚三烯基、氧杂环庚三烯基和硫杂环庚三烯基。示例性6,6-双环杂芳基包括，但不限于，二氮杂萘基、蝶啶基、喹啉基、异喹啉基、噌啉基、喹喔啉基、酞嗪基和喹唑啉基。示例性5,6-双环杂芳基包括，但不限于，下式任一种：
在单环或双环杂芳基基团的任一个中，连接点可为任何碳或氮原子，只要化合价允许。
“部分不饱和”是指包含至少一个双键或三键的基团。术语“部分不饱和”旨在涵盖具有多个不饱和位点的环，但并不包括如本文所定义的芳族基(例如，芳基或杂芳基基团)。同样，“饱和”是指不包含双键或三键的基团，即全包含单键。
在一些实施方案中，本文所定义的脂族基团、烷基、烯基、炔基、碳环基、杂环基、芳基和杂芳基，为任选取代的(例如，“取代”或“未取代的”脂族基团，“取代”或“未取代的”烷基，“取代”或“未取代的”烯基，“取代”或“未取代的”炔基，“取代”或“未取代的”碳环基，“取代”或“未取代的”杂环基，“取代”或“未取代的”芳基或“取代”或“未取代的”杂芳基)。通常，术语“取代的”，不管其前面是否有术语“任选地”，是指基团(如碳或氮原子)上存在的至少一个氢被可允许的取代基代替，如其取代产生稳定化合物的取代基，所述化合物例如为不自发进行转化的化合物，所述转化例如为重排、环化、消除或其它反应。除非另外说明，“取代的”基团在该基团的一个或多个可取代的位置具有取代基，且当在任何给定结构中的多于一个位置被取代时，每个位置上的取代基相同或不同。术语“取代的”被认为包括被有机化合物所有可允许的取代基取代，包括导致形成稳定的化合物的任何本文所述的取代基。本发明考虑到任何以及所有的该组合以获得稳定化合物。为了本文的目的，例如氮的杂原子可具有氢取代基和/或如本文所述的任何合适的取代基，其满足杂原子的原子价并导致形成稳定部分。
示例性碳原子取代基包括，但不限于，卤素、-CN、-NO2、-N3、-SO2H、-SO3H、-OH、-ORaa、-ON(Rbb)2、-N(Rbb)2、-N(Rbb)3 +X、-N(ORcc)Rbb、-SH、-SRaa、-SSRCC、-C(＝O)Raa、-CO2H、-CHO、-C(ORcc)2、-CO2Raa、-OC(＝O)Raa、-OCO2Raa、-C(＝O)N(Rbb)2、-OC(＝O)N(Rbb)2、-NRbbC(＝O)Raa、-NRbbCO2Raa、-NRbbC(＝O)N(Rbb)2、-C(＝NRbb)Raa、-C(＝NRbb)ORaa、-OC(＝NRbb)Raa、-OC(＝NRbb)ORaa、-C(＝NRbb)N(Rbb)2、-OC(＝NRbb)N(Rbb)2、-NRbbC(＝NRbb)N(Rbb)2、-C(＝O)NRbbSO2Raa、-NRbbSO2Raa、-SO2N(Rbb)2、-SO2Raa、-SO2ORaa、-OSO2Raa、-S(＝O)Raa、-OS(＝O)Raa、-Si(Raa)3、-OSi(Raa)3-C(＝S)N(Rbb)2、-C(＝O)SRaa、-C(＝S)SRaa、-SC(＝S)SRaa、-SC(＝O)SRaa、-OC(＝O)SRaa、-SC(＝O)ORaa、-SC(＝O)Raa、-P(＝O)2Raa、-OP(＝O)2Raa、-P(＝O)(Raa)2、-OP(＝O)(Raa)2、-OP(＝O)(ORcc)2、-P(＝O)2N(Rbb)2、-OP(＝O)2N(Rbb)2、-P(＝O)(NRbb)2、-OP(＝O)(NRbb)2、-NRbbP(＝O)(ORcc)2、-NRbbP(＝O)(NRbb)2、-P(RCC)2、-P(RCC)3、-OP(Rcc)2、-OP(Rcc)3、-B(Raa)2、-B(ORcc)2、-BRaa(ORcc)、C1-10烷基、C1-10全卤代烷基、C2-10烯基、C2-10炔基、C3-10碳环基、3-14元杂环基、C6-14芳基和5-14元杂芳基，其中各个烷基、烯基、炔基、碳环基、杂环基、芳基和杂芳基独立地取代有0、1、2、3、4或5个Rdd基团；
或碳原子上的两个偕位氢被基团＝O、＝S、＝NN(Rbb)2、＝NNRbbC(＝O)Raa、＝NNRbbC(＝O)ORaa、＝NNRbbS(＝O)2Raa、＝NRbb、或＝NORcc替代；Raa的每种情况独立选自C1-10烷基、C1-10全卤代烷基、C2-10烯基、C2-10炔基、C3-10碳环基、3-14元杂环基、C6-14芳基和5-14元杂芳基，或两个Raa基团连接以形成3-14元杂环基或5-14元杂芳基环，其中各个烷基、烯基、炔基、碳环基、杂环基、芳基和杂芳基独立地取代有0、1、2、3、4或5个Rdd基团；
Rbb的每种情况独立选自氢、-OH、-ORaa、-N(RCC)2、-CN、-C(＝O)Raa、-C(＝O)N(Rcc)2、-CO2Raa、-SO2Raa、-C(＝NRcc)ORaa、-C(＝NRCC)N(RCC)2、-SO2N(Rcc)2、-SO2Rcc、-SO2ORcc、-SORaa、-C(＝S)N(RCC)2、-C(＝O)SRcc、-C(＝S)SRCC、-P(＝O)2Raa、-P(＝O)(Raa)2、-P(＝O)2N(Rcc)2、-P(＝O)(NRcc)2、C1-10烷基、C1-10全卤代烷基、C2-10烯基、C2-10炔基、C3-10碳环基、3-14元杂环基、C6-14芳基和5-14元杂芳基，或两个Rbb基团连接以形成3-14元杂环基或5-14元杂芳基环，其中各个烷基、烯基、炔基、碳环基、杂环基、芳基和杂芳基独立地取代有0、1、2、3、4或5个Rdd基团；
Rcc的每种情况独立选自氢、C1-10烷基、C1-10全卤代烷基、C2-10烯基、C2-10炔基、C3-10碳环基、3-14元杂环基、C6-14芳基和5-14元杂芳基，或两个Rcc基团连接以形成3-14元杂环基或5-14元杂芳基环，其中各个烷基、烯基、炔基、碳环基、杂环基、芳基和杂芳基独立地取代有0、1、2、3、4或5个Rdd基团；
Rdd的每种情况独立选自卤素、-CN、-NO2、-N3、-SO2H、-SO3H、-OH、-ORee、-ON(Rff)2、-N(Rff)2、-N(Rff)3 +X、-N(ORee)Rff、-SH、-SRee、-SSRee、-C(＝O)Ree、-CO2H、-CO2Ree、-OC(＝O)Ree、-OCO2Ree、-C(＝O)N(Rff)2、-OC(＝O)N(Rff)2、-NRffC(＝O)Ree、-NRffCO2Ree、-NRffC(＝O)N(Rff)2、-C(＝NRff)ORee、-OC(＝NRff)Ree、-OC(＝NRff)ORee、-C(＝NRff)N(Rff)2、-OC(＝NRff)N(Rff)2、-NRffC(＝NRff)N(Rff)2,-NRffSO2Ree、-SO2N(Rff)2、-SO2Ree、-SO2ORee、-OSO2Ree、-S(＝O)Ree、-Si(Ree)3、-OSi(Ree)3、-C(＝S)N(Rff)2、-C(＝O)SRee、-C(＝S)SRee、-SC(＝S)SRee、-P(＝O)2Ree、-P(＝O)(Ree)2、-OP(＝O)(Ree)2、-OP(＝O)(ORee)2、C1-6烷基、C1-6全卤代烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-10碳环基、3-10元杂环基、C6-10芳基、5-10元杂芳基，其中各个烷基、烯基、炔基、碳环基、杂环基、芳基和杂芳基独立地取代有0、1、2、3、4或5个Rgg基团，或两个偕位Rdd取代基可连接以形成＝O或＝S；
Ree的每种情况独立选自C1-6烷基、C1-6全卤代烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-10碳环基、C6-10芳基、3-10元杂环基和3-10元杂芳基，其中各个烷基、烯基、炔基、碳环基、杂环基、芳基和杂芳基独立地取代有0、1、2、3、4或5个Rgg基团；
Rff的每种情况独立选自氢、C1-6烷基、C1-6全卤代烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-10碳环基、3-10元杂环基、C1-6芳基和5-10元杂芳基，或两个Rff基团连接以形成3-14元杂环基或5-14元杂芳基环，其中各个烷基、烯基、炔基、碳环基、杂环基、芳基和杂芳基独立地取代有0、1、2、3、4或5个Rgg基团；且
Rgg的每种情况独立地为，卤素、-CN、-NO2、-N3、-SO2H、-SO3H、-OH、-O1-6烷基、-ON(C1-6烷基)2、-N(C1-6烷基)2、-N(C1-6烷基)3 +X-、-NH(C1-6烷基)2 +X-、-NH2(C1-6烷基)+X-、-NH3 +X、-N(OC1-6烷基)(C1-6烷基)、-N(OH)(C1-6烷基)、-NH(OH)、-SH、-S1-6烷基、-SS(C1-6烷基)、-C(＝O)(C1-6烷基)、-CO2H、-CO2(C1-6烷基)、-OC(＝O)(C1-6烷基)、-OCO2(C1-6烷基)、-C(＝O)NH2、-C(＝O)N(C1-6烷基)2、-OC(＝O)NH(C1-6烷基)、-NHC(＝O)(C1-6烷基)、-N(C1-6烷基)C(＝O)(C1-6烷基)、-NHCO2(C1-6烷基)、-NHC(＝O)N(C1-6烷基)2、-NHC(＝O)NH(C1-6烷基)、-NHC(＝O)NH2、-C(＝NH)O(C1-6烷基)、-OC(＝NH)(C1-6烷基)、-OC(＝NH)OC1-6烷基、-C(＝NH)N(C1-6烷基)2、-C(＝NH)NH(C1-6烷基)、-C(＝NH)NH2、-OC(＝NH)N(C1-6烷基)2、-OC(NH)NH(C1-6烷基)、-OC(NH)NH2、-NHC(NH)N(C1-6烷基)2、-NHC(＝NH)NH2、-NHSO2(C1-6烷基)、-SO2N(C1-6烷基)2、-SO2NH(C1-6烷基)、-SO2NH2,-SO2C1-6烷基、-SO2OC1-6烷基、-OSO2C1-6烷基、-SOC1-6烷基、-Si(C1-6烷基)3、-OSi(C1-6烷基)3-C(＝S)N(C1-6烷基)2、C(＝S)NH(C1-6烷基)、C(＝S)NH2、-C(＝O)S(C1-6烷基)、-C(＝S)SC1-6烷基、-SC(＝S)SC1-6烷基、-P(＝O)2(C1-6烷基)、-P(＝O)(C1-6烷基)2、-OP(＝O)(C1-6烷基)2、-OP(＝O)(OC1-6烷基)2、C1-6烷基、C1-6全卤代烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-10碳环基、C6-10芳基、3-10元杂环基、5-10元杂芳基；或两个偕位Rgg取代基可连接以形成＝O或＝S；其中X为抗衡离子。
“抗衡离子”或“阴离子抗衡离子”为与阳离子季氨基相缔合以保持电中性的带负电荷的基团。示例性的抗衡离子包括卤素离子(如F–、Cl–、Br–、I–)、NO3 –、ClO4 –、OH–、H2PO4 –、HSO4 –、SO4 –2、磺酸根离子(如甲磺酸根、三氟甲磺酸根、对甲苯磺酸根、苯磺酸根、10–樟脑磺酸根、萘–2–磺酸根、萘–1–磺酸–5–磺酸根、乙烷–1–磺酸–2–磺酸根等)和羧酸根离子(如醋酸根、乙酸根、丙酸根、苯甲酸根、甘油酸根、乳酸根、酒石酸根、羟乙酸根等)。
"卤代"或"卤素"是指氟(氟代、-F)、氯(氯代、-CI)、溴(溴代、-Br)、或碘(碘代、-I)。
只要化合价允许，氮原子可为取代或未取代的，且包括伯氮、仲氮、叔氮和季氮原子。示例性的氮原子取代基包括但不限于，氢、-OH、-ORaa、-N(RCC)2、-CN、-C(＝O)Raa、-C(＝O)N(Rcc)2、-CO2Raa、-SO2Raa、-C(＝NRbb)Raa、-C(＝NRcc)ORaa、-C(＝NRCC)N(RCC)2、-SO2N(Rcc)2、-SO2Rcc、-SO2ORcc、-SORaa、-C(＝S)N(RCC)2、-C(＝O)SRcc、-C(＝S)SRCC、-P(＝O)2Raa、-P(＝O)(Raa)2、-P(＝O)2N(Rcc)2、-P(＝O)(NRcc)2、C1-10烷基、C1-10全卤代烷基、C2-10烯基、C2-10炔基、C3-10碳环基、3-14元杂环基、C6-14芳基和5-14元杂芳基，或连接至氮原子的两个Rcc基团连接以形成3-14元杂环基或5-14元杂芳基环，其中各个烷基、烯基、炔基、碳环基、杂环基、芳基和杂芳基独立地取代有0、1、2、3、4或5个Rdd基团，且其中Raa、Rbb、Rcc和Rdd如上定义。
在某些实施方案中，氮原子上存在的取代基为氮保护基(也称为氨基保护基)。氮保护基包括，但不限于，-OH、-ORaa、-N(RCC)2、-C(＝O)Raa、-C(＝O)N(Rcc)2、-CO2Raa、-SO2Raa、-C(＝NRcc)Raa、-C(＝NRcc)ORaa、-C(＝NRCC)N(RCC)2、-SO2N(Rcc)2、-SO2Rcc、-SO2ORcc、-SORaa、-C(＝S)N(RCC)2、-C(＝O)SRcc、-C(＝S)SRCC、C1-10烷基{例如、芳烷基、杂芳烷基)、C2-10烯基、C2-10炔基、C3-10碳环基、3-14元杂环基、C6-14芳基和5-14元杂芳基基团，其中各个烷基、烯基、炔基、碳环基、杂环基、芳烷基、芳基和杂芳基独立地取代有0、1、2、3、4或5个R基团，且其中Raa、Rbb、Rcc和Rdd如本文所定义。氮保护基是本领域众所周知的且包括Protecting Groupsin Organic Synthesis,T.W.Greene and P.G.M.Wuts,第3版,John Wiley&Sons,1999中所述的那些，在此引入作为参考。
酰胺氮保护基(例如，-C(＝O)Raa)包括，但不限于，甲酰胺、乙酰胺、氯乙酰胺、三氯乙酰胺、三氟乙酰胺、苯基乙酰胺、3-苯基丙酰胺、吡啶酰胺、3-吡啶基甲酰胺、N-苯甲酰基苯基丙氨酰基衍生物、苯甲酰胺、对苯基苯甲酰胺、邻硝基苯基乙酰胺、邻硝基苯氧基乙酰胺、乙酰乙酰胺、(N'-二硫基苄基氧基酰基氨基)乙酰胺、3-{对-羟基苯基)丙酰胺、3-(邻-硝基苯基)丙酰胺、2-甲基-2-(邻硝基苯氧基)丙酰胺、2-甲基-2-(邻-苯偶氮基苯氧基)丙酰胺、4-氯丁酰胺、3-甲基-3-硝基丁酰胺、邻-硝基肉桂酰胺、N-乙酰基甲硫氨酸、邻硝基苯甲酰胺、和邻-(苯甲酰基氧基甲基)苯甲酰胺。
氨基甲酸酯氮保护基(例如，-C(＝O)ORaa)包括，但不限于，氨基甲酸甲基酯、氨基甲酸乙基酯、氨基甲酸9-芴基甲基酯(Fmoc)、氨基甲酸9-(2-磺基)芴基甲基酯、氨基甲酸9-(2,7-二溴)芴基甲基酯、氨基甲酸2,7-二-叔丁基-[9-(10,10-二氧代-10,10,10,10-四氢噻吨基)]甲基酯(DBD-Tmoc)、氨基甲酸4-甲氧基苯甲酰甲基酯(Phenoc)、氨基甲酸2,2,2-三氯乙基酯(Troc)、氨基甲酸2-三甲基甲硅烷基乙基酯(Teoc)、氨基甲酸2-苯基乙基酯(hZ)、氨基甲酸1-(1-金刚烷基)-1-甲基乙基酯(Adpoc)、氨基甲酸1,1-二甲基-2-卤代乙基酯、氨基甲酸1,1-二甲基-2,2-二溴乙基酯(DB-t-BOC)、氨基甲酸1,1-二甲基-2,2,2-三氯乙基酯(TCBOC)、氨基甲酸1-甲基-1-(4-联苯基)乙基酯(Bpoc)、氨基甲酸1-(3,5-二-叔丁基苯基)-1-甲基乙基酯(t-Bumeoc)、氨基甲酸2-(2’-和4’-吡啶基)乙基酯(Pyoc)、氨基甲酸2-(N,N-二环己基甲酰胺基)乙基酯、氨基甲酸叔丁基酯(BOC)、氨基甲酸1-金刚烷基酯(Adoc)、氨基甲酸乙烯基酯(Voc)、氨基甲酸烯丙基酯(Alloc)、氨基甲酸1-异丙基烯丙基酯(Ipaoc)、氨基甲酸肉桂基酯(Coc)、氨基甲酸4-硝基肉桂基酯(Noc)、氨基甲酸8-喹啉基酯、氨基甲酸N-羟基哌啶基酯、氨基甲酸烷基二硫基酯、氨基甲酸苄基酯(Cbz)、氨基甲酸对甲氧基苄基酯(Moz)、氨基甲酸对硝基苄基酯、氨基甲酸对溴苄基酯、氨基甲酸对氯苄基酯、氨基甲酸2,4-二氯苄基酯、氨基甲酸4-甲基亚磺酰基苄基酯(Msz)、氨基甲酸9-蒽基甲基酯、氨基甲酸二苯基甲基酯、氨基甲酸2-甲基硫基乙基酯、氨基甲酸2-甲基磺酰基乙基酯、氨基甲酸2-(对甲苯磺酰基)乙基酯、氨基甲酸[2-(1,3-二噻烷基)]甲基酯(Dmoc)、氨基甲酸4-甲基噻吩基酯(Mtpc)、氨基甲酸2,4-二甲基噻吩基酯(Bmpc)、氨基甲酸2-磷基乙基酯(Peoc)、氨基甲酸2-三苯基磷基异丙基酯(Ppoc)、氨基甲酸1,1-二甲基-2-氰基乙基酯、氨基甲酸间氯-对酰基氧基苄基酯、氨基甲酸对(二羟基硼基)苄基酯、氨基甲酸5-苯并异噁唑基甲基酯、氨基甲酸2-(三氟甲基)-6-色酮基甲基酯(Tcroc)、氨基甲酸间硝基苯基酯、氨基甲酸3,5-二甲氧基苄基酯、氨基甲酸邻硝基苄基酯、氨基甲酸3,4-二甲氧基-6-硝基苄基酯、氨基甲酸苯基(邻硝基苯基)甲基酯、氨基甲酸叔戊基酯、氨基硫代甲酸S-苄基酯、氨基甲酸对氰基苄基酯、氨基甲酸环丁基酯、氨基甲酸环己基酯、氨基甲酸环戊基酯、氨基甲酸环丙基甲基酯、氨基甲酸对癸基氧基苄基酯、氨基甲酸2,2-二甲氧基酰基乙烯基酯、氨基甲酸邻(N,N-二甲基甲酰胺基)苄基酯、氨基甲酸1,1-二甲基-3-(N,N-二甲基甲酰胺基)丙基酯、氨基甲酸1,1-二甲基丙炔基酯、氨基甲酸二(2-吡啶基)甲基酯、氨基甲酸2-呋喃基甲基酯、氨基甲酸2-碘乙基酯、氨基甲酸异冰片基酯、氨基甲酸异丁基酯、氨基甲酸异烟酰基酯、氨基甲酸p-(p’-甲氧基苯偶氮基)苄基酯、氨基甲酸1-甲基环丁基酯、氨基甲酸1-甲基环己基酯、氨基甲酸1-甲基-1-环丙基甲基酯、氨基甲酸1-甲基-1-(3,5-二甲氧基苯基)乙基酯、氨基甲酸1-甲基-1-(对苯偶氮基苯基)乙基酯、氨基甲酸1-甲基-1-苯基乙基酯、氨基甲酸1-甲基-1-(4-吡啶基)乙基酯、氨基甲酸苯基酯、氨基甲酸对(苯偶氮基)苄基酯、氨基甲酸2,4,6-三-叔丁基苯基酯、氨基甲酸4-(三甲基铵)苄基酯和氨基甲酸2,4,6-三甲基苄基酯。
磺酰胺氮保护基(例如，-S(＝O)2Raa)包括，但不限于，对甲苯磺酰胺(Ts)、苯磺酰胺、2,3,6,-三甲基-4-甲氧基苯磺酰胺(Mtr)、2,4,6-三甲氧基苯磺酰胺(Mtb)、2,6-二甲基-4-甲氧基苯磺酰胺(Pme)、2,3,5,6-四甲基-4-甲氧基苯磺酰胺(Mte)、4-甲氧基苯磺酰胺(Mbs)、2,4,6-三甲基苯磺酰胺(Mts)、2,6-二甲氧基-4-甲基苯磺酰胺(iMds)、2,2,5,7,8-五甲基色满-6-磺酰胺(Pmc)、甲烷磺酰胺(Ms)、β-三甲基甲硅烷基乙烷磺酰胺(SES)、9-蒽磺酰胺、4-(4’,8’-二甲氧基萘基甲基)苯磺酰胺(DNMBS)、苄基磺酰胺、三氟甲基磺酰胺和苯甲酰甲基磺酰胺。
其它氮保护基包括，但不限于，吩噻嗪基-(10)-酰基衍生物、N’-对甲苯磺酰基氨基酰基衍生物、N’-苯基氨基硫代酰基衍生物、N-苯甲酰基苯基丙氨酰基衍生物、N-乙酰基蛋氨酸衍生物、4,5-二苯基-3-噁唑啉-2-酮、N-邻苯二甲酰亚胺、N-二硫代琥珀酰亚胺(Dts)、N-2,3-二苯基马来酰亚胺、N-2,5-二甲基吡咯、N-1,1,4,4-四甲基二甲硅烷基氮杂环戊烷加合物(STABASE)、5-取代的1,3-二甲基-1,3,5-三氮杂环己-2-酮、5-取代的1,3-二苄基-1,3,5-三氮杂环己-2-酮、1-取代的3,5-二硝基-4-吡啶酮、N-甲基胺、N-烯丙基胺、N-[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲基胺(SEM)、N-3-乙酰氧基丙基胺、N-(1-异丙基-4-硝基-2-氧代-3-吡咯烷-3-基)胺、季铵盐、N-苄基胺、N-二(4-甲氧基苯基)甲基胺、N-5-二苯并环庚三烯基胺、N-三苯基甲基胺(Tr)、N-[(4-甲氧基苯基)二苯基甲基]胺(MMTr)、N-9-苯基芴基胺(PhF)、N-2,7-二氯-9-芴基亚甲基胺、N-二茂铁基甲基氨基(Fcm)、N-2-吡啶甲基氨基N’-氧化物、N-1,1-二甲基硫基亚甲基胺、N-亚苄基胺、N-对甲氧基亚苄基胺、N-二苯基亚甲基胺、N-[(2-吡啶基)基]亚甲基胺、N-(N’,N’-二甲基氨基亚甲基)胺、N,N’-亚异丙基二胺、N-对硝基亚苄基胺、N-亚水杨基胺、N-5-氯亚水杨基胺、N-(5-氯-2-羟基苯基)苯基亚甲基胺、N-亚环己基胺、N-(5,5-二甲基-3-氧代-1-环己烯基)胺、N-硼烷衍生物、N-二苯基硼酸衍生物、N-[苯基(五酰基铬-或钨)酰基]胺、N-铜螯合物、N-锌螯合物、N-硝基胺、N-亚硝胺、胺N-氧化物、二苯基膦酰胺(Dpp)、二甲基硫代膦酰胺(Mpt)、二苯基硫代膦酰胺(Ppt)、二烷基氨基磷酸酯、二苄基氨基磷酸酯、二苯基氨基磷酸酯、苯亚磺酰胺、邻硝基苯亚磺酰胺(Nps)、2,4-二硝基苯亚磺酰胺、五氯苯亚磺酰胺、2-硝基-4-甲氧基苯亚磺酰胺、三苯基甲基亚磺酰胺和3-硝基吡啶亚磺酰胺(Npys)。
在一些实施方案中，存在于氧原子上的取代基为氧保护基(也称作羟基保护基)。氧保护基包括，但不限于，-Raa、-N(Rbb)2、-C(＝O)SRaa、-C(＝O)Raa、-CO2Raa、-C(＝O)N(Rbb)2、-C(＝NRbb)Raa、-C(＝NRbb)ORaa、-C(＝NRbb)N(Rbb)2、-S(＝O)Raa、-SO2Raa、-Si(Raa)3、-P(RCC)2、-P(RCC)3、-P(＝O)2Raa、-P(＝O)(Raa)2、-P(＝O)(ORcc)2、-P(＝O)2N(Rbb)2和-P(＝O)(NRbb)2，其中Raa、Rbb和Rcc如本文所定义。氧保护基是本领域中公知的且包括在ProtectingGroups in Organic Synthesis，T.W.Greene和P.G.M.Wuts，第3版，John Wiley&Sons，1999中详细描述的那些，将该文献通过参考引入本文中。
示例性的氧保护基包括，但不限于，甲基、甲氧基甲基(MOM)、甲基硫基甲基(MTM)、叔丁基硫基甲基、(苯基二甲基甲硅烷基)甲氧基甲基(SMOM)、苄基氧基甲基(BOM)、对甲氧基苄基氧基甲基(PMBM)、(4-甲氧基苯氧基)甲基(对-AOM)、愈创木酚甲基(GUM)、叔丁氧基甲基、4-戊烯基氧基甲基(POM)、甲硅烷氧基甲基、2-甲氧基乙氧基甲基(MEM)、2,2,2-三氯乙氧基甲基、二(2-氯乙氧基)甲基、2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基甲基(SEMOR)、四氢吡喃基(THP)、3-溴代四氢吡喃基、四氢噻喃基、1-甲氧基环己基、4-甲氧基四氢吡喃基(MTHP)、4-甲氧基四氢噻喃基、4-甲氧基四氢噻喃基S,S-二氧化物、1-[(2-氯-4-甲基)苯基]-4-甲氧基哌啶-4-基(CTMP)、1,4-二噁烷-2-基、四氢呋喃基、四氢噻吩基、2,3,3a,4,5,6,7,7a-八氢-7,8,8-三甲基-4,7-甲桥苯并呋喃(methanobenzofuran)-2-基、1-乙氧基乙基、1-(2-氯乙氧基)乙基、1-甲基-1-甲氧基乙基、1-甲基-1-苄基氧基乙基、1-甲基-1-苄基氧基-2-氟乙基、2,2,2-三氯乙基、2-三甲基甲硅烷基乙基、2-(苯基氢硒基)乙基、叔丁基、烯丙基、对氯苯基、对甲氧基苯基、2,4-二硝基苯基、苄基(Bn)、对甲氧基苄基、3,4-二甲氧基苄基、邻硝基苄基、对硝基苄基、对卤代苄基、2,6-二氯苄基、对氰基苄基、对苯基苄基、2-吡啶甲基、4-吡啶甲基、3-甲基-2-吡啶甲基N-氧化物、二苯基甲基、p,p’-二硝基二苯甲基、5-二苯并环庚三烯基、三苯基甲基、α-萘基二苯基甲基、对甲氧基苯基二苯基甲基、二(对甲氧基苯基)苯基甲基、三(对甲氧基苯基)甲基、4-(4′-溴代苯甲酰基氧基苯基)二苯基甲基、4,4′,4″-三(4,5-二氯苯二酰亚氨基苯基)甲基、4,4′,4″-三(乙酰丙酰基氧基苯基)甲基、4,4′,4″-三(苯甲酰基氧基苯基)甲基、3-(咪唑-1-基)二(4′,4″-二甲氧基苯基)甲基、1,1-二(4-甲氧基苯基)-1′-芘基甲基、9-蒽基、9-(9-苯基)吨基、9-(9-苯基-10-氧代)蒽基、1,3-苯并二硫杂噻吩(disulfuran)-2-基、苯并异噻唑基S,S-二氧化物、三甲基甲硅烷基(TMS)、三乙基甲硅烷基(TES)、三异丙基甲硅烷基(TIPS)、二甲基异丙基甲硅烷基(IPDMS)、二乙基异丙基甲硅烷基(DEIPS)、二甲基己基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)、叔丁基二苯基甲硅烷基(TBDPS)、三苄基甲硅烷基、三-对二甲苯基甲硅烷基、三苯基甲硅烷基、二苯基甲基甲硅烷基(DPMS)、叔丁基甲氧基苯基甲硅烷基(TBMPS)、甲酸酯、苯甲酰基甲酸酯、乙酸酯、氯乙酸酯、二氯乙酸酯、三氯乙酸酯、三氟乙酸酯、甲氧基乙酸酯、三苯基甲氧基乙酸酯、苯氧基乙酸酯、对氯苯氧基乙酸酯、3-苯基丙酸酯、4-戊酮酸酯(乙酰丙酸酯)、4,4-(亚乙基二硫基)戊酸酯(乙酰丙酰基二硫缩醛)、新戊酸酯、金刚酸酯、巴豆酸酯、4-甲氧基巴豆酸酯、苯甲酸酯、对苯基苯甲酸酯、2,4,6-三甲基苯甲酸酯(酸酯(mesitoate))、叔丁基碳酸酯(BOC)、烷基甲基碳酸酯、9-芴基甲基碳酸酯(Fmoc)、烷基乙基碳酸酯、烷基2,2,2-三氯乙基碳酸酯(Troc)、2-(三甲基甲硅烷基)乙基碳酸酯(TMSEC)、2-(苯基磺酰基)乙基碳酸酯(Psec)、2-(三苯基磷基)乙基碳酸酯(Peoc)、烷基异丁基碳酸酯、烷基乙烯基碳酸酯、烷基烯丙基碳酸酯、烷基对硝基苯基碳酸酯、烷基苄基碳酸酯、烷基对甲氧基苄基碳酸酯、烷基3,4-二甲氧基苄基碳酸酯、烷基邻硝基苄基碳酸酯、烷基对硝基苄基碳酸酯、烷基S-苄基硫代碳酸酯、4-乙氧基-1-萘基碳酸酯、甲基二硫代碳酸酯、2-碘代苯甲酸酯、4-叠氮基丁酸酯、4-硝基-4-甲基戊酸酯、邻-(二溴甲基)苯甲酸酯、2-甲酰基苯磺酸酯、2-(甲基硫基甲氧基)乙基、4-(甲基硫基甲氧基)丁酸酯、2-(甲基硫基甲氧基甲基)苯甲酸酯、2,6-二氯-4-甲基苯氧基乙酸酯、2,6-二氯-4-(1,1,3,3-四甲基丁基)苯氧基乙酸酯、2,4-二(1,1-二甲基丙基)苯氧基乙酸酯、氯二苯基乙酸酯、异丁酸酯、单琥珀酸酯、(E)-2-甲基-2-丁烯酸酯、o-(甲氧基酰基)苯甲酸酯、α-萘甲酸酯、硝酸酯、烷基N,N,N’,N’-四甲基磷酰二胺酯(phosphorodiamidate)、烷基N-苯基氨基甲酸酯、硼酸酯、二甲基膦基亚硫酰基、烷基2,4-二硝基苯基次磺酸酯、硫酸酯、甲烷磺酸酯(甲磺酸酯)、苄基磺酸酯和甲苯磺酸酯(Ts)。
在某些实施方案中，存在于硫原子上的取代基为硫保护基(也称作硫醇保护基)。硫保护基包括，但不限于，-Raa、-N(Rbb)2、-C(＝O)SRaa、-C(＝O)Raa、-CO2Raa、-C(＝O)N(Rbb)2、-C(＝NRbb)Raa、-C(＝NRbb)ORaa、-C(＝NRbb)N(Rbb)2、-S(＝O)Raa、-SO2Raa、-Si(Raa)3-P(RCC)2、-P(RCC)3、-P(＝O)2Raa、-P(＝O)(Raa)2、-P(＝O)(ORcc)2、-P(＝O)2N(Rbb)2和-P(＝O)(NRbb)2，其中Raa、Rbb和Rcc如本文所定义。硫保护基是本领域中公知的并且包括在Protecting Groups in Organic Synthesis，T.W.Greene和P.G.M.Wuts，第3版，JohnWiley&Sons，1999中详细描述的那些，将该文献通过参考引入本文中。
如本文所用，“离去基团”或“LG”是本领域中理解的术语，指在异裂键断裂时与一对电子分离的分子片段，其中分子片段是阴离子或中性分子。参见，例如，Smith，MarchAdvanced Organic Chemistry第6版(501-502)。合适的离去基团的实例包括但不限于卤素(例如氯、溴或碘)、烷氧基羰基氧基、芳基氧基羰基氧基、烷基磺酰基氧基、芳基磺酰基氧基、烷基-羰基氧基(例如、乙酰氧基)、芳基羰基氧基、芳基氧基、甲氧基、N,O-二甲基羟基氨基、9-苯基氧杂蒽基(pixyl，9-phenylxanthyl)、卤代甲酸酯基、-NO2、三烷基铵和芳基碘鎓盐。在一些实施方案中，离去基团是磺酸酯基。在一些实施方案中，磺酸酯基包括式-OSO2RLG1，其中RLG1选自任选取代的烷基、任选取代的烯基、任选取代的杂烷基、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基、任选取代的芳烷基和任选取代的杂芳基烷基。在一些实施方案中，RLGl为取代或未取代的C1-C6烷基。在一些实施方案中，R LGl为甲基。在一些实施方案，RLGl为取代或未取代的芳基。在一些实施方案中，R LGl为取代的或未取代的苯基。在一些实施方案中，R LGl为：
在一些情况下，离去基团为甲苯磺酸酯基(甲苯磺酸酯基，Ts)，甲烷磺酸酯基(甲磺酸酯基，Ms)，对溴苯磺酰基(对溴苯磺酸酯基，Bs)，或三氟甲烷磺酸酯基(三氟甲磺酸酯基，Tf)。在一些情况下，离去基团为对溴苯磺酸酯基(对溴苯磺酰基)。在一些情况下，离去基团为硝基苯磺酸基(2-硝基苯磺酰基)。在一些实施方案中，所述离去基团为含磺酸酯基的基团。在一些实施方案中，所述离去基团为甲苯磺酸酯基。离去基团也可为氧化膦(例如，Mitsunobu反应中形成)或内部离去基团如环氧化物或环状硫酸酯基。
在实施例和权利要求中更详细地描述了这些和其他示例性取代基。本公开内容不旨在通过上述取代基的示例性列表以任何方式进行限制。
“药学上可接受的盐”是指那些在合理的医学判断范围内适用于与人和其它动物的组织接触而没有过多毒性、刺激、过敏反应等，且与合理的利益/风险比相称的盐。药学上可接受的盐是本领域熟知的。例如，Berge等人在J.Pharmaceutical Sciences(1977)66:1–19中详细描述了药学上可接受的盐。本发明化合物的药学上可接受的盐包括衍生自适当的无机和有机酸和无机和有机碱的那些。药学上可接受的无毒酸加成盐的实例是氨基与无机酸(例如盐酸、氢溴酸、磷酸、硫酸和高氯酸)或与有机酸(例如乙酸、草酸、马来酸、酒石酸、柠檬酸、琥珀酸或丙二酸)形成的盐或使用本领域使用的其他方法(例如离子交换)形成的盐。其他药学上可接受的盐包括己二酸盐、海藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、硫酸氢盐、硼酸盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、环戊丙酸盐、葡糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、甲酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、甘油磷酸盐、双葡糖酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、氢碘酸盐、2-羟基-乙磺酸盐、乳糖酸盐、乳酸盐、月桂酸盐、月桂基硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、扑酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、对甲苯磺酸盐、十一酸盐、戊酸盐等。衍生自适当的碱的盐包括碱金属盐、碱土金属盐、铵盐和N+(C1-4烷基)4 -盐。代表性的碱金属或碱土金属盐包括钠盐、锂盐、钾盐、钙盐、镁盐等。当合适时，其他药学上可接受的盐包括季铵盐。
本发明提供I型PRMT抑制剂。在一个实施方案中，所述I型PRMT抑制剂为式(I)的化合物:
或其药学上可接受的盐，
其中
X为N，Z为NR4，且Y为CR5；或
X为NR4，Z为N，且Y为CR5；或
X为CR5，Z为NR4，且Y为N；或
X为CR5，Z为N，且Y为NR4；
RX为任选取代的C1-4烷基或任选取代的C3-4环烷基；
L1为键、-O-、-N(RB)-、-S-、-C(O)-、-C(O)O-、-C(O)S-、-C(O)N(RB)-、-C(O)N(RB)N(RB)-、-OC(O)-、-OC(O)N(RB)-、-NRBC(O)-、-NRBC(O)N(RB)-、-NRBC(O)N(RB)N(RB)-、-NRBC(O)O-、-SC(O)-、-C(＝NRB)-、-C(＝NNRB)-、-C(＝NORA)-、-C(＝NRB)N(RB)-、-NRBC(＝NRB)-、-C(S)-、-C(S)N(RB)-、-NRBC(S)-、-S(O)-、-OS(O)2-、-S(O)2O-、-SO2-、-N(RB)SO2-、-SO2N(RB)-、或任选取代的C1-6饱和或不饱和烃链，其中该烃链的一个或多个亚甲基单元任选且独立被以下替代：-O-、-N(RB)-、-S-、-C(O)-、-C(O)O-、-C(O)S-、-C(O)N(RB)-、-C(O)N(RB)N(RB)-、-OC(O)-、-OC(O)N(RB)-、-NRBC(O)-、-NRBC(O)N(RB)-、-NRBC(O)N(RB)N(RB)-、-NRBC(O)O-、-SC(O)-、-C(＝NRB)-、-C(＝NNRB)-、-C(＝NORA)-、-C(＝NRB)N(RB)-、-NRBC(＝NRB)-、-C(S)-、-C(S)N(RB)-、-NRBC(S)-、-S(O)-、-OS(O)2-、-S(O)2O-、-SO2-、-N(RB)SO2-、或-SO2N(RB)-；
各个RA独立地选自氢、任选取代的烷基、任选取代的烯基、任选取代的炔基、任选取代的碳环基、任选取代的杂环基、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基、连接至氧原子时的氧保护基和连接至硫原子时的硫保护基；
各个RB独立地选自氢、任选取代的烷基、任选取代的烯基、任选取代的炔基、任选取代的碳环基、任选取代的杂环基、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基和氮保护基，或相同氮原子上的RB和RW可与介于其中间的氮一起形成任选取代的杂环；
RW为氢、任选取代的烷基、任选取代的烯基、任选取代的炔基、任选取代的碳环基、任选取代的杂环基、任选取代的芳基、或任选取代的杂芳基；条件是当L1为键时，RW不为氢、任选取代的芳基、或任选取代的杂芳基；
R3为氢、C1-4烷基、或C3-4环烷基；
R4为氢、任选取代的C1-6烷基、任选取代的C2-6烯基、任选取代的C2-6炔基、任选取代的C3-7环烷基、任选取代的4-至7-元杂环基；或任选取代的C1-4烷基-Cy；
Cy为任选取代的C3-7环烷基、任选取代的4-至7-元杂环基、任选取代的芳基、或任选取代的杂芳基；且
R5为氢、卤素、-CN、任选取代的C1-4烷基、或任选取代的C3-4环烷基。在一方面，R3为C1-4烷基。在一方面，R3为甲基。在一方面，R4为氢。在一方面，R5为氢。在一方面，L1为键。
在一个实施方案中，所述I型PRMT抑制剂为式(I)的化合物，其中-L1-RW为任选取代的碳环基。在一方面，R3为C1-4烷基。在一方面，R3为甲基。在另一方面，R4为氢。在一方面，R5为氢。在一方面，L1为键。
在一个实施方案中，所述I型PRMT抑制剂为式(V)的化合物
或其药学上可接受的盐，其中环A为任选取代的碳环基、任选取代的杂环基、任选取代的芳基、或任选取代的杂芳基。在一方面，环A为任选取代的碳环基。在一方面，R3为C1-4烷基。在一方面，R3为甲基。在一方面，Rx为未取代的C1-4烷基。在一方面，Rx为甲基。在一方面，L1为键。
在一个实施方案中，所述I型PRMT抑制剂为式(VI)的化合物
或其药学上可接受的盐。在一方面，环A为任选取代的碳环基。在一方面，R3为C1-4烷基。在一方面，R3为甲基。在一方面，Rx为未取代的C1-4烷基。在一方面，Rx为甲基。
在一个实施方案中，所述I型PRMT抑制剂为式(II)的化合物:
或其药学上可接受的盐。在一方面，-L1-RW为任选取代的碳环基。在一方面，R3为C1-4烷基。在一方面，R3为甲基。在一方面，Rx为未取代的C1-4烷基。在一方面，Rx为甲基。在一方面，R4为氢。
在一个实施方案中，所述I型PRMT抑制剂为化合物A:
或其药学上可接受的盐。化合物A和制备化合物A的方法公开于PCT/US2014/029710，至少在第171页(化合物158)和在第266页，第[00331]段。
在一个实施方案中，所述I型PRMT抑制剂为化合物A-三-HCl，其为化合物A的三HCl盐形式。在另一实施方案中，所述I型PRMT抑制剂为化合物A-单-HCl，其为化合物A的单-HCl盐形式。在另一实施方案中，所述I型PRMT抑制剂为化合物A-游离碱，其为化合物A的游离碱形式。在另一实施方案中，所述I型PRMT抑制剂为化合物A-二-HCl，其为化合物A的二-HCl盐形式。
在一个实施方案中，所述I型PRMT抑制剂为化合物D:
或其药学上可接受的盐。
I型PRMT抑制剂进一步公开于PCT/US2014/029710，将其在此引入作为参考。示例性I型PRMT抑制剂公开于PCT/US2014/029710的表1A和表1B，且制备I型PRMT抑制剂的方法描述于PCT/US2014/029710的至少第226页第[00274]段至第328页第[00050]段。
本发明还提供II型PRMT抑制剂。在一个实施方案中，所述II型PRMT抑制剂为式(III)的化合物:
或其药学上可接受的盐,
其中
表示单键或双键；
R1为氢、Rz或-C(O)Rz，其中Rz为任选取代的C1-6烷基；
L为-N(R)C(O)-、-C(O)N(R)-、-N(R)C(O)N(R)-、-N(R)C(O)O-、或-OC(O)N(R)-；
各个R独立地为氢或任选取代的C1-6脂族基团；
Ar为具有0-4个独立选自氮、氧和硫的杂原子的单环或双环芳环，其中Ar取代有0、1、2、3、4或5个Ry基团，只要化合价允许；
各个Ry独立地选自卤素、-CN、-NO2、任选取代的脂族基团、任选取代的碳环基、任选取代的芳基、任选取代的杂环基、任选取代的杂芳基、-ORA、-N(RB)2、-SRA、-C(＝O)RA、-C(O)ORA、-C(O)SRA、-C(O)N(RB)2、-C(O)N(RB)N(RB)2、-OC(O)RA、-OC(O)N(RB)2、-NRBC(O)RA、-NRBC(O)N(RB)2、-NRBC(O)N(RB)N(RB)2、-NRBC(O)ORA、-SC(O)RA、-C(＝NRB)RA、-C(＝NNRB)RA、-C(＝NORA)RA、-C(＝NRB)N(RB)2、-NRBC(＝NRB)RB、-C(＝S)RA、-C(＝S)N(RB)2、-NRBC(＝S)RA、-S(O)RA、-OS(O)2RA、-SO2RA、-NRBSO2RA或-SO2N(RB)2；
各个RA独立地选自氢、任选取代的脂族基团、任选取代的碳环基、任选取代的杂环基、任选取代的芳基和任选取代的杂芳基；
各个RB独立地选自氢、任选取代的脂族基团、任选取代的碳环基、任选取代的杂环基、任选取代的芳基和任选取代的杂芳基，或两个RB基团与介于它们之间的原子一起形成任选取代的杂环；
R5、R6、R7和R8独立地为氢、卤素或任选取代的脂族基团；
各个RX独立地选自卤素、-CN、任选取代的脂族基团、-OR'和-N(R")2；
R'为氢或任选取代的脂族基团；
各个R"独立地为氢或任选取代的脂族基团，或两个R"与介于它们之间的原子一起形成杂环；且
n为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，只要化合价允许。
在一方面，L为-C(O)N(R)-。在一方面，R1为氢。在一方面，n为0。
在一个实施方案中，所述II型PRMT抑制剂为式(IV)的化合物:
或其药学上可接受的盐。在一方面，至少一个Ry为–NHRB。在一方面，RB为任选取代的环烷基。
在一个实施方案中，所述II型PRMT抑制剂为式(VII)的化合物:
或其药学上可接受的盐。在一方面，L为-C(O)N(R)-。在一方面，R1为氢。在一方面，n为0。
在一个实施方案中，所述II型PRMT抑制剂为式(VIII)的化合物:
或其药学上可接受的盐。在一方面，L为-C(O)N(R)-。在一方面，R1为氢。在一方面，n为0。
在一个实施方案中，所述II型PRMT抑制剂为式(IX)的化合物:
或其药学上可接受的盐。
在一个实施方案中，所述II型PRMT抑制剂为化合物B：
或其药学上可接受的盐。
在一个实施方案中，所述II型PRMT抑制剂为式(X)的化合物:
或其药学上可接受的盐。在一方面，Ry为–NHRB。在一方面，RB为任选取代的杂环基。
在某些实施方案中，所述II型PRMT抑制剂为式(XI)的化合物:
或其药学上可接受的盐，其中X为–C(RXC)2-，–O-、-S-、或-NRXN-，其中RXC的每种情况独立地为氢、任选取代的烷基、任选取代的碳环基、任选取代的杂环基、任选取代的芳基、或任选取代的杂芳基；RXN独立地为氢、任选取代的烷基、任选取代的碳环基、任选取代的杂环基、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基、-C(＝O)RXA，或氮保护基；RXA为任选取代的烷基、任选取代的碳环基、任选取代的杂环基、任选取代的芳基、或任选取代的杂芳基。
在一个实施方案中，所述II型PRMT抑制剂为化合物C：
或其药学上可接受的盐。化合物C和制备化合物C的方法公开于PCT/US2013/077235，至少在141页(化合物208)和291页，第[00464]段至第294页，第[00469]段。
在另一实施方案中，所述II型PRMT抑制剂为化合物E:
或其药学上可接受的盐。
在另一实施方案中，所述II型PRMT抑制剂为化合物F:
或其药学上可接受的盐。
II型PRMT抑制剂进一步公开于PCT/US2013/077235和PCT/US2015/043679，将其引入参考。示例性II型PRMT抑制剂公开于PCT/US2013/077235的表1A、表1B、表1C、表1D、表1E、表1F和表1G，制备II型PRMT抑制剂的方法至少描述于PCT/US2013/077235的第239页第[00359]段至第301页第[00485]段。II型PRMT抑制剂或PRMT5抑制剂的其它非限制性实例公开于以下公开的专利申请：WO2011/079236、WO2014/100695、WO2014/100716、WO2014/100730、WO2014/100764和WO2014/100734、和美国临时申请号62/017,097和62/017,055。这些专利申请的通式和具体化合物在此引入作为参考且可如本文所述用于治疗癌症。在一些实施方案中，所述II型PRMT抑制剂为核酸(例如，siRNA)。对PRMT5的siRNAs描述于例如MolCancer Res.2009Apr；7(4)：557-69，和Biochem J.2012Sep 1；446(2):235-41。
在一个实施方案中，提供I型蛋白质精氨酸甲基转移酶(I型PRMT)抑制剂和II型蛋白质精氨酸甲基转移酶(II型PRMT)抑制剂的组合。在一方面，I型PRMT抑制剂为蛋白质精氨酸甲基转移酶1(PRMT1)抑制剂、蛋白质精氨酸甲基转移酶3(PRMT3)抑制剂、蛋白质精氨酸甲基转移酶4(PRMT4)抑制剂、蛋白质精氨酸甲基转移酶6(PRMT6)抑制剂、或蛋白质精氨酸甲基转移酶8(PRMT8)抑制剂。在一方面，II型PRMT抑制剂为蛋白质精氨酸甲基转移酶5(PRMT5)抑制剂或蛋白质精氨酸甲基转移酶9(PRMT9)抑制剂。在另一方面，I型PRMT抑制剂为式I、II、V或VI的化合物。在一方面，I型PRMT抑制剂为化合物A。在另一方面，I型PRMT抑制剂为化合物D。在一方面，II型PRMT抑制剂为式III、IV、VII、VIII、IX、X或XI的化合物。在另一方面，II型PRMT抑制剂为化合物B。在一方面，II型PRMT抑制剂为化合物C。在一个实施方案中，提供化合物A和化合物C的组合。
在另一实施方案中，提供在需要的人中治疗癌症的方法，所述方法包括向人施用I型PRMT抑制剂和II型PRMT抑制剂的组合，以及以下至少一种：药学上可接受的载体和药学上可接受的稀释剂，从而治疗人的癌症。在一方面，I型PRMT抑制剂为蛋白质精氨酸甲基转移酶1(PRMT1)抑制剂、蛋白质精氨酸甲基转移酶3(PRMT3)抑制剂、蛋白质精氨酸甲基转移酶4(PRMT4)抑制剂、蛋白质精氨酸甲基转移酶6(PRMT6)抑制剂、或蛋白质精氨酸甲基转移酶8(PRMT8)抑制剂。在一方面，II型PRMT抑制剂为蛋白质精氨酸甲基转移酶5(PRMT5)抑制剂或蛋白质精氨酸甲基转移酶9(PRMT9)抑制剂。在一方面，I型PRMT抑制剂为式I、II、V或VI的化合物。在一方面，I型PRMT抑制剂为化合物A。在另一方面，I型PRMT抑制剂为化合物D。在一方面，II型PRMT抑制剂为式III、IV、VII、VIII、IX、X或XI的化合物。在另一方面，II型PRMT抑制剂为化合物B。在一方面，II型PRMT抑制剂为化合物C。在一个实施方案中，提供在需要的人中治疗癌症的方法，所述方法包括向人施用化合物A和化合物C的组合，以及以下至少一种：药学上可接受的载体和药学上可接受的稀释剂，从而治疗人的癌症。
在另一实施方案中，提供包含治疗有效量的I型蛋白质精氨酸甲基转移酶(I型PRMT)抑制剂和第二药物组合物的药物组合物，该第二药物组合物包含治疗有效量的II型蛋白质精氨酸甲基转移酶(II型PRMT)抑制剂。在一方面，I型PRMT抑制剂为蛋白质精氨酸甲基转移酶1(PRMT1)抑制剂、蛋白质精氨酸甲基转移酶3(PRMT3)抑制剂、蛋白质精氨酸甲基转移酶4(PRMT4)抑制剂、蛋白质精氨酸甲基转移酶6(PRMT6)抑制剂、或蛋白质精氨酸甲基转移酶8(PRMT8)抑制剂。在一方面，II型PRMT抑制剂为蛋白质精氨酸甲基转移酶5(PRMT5)抑制剂或蛋白质精氨酸甲基转移酶9(PRMT9)抑制剂。在另一方面，I型PRMT抑制剂为式I、II、V或VI的化合物。在一方面，I型PRMT抑制剂为化合物A。在另一方面，I型PRMT抑制剂为化合物D。在一方面，II型PRMT抑制剂为式III、IV、VII、VIII、IX、X或XI的化合物。在另一方面，II型PRMT抑制剂为化合物B。在一方面，II型PRMT抑制剂为化合物C。在一个实施方案中，提供包含治疗有效量的化合物A的药物组合物和包含治疗有效量的化合物C的第二药物组合物。
在另一实施方案中，提供I型PRMT抑制剂和II型PRMT抑制剂的组合在制备药物中的用途。在一个实施方案中，提供I型PRMT抑制剂和II型PRMT抑制剂的组合用于治疗癌症的用途。在一方面，I型PRMT抑制剂为蛋白质精氨酸甲基转移酶1(PRMT1)抑制剂、蛋白质精氨酸甲基转移酶3(PRMT3)抑制剂、蛋白质精氨酸甲基转移酶4(PRMT4)抑制剂、蛋白质精氨酸甲基转移酶6(PRMT6)抑制剂、或蛋白质精氨酸甲基转移酶8(PRMT8)抑制剂。在一方面，II型PRMT抑制剂为蛋白质精氨酸甲基转移酶5(PRMT5)抑制剂或蛋白质精氨酸甲基转移酶9(PRMT9)抑制剂。在另一方面，I型PRMT抑制剂为式I、II、V或VI的化合物。在一方面，I型PRMT抑制剂为化合物A。在另一方面，I型PRMT抑制剂为化合物D。在一方面，II型PRMT抑制剂为式III、IV、VII、VIII、IX、X或XI的化合物。在另一方面，II型PRMT抑制剂为化合物B。在一方面，II型PRMT抑制剂为化合物C。在一个实施方案中，提供化合物A和化合物C的组合在制备药物中的用途。
在一个实施方案中，提供包含I型PRMT抑制剂和II型PRMT抑制剂的产品，其作为组合制剂用于在用药中同时、分开或相继使用。在一方面，I型PRMT抑制剂为蛋白质精氨酸甲基转移酶1(PRMT1)抑制剂、蛋白质精氨酸甲基转移酶3(PRMT3)抑制剂、蛋白质精氨酸甲基转移酶4(PRMT4)抑制剂、蛋白质精氨酸甲基转移酶6(PRMT6)抑制剂、或蛋白质精氨酸甲基转移酶8(PRMT8)抑制剂。在一方面，II型PRMT抑制剂为蛋白质精氨酸甲基转移酶5(PRMT5)抑制剂或蛋白质精氨酸甲基转移酶9(PRMT9)抑制剂。在另一方面，I型PRMT抑制剂为式I、II、V或VI的化合物。在一方面，I型PRMT抑制剂为化合物A。在另一方面，I型PRMT抑制剂为化合物D。在一方面，II型PRMT抑制剂为式III、IV、VII、VIII、IX、X或XI的化合物。在另一方面，II型PRMT抑制剂为化合物B。在一方面，II型PRMT抑制剂为化合物C。在一个实施方案中，提供包含化合物A和化合物C的产品，其作为组合制剂用于在用药中同时、分开或相继使用。
在另一实施方案中，提供包含I型PRMT抑制剂和II型PRMT抑制剂的产品，其作为组合制剂用于同时、分开或相继使用以治疗人受试者的癌症。在一方面，I型PRMT抑制剂为蛋白质精氨酸甲基转移酶1(PRMT1)抑制剂、蛋白质精氨酸甲基转移酶3(PRMT3)抑制剂、蛋白质精氨酸甲基转移酶4(PRMT4)抑制剂、蛋白质精氨酸甲基转移酶6(PRMT6)抑制剂、或蛋白质精氨酸甲基转移酶8(PRMT8)抑制剂。在一方面，II型PRMT抑制剂为蛋白质精氨酸甲基转移酶5(PRMT5)抑制剂或蛋白质精氨酸甲基转移酶9(PRMT9)抑制剂。在另一方面，I型PRMT抑制剂为式I、II、V或VI的化合物。在一方面，I型PRMT抑制剂为化合物A。在另一方面，I型PRMT抑制剂为化合物D。在一方面，II型PRMT抑制剂为式III、IV、VII、VIII、IX、X或XI的化合物。在另一方面，II型PRMT抑制剂为化合物B。在一方面，II型PRMT抑制剂为化合物C。在一个实施方案中，提供包含化合物A和化合物C的产品，其作为组合制剂用于同时、分开或相继使用以治疗人受试者的癌症。
在另一实施方案中，提供包含I型PRMT抑制剂和II型PRMT抑制剂的产品，其作为组合制剂用于同时、分开或相继使用以治疗人受试者的癌症，其中所述癌症为黑素瘤，乳腺癌，淋巴瘤，三阴性乳腺癌(TNBC)，或膀胱癌。在一方面，I型PRMT抑制剂为蛋白质精氨酸甲基转移酶1(PRMT1)抑制剂、蛋白质精氨酸甲基转移酶3(PRMT3)抑制剂、蛋白质精氨酸甲基转移酶4(PRMT4)抑制剂、蛋白质精氨酸甲基转移酶6(PRMT6)抑制剂、或蛋白质精氨酸甲基转移酶8(PRMT8)抑制剂。在一方面，II型PRMT抑制剂为蛋白质精氨酸甲基转移酶5(PRMT5)抑制剂或蛋白质精氨酸甲基转移酶9(PRMT9)抑制剂。在另一方面，I型PRMT抑制剂为式I、II、V或VI的化合物。在一方面，I型PRMT抑制剂为化合物A。在另一方面，I型PRMT抑制剂为化合物D。在一方面，II型PRMT抑制剂为式III、IV、VII、VIII、IX、X或XI的化合物。在另一方面，II型PRMT抑制剂为化合物B。在一方面，II型PRMT抑制剂为化合物C。在一个实施方案中，提供包含化合物A和化合物C的产品，其作为组合制剂用于同时、分开或相继使用以治疗人受试者的癌症，其中所述癌症为黑素瘤、乳腺癌、淋巴瘤、三阴性乳腺癌(TNBC)、或膀胱癌。
在一个实施方案中，提供在需要的人中治疗癌症的方法，所述方法包括向人施用治疗有效量的包含I型PRMT抑制剂的药物组合物和包含II型PRMT抑制剂的药物组合物，从而治疗人的癌症。在一方面，I型PRMT抑制剂为蛋白质精氨酸甲基转移酶1(PRMT1)抑制剂、蛋白质精氨酸甲基转移酶3(PRMT3)抑制剂、蛋白质精氨酸甲基转移酶4(PRMT4)抑制剂、蛋白质精氨酸甲基转移酶6(PRMT6)抑制剂、或蛋白质精氨酸甲基转移酶8(PRMT8)抑制剂。在一方面，II型PRMT抑制剂为蛋白质精氨酸甲基转移酶5(PRMT5)抑制剂或蛋白质精氨酸甲基转移酶9(PRMT9)抑制剂。在另一方面，I型PRMT抑制剂为式I、II、V或VI的化合物。在一方面，I型PRMT抑制剂为化合物A。在另一方面，I型PRMT抑制剂为化合物D。在一方面，II型PRMT抑制剂为式III、IV、VII、VIII、IX、X或XI的化合物。在另一方面，II型PRMT抑制剂为化合物B。在一方面，II型PRMT抑制剂为化合物C。
在本文任一个实施方案中，I型PRMT抑制剂和II型PRMT抑制剂以选自以下的途径给药于患者：同时、相继、以任何顺序、全身、口服、静脉内和瘤内。在一方面，该I型PRMT抑制剂和/或II型PRMT抑制剂口服给药。在一方面，该I型PRMT抑制剂和II型PRMT抑制剂以约1:1的比例给药。
在本文实施方案任一个的一方面，所述癌症为实体瘤或血液癌症。在一方面，为黑素瘤、乳腺癌、淋巴瘤或膀胱癌。
在一方面，癌症选自头颈癌、乳腺癌、肺癌、结肠癌、卵巢癌、前列腺癌、神经胶质瘤、成胶质细胞瘤、星形细胞瘤、多形性成胶质细胞瘤、Bannayan-Zonana综合征、考登病、Lhermitte-Duclos疾病、炎性乳腺癌、威尔姆斯肿瘤、尤因肉瘤、横纹肌肉瘤、室管膜瘤、成神经管细胞瘤、肾癌、肝癌、黑素瘤、胰腺癌、肉瘤、骨肉瘤、骨的巨细胞肿瘤、甲状腺癌、成淋巴细胞性T细胞白血病、慢性髓细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、毛细胞白血病、急性成淋巴细胞性白血病、急性骨髓性白血病、AML、慢性中性粒细胞性白血病、急性成淋巴细胞性T细胞白血病、浆细胞瘤、成免疫细胞性大细胞白血病、套细胞白血病、多发性骨髓瘤、巨核细胞性白血病、多发性骨髓瘤、急性巨核细胞性白血病、前髓细胞性白血病、红白血病、恶性淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、成淋巴细胞性T细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、成神经细胞瘤、膀胱癌、尿路上皮癌、外阴癌、子宫颈癌、子宫内膜癌、肾癌、间皮瘤、食管癌、唾液腺癌、肝细胞癌、胃癌、鼻咽癌(nasopharangeal cancer)、颊癌(buccalcancer)、口腔癌(cancer of the mouth)、GIST(胃肠道间质瘤)、和睾丸癌。
在一方面，本发明的方法进一步包括向所述人给药至少一种肿瘤药物。
在一方面所述人具有实体瘤。在一方面，肿瘤选自头颈癌、胃癌、黑素瘤、肾细胞癌(RCC)、食管癌、非小细胞肺癌、前列腺癌、结肠直肠癌、卵巢癌和胰腺癌。在另一方面所述人具有液体肿瘤如弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、多发性骨髓瘤、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、滤泡性淋巴瘤、急性骨髓性白血病和慢性髓细胞性白血病。
本发明还涉及治疗或减轻选自以下的癌症的严重性的方法：脑(神经胶质瘤)、成胶质细胞瘤、Bannayan-Zonana综合征、考登病、Lhermitte-Duclos疾病、乳腺癌、炎性乳腺癌、威尔姆斯肿瘤、尤因肉瘤、横纹肌肉瘤、室管膜瘤、成神经管细胞瘤、结肠、头与颈、肾、肺、肝、黑素瘤、卵巢、胰腺、前列腺、肉瘤、骨肉瘤、骨的巨细胞肿瘤、甲状腺、成淋巴细胞性T-细胞白血病、慢性髓细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、毛细胞白血病、急性成淋巴细胞性白血病、急性骨髓性白血病、慢性中性粒细胞性白血病、急性成淋巴细胞性T-细胞白血病、浆细胞瘤、成免疫细胞性大细胞白血病、套细胞白血病、多发性骨髓瘤、巨核细胞性白血病、多发性骨髓瘤、急性巨核细胞性白血病、前髓细胞性白血病、红白血病、恶性淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、成淋巴细胞性T细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、成神经细胞瘤、膀胱癌、尿路上皮癌、肺癌、外阴癌、子宫颈癌、子宫内膜癌、肾癌、间皮瘤、食管癌、唾液腺癌、肝细胞癌、胃癌、鼻咽癌、颊癌、口腔癌、GIST(胃肠道间质瘤)和睾丸癌。
本发明所用术语“治疗”及其语法变化形式是指治疗性治疗。在提到特定病症时，治疗意味着(1)改善或预防病症或该病症的一种或多种生物学表现；(2)干扰(a)引发或造成该病症的生物级联中的一个或多个点或(b)病症的一种或多种生物学表现；(3)缓解与病症或其治疗相关的一种或多种症状、效应或副作用；或(4)延缓病症的发展或该病症的一种或多种生物学表现。从而也能推想预防性治疗。技术人员将会意识到，“预防”不是绝对的术语。在医学中，“预防”被理解为是指药物的预防性给药，以基本上降低病症或其生物学表现的可能性或严重性，或延迟该病症或其生物学表现的发生。例如当认为受试者是处于发展为癌症的高风险时，预防性治疗是适当的(例如当受试者具有极强的癌症家族病史或当受试者暴露于致癌物质时)。
如本发明所用，术语“癌症”、“赘生物”和“肿瘤”可以单数或复数形式互换使用，是指经历恶性转化使其变为对宿主生物体具有病理性的细胞。可以通过成熟的技术，特别是组织学检查，容易地将原发性癌细胞与非癌细胞区分开来。如本发明所用的癌细胞的定义不仅包括原发性癌细胞，还包括衍生自前驱癌细胞的任何细胞。这包括转移的癌细胞，以及衍生自癌细胞的体外培养物和细胞系。当提及通常表现为实体瘤的癌症类型时，“临床可检测”的肿瘤是基于肿瘤块可检测到的肿瘤；例如，通过诸如计算机断层摄影(CT)扫描、磁共振成像(MRI)、X射线、超声或物理检查触诊的程序，和/或由于可检测到从患者获得的样品中一种或多种癌症特异性抗原的表达。肿瘤可能是造血性(或血液学或血液或血液相关的)癌症，例如衍生自血细胞或免疫细胞的癌症，其可被称为“液体肿瘤”。基于血液肿瘤的临床病症的具体实例包括：白血病，如慢性髓细胞性白血病、急性髓细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病和急性淋巴细胞性白血病；浆细胞恶性肿瘤，如多发性骨髓瘤、MGUS和瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症；淋巴瘤，如非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤；等等。
癌症可以是其中存在异常数量的母细胞或不期望的细胞增殖或被诊断为造血系统癌症(包括淋巴性和骨髓性恶性肿瘤)的任何癌症。骨髓性恶性肿瘤包括但不限于：急性骨髓性(或髓细胞性或骨髓性或成髓细胞性)白血病(未分化或分化的)、急性早幼粒细胞(或早幼粒细胞性或前髓细胞性或前髓母细胞性)白血病、急性骨髓单核细胞性(或骨髓单核母细胞性)白血病、急性单核细胞性(或单核母细胞性)白血病、红细胞白血病和巨核细胞性(或巨核母细胞性)白血病。这些白血病可以一起称为急性骨髓性(或髓细胞性或骨髓性的)白血病(AML)。骨髓恶性肿瘤还包括骨髓增生性疾病(MPD)，其包括但不限于：慢性骨髓性(或髓细胞性)白血病(CML)、慢性骨髓单核细胞性白血病(CMML)、原发性血小板增多症(或血小板增多症)和真性红细胞增多症(PCV)。骨髓恶性肿瘤还包括：骨髓发育不良(或骨髓增生异常综合征或MDS)，其可被称为难治性贫血(RA)、具有过量母细胞的难治性贫血(RAEB)以及具有过量转化中的母细胞的难治性贫血(RAEBT)；以及伴有或不伴有原因不明性髓样化生的骨髓纤维化(MFS)。
造血系统癌症还包括淋巴恶性病，其会影响淋巴结、脾脏、骨髓、外周血和/或结外位点。淋巴癌包括B细胞恶性病，包括但不限于B细胞非霍奇金淋巴瘤(B-NHL)。B-NHL可以是无痛的(或低度)、中度(或侵袭性)或高度(高侵袭性)。无痛B细胞淋巴瘤包括：滤泡性淋巴瘤(FL)；小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)；边缘区淋巴瘤(MZL)，包括结节MZL、结外MZL、脾MZL和具有绒毛状淋巴细胞的脾MZL；淋巴浆细胞性淋巴瘤(LPL)；以及粘膜相关淋巴样组织(MALT或结外边缘区)淋巴瘤。中度B-NHL包括：涉及或不涉及白血病的套细胞性淋巴瘤(MCL)、弥漫性大细胞淋巴瘤(DLBCL)、滤泡性大细胞(或3级或3B级)淋巴瘤和原发性纵隔淋巴瘤(PML)。高度B-NHL包括伯基特淋巴瘤(BL)、伯基特样淋巴瘤、小无裂细胞淋巴瘤(SNCCL)和成淋巴细胞性淋巴瘤。其它B-NHL包括免疫母细胞性淋巴瘤(或免疫细胞瘤)、原发性渗出性淋巴瘤、HIV相关(或AIDS相关)的淋巴瘤和移植后淋巴增生性病症(PTLD)或淋巴瘤。B细胞恶性病还包括但不限于：慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、幼淋巴细胞性白血病(PLL)、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症(WM)、毛细胞白血病(HCL)、大颗粒淋巴细胞性(LGL)白血病、急性淋巴性(或淋巴细胞性或成淋巴细胞性)白血病和卡斯尔曼氏病。NHL还可包括：T细胞非霍奇金淋巴瘤(T-NHL)，其包括但不限于未列名(NOS)的T细胞非霍奇金淋巴瘤、外周T细胞淋巴瘤(PTCL)、间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)、血管免疫母细胞性淋巴样病(AILD)、鼻腔型自然杀伤(NK)细胞/T细胞淋巴瘤、/淋巴瘤、皮肤型T细胞淋巴瘤、蕈样肉芽肿和塞扎里综合征(Sezary syndrome)。
造血系统癌症还包括霍奇金淋巴瘤(或疾病)，其包括典型霍奇金淋巴瘤,结节硬化型霍奇金淋巴瘤,混合细胞型霍奇金淋巴瘤,淋巴细胞主导型(LP)霍奇金淋巴瘤,结节LP霍奇金淋巴瘤和淋巴细胞缺乏型霍奇金淋巴瘤。造血系统癌症还包括浆细胞疾病或癌症，如多发性骨髓瘤(MM)，其包括郁积型MM,意义未确定(或未知或未明)的单克隆丙种球蛋白病(MGUS),浆细胞瘤(骨,髓外),淋巴浆细胞性淋巴瘤(LPL),瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症,浆细胞白血病和原发性淀粉样变性病(AL)。造血系统癌症还可包括其它造血细胞的其它癌症，包括多形核白细胞(或中性粒细胞),嗜碱性粒细胞,嗜酸性粒细胞,树突状细胞,血小板,红细胞和自然杀伤细胞。包括造血细胞的组织在本发明中被称为“造血细胞组织”，其包括骨髓；外周血；胸腺；和外周淋巴组织，诸如脾脏、淋巴结、与粘膜相关的淋巴组织(例如与肠相关淋巴组织)、扁桃体、派伊尔淋巴集结和阑尾，以及与其他粘膜相关的淋巴组织，例如支气管内衬。
如本文所用，术语“化合物A2”是指I型PRMT抑制剂。在一些实施方案中，化合物A2为式I、II、V或VI的化合物。适当地，化合物A2为化合物A。
如本文所用，术语“化合物B2”是指I型PRMT抑制剂。在一些实施方案中，化合物B2为式III、IV、VII、VIII、IX、X或XI的化合物。适当地，化合物B2为化合物C。
适当地，本发明的组合“在规定的期间内”给药。
如本文所使用的术语“规定的期间(specified period)”及其语法变形，表示给药化合物A2和化合物B2中的一种以及给药化合物A2和化合物B2中的另一种之间的时间间隔。除非另有说明，规定的期间可以包括同时给药。除非另有说明，规定的期间是指在一天内给药化合物A2和化合物B2。
适当地，如果在“规定的期间”内给药所述化合物而不同时给药，它们均可以在彼此相隔约24小时内给药–在该情况中，所述规定的期间将为约24小时；适当地，它们均可以在彼此相隔约12小时内给药–在该情况中，所述规定的期间将为约12小时；适当地，它们均可以在彼此相隔约11小时内给药–在该情况中，所述规定的期间将为约11小时；适当地，它们均可以在彼此相隔约10小时内给药–在该情况中，所述规定的期间将为约10小时；适当地，它们均可以在彼此相隔约9小时内给药–在该情况中，所述规定的期间将为约9小时；适当地，它们均可以在彼此相隔约8小时内给药–在该情况中，所述规定的期间将为约8小时；适当地，它们均可以在彼此相隔约7小时内给药–在该情况中，所述规定的期间将为约7小时；适当地，它们均可以在彼此相隔约6小时内给药–在该情况中，所述规定的期间将为约6小时；适当地，它们均可以在彼此相隔约5小时内给药–在该情况中，所述规定的期间将为约5小时；适当地，它们均可以在彼此相隔约4小时内给药–在该情况中，所述规定的期间将为约4小时；适当地，它们均可以在彼此相隔约3小时内给药–在该情况中，所述规定的期间将为约3小时；适当地，它们可以在彼此相隔约2小时内给药–在该情况中，所述规定的期间将为约2小时；适当地，它们均可以在彼此相隔约1小时内给药–在该情况中，所述规定的期间将为约1小时。如本发明所使用的，化合物A2和化合物B2的给药相隔小于约45分钟被认为是同时给药。
适当地，当本发明的组合以一段“规定的期间”给药时，各化合物共同给药一段“持续时间”。
如本发明所使用的术语“持续时间”及其语法变形，表示本发明的两种化合物连续给药指定数目的天数。除非另有说明，连续的天数不必须是在治疗起点开始或治疗终点结束，它只需要在治疗过程中的某时间点出现连续的天数。
关于“规定的期间”给药：适当地，两种化合物在规定的期间内给药至少一天–在该情况中，所述持续时间为至少一天；适当地，在治疗过程中，两种化合物在规定的期间内给药至少连续3天–在该情况中，所述持续时间为至少3天；适当地，在治疗过程中，两种化合物在规定的期间内给药至少连续5天–在该情况中，所述持续时间为至少5天；适当地，在治疗过程中，两种化合物在规定的期间内给药至少连续7天–在该情况中，所述持续时间为至少7天；适当地，在治疗过程中，两种化合物在规定的期间内给药至少连续14天–在该情况中，所述持续时间为至少14天；适当地，在治疗过程中，两种化合物在规定的期间内给药至少连续30天–在该情况中，所述持续时间为至少30天。
适当地，如果所述化合物“不历经规定的期间内(during a specifiled period)”给药，那么它们就是顺序给药。如本发明所使用的术语“顺序给药”及其语法变形，表示每天给药一次化合物A2和化合物B2中的一种，连续两天或更多天，接着每天给药一次化合物A2和化合物B2中的另一种，连续两天或更多天。同样地，本发明还包括在顺序给药化合物A2和化合物B2中的一种以及给药化合物A2和化合物B2中的另一种之间所使用的休药期。如本发明所使用的，休药期为在顺序给药化合物A2和化合物B2中的一种之后和在给药化合物A2和化合物B2中的另一种之前不给药化合物A2也不给药化合物B2的间隔天数。休药期为选自以下的一段天数：1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天和14天。
关于顺序给药(sequential administration)：适当地，给药化合物A2和化合物B2中的一种连续1至30天，接着是任选的休药期，接着给药化合物A2和化合物B2中的另一种连续1至30天。适当地，给药化合物A2和化合物B2中的一种连续1至21天，接着是任选的休药期，接着给药化合物A2和化合物B2中的另一种连续1至21天。适当地，给药化合物A2和化合物B2中的一种连续1至14天，接着是1至14天的休药期，接着给药化合物A2和化合物B2中的另一种连续1至14天。适当地，给药化合物A2和化合物B2中的一种连续1至7天，接着是1至10天的休药期，接着给药化合物A2和化合物B2中的另一种连续1至7天。
适当地，在该顺序中化合物B2首先给药，接着是任选的休药期，接着给药化合物A2。适当地，给药化合物B2连续3至21天，接着是任选的休药期，接着给药化合物A2连续3至21天。适当地，给药化合物B2连续3至21天，接着是1至14天的休药期，接着给药化合物A2连续3至21天。适当地，给药化合物B2连续3至21天，接着是3至14天的休药期，接着给药化合物A2连续3至21天。适当地，给药化合物B2连续21天，接着是任选的休药期，接着给药化合物A2连续14天。适当地，给药化合物B2连续14天，接着是1至14天的休药期，接着给药化合物A2连续14天。适当地，给药化合物B2连续7天，接着是3至10天的休药期，接着给药化合物A2连续7天。适当地，给药化合物B2连续3天，接着是3至14天的休药期，接着给药化合物A2连续7天。适当地，给药化合物B2连续3天，接着是3至10天的休药期，接着给药化合物A2连续3天。
应当理解，“规定的期间”给药和“顺序”给药之后可以为重复给药(dosing)或者可以接着交替的给药方案，休药期可以在重复给药或交替的给药方案之前。
本发明的方法还可以与其他治疗癌症的治疗方法一起使用。
化合物A2和化合物B2可以通过任何适合的途径给药。合适的途径包括经口、经直肠、经鼻、局部(包括含服(buccal)和舌下)、瘤内、经阴道和肠胃外(包括皮下、肌内、静脉内、真皮内、鞘内和硬膜外)。可以理解优选途径可随着例如该组合的受试者的状况和所治疗的癌症而变化。还可以理解所施用的各个药物可以通过相同或不同的途径给药，化合物A2和化合物B2可以一起配制成药物组合物/制剂。
在一个实施方案中，本发明的组合中的一种或多种成分静脉内给药。在一个实施方案中，本发明的组合中的一种或多种成分口服给药。在另一实施方案中，本发明的组合中的一种或多种成分经瘤内给药。在另一实施方案中，本发明的组合中的一种或多种成分全身性给药，如静脉内，以及本发明组合中的一种或多种其它成分经瘤内给药。在该实施方案的任一者中，如在此段中，本发明的各成分作为一种或多种药物组合物给药。
典型地，在本发明中，对所治疗的易感肿瘤具有活性的任何抗肿瘤剂都可以在癌症治疗中被共同施用。该药物的实例可以在Cancer Principles and Practice ofOncology by V.T.Devita，T.S.Lawrence，和S.A.Rosenberg(编辑)，第10版(2014年12月5日)，Lippincott Williams&Wilkins Publishers中找到。本领域普通技术人员将能够基于药物的特定特征和所涉及的癌症来辨别可使用哪些药物组合。可用于本发明的典型的抗肿瘤剂包括但不限于：抗微管或抗有丝分裂剂如二萜和长春花生物碱；铂配位络合物；烷化剂如氮芥、氧氮磷环类(oxazaphosphorine)、烷基磺酸酯、亚硝基脲和三氮烯；抗生素如放线菌素、蒽环类和博来霉素；拓扑异构酶I抑制剂如喜树碱；拓扑异构酶II抑制剂如表鬼臼毒素；抗代谢物如嘌呤和嘧啶类似物和抗叶酸化合物；激素和激素类似物；信号转导途径抑制剂；非受体酪氨酸激酶血管生成抑制剂；免疫治疗剂；促凋亡剂；细胞周期信号转导抑制剂；蛋白酶体抑制剂；热休克蛋白抑制剂；癌症代谢抑制剂；和癌症基因治疗剂如基因修饰的T细胞。
用于与本发明方法或组合联合或共同施用的其他活性成分的实例是抗肿瘤剂。抗肿瘤剂的实例包括但不限于化学治疗剂；免疫调控剂(immuno-modulatory agent)；免疫调节剂(immune-modulator)；和免疫刺激佐剂。
实施例
以下实施例示出本发明的多个非限制性方面。
实施例1
精氨酸甲基化和PRMT
精氨酸甲基化是对参与多种细胞过程的蛋白质的重要翻译后修饰，例如基因调控、RNA加工、DNA损伤应答和信号转导。含有甲基化精氨酸的蛋白质存在于细胞核和胞质组分中，这表明催化甲基转移到精氨酸上的酶也存在于这些亚细胞腔隙中(综述于Yang,Y.&Bedford,M.T.Protein arginine methyltransferases and cancer.Nat Rev Cancer13,37-50,doi:10.1038/nrc3409(2013)；Lee,Y.H.&Stallcup,M.R.Minireview:proteinarginine methylation of nonhistone proteins in transcriptional regulation.MolEndocrinol23,425-433,doi:10.1210/me.2008-0380(2009))。在哺乳动物细胞中，甲基化精氨酸以三种主要形式存在：ω-NG-单甲基-精氨酸(MMA)、ω-NG,NG-不对称二甲基精氨酸(ADMA)或ω-NG,N’G-对称的二甲基精氨酸(SDMA)。每种甲基化状态都可以以不同方式影响蛋白质-蛋白质相互作用，因此有可能为底物的生物活性赋予不同的功能性后果(Yang,Y.&Bedford,M.T.Protein arginine methyltransferases and cancer.Nat Rev Cancer13,37-50,doi:10.1038/nrc3409(2013))。
精氨酸甲基化主要在富含甘氨酸、精氨酸(GAR)基序的情况下通过蛋白质精氨酸甲基转移酶(PRMT)家族的活性发生，所述蛋白质精氨酸甲基转移酶将甲基从S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)转移至底物精氨酸侧链，产生S-腺苷-高半胱氨酸(SAH)和甲基化精氨酸(图1)。该蛋白质家族由10个成员组成，其中9个已被证明具有酶活性(Bedford,M.T.&Clarke,S.G.Protein arginine methylation in mammals:who,what,and why.Mol Cell33,1-13,doi:10.1016/j.molcel.2008.12.013(2009))。根据酶促反应的产物，PRMT家族分为四种亚型(I-IV型)(图1)。IV型酶甲基化内部胍基氮并且仅在酵母中描述(Fisk,J.C.&Read,L.K.Protein arginine methylation in parasitic protozoa.Eukaryot Cell10,1013-1022,doi:10.1128/EC.05103-11(2011))；I-III型酶通过单一甲基化事件产生单甲基-精氨酸(MMA，Rme1)。MMA中间体被认为是相对低丰度的中间体，然而，PRMT7的主要III型活性的选择底物可以保持单甲基化，而I型和II型酶分别催化从MMA向不对称二甲基精氨酸(ADMA，Rme2a)或对称的二甲基精氨酸(SDMA，Rme2s)的进展。II型PRMT包括PRMT5和PRMT9，然而，PRMT5是负责形成对称二甲基化的主要酶。I型酶包括PRMT1、PRMT3、PRMT4、PRMT6和PRMT8。PRMT1、PRMT3、PRMT4和PRMT6普遍表达，而PRMT8主要限于脑(综述于Bedford,M.T.&Clarke,S.G.Protein arginine methylation in mammals:who,what,and why.MolCell33,1-13,doi:10.1016/j.molcel.2008.12.013(2009))。
PRMT1是主要的1型酶，能够在许多细胞底物上催化MMA和ADMA的形成(Bedford,M.T.&Clarke,S.G.Protein arginine methylation in mammals:who,what,and why.MolCell33,1-13,doi:10.1016/j.molcel.2008.12.013(2009))。在许多情况下，PRMT1依赖性ADMA修饰是其底物的生物活性和运输所必需的(Nicholson,T.B.,Chen,T.&Richard,S.Thephysiological and pathophysiological role of PRMT1-mediated protein argininemethylation.Pharmacol Res60,466-474,doi:10.1016/j.phrs.2009.07.006(2009))，且PRMT1的活性占细胞ADMA水平的～85％(Dhar,S.等人，Loss of the major Type Iarginine methyltransferase PRMT1causes substrate scavenging by otherPRMTs.Sci Rep3,1311,doi:10.1038/srep01311(2013)；Pawlak,M.R.,Scherer,C.A.,Chen,J.,Roshon,M.J.&Ruley,H.E.Arginine N-methyltransferase 1is required forearly postimplantation mouse development,but cells deficient in the enzymeare viable.Mol Cell Biol20,4859-4869(2000))。PRMT1的完全敲除导致许多底物中MMA的显著增加，表明PRMT1的主要生物学功能是将MMA转化为ADMA，而其他PRMT可以建立和维持MMA(Dhar,S.等人，Loss of the major Type I arginine methyltransferasePRMT1causes substrate scavenging by other PRMTs.Sci Rep3,1311,doi:10.1038/srep01311(2013))。此外，在PRMT1丢失时SDMA水平增加，这可能是ADMA损失和MMA相应增加的结果，MMA可作为产生SDMA的II型PRMT的底物。I型PRMT的抑制可能通过ADMA的丧失、MMA的增加、或者转换为与SDMA相关的不同甲基化模式而导致底物功能改变(Dhar,S.等人，Loss of the major Type I arginine methyltransferase PRMT1causes substratescavenging by other PRMTs.Sci Rep3,1311,doi:10.1038/srep01311(2013))。
小鼠中Prmt1基因座的破坏导致早期胚胎致死，并且纯合胚胎未能发育超过E6.5，表明PRMT1在正常发育中的需要(Pawlak,M.R.,Scherer,C.A.,Chen,J.,Roshon,M.J.&Ruley,H.E.Arginine N-methyltransferase 1is required for earlypostimplantation mouse development,but cells deficient in the enzyme areviable.Mol Cell Biol20,4859-4869(2000)；Yu,Z.,Chen,T.,Hebert,J.,Li,E.&Richard,S.A mouse PRMT1null allele defines an essential role for arginine methylationin genome maintenance and cell proliferation.Mol Cell Biol29,2982-2996,doi:10.1128/MCB.00042-09(2009))。需要条件或组织特异性敲除以更好地理解PRMT1在成人中的作用。源自Prmt1缺失小鼠的小鼠胚胎成纤维细胞经历生长停滞，多倍化，染色体不稳定性和与DNA损伤应答蛋白MRE11的低甲基化相关的自发DNA损伤，表明PRMT1在基因组维持和细胞增殖中的作用(Yu,Z.,Chen,T.,Hebert,J.,Li,E.&Richard,S.A mouse PRMT1nullallele defines an essential role for arginine methylation in genomemaintenance and cell proliferation.Mol Cell Biol29,2982-2996,doi:10.1128/MCB.00042-09(2009))。PRMT1蛋白和mRNA可以在广泛的胚胎和成体组织中检测到，与其作为负责大多数细胞精氨酸甲基化的酶的功能一致。尽管PRMT本身可以进行翻译后修饰并与相互作用的调节蛋白相关，但PRMT1保留基础活性而无需进行额外修饰(综述于Yang,Y.&Bedford,M.T.Protein arginine methyltransferases and cancer.Nat Rev Cancer13,37-50,doi:10.1038/nrc3409(2013))。
PRMT1和癌症
PRMT1的错误调节和过表达与许多实体和造血系统癌症有关(Yang,Y.&Bedford,M.T.Protein arginine methyltransferases and cancer.Nat Rev Cancer13,37-50,doi:10.1038/nrc3409(2013)；Yoshimatsu,M.等人，Dysregulation of PRMT1and PRMT6,Type I arginine methyltransferases,is involved in various types of humancancers.Int J Cancer128,562-573,doi:10.1002/ijc.25366(2011))。PRMT1与癌症生物学之间的联系主要是通过调节相关底物上发现的精氨酸残基的甲基化(图2)。在几种肿瘤类型中，PRMT1可以通过组蛋白H4的甲基化驱动异常致癌程序的表达(Takai,H.等人，5-Hydroxymethylcytosine plays a critical role in glioblastomagenesis byrecruiting the CHTOP-methylosome complex.Cell Rep9,48-60,doi:10.1016/j.celrep.2014.08.071(2014)；Shia,W.J.等人，PRMT1interacts with AML1-ETO topromote its transcriptional activation and progenitor cell proliferativepotential.Blood119,4953-4962,doi:10.1182/blood-2011-04-347476(2012)；Zhao,X.等人，Methylation of RUNX1by PRMT1abrogates SIN3A binding and potentiates itstranscriptional activity.Genes Dev22,640-653,doi:10.1101/gad.1632608(2008),以及通过其对非组蛋白底物的活性驱动异常致癌程序的表达(Wei,H.,Mundade,R.,Lange,K.C.&Lu,T.Protein arginine methylation of non-histone proteins and its rolein diseases.Cell Cycle13,32-41,doi:10.4161/cc.27353(2014))。在许多这些实验系统中，其底物的PRMT1依赖性ADMA修饰的破坏降低了癌细胞的增殖能力(Yang,Y.&Bedford,M.T.Protein arginine methyltransferases and cancer.Nat Rev Cancer13,37-50,doi:10.1038/nrc3409(2013))。
一些研究已将PRMT1与血液和实体肿瘤的发展联系起来。PRMT1通过MLL和AML1-ETO融合等关键驱动因子的甲基化与白血病发展相关，导致致癌途径的激活(Shia,W.J.等人，PRMT1interacts with AML1-ETO to promote its transcriptional activation andprogenitor cell proliferative potential.Blood119,4953-4962,doi:10.1182/blood-2011-04-347476(2012)；Cheung,N.et al.Targeting Aberrant Epigenetic NetworksMediated by PRMT1and KDM4C in Acute Myeloid Leukemia.Cancer Cell29,32-48,doi:10.1016/j.ccell.2015.12.007(2016))。来自表达AML1-ETO的小鼠的骨髓细胞中PRMT1的敲低抑制了克隆形成，证明了PRMT1维持该模型的白血病表型的关键要求(Shia,W.J.等人，PRMT1interacts with AML1-ETO to promote its transcriptional activation andprogenitor cell proliferative potential.Blood119,4953-4962,doi:10.1182/blood-2011-04-347476(2012))。PRMT1也是MLL融合复合物的一个组成部分，促进与H4R3甲基化相关的异常转录激活，并且PRMT1的敲低可以抑制MLL-EEN介导的造血干细胞转化(Cheung,N.,Chan,L.C.,Thompson,A.,Cleary,M.L.&So,C.W.Protein arginine-methyltransferase-dependent oncogenesis.Nat Cell Biol9,1208-1215,doi:10.1038/ncb1642(2007))。在乳腺癌患者中，发现PRMT1的高表达与较短的无疾病存活期和具有晚期组织学分级的肿瘤相关(Mathioudaki,K.et al.Clinical evaluation of PRMT1geneexpression in breast cancer.Tumour Biol32,575-582,doi:10.1007/s13277-010-0153-2(2011))。为此，PRMT1已参与促进转移和癌细胞侵袭(Gao,Y.等人，The dualfunction of PRMT1in modulating epithelial-mesenchymal transition and cellularsenescence in breast cancer cells through regulation of ZEB1.Sci Rep6,19874,doi:10.1038/srep19874(2016)；Avasarala,S.等人，PRMT1Is a Novel Regulator ofEpithelial-Mesenchymal-Transition in Non-small Cell Lung Cancer.J BiolChem290,13479-13489,doi:10.1074/jbc.M114.636050(2015))，且PRMT1介导的雌激素受体α(ERα)甲基化可以增强生长促进信号转导途径。即使在存在抗雌激素的情况下，这种甲基化驱动机制也可为乳腺癌细胞提供生长优势(Le Romancer,M.等人，Regulation ofestrogen rapid signaling through arginine methylation by PRMT1.Mol Cell31,212-221,doi:10.1016/j.molcel.2008.05.025(2008))。此外，PRMT1通过调节同源重组和非同源末端连接DNA修复途径来促进基因组稳定性和对DNA损伤剂的抗性(Boisvert,F.M.,Rhie,A.,Richard,S.&Doherty,A.J.The GAR motif of 53BP1is arginine methylatedby PRMT1and is necessary for 53BP1DNA binding activity.Cell Cycle4,1834-1841,doi:10.4161/cc.4.12.2250(2005)；Boisvert,F.M.,Dery,U.,Masson,J.Y.&Richard,S.Arginine methylation of MRE11by PRMT1is required for DNA damage checkpointcontrol.Genes Dev19,671-676,doi:10.1101/gad.1279805(2005))。因此，PRMT1的抑制可能使癌症对DNA损伤因子敏感，特别是在DNA修复机制可能受突变影响的肿瘤中(如乳腺癌中的BRCA1)(O'Donovan,P.J.&Livingston,D.M.BRCA1and BRCA2:breast/ovarian cancersusceptibility gene products and participants in DNA double-strand breakrepair.Carcinogenesis31,961-967,doi:10.1093/carcin/bgq069(2010))。总之，这些观察结果证明了PRMT1在肿瘤生物学的临床相关方面的关键作用，并提出了探索与例如促进DNA损伤的治疗相结合的理论基础。
RNA结合蛋白和剪接机制是PRMT1底物的主要类别，并且通过其生物学功能以及白血病的复发突变与癌症生物学有关(Bressan,G.C.等人，Arginine methylation analysisof the splicing-associated SR protein SFRS9/SRP30C.Cell Mol Biol Lett14,657-669,doi:10.2478/s11658-009-0024-2(2009)；Sveen,A.,Kilpinen,S.,Ruusulehto,A.,Lothe,R.A.&Skotheim,R.I.Aberrant RNA splicing in cancer；expression changesand driver mutations of splicing factor genes.Oncogene35,2413-2427,doi:10.1038/onc.2015.318(2016)；Hsu,T.Y.等人，The spliceosome is a therapeuticvulnerability in MYC-driven cancer.Nature525,384-388,doi:10.1038/nature14985(2015))。在最近的一项研究中，PRMT1显示在急性巨核细胞白血病中甲基化RNA结合蛋白RBM15(Zhang,L.等人，Cross-talk between PRMT1-mediated methylation andubiquitylation on RBM15controls RNA splicing.Elife4,doi:10.7554/eLife.07938(2015))。PRMT1介导的RBM15甲基化调节其表达；因此，显示AML细胞系中PRMT1的过表达通过下调RBM15来阻断分化，从而阻止其结合对分化重要的基因的前mRNA内含子区域的能力。为了鉴定推定的PRMT1底物，利用蛋白质组学方法(Methylscan，Cell SignalingTechnology)鉴定具有响应于工具PRMT1抑制剂(化合物D)的精氨酸甲基化状态变化的蛋白质。来自化合物D-和DSMO处理的细胞提取物的蛋白质片段使用甲基精氨酸特异性抗体(ADMA，MMA，SDMA)免疫沉淀，并通过质谱法鉴定肽。虽然许多蛋白质经历精氨酸甲基化的变化，但鉴定的大多数底物是用工具化合物处理的AML细胞系中的转录调节因子和RNA加工蛋白质(图3)。
总之，PRMT1对癌症相关途径的影响表明抑制可能导致抗肿瘤活性，为治疗AML、淋巴瘤和实体肿瘤适应症提供了新的治疗机制。如新兴文献中所述，几种机制支持在血液学和实体瘤中使用PRMT1抑制剂的基本原理，包括：抑制白血病中AML-ETO驱动的肿瘤发生，抑制乳腺癌中生长促进信号转导，以及通过RNA结合蛋白的甲基化和剪接体机制调节剪接。抑制包括PRMT1在内的I型PRMT代表了一种易于控制的抑制异常癌细胞增殖和存活的策略。
生物化学
用化合物A进行详细的体外生物化学研究，以表征对I型PRMT的抑制效力和机制。
抑制机制
通过底物竞争实验探索了化合物A对PRMT1的抑制机制。通过将化合物A IC50值作为底物浓度的函数除以其Km app绘图，且将得到的图与竞争性、非竞争性和未竞争性抑制的Cheng-Prusoff关系进行比较，来检查抑制剂形态(Copeland,R.A.Evaluation of enzymeinhibitors in drug discovery.A guide for medicinal chemists andpharmacologists.Methods Biochem Anal46,1-265(2005))。化合物A的IC50值随着SAM浓度的增加而降低，表明化合物A对PRMT1的抑制与SAM是非竞争性的，当拟合至非竞争性抑制的方程时，Ki app值为15nM(图4A)。当化合物A IC50值作为H4 1-21肽的函数作图(图4B)，未观察到明确的形态趋势，表明混合型抑制。使用全局分析进行进一步分析，得到3.7的α值，证实肽机理是混合的并且得到19nM的Ki app值(图4B，插图)。
时间依赖性和可逆性
在变化的SAM：PRMT1：化合物A预孵育时间和20分钟反应后，通过测量IC50值来评估化合物A的时间依赖性抑制。与SAM无竞争性的抑制机制意味着需要产生SAM：PRMT1复合物以支持化合物A的结合，因此在预孵育期间包括SAM(保持在Km app)。化合物A显示PRMT1甲基化的时间依赖性抑制，其通过较长的预孵育时间的效力增加而证明(图5A)。由于观察到时间依赖性抑制，进一步的IC50测定包括60分钟SAM：PRMT1：化合物A预孵育和40分钟反应时间以提供化合物效力的更好表示。这些条件产生的IC50为3.1±0.4nM(n＝29)，其大于该测试的理论紧密结合极限(0.25nM)10倍。在不同的PRMT1浓度下检查IC50值表明，由于活性部分较低，实际的紧密结合限度将显著低于0.25nM(图5B)。化合物A的盐形式没有显著影响针对PRMT1测定的IC50值(图5B)。
对时间依赖性抑制的两种解释是缓慢结合的可逆抑制和不可逆抑制。为了区分这两种机制，使用亲和选择质谱法(ASMS)检查化合物A与PRMT1的结合。ASMS首先分离结合的配体与未结合配体，然后通过MS检测可逆结合的配体。使用PRMT1：SAM与化合物A的2小时预孵育来确保完全形成时间依赖性复合物(ESI*)，其基于(图5A)中所示的曲线。其中在预孵育20分钟后观察到最大效力。在这些条件下，使用ASMS可检测化合物A。这表明主要机制本质上是可逆的，因为ASMS将无法检测到不可逆结合的化合物A。尚未进行包括解离速率(off-rate)分析在内的确定性可逆性研究，并将进一步验证该机制。
结晶学
为了确定抑制剂结合模式，确定与PRMT1和SAH结合的化合物A的共晶结构(分辨率)(图6)。SAH是PRMT1从SAM中除去甲基后形成的产物；因此，SAH和SAM应该同样占据PRMT1的相同口袋。抑制剂在通常由直接与SAH袋相邻的底物肽占据的裂隙中结合，并且其二胺侧链占据推定的精氨酸底物位点。末端甲胺与距SAH的硫醚的Glu162侧链残基形成氢键，并且SAH结合口袋通过Tyr57和Met66桥接至化合物A。化合物A通过在化合物A的吡唑氮的质子和Glu65的酸性侧链之间形成氢键来结合PRMT1；二乙氧基支链环己基部分位于由Tyr57、Ile62、Tyr166和Tyr170形成的疏水沟槽中的溶剂暴露表面。SAH和抑制剂结合之间的空间分离，以及与诸如Tyr57的残基的相互作用可以支持酶研究中揭示的SAM非竞争机制。发现化合物A结合在底物肽口袋中并且二胺侧链可以模拟底物精氨酸残基的胺，意味着抑制剂形式可能与肽竞争。生物化学抑制模式研究支持化合物A是关于肽的混合抑制剂(图4B)。化合物A的时间依赖性行为以及肽裂缝外的底物肽的外部位点结合的可能性都可以导致与肽不竞争的抑制模式，解释了结构和生化研究所暗示的形态差异。
直系同源
为了便于解释毒理学研究，针对PRMT1的大鼠和狗直系同源物评估化合物A的效力。与人PRMT1一样，化合物A显示出对大鼠和狗PRMT1的时间依赖性抑制，IC50值随着预孵育的增加而降低(图7A)。另外，在一系列酶浓度(0.25-32nM)中未观察到化合物A效力的变化，表明测量的IC50值未接近人、大鼠或狗的测定的紧密结合极限(图7B)。使用与用于评估人PRMT1的条件相当的条件测定IC50值，并显示化合物A效力在所有物种中变化＜2倍(图7C)。
选择性
在一组PRMT家族成员中评估化合物A的选择性。在60分钟SAM：酶：化合物A预孵育后，针对代表性的I型(PRMT3，PRMT4，PRMT6和PRMT8)和II型(PRMT5/MEP50和PRMT9)家族成员测定IC50值。化合物A以不同效力抑制了测试的所有I型PRMT的活性，但未能抑制II型家族成员(图8A)。I型PRMT的另外表征显示化合物A是PRMT4、PRMT6和PRMT8的时间依赖性抑制剂，这是由于增加酶:SAM:化合物A预孵育时间后观察到效力增加；然而，PRMT3没有显示出时间依赖性行为(图8B)。
为了进一步表征化合物A的选择性，在单一浓度的化合物A(10μM，响应生物学)下评估二十一种甲基转移酶的抑制。对PRDM9观察到最高抑制程度，18％。总之，化合物A显示对测试的甲基转移酶的最小抑制，表明它是I型PRMT的选择性抑制剂(表1)。安全性部分描述了其他选择性测定。
表1针对对化合物A的抑制测试的甲基转移酶。在固定浓度的SAM(1μM)测定酶，独立于SAM Km值。
总之，化合物A是I型PRMT家族成员的有效、可逆、选择性抑制剂，显示出对PRMT1、PRMT6和PRMT8的等效生化能力，IC50值在3-5nM之间。与化合物A复合的PRMT1的晶体结构显示化合物A在肽口袋中结合，并且晶体结构以及酶学研究都与SAM非竞争机制一致。
生物学
细胞机制效应
预计PRMT1的抑制导致细胞PRMT1底物上的ADMA降低，包括组蛋白H4的精氨酸3(H4R3me2a)，伴随MMA和SDMA的增加(Dhar,S.等人，Loss of the major Type I argininemethyltransferase PRMT1causes substrate scavenging by other PRMTs.Sci Rep3,1311,doi:10.1038/srep01311(2013))。为了评估化合物A对精氨酸甲基化的影响，使用抗体检测MMA。在细胞内-western测定(in-cell-western assay)中评估与增加的MMA相关的剂量响应，并测定细胞机理性EC50为10.1+4.4nM的(图9)。剂量响应似乎是双相的，可能是由于I型PRMT之间的差异活性或对特定底物亚组的差异效力。使用描述双相曲线的方程来拟合数据，并且因为在测试的浓度范围内没有与第二拐点相关的明显平台，报告了第一个拐点。在该测定形式中测试了各种盐形式，并且所有盐形式都显示出相似的EC50值，因此，对于所有生物学研究，认为它们是可互换的(图9)。进行另外的研究以检查选择的肿瘤类型中的时机、持续性和对其他甲基化状态的影响，如下所示。化合物A对MMA诱导的效力表明化合物A可用于研究与抑制细胞中1型PRMT相关的生物学机制。
癌症中的I型PRMT表达
通过癌症基因组图谱(TCGA)和cBioPortal代表的其他原发肿瘤数据库从＞100个癌症研究中收集的多种肿瘤类型的基因表达数据分析表明PRMT1在癌症中高度表达，淋巴瘤中水平最高(弥漫型大B-细胞淋巴瘤，DLBCL)，相对于其他实体和血液恶性肿瘤(图10)。还调查了ACTB(一种常见的管家基因)和TYR(一种在皮肤中选择性表达的基因)的表达，以分别表征与高遍在表达或组织限制性表达相关的范围。淋巴瘤在其他癌症中的高表达提供额外的置信度，即化合物A抑制的靶标存在于对应于临床前研究中评估的细胞系的原发性肿瘤中。PRMT 3、4和6也在一系列肿瘤类型中表达，而如预测的那样，PRMT8表达似乎更受限，因为其组织特异性表达(Lee,J.,Sayegh,J.,Daniel,J.,Clarke,S.&Bedford,M.T.PRMT8,a new membrane-bound tissue-specific member of the protein argininemethyltransferase family.J Biol Chem280,32890-32896,doi:10.1074/jbc.M506944200(2005))。
细胞表型效应
使用Cell Titer Glo(Promega)分析化合物A在6天生长-死亡测定中抑制培养的肿瘤细胞系生长的能力，该Cell Titer Glo(Promega)定量ATP作为细胞数的替代。在广泛的接种密度范围内评估所有细胞系随时间的生长，以鉴定在整个6天测定中允许增殖的条件。将细胞以最佳接种密度铺板，并在孵育过夜后，加入20点2倍滴定的化合物并将板孵育6天。在加入化合物时收获细胞的复制平板以定量细胞的起始数(T0)。将6天处理后获得的值表示为T0值的函数，并相对于化合物浓度作图。将T0值归一化至100％并表示化合物添加时的细胞数。将数据与4参数方程拟合以产生浓度响应曲线，并测定生长IC50(gIC50)。gIC50是“生长窗口”的中点，即化合物添加时的细胞数(T0)与6天后的细胞数(DMSO对照)之间的差异。生长-死亡测定法可用于量化净种群变化，明确地将细胞死亡(细胞毒性)定义为与化合物添加时的数量(T0)相比更少的细胞。负Ymin-T0值表示细胞死亡，而gIC100值表示100％抑制生长所需的化合物浓度。使用该测定法在196种代表实体和血液恶性肿瘤的人癌细胞系中评估化合物A的生长抑制作用(图11)。
化合物A在大多数细胞系中诱导接近或完全生长抑制，其中亚组显示细胞毒性响应，如负Ymin-T0值所示(图11B)。这种作用在AML和淋巴瘤癌细胞系中最为明显，其中50和54％的细胞系分别显示出细胞毒性响应。从大鼠14天MTD(150mg/kg，Cave＝2.1μM)计算的总AUC或暴露(Cave)用作化合物A的临床相关浓度估计值以评估敏感度。虽然淋巴瘤细胞系显示细胞毒性，且gIC100值低于2.1μM，但评估的所有肿瘤类型中的许多细胞系显示gIC50值＜2.1μM，表明与抗肿瘤活性相关的浓度可在患者中实现。狗21天MTD稍高(25mg/kg；总AUC或Cave＝3.2μM)，因此来自大鼠的较低浓度提供了更保守的靶标以鉴别细胞系敏感性。淋巴瘤细胞系对I型PRMT抑制高度敏感，中值gIC50为0.57μM，细胞毒性在54％中观察到。在实体瘤类型中，在黑素瘤和肾癌细胞系(主要代表透明细胞肾癌)中观察到化合物A的有效抗增殖活性，然而，在该测定形式中，响应主要是细胞抑制的(图11，表2)。
表2化合物A的6天增殖概述。基于在大鼠14天MTD(150mg/kg，Cave＝2.1μM)中实现的浓度，gIC50＜2.1μM用作靶标。
评价化合物A的抗增殖作用表明PRMT1的抑制导致代表一系列实体和血液恶性肿瘤的细胞系的有效抗肿瘤活性。总之，这些数据表明实体和血液恶性肿瘤的临床开发是必要的。优先适应症包括：
·淋巴瘤：在54％的细胞系中有细胞毒性
·AML：在50％的细胞系中有细胞毒性
·肾细胞癌：在60％的细胞系中gIC50≤2.1μM
·黑素瘤：在71％的细胞系中gIC50≤2.1μM
·乳腺癌，包括TNBC：在41％的细胞系中gIC50≤2.1μM
淋巴瘤生物学
细胞机理效应
为了评估化合物A对淋巴瘤中精氨酸甲基化的影响，用0.4μM化合物A或媒介物处理人DLBCL细胞系(Toledo)长达120小时，之后通过western分析使用针对各种精氨酸甲基化状态的抗体评估蛋白质裂解物。如所预测的，在化合物暴露时ADMA甲基化降低，而MMA增加(图12)。还观察到SDMA水平的增加，表明MMA的增加可能导致PRMT5的潜在底物池中的积累，PRMT5是SDMA形成的主要催化剂。鉴于检测到具有不同动力学的多种底物，以及DMSO处理的样品中ADMA水平的可变性，全泳道和显著的45kDa条带均被表征以评估ADMA。MMA的增加在24小时内明显，到48小时接近最大值，而45kDa ADMA带的减少需要72-96小时才能达到最大效果。在化合物暴露48小时后SDMA的增加是明显的并且持续增加至120小时，这与MMA到ADMA(通过I型PRMT)的转化至SDMA(通过II型PRMT)的潜在转变一致(图12)。
在一组淋巴瘤细胞系中测定与化合物A对精氨酸甲基化(MMA，ADMA，SDMA)的作用相关的剂量响应(图13)。在整个泳道和在评估的所有细胞系中降低至不可检测的水平的单个45kDa条带上测量ADMA降低。总体而言，实现50％最大效应所需的浓度在细胞系中是相似的，并且在6天生长死亡测定中与gIC50不相符，表明缺乏敏感性不能通过靶标接合不良解释。
为了确定响应化合物A的精氨酸甲基化的全局变化的耐久性，在化合物冲洗后用化合物A处理的细胞中评估ADMA、SDMA和MMA水平(图14)。将Toledo细胞与0.4μM化合物A一起培养72小时，以对精氨酸甲基化标志物建立稳健的作用。然后洗涤细胞，在无化合物A的培养基中培养，每天收集样品至120小时，并通过western分析检查精氨酸甲基化水平。MMA水平迅速下降，在化合物A冲洗后24小时回到基线，而ADMA和SDMA分别在24和96小时后恢复到基线。值得注意的是，相对于ADMA蛋白质印迹中的大多数其他种类，45kDa ADMA条带的恢复似乎延迟，表明化合物A的精氨酸甲基化变化的耐久性可能因底物而异。即使在冲洗6小时后，SDMA似乎仍继续增加。这与到120小时观察到的持续增加且没有任何明显的平稳期(图12)以及在冲洗后尚未恢复到基线的MMA的持久增加相一致。每种修饰的耐久性通常反映化合物A引起的精氨酸甲基化变化的动力学，其中MMA是最快的。
细胞表型效应
为了评估与化合物A抑制生长相关的时间过程，在淋巴瘤细胞系的亚组中进行延长持续时间的生长-死亡测定。类似于先前描述的6天增殖测定，优化接种密度以确保在整个测定期间的生长，并且在从第3-10天开始的选定时间点通过CTG评估细胞数。早在6天就观察到生长抑制，在Toledo和Daudi淋巴瘤细胞系中最多为8天(图15)。
在第6天和第10天评估更大的细胞系组以测量长期暴露于化合物A的效果，并确定在6天测定中显示细胞抑制响应的细胞系是否可能在稍后的时间点发生细胞毒性。延长暴露于化合物A的时间对评估的淋巴瘤细胞系的效力(gIC50)或细胞毒性(Ymin-T0)具有最小影响(图16)，表明6天增殖评估可用于评估敏感性。
鉴于生长抑制在第6天是明显的并且延长暴露对效力或抑制百分比的影响最小，代表霍奇金和非霍奇金亚型的一组广泛的淋巴瘤细胞系以6天生长-死亡测定形式进行评估(图17)。所有亚型在这种形式下似乎同样敏感，并且许多细胞系经历细胞毒性(如负Ymin-T0所示)，独立于分类，表明化合物A在评估的所有淋巴瘤亚型中具有抗肿瘤作用。
增殖测定结果表明PRMT1的抑制在淋巴瘤细胞系的亚组中诱导明显的细胞毒性。为了进一步阐明这种效果，使用碘化丙锭染色然后流式细胞术评估用化合物A处理的淋巴瘤细胞系中的细胞周期分布。在6天增殖试验中显示一系列Ymin-T0和gIC50值的细胞系以低密度接种以允许在试验期间进行对数生长，并用不同浓度的化合物A处理。与生长-死亡测定结果一致，以时间和剂量依赖性方式在Toledo细胞中观察到亚G1(＜G1)中细胞的积累(指示细胞死亡)，在用化合物A浓度≥1000nM处理3天后开始(图18)。到第7天，在浓度≥100nM时，亚G1群体的增加明显。在U2932和OCI-Ly1(在6天增殖试验中经历明显的细胞抑制性生长抑制的细胞系)中，这种作用仅在10μM化合物A时才明显。在该试验形式中没有显示任何其他细胞周期阶段的显著影响。
为了确认细胞周期的FACS分析，在10天的时间过程中进行胱天蛋白酶断裂的评估作为细胞凋亡的额外测量。优化接种密度以确保在整个测定期间的一致生长，并使用发光胱天蛋白酶-Glo 3/7测定(Promega)评估胱天蛋白酶活化。将胱天蛋白酶-Glo 3/7信号归一化为细胞数(通过CTG评估)并显示为相对于对照(DMSO处理的)细胞的倍数诱导。在DLBCL细胞系中的10天时间过程中监测胱天蛋白酶3/7活性，该DLBCL细胞系显示对化合物A的细胞毒性(Toledo)和细胞抑制(Daudi)响应(图19)。与在生长-死亡测定中观察到的情况一致，Toledo细胞系显示出稳健的胱天蛋白酶活化，同时在所有时间点细胞数量减少，而Daudi细胞系中胱天蛋白酶活性的诱导不太明显并且限于最高浓度的化合物A。
与细胞周期谱一起，这些数据表明化合物A在Toledo DLBCL细胞系中诱导胱天蛋白酶介导的细胞凋亡，表明在其他淋巴瘤细胞系中观察到的细胞毒性可能反映化合物A对凋亡途径的激活。
小鼠异种移植物中的抗肿瘤作用
在Toledo(人DLBCL)异种移植模型中评估化合物A对肿瘤生长的影响。将带有皮下Toledo肿瘤的雌性SCID小鼠称重，用测径器测量肿瘤，并根据肿瘤大小将小鼠随机分组到每组10只小鼠的治疗组中。每天给小鼠口服媒介物或化合物A(150mg/kg-600mg/kg)达28天。在整个研究中，每周两次进行称重小鼠和肿瘤测量。在所有剂量下观察到显著的肿瘤生长抑制(TGI)，并且在≥300mg/kg的剂量下观察到消退(图20，表5)。在任何剂量组中没有显著的体重减轻。
鉴于在评估的所有剂量下观察到完整的TGI，进行第二项研究以测试化合物A在较低剂量下的抗肿瘤作用以及相对于每日(QD)比较每日两次(BID)给药。在该第二项研究中，给小鼠口服媒介物或化合物A(37.5mg/kg-150mg/kg)达24天QD或75mg/kg BID。在该研究中，75mg/kg的BID给药导致与150mg/kg相同的TGI(分别为95％和96％)，而≤75mg/kg QD导致部分TGI(≤79％)(图20，表5)。在任何剂量组中未观察到显著的体重减轻。这些数据表明，用相同的总日剂量给药的BID或QD应该产生相似的功效。
其它肿瘤类型
AML
除淋巴瘤细胞系外，化合物A在6天增殖试验中检测的AML细胞系亚组中具有有效的细胞毒活性(表3)。10个细胞系中的8个具有＜2μM的gIC50值，并且化合物A在5个细胞系中诱导细胞毒性。尽管PRMT1与M2AML亚型的AML-ETO融合特征相互作用(Shia,W.J.等人，PRMT1interacts with AML1-ETO to promote its transcriptional activation andprogenitor cell proliferative potential.Blood119,4953-4962,doi:10.1182/blood-2011-04-347476(2012))，但携带该融合蛋白(Kasumi-1和SKNO-1)的细胞系不是通过gIC50测量而显示对化合物A的敏感性或经历细胞毒性的唯一细胞系(表3，图21)。因此，这种致癌融合蛋白的存在并不能仅仅预测AML细胞系对化合物A的敏感性。
表3 AML细胞系中化合物A活性的概述
与淋巴瘤研究类似，在第6天和第10天评估一组细胞系以测量长期暴露于化合物A的效果，并确定在6天测定中显示细胞抑制响应的AML细胞系是否可能在稍后时间点发生细胞毒性。与淋巴瘤结果一致，延长暴露于化合物A的时间对评估的AML细胞系的效力(gIC50)或细胞毒性(Ymin-T0)具有最小影响(图21)。
肾细胞癌
与其他实体瘤类型相比，肾细胞癌细胞系具有最低的中值gIC50。尽管在用化合物A处理时，所测试的细胞系均未显示出细胞毒性响应，但均显示完全生长抑制，并且10个中的6个具有≤2μM的gIC50值(表4)。所描述的10个细胞系中的7个代表透明细胞肾癌(ccRCC)，其是肾癌的主要临床亚型。
表4化合物A在肾细胞癌细胞中的抗增殖作用
为了评估化合物A对肾癌细胞系中生长抑制的时间过程，在第3、4、5和6天通过一组4个ccRCC细胞系中的CTG评估细胞生长(图22)。活性的最大变化发生在第3天和第4天之间，其中所有细胞系显示降低gIC50值并增加生长抑制。化合物A的效力(通过gIC50评估)在4个细胞系中的3个到第4天最大，并且在6天测定持续时间内进一步没有变化。另外，在评估的所有细胞系中，生长抑制百分比达到100％。因此，ccRCC细胞系中的最大生长抑制在细胞系筛选策略中使用的6天生长窗口内是明显的。
在增殖期间评估胱天蛋白酶活化，并且与Ymin-T0值所示的缺乏明显细胞毒性一致，胱天蛋白酶断裂仅发生在最高浓度(30μM)，表明凋亡可能对化合物A在ccRCC细胞系中诱导的整体生长抑制作用影响最小。
在携带人肾细胞癌异种移植物(ACHN)的小鼠中评估化合物A对肿瘤生长的影响。将带有皮下ACHN细胞系肿瘤的雌性SCID小鼠称重，并通过测径器测量肿瘤，并根据肿瘤大小随机分组到每组10只小鼠的治疗组中。小鼠每天口服给予媒介物或化合物A(150mg/kg-600mg/kg)，最多59天。在整个研究中，称重小鼠并每周两次进行肿瘤测量。在所有剂量下观察到显著的肿瘤生长抑制，并且在≥300mg/kg的剂量下观察到消退。在每天600mg/kg治疗的动物中观察到显著的体重减轻，因此，给药组在第31天终止(图23，表5)。
表5化合物A体内功效
*p＜0.05，双尾t检验
**ACHN功效研究的600QD组在第31天终止
总之，这些数据表明在人类实体和血液肿瘤的皮下异种移植物中可以以相似剂量实现100％TGI。
乳腺癌
乳腺癌细胞系显示出对化合物A的一系列敏感性，并且在许多情况下，在6天增殖测定中显示出部分生长抑制(图24)。代表三阴性乳腺癌(TNBC)的细胞系与非TNBC细胞系相比具有略低的中值gIC50值(对于TNBC和非TNBC分别为3.6μM和6.8μM)。由于化合物A对增殖的作用是细胞抑制的并且在大多数乳腺癌细胞系中没有导致完全生长抑制，因此进行延长的持续时间生长-死亡测定以确定对化合物A的敏感性是否会随着延长的暴露而增加。在测试的17种细胞系中有7种最大抑制百分比增加≥10％，且gIC50减少≥2倍(图25)。在延长的暴露测定中，17种细胞系中有11种gIC50≤2μM(65％)，而17种细胞系中有7种(41％)在7天测定形式中符合该标准。
黑素瘤
在实体瘤类型中，化合物A在黑素瘤细胞系中具有最有效的抗增殖作用(图11)。评估的7个细胞系中的6个具有小于2μM的gIC50值(表6)。无论gIC50值如何，化合物A在所有黑素瘤细胞系中均具有细胞抑制作用。
表6黑素瘤细胞系中化合物A活性的概述
实施例2
背景
PRMT5为对称的蛋白质精氨酸甲基转移酶
蛋白质精氨酸甲基转移酶(PRMT)是酶的亚类，其在含有富含甘氨酸和精氨酸残基(GAR基序)的区域的蛋白质中的甲基化精氨酸。基于酶促反应的产物将PRMT分为四种亚型(I-IV型)(图26,Fisk JC等人，A type III protein arginine methyltransferase fromthe protozoan parasite Trypanosoma brucei.J Biol Chem.2009Apr 24；284(17):11590-600)。I-III型酶产生ω-N-单甲基-精氨酸(MMA)。最大的亚型，I型(PRMT1、3、4、6和8)，使MMA进展为不对称二甲基精氨酸(ADMA)，而II型产生对称的二甲基精氨酸(SDMA)。虽然PRMT9/FBXO11也可以产生SDMA，但PRMT5是负责对称二甲基化的主要酶。PRMT5在细胞质和细胞核中的几种类型的复合物中起作用，并且PRMT5的结合配偶体是底物识别和选择性所必需的。甲基体蛋白50(MEP50)是PRMT5的已知辅因子，其是PRMT5结合和对组蛋白和其他底物的活性所必需的(Ho MC等人，Structure of the arginine methyltransferasePRMT5-MEP50reveals a mechanism for substrate specificity.PLoS One.2013；8(2))。
PRMT5底物
PRMT5甲基化各种细胞蛋白中的精氨酸，包括剪接因子、组蛋白、转录因子、激酶等(图27)(Karkhanis V，等人，Trends Biochem Sci.2011Dec；36(12):633-41)。剪接体的多个组分的甲基化是剪接体组装中的关键事件，并且通过敲低或基因敲除减弱PRMT5活性导致细胞剪接的破坏(Bezzi M等人，Regulation of constitutive and alternativesplicing by PRMT5 reveals a role for Mdm4 pre-mRNA in sensing defects in thespliceosomal machinery.Genes Dev.2013年9月1日；27(17):1903-16)。PRMT5还甲基化组蛋白精氨酸残基(H3R8，H2AR3和H4R3)，这些组蛋白标志物与肿瘤抑制基因的转录沉默相关，如RB和ST7(Wang L等人，Protein arginine methyltransferase 5suppresses thetranscription of the RB family of tumor suppressors in leukemia and lymphomacells.Mol Cell Biol.2008Oct；28(20):6262-77；Pal S等人，Low levels of miR-92b/96induce PRMT5translation and H3R8/H4R3methylation in mantle celllymphoma.EMBO J.2007年8月8日；26(15):3558-69)。另外，H2AR3的对称二甲基化与胚胎干细胞中分化基因的沉默有关(Tee WW等人，Prmt5is essential for early mousedevelopment and acts in the cytoplasm to maintain ES cell pluripotency.GenesDev.2010年12月15日；24(24):2772-7).PRMT5also plays a role in cellularsignaling,through the methylation of EGFR and PI3K(Hsu JM等人，Crosstalkbetween Arg 1175methylation and Tyr 1173phosphorylation negatively modulatesEGFR-mediated ERK activation.Nat Cell Biol.2011年2月；13(2):174-81；Wei TY,JuanCC,Hisa JY,Su LJ,Lee YC,Chou HY,Chen JM,Wu YC,Chiu SC,Hsu CP,Liu KL,YuCT.Protein arginine methyltransferase 5is a potential oncoprotein thatupregulates G1cyclins/cyclin-dependent kinases and the phosphoinositide 3-kinase/AKT signaling cascade.Cancer Sci.2012年9月；103(9):1640-50)。PRMT5在参与癌症-相关的途径的蛋白质的甲基化中的作用如下所述。
PRMT5敲除模型
完全丧失PRMT5是胚胎致死的。PRMT5在胚胎发育中发挥关键作用，其通过PRMT5缺失小鼠在胚胎期3.5至6.5天之间死亡而证明(Tee WW，等人，Prmt5is essential forearly mouse development and acts in the cytoplasm to maintain ES cellpluripotency.Genes Dev.2010年12月15日；24(24):2772-7)。早期研究表明PRMT5在HSC(造血干细胞)和NPC(神经祖细胞)发育中起重要作用。人脐带血CD34+细胞中PRMT5的敲低导致红细胞分化增加(Liu F等人，JAK2V617F-mediatedphosphorylation ofPRMT5downregulates its methyltransferase activity and promotesmyeloproliferation.Cancer Cell.2011年2月15日；19(2):283-94)。在NPC中，PRMT5调节神经分化、细胞生长和存活(Bezzi M等人，Regulation of constitutive andalternative splicing by PRMT5 reveals a role for Mdm4 pre-mRNA in sensingdefects in the spliceosomal machinery.Genes Dev.2013年9月1日；27(17):1903-16)。
癌症中的PRMT5
越来越多的证据表明PRMT5参与肿瘤发生。PRMT5蛋白在许多癌症类型中过表达，包括淋巴瘤、神经胶质瘤，乳腺癌和肺癌，仅PRMT5过表达足以转化正常成纤维细胞(Pal S等人，Low levels of miR-92b/96induce PRMT5translation and H3R8/H4R3methylationin mantle cell lymphoma.EMBO J.2007年8月8日；26(15):3558-69.；Ibrahim R等人，Expression of PRMT5in lung adenocarcinoma and its significance in epithelial-mesenchymal transition.Hum Pathol.2014年7月；45(7):1397-405；Powers MA等人，Protein arginine methyltransferase 5accelerates tumor growth by argininemethylation of the tumor suppressor programmed cell death 4.Cancer Res.2011年8月15日；71(16):5579-87；Yan F等人，Genetic validation of the protein argininemethyltransferase PRMT5as a candidate therapeutic target inglioblastoma.Cancer Res.2014年3月15日；74(6):1752-65)。PRMT5的敲低通常导致癌细胞系中细胞生长和存活的减少。在乳腺癌中，高PRMT5表达与高PDCD4(程序性细胞死亡4)水平一起预测总体不良存活(Powers MA等人，Protein arginine methyltransferase5accelerates tumor growth by arginine methylation of the tumor suppressorprogrammed cell death 4.Cancer Res.2011年8月15日；71(16):5579-87)。PRMT5甲基化PDCD4，改变肿瘤相关功能。PRMT5和PDCD4在乳腺癌的原位模型中的共表达促进肿瘤生长。PRMT5在神经胶质瘤中的高表达与高肿瘤等级和总体较差的存活率相关，并且PRMT5敲低在原位成胶质细胞瘤模型中提供存活益处(Yan F等人，Genetic validation of theprotein arginine methyltransferase PRMT5as a candidate therapeutic target inglioblastoma.Cancer Res.2014年3月15日；74(6):1752-65)。增加的PRMT5表达和活性有助于沉默神经胶质瘤细胞系中的几种肿瘤抑制基因。
目前在PRMT5和癌症之间描述的最强的机制联系是套细胞淋巴瘤(MCL)。PRMT5经常在MCL中过表达，并且在核区室中高度表达，其中它增加组蛋白甲基化水平并沉默肿瘤抑制基因的亚类。最近的研究揭示了miRNA在MCL中上调PRMT5表达中的作用。预计超过50种miRNA退火至PRMT5mRNA的3'未翻译区。据报道，miR-92b和miR-96水平与MCL中的PRMT5水平呈负相关，并且MCL细胞中这些miRNA的下调导致PRMT5蛋白水平的上调。细胞周期蛋白D1是绝大多数MCL患者中易位的癌基因，与PRMT5相关，并通过cdk4依赖性机制增加PRMT5活性(图28,Aggarwal P等人，Cancer Cell.2010年10月19日；18(4):329-40)。PRMT5介导负调节DNA复制的关键基因的抑制，从而允许细胞周期蛋白D1依赖性肿瘤生长。PRMT5敲低抑制细胞周期蛋白D1依赖性细胞转化，导致肿瘤细胞死亡。这些数据突出了PRMT5在MCL中的重要作用，并表明PRMT5抑制可用作MCL中的治疗策略。
在其他肿瘤类型中，已假定PRMT5在分化、细胞死亡、细胞周期进展、细胞生长和增殖中起作用。虽然将PRMT5与肿瘤发生联系起来的主要机制尚不清楚，但新出现的数据表明PRMT5有助于调节基因表达(组蛋白甲基化，转录因子结合或启动子结合)、剪接改变和信号转导。转录因子E2F1的PRMT5甲基化降低其抑制细胞生长和促进细胞凋亡的能力(Zheng S等人，Arginine methylation-dependent reader-writer interplay governs growthcontrol by E2F-1.Mol Cell.2013年10月10日；52(1):37-51)。PRMT5也甲基化p53(Jansson M等人，Arginine methylation regulates the p53response.Nat CellBiol.2008年12月；10(12):1431-9)以响应DNA损伤并降低p53诱导细胞周期停滞的能力，同时增加p53依赖性细胞凋亡。这些数据表明，PRMT5抑制可通过诱导p53依赖性细胞凋亡使细胞对DNA损伤剂敏感。
除了直接甲基化p53外，PRMT5还通过剪接相关机制上调p53途径。小鼠神经祖细胞中的PRMT5敲除导致细胞剪接的改变，包括MDM4基因的同工型转换(Bezzi M等人，Regulation of constitutive and alternative splicing by PRMT5 reveals a rolefor Mdm4 pre-mRNA in sensing defects in the spliceosomal machinery.GenesDev.2013年9月1日；27(17):1903-16)。Bezzi等人发现PRMT5敲除细胞具有降低的长MDM4同工型的表达(导致功能性p53泛素连接酶)和增加的MDM4短同工型的表达(导致无活性的连接酶)。MDM4剪接的这些变化导致MDM4的失活，增加p53蛋白的稳定性，并随后激活p53途径和细胞死亡。在PRMT5敲低的癌细胞系中也观察到MDM4可变剪接。这些数据表明PRMT5抑制可以激活p53途径的多个节点。
除了癌细胞生长和存活的调节之外，PRMT5还涉及上皮-间充质转化(EMT)。PRMT5与转录因子SNAIL结合，并作为E-钙粘蛋白表达的关键共抑制因子；PRMT5的敲低导致E-钙粘蛋白水平的上调(Hou Z等人，The LIM protein AJUBA recruits protein argininemethyltransferase 5to mediate SNAIL-dependent transcriptional repression.MolCell Biol.2008年5月；28(10):3198-207)。
这些数据突出了PRMT5作为多种癌症相关途径的关键调节因子的作用，并表明PRMT5抑制剂可能在血液和实体癌症中具有广泛的活性。PRMT5抑制剂作为MCL以及乳腺癌和脑癌的治疗策略有很强的理论基础。这些数据还强调了在适当的细胞环境中使用PRMT5抑制剂的机制原理：
·抑制MCL中依赖细胞周期蛋白D1的功能；
·激活和调节p53途径活性；
·调节依赖E2F1的细胞生长和凋亡功能；
·去抑制E-钙粘蛋白的表达；
化合物C是PRMT5/MEP50复合物的中等分子量(MW＝452.55)的有效的、选择性的、肽竞争性的、可逆的抑制剂，具有良好的总体物理性质和口服生物利用度。化合物C影响几种癌症相关途径，最终在体外和体内模型中产生有效的抗癌活性，为治疗MCL、乳腺癌和脑癌提供了新的治疗机制。
生物化学
在许多体外生物化学测定中分析化合物C以表征PRMT5的效力、可逆性、选择性和抑制机制。
使用放射性测定法评估化合物C的抑制效力，所述放射性测定法测量3H从SAM到由组蛋白肽库筛选鉴定的组蛋白H4衍生的肽的转移。使用120分钟的长反应时间来捕获效力的任何时间依赖性增加。发现化合物C是PRMT5/MEP50的有效抑制剂，IC50为8.7±5nM(n＝3)。该效力接近测定的紧密结合极限(2nM)，因此代表分子真实效力的上限(图29)。化合物C的近似类似物的抑制效力相似，包括化合物F、化合物B和化合物E(关键差异在分子左侧)，其在一些生物学研究中用作工具化合物。
为了评估化合物C抑制除组蛋白H4之外的细胞底物的PRMT5依赖性甲基化的能力，组装了一组PRMT5底物用于评估，包括SmD3、Lsm4、hnRNPH1和FUBP1(参与剪接和转录沉默的这些底物的大部分通过下文生物学部分中描述的细胞MethylscanTM研究发现)。化合物C有效地抑制PRMT5/MEP50催化的所有这些底物的甲基化，尽管极低的Km表观妨碍了效力的准确测定。
为了能够解释安全性研究，还在与人PRMT5测定相似的条件下针对PRMT5/MEP50复合物的大鼠和狗直系同源物评估化合物C的效力。化合物C效力相对于所有物种变化＜3倍(表7)。
表7.使用放射性测定法在平衡条件下(Km表观的底物浓度)监测PRMT5/MEP50活性，其测量用化合物C处理后3H从SAM至蛋白质底物的转移。通过将数据拟合至3参数剂量-响应方程来确定IC50值。
为了确定抑制机制和抑制剂结合模式，将化合物C与PRMT5/MEP50复合物和西奈芬净(一种天然产物SAM类似物共结晶(分辨率))(图30)。该抑制剂结合在通常由底物肽占据的裂缝中并且紧邻占据SAM袋的西奈芬净。四氢异喹啉的芳基环似乎与西奈芬净的氨基形成π-芳基堆积相互作用。在化合物C的羟基与Leu437骨架和Glu244之间形成氢键。在嘧啶环的酰胺和Phe580的主链NH基团之间也形成氢键相互作用。末端哌啶乙酰胺位于溶剂暴露表面上，没有明显的临界接触。总的来说，该结构支持一种抑制机制，即与SAM无竞争性并且与底物竞争。
为了确定化合物C是否是PRMT5/MEP50的可逆抑制剂并且为了进一步探索抑制机制，使用亲和选择质谱法(ASMS)来测量化合物C与各种PRMT5/MEP50复合物的结合。可以在以下检测到阳性结合：含有PRMT5/MEP50与SAM、西奈芬净或SAH的二元复合物，到PRMT5/MEP50:H4肽：SAH或西奈芬净的死端(dead-end)三元复合物。由于ASMS无法检测到不可逆结合的化合物C，因此这些结果与可逆结合机制一致。在与10倍过量的H4肽竞争时，化合物C的结合在PRMT5/MEP50：H4肽：西奈芬净复合物内降低。用PRMT5/MEP50：H4肽复合物或单独用PRMT5/MEP50检测不到化合物C的结合，表明需要占用SAM结合口袋用于化合物C结合。这些结果与以下抑制机制最匹配，即与SAM无竞争性且与H4肽竞争。
在一组酶中评估化合物C的选择性，所述酶包括I型和II型PRMT和赖氨酸甲基转移酶(KMT)。由于缺乏功能性酶测定，未包括PRMT9/FBXO11，其为另一种II型PRMT和唯一缺乏THW环的PRMT。化合物C在IC50值＞40μM时不抑制甲基转移酶选择性组中的19种酶中的任何一种，导致对于PRMT5/MEP50的选择性＞4000倍(图31)。对于在本文件的生物学部分中使用的PRMT5工具化合物(化合物B，化合物F和化合物E)，还观察到PRMT5/MEP50相对于其他甲基转移酶的选择性。
总之，化合物C是PRMT5/MEP50复合物的有效、选择性、可逆抑制剂，IC50为8.7±5nM。PRMT5/MEP50与化合物C复合物的晶体结构和ASMS结合数据与SAM非竞争性蛋白质底物竞争机制一致。
生物学
摘要
PRMT5在许多人类癌症中过表达，并且涉及多种癌症相关途径。使用PRMT5抑制剂作为MCL以及乳腺癌和脑癌的治疗策略有很强的理论基础。为了理解PRMT5抑制剂抗增殖活性的范围，使用2D和3D生长测定法在各种体外和体内肿瘤模型中分析化合物C.
受PRMT5抑制影响的基因和途径的特性对于理解适应症优先、预测性生物标志物的发现和合理组合研究的设计所需的PRMT5抑制剂的机制是至关重要的。进行了几项体外机制研究以评估对PRMT5抑制的响应的生物学。评估许多PRMT5底物的精氨酸甲基化水平以监测细胞和异种移植肿瘤中化合物C针对PRMT5的活性。进行许多细胞系的RNA测序以评估化合物C对基因表达、剪接以及受PRMT5活性调节的其他分子机制和途径的影响。在用PRMT5抑制剂处理的细胞系中监测p53途径活性。
最后，在MCL和乳腺癌的几种异种移植模型中测试化合物C活性，以评估PRMT5抑制在临床前癌症模型中的功效并评估分子机制和响应的潜在生物标志物。
细胞系敏感性
为了评估PRMT5抑制在各种肿瘤类型中的抗增殖活性，使用广泛组的癌症细胞系和患者衍生的肿瘤模型在2D和3D体外测定中分析化合物C。首先，在2D 6天生长/死亡测定中在一组癌细胞系中评估化合物C(图32)。选择细胞系以代表肿瘤类型，该肿瘤类型中已报道PRMT5活性调节关键途径和/或细胞生长和存活(例如淋巴瘤和MCL，神经胶质瘤，乳腺癌和肺癌细胞系)。总体而言，测试的大多数细胞系表现出低于1μM的gIC50值，而最敏感的淋巴瘤细胞系(套细胞淋巴瘤和弥漫型大B细胞淋巴瘤细胞系)具有个位数nM范围的gIC50值。
在6天生长/死亡测定中，化合物C在浓度高于100nM在弥漫型大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、成胶质细胞瘤、乳腺癌和膀胱癌细胞系中诱导细胞毒性响应(图33，负Ymin-T0值)。总体而言，MCL和DLBLC细胞系显示出最强的细胞毒性响应。大多数乳腺癌细胞系具有低Ymin-T0值，表明PRMT5抑制导致乳腺癌模型中的完全生长抑制，而其余细胞系表现出部分细胞抑制响应(正Ymin-T0值)。
在用PRMT5工具分子进行的大型癌细胞系筛选(240种细胞系，10天2D生长测定)中进一步测试PRMT5抑制的抗增殖活性(图34，图29中的化合物C和化合物B的生物化学/细胞活性比较)。总之，大多数细胞系表现出低于1μM的gIC50值。中值gIC50＜100nM的肿瘤类型为急性骨髓性白血病(AML)、慢性髓细胞性白血病(CML)、霍奇金淋巴瘤(HL)、多发性骨髓瘤(MM)、乳腺癌、神经胶质瘤、肾、黑素瘤和卵巢癌。这些数据表明PRMT5抑制剂对各种血液和实体瘤类型表现出广泛的抗增殖活性。
在软琼脂3D集落形成测定中，在一组患者衍生的肿瘤模型和细胞系(n＝73)中用PRMT5工具化合物观察到类似的宽范围的抗生长作用(图35)。在37％的模型中观察到相对生长IC50值低于1μM，包括非小细胞肺癌(NSCLC)、乳腺癌、黑素瘤、结肠癌和神经胶质瘤。具有最低中值IC50值的肿瘤类型是大细胞肺癌、乳腺癌、肾癌和神经胶质瘤。
总之，这些数据表明PRMT5抑制剂在各种实体和血液癌症模型中具有有效的抗增殖活性。根据上述研究中观察到的活性、文献推论和临床开发潜力，选择以下适应症进行额外研究：
·MCL和DLBCL(对PRMT5抑制有效的抗增殖和细胞毒性响应)
·乳腺癌(细胞系中低gIC50值和完全生长抑制，以及在患者衍生模型组中的集落形成测定中的低IC50值)
·成胶质细胞瘤(集落形成测定中的低IC50值)。
淋巴瘤生物学
如上所述，化合物C在套细胞和弥漫型大B细胞淋巴瘤细胞系的亚类中诱导了有力的细胞毒性响应(图32-33)。由于PRMT5在MCL中经常过表达并且在MCL途径(例如细胞周期蛋白D1和p53)中起重要作用，因此在几种细胞机制研究中评估了化合物C活性和机制。在两种套细胞淋巴瘤的异种移植模型中评估化合物C的功效。
细胞机制数据(淋巴瘤)
SDMA抑制
PRMT5负责绝大多数细胞对称精氨酸二甲基化。为了更好地理解将PRMT5抑制与抗癌表型联系起来的生物学机制，使用识别在精氨酸残基上对称二甲基化的细胞蛋白亚组的SDMA抗体鉴定底物。通过用SDMA抗体免疫沉淀和质谱分析(MethylscanTM)，在Z138细胞裂解物(来自对照和PRMT5抑制剂处理的细胞)中测定由SDMA抗体检测的蛋白质的身份。在含有SDMA的蛋白质中，绝大多数是参与细胞剪接和RNA加工(SmB、Lsm4、hnRNPH1和其他)、转录(FUBP1)和翻译的因子，突出了PRMT5作为细胞RNA稳态的重要调节剂的作用。
然后将SDMA抗体用于western和ELISA测定以测量甲基化的化合物C依赖性抑制。首先，用递增浓度的化合物C处理Z138MCL细胞(化合物C gIC50 2.7nM、gIC95 82nM和gIC100880nM，在6天生长/死亡测定中的细胞毒性响应，图32-33)以确定处理后第1天和第3天的SDMA抑制的细胞IC50(图36)。SDMA ELISA显示SDMA水平的时间依赖性变化，第3天的IC50值为4.79nM，第1天和第3天的EC50分别为7.3和2.35(图36，图A)。在第3天在高于19nM(EC90)的浓度下观察到SDMA的完全抑制。在gIC95(82nM)和gIC100(880nM)之间观察到Z138细胞中的完全生长抑制(在6天生长/死亡测定中)，浓度高于SDMA抑制的EC90。这些数据表明，为了在Z138细胞中触发完全生长抑制和细胞毒性，需要将PRMT5活性抑制＞90％。
为了评估SDMA水平的抑制是否是对化合物C的细胞生长响应的预测，在一组MCL细胞系中测定SDMA IC50值。在一组5个MCL细胞系中，SDMA IC50值在0.3至14nM的范围内(图36，图B)(敏感的Z138，Granta-519，Maver-1和中度抗性Mino，以及Jeko-1，图32-33)，表明SDMA不是反应标志物，而是PRMT5活性的标志物，可用于监测敏感和抗性模型中的PRMT5抑制。
淋巴瘤细胞系的基因表达谱
PRMT5甲基化参与RNA加工的组蛋白和蛋白质，因此预期PRMT5抑制对细胞mRNA稳态具有深远影响。为了进一步破译由PRMT5调节并有助于PRMT5抑制剂的细胞响应的细胞机制，在对PRMT5抑制敏感的淋巴瘤模型中评估全局基因表达变化。为了阐明在PRMT5抑制剂处理后在淋巴瘤细胞系中发生的基因表达变化，通过RNA测序分析4个敏感性淋巴瘤细胞系(2个MCL细胞系-Z138和Granta-519和2个DLBCL细胞系-DOHH2和RL)。
在用递增浓度的PRMT5工具分子处理2周和4天的淋巴瘤细胞系中评估基因表达变化(图37)。对RNA表达的作用是时间和剂量依赖性的，并且通常在4个淋巴瘤细胞系中调节48种基因。这些数据表明PRMT5抑制引发数百个基因的表达变化，并且这些变化的亚类对于所测试的所有4种敏感性淋巴瘤细胞系是常见的。正在评估这些基因在PRMT5抑制的细胞响应机制中的相关性。
SDMA和基因表达变化
为了证实RNA-seq实验发现的基因表达变化，进行了基因亚类表达的qPCR分析(具有强烈变化的基因和参与p53途径的基因)。用递增剂量的化合物C处理Z138细胞2和4天，分离RNA并通过qPCR分析。图38在左图中显示代表性剂量-响应曲线，并且在右图中总结了基因表达EC50值(第4天)。总体而言，测试的所有11个基因显示时间和剂量依赖性表达变化，EC50值在22至332nM的范围内，中值基因表达EC50为212nM。重要的是，基因表达中值EC50值对应于导致Z138中细胞甲基化的最大抑制的化合物C浓度(通过SDMA抗体ELISA测量，图36)，表明需要几乎完全抑制PRMT5活性，以建立基因表达程序的变化。这些数据突出了PRMT5抑制程度与基因表达和生长表型变化的关系，其中两者都需要接近完全抑制PRMT5活性。
PRMT5抑制和剪接
由于PRMT5甲基化剪接体亚基且PRMT5抑制作用减弱参与剪接的许多蛋白质的精氨酸甲基化，因此研究了PRMT5抑制对细胞剪接的影响。在上述淋巴瘤RNA-seq数据集中评估RNA剪接的变化。
存在几种可以调节细胞剪接的分子机制(图39，图A)，其中内含子(B)的保留通常导致基因表达的改变，而外显子跳跃或可变剪接位点的使用导致同工型转换(A，C-E)。PRMT5工具化合物处理导致所测试的所有淋巴瘤细胞系中内含子保留的剂量和时间依赖性增加(图39，图B)。有趣的是，剪接因子图分析表明，剪接因子结合位点的亚类在所有四种细胞系中保留的内含子中富集，包括hnRNPH1(由PRMT5直接甲基化)、hnRNPF、SRSF1和SRSF5，表明PRMT5对细胞剪接的影响可能是依赖于剪接体机制的多种组分(Sm和hnRNP蛋白)的甲基化。PRMT5抑制还诱导淋巴瘤细胞系中的同工型转换(可变剪接)(图40，图A)且34种基因在所有测试的细胞系中显示出一致的可变剪接变化(图40，图B和C)。
总体而言，观察到数百个基因的剪接变化，突出显示PRMT5对剪接的影响不是全局的，而是针对有限数量的RNA有特异性。这种特异性的一个可能的解释可能是PRMT5直接调节特定剪接因子的RNA结合，例如hnRNPH1等。正在研究PRMT5抑制剂作用机制中可变剪接变化的作用，下面将讨论一个特定的例子。
MDM4剪接和p53途径的激活
据报道，PRMT5敲除或敲低导致MDM4同工型转换，其导致MDM4泛素连接酶活性对p53失活(在背景技术部分中描述)。PRMT5抑制导致在RNA-seq实验(GSEA)中测试的4种淋巴瘤细胞系中p53途径的激活。为了理解p53活化是否与MDM4同工型转换相关，分析了MDM4可变剪接。在所有4个淋巴瘤细胞系中观察到MDM4同工型转换。接下来，通过RT-PCR在一组4个MCL细胞系中确认MDM4剪接的变化(图41，图A，Z138，JVM-2和MAVER-1MCL细胞系对化合物C敏感，而REC-1是最具抗性的MCL细胞系)。在Z138和JVM-2细胞(两种p53野生型)中，化合物C诱导MDM4同工型转换。在MAVER-1和REC-1细胞(两种p53突变体)中，MDM4长型的基础表达低/不可检测，因此，不能检测到MDM4同工型转换。随后，在JVM-2和Z138细胞中p53和p21(或CDKN1A，p53靶基因)蛋白表达增加(图41，图B)。重要的是，在Z138细胞中，200nM化合物C和5μM MDM2抑制剂(Nutlin-3)处理使p53和p21表达增加至相似水平。这些数据表明PRMT5抑制调节表达高水平MDM4长同工型的细胞系中的MDM4剪接，并在p53野生型细胞系中诱导p53途径活性。正在评估p53途径在p53野生型MCL细胞对PRMT5抑制的响应的生物学中的作用。
此外，在用递增浓度的化合物C处理的Z138细胞中评估MDM4剪接、SDMA抑制和p53表达的变化的剂量响应，以评估PRMT5抑制、MDM4剪接和p53活化的关系(图42，图A和B)。在高于8nM的化合物C的浓度下，通过Western印迹检测不到SDMA水平。同时，在高于8nM的化合物C的浓度下，MDM4剪接和p53/p21蛋白表达的变化是明显的。这些结果表明，在基因剪接和随后的途径活性发生变化(MDM4/p53/p21)之前，需要基本上抑制PRMT5活性(没有Western可检测到的SDMA水平)。
这些数据表明PRMT5抑制通过调节MDM4剪接激活野生型p53。这种机制可用于p53不经常突变的癌症类型，例如血液和儿科恶性肿瘤。在淋巴瘤模型中，PRMT5抑制导致显著的(GSEA分析)和相对快速的p53途径激活，这可能有助于在用PRMT5抑制剂处理的细胞系中观察到的生长/死亡表型。敲低/挽救实验将用于进一步评估MDM4/p53途径在PRMT5抑制剂诱导的细胞响应中的作用。
MDM4同工型表达和p53突变是MCL中PRMT5抑制响应的潜在预测生物标志物。在MCL细胞系组中，仅有的两种野生型p53系Z138和JVM-2是最敏感的细胞系(最低的gIC50值和仅有两种在6天生长/死亡分析中表现出细胞毒性的MCL细胞系))。在两种细胞系中，化合物C处理导致MDM4同工型转换和p53途径活化。有限数量的MCL细胞系和建立初级MCL模型的极低成功率使我们无法进一步评估p53预测性生物标志物假说。虽然p53途径可能对p53野生型细胞对PRMT5抑制剂的响应生物学起重要作用，但我们的数据强烈强调了其他可以驱动抗肿瘤效力的途径的重要性，因为PRMT5抑制在没有功能性p53的情况下导致抗增殖作用(例如Maver-1细胞系)。
套细胞淋巴瘤：化合物C和依鲁替尼的比较和组合活性。
布鲁顿酪氨酸激酶(BTK)抑制剂依鲁替尼最近被批准用于MCL，在复发/难治性环境中具有前所未有的总体响应率，接近70％(Wang ML，等人，N Engl J Med.2013年8月8日；369(6):507-16)。然而，接受依鲁替尼治疗的大多数患者未达到完全缓解，中位无进展生存期约为14个月。为了解化合物C是否可用于依鲁替尼抗性MCL，在6天生长/死亡测定中评估化合物C和依鲁替尼敏感性(图43，图A)。具有低化合物C gIC50值的细胞系(Z-138，Maver-1和JVM-2)对依鲁替尼具有抗性，而依鲁替尼敏感品系(Mino，Jeko-1)仅对化合物C具有中度敏感性(图43，图A)。该数据表明依鲁替尼和化合物C的活性谱不重叠，并且依鲁替尼抗性MCL模型对PRMT5抑制敏感。此外，PRMT5抑制剂和依鲁替尼的组合在大多数测试的MCL细胞系中显示出协同的抗增殖活性(组合指数(CI)＜1)(图43，图B和C)，表明两种化合物的组合可以提供增加的治疗益处。这些数据表明PRMT5抑制剂可用于依鲁替尼耐药的MCL患者群体，并且可以在依鲁替尼难治性和敏感性环境中探索PRMT5抑制剂与依鲁替尼的组合。
套细胞淋巴瘤模型中的功效
为了测试在淋巴瘤细胞系模型中体外生长/死亡测定中观察到的功效是否转化为体内环境，在套细胞淋巴瘤(敏感Z138和Maver-1细胞系)的异种移植模型中进行化合物C功效研究。首先，在Z-138MCL异种移植模型中的21天功效研究中测试化合物C治疗对肿瘤生长的治疗效果。与媒介物样品相比，所有化合物C剂量组中的肿瘤显示出重量和体积的显著差异，最低剂量组(25mg/kg BID)的最低40％TGI至最高100mg/kg BID剂量组的高达＞90％(在所有功效研究中，在所有组中未观察到体重减轻，图44，图A)。使用SDMA western对肿瘤进行PD分析显示，所有剂量组的甲基标志物降低超过70％，在最高剂量组中高达＞98％(图44，图B)。
接下来，在Maver-1MCL异种移植模型中评估化合物C的功效(图45)。在第18天测量的所有化合物C剂量组中的肿瘤与媒介物样品相比在体积上显示出显著差异，范围从最低剂量组的最小50％TGI到最高剂量组中高达＞90％。使用SDMA对肿瘤进行PD分析显示所有剂量组的甲基标志物减少了80-95％。
这些数据表明化合物C处理在套细胞淋巴瘤的异种移植模型中导致显著的肿瘤生长抑制(接近100％TGI)。似乎对于最大TGI(＞90％)要求几乎完全抑制SDMA信号(＞90％)，表明为了在肿瘤中获得显著功效，需要将PRMT5活性抑制＞90％。
淋巴瘤生物学概要
·PRMT5与癌症之间目前描述的最强大的机制联系是在MCL中。PRMT5经常在MCL中过表达，并且在核区室中高度表达，其中增加组蛋白甲基化水平并沉默肿瘤抑制基因的亚类。重要的是，细胞周期蛋白D1(在绝大多数MCL患者中易位的癌基因)与PRMT5相关并通过cdk4依赖性机制增加PRMT5活性。PRMT5介导抑制负调节DNA复制的关键基因，从而允许细胞周期蛋白D1依赖性肿瘤生长。PRMT5敲低抑制细胞周期蛋白D1依赖性细胞转化，导致肿瘤细胞死亡。这些数据突出了PRMT5在MCL中的重要作用，并表明PRMT5抑制可用作MCL中的治疗策略。
·化合物C抑制MCL细胞系中的生长并诱导死亡，MCL细胞系是迄今为止测试的最敏感细胞系之一(在6天生长/死亡测定中)。在一组测试的MCL细胞系中，3个细胞系的gIC50＜10nM，2个细胞系显示gIC50≤100nM，1个细胞系的gIC50＞1μM。目前正在研究化合物C对PRMT5和细胞周期蛋白D1的下游靶标的影响，以评估其是否有助于抗生长和促细胞凋亡反应。
·SDMA抗体MethylscanTM用于评估MCL细胞系中的PRMT5底物。绝大多数含有SDMA的蛋白质是参与细胞剪接和RNA加工(SmB，Lsm4，hnRNPH1和其他)、转录(FUBP1)和翻译的因子，突出了PRMT5作为细胞RNA稳态的重要调节剂的作用。SDMA抗体进一步用于评估一组MCL细胞系中的PRMT5抑制，其中SDMA IC50值在敏感和抗性模型中相似，表明SDMA不是反应的标志物，而是PRMT5抑制的标志物。
·化合物C处理诱导RNA亚组中的剪接变化，特别是在MCL和DLBCL细胞系中观察到MDM4同工型转换，表明PRMT5抑制通过调节MDM4剪接激活p53途径。敲低/挽救实验将用于进一步评估MDM4/p53途径在PRMT5抑制剂诱导的细胞响应中的作用。
·MDM4同工型表达和p53突变是MCL中对PRMT5抑制响应的潜在预测性生物标志物。在MCL细胞系组中，两种野生型p53细胞系Z138和JVM-2是最敏感的细胞系(最低的gIC50值和仅有两个在6天生长/死亡测定中表现出细胞毒性的MCL细胞系)。
·近年来，依鲁替尼的临床探索彻底改变了MCL治疗的方法。体外数据表明，PRMT5抑制剂可用于依鲁替尼耐药的MCL患者群体，并且可以在依鲁替尼难治性和敏感性环境中探索PRMT5抑制剂与依鲁替尼的组合。
·体内研究表明，化合物C治疗在套细胞淋巴瘤的异种移植模型中导致显著的肿瘤生长抑制(接近100％TGI)。看起来为了在肿瘤中获得最大功效(TGI＞90％)，需要几乎完全抑制PRMT5活性(＞90％)。
乳腺癌生物学
细胞系筛选数据证明乳腺癌细胞系对PRMT5抑制敏感，并且在2D 6天生长/死亡测定中显示出几乎完全的生长抑制(低Ymin-T0，图32-34)。另外，来自患者衍生的(PDX)肿瘤模型组中的集落形成测定的数据表明，乳腺肿瘤是该组中最敏感的肿瘤之一(基于化合物E相对IC50值，图35)。因此，在若干生长/死亡和机制研究中评估乳腺癌细胞系，以评估PRMT5抑制在乳腺癌中的作用和治疗潜力。
为了理解跨不同乳腺肿瘤亚型的PRMT5抑制剂活性，使用PRMT5工具化合物在7天生长测定中分析一组乳腺癌细胞系(图46)。PRMT5抑制在所测试的乳腺癌细胞系的各种亚型中以低IC50值减弱细胞生长。与HER2或激素受体(HR)阳性细胞系相比，TNBC(三阴性乳腺癌)细胞系中的值IC50值最低。
在6天的生长/死亡测定中，大多数乳腺癌细胞系表现出细胞抑制作用。为了评估是否长期暴露于化合物C将影响响应的细胞抑制性与细胞毒性性质，在长期生长/死亡测定中评估PRMT5抑制剂(图47)。在SKBR3、MDA-MB-468和MCF-7细胞中，用化合物C(以及工具分子化合物B)处理在长时间暴露于化合物后导致细胞毒性响应(7-10天)。在ZR-75-1细胞中，PRMT5抑制剂在所有时间点(第3-12天)引发细胞抑制响应，而Z-138(MCL，包括作为对照)细胞在测定的所有时间点(第3-10天)表现出严重的总体净细胞死亡。这些数据表明PRMT5抑制在一部分乳腺癌细胞系中导致在长时间暴露(＞5天)后的净细胞死亡(细胞毒性响应)。
为了测试化合物C对细胞生长的影响是否与细胞周期分布的变化相关，使用碘化丙锭FACS(荧光激活细胞分选)分析评估化合物C对细胞周期的影响(图48)。总体而言，FACS结果与长期增殖数据一致，表明在4个乳腺癌细胞系中有3个，长期化合物C处理导致7-10天处理后诱导细胞死亡(＜2N增加)。在MCF-7细胞(p53野生型)中，化合物C处理导致在第2天细胞在G1期(2N)的积累和细胞周期的S期细胞的丢失(＞2N和＜4N)，随后细胞死亡，如第10天细胞在亚G1期(＜2N)积累所证明。在ZR-75-1细胞(p53野生型)中，化合物C对细胞周期分布影响较小。其中在第7天和第10天G1(2N)减少，且在＞4N细胞部分增加。MDA-MB-468和SKBR-3细胞系对化合物C处理的反应类似，在G1(2N)期(第7天或第10天)减少，在G2/M(4N)和＞4N DNA含量增加，这与subG1(＜2N)中细胞的积累一致，表明细胞死亡。这些数据表明PRMT5抑制影响细胞周期中细胞的分布，并且表型结果取决于细胞环境。
为了评估PRMT5活性是否在敏感和抗性乳腺癌细胞系中被同等地抑制，在PRMT5抑制剂处理后的细胞中测量SDMA水平(图49)。总体而言，SDMA降低的时间对于所有测试的细胞系(敏感和抗性)是相似的。在第3天观察到SDMA的最大抑制。MDA-MB-468细胞中的SDMAIC50为5.4nM，类似于Z138细胞中的SDMAIC50。这些数据表明SDMA是PRMT5催化活性的标志物，并且不能预测PRMT5抑制的抗增殖响应。SDMAIC50值正在一组乳腺癌细胞系中进一步评估。
体内乳腺癌模型的功效
接下来，在乳腺癌的体内模型中评估PRMT5抑制的功效。首先，用100mg/kg(QD和BID)和200mg/kg(QD)的化合物C处理MDA-MB-468，三阴性乳腺癌异种移植模型(图50)。在100mg/kg BID处理组中观察到最大肿瘤生长抑制(TGI＝83％)，其中SDMA抑制大于90％，而在100mg/kg QD处理的动物中，化合物C处理无效且SDMA抑制率低于80％。该数据表明SDMA水平需要几乎完全被抑制(＞90％)，以便在体内乳腺癌异种移植模型中看到显著的TGI。
乳腺癌概述
·在乳腺癌中，高PRMT5表达和高PDCD4(程序性细胞死亡4)水平预测总体不良生存率。
·乳腺癌细胞系和乳腺癌患者衍生模型是2D生长/死亡和集落形成测定中测试的最敏感模型之一。
·化合物C处理在6天生长/死亡测定中导致完全生长抑制，并且在测试的4个细胞系中的3个中长期暴露于PRMT5抑制剂诱导细胞死亡。
·在7天增殖试验中，TNBC细胞系对PRMT5的抑制作用比Her2和激素受体阳性细胞系更敏感。
·用PRMT5抑制剂处理的敏感和耐药乳腺癌细胞系的SDMA水平降低，表明SDMA不是反应的标志物，而是PRMT5活性的标志物。
·在MDA-MB-468异种移植模型中，化合物C治疗在100mg/kg BID治疗组中导致肿瘤生长抑制(TGI＝83％)，其中SDMA抑制大于90％，而在100mg/kg kg QD治疗的动物中，化合物C治疗无效并且SDMA抑制小于80％。该数据表明，为了在体内乳腺癌异种移植模型中观察到显著的TGI，需要几乎完全抑制SDMA水平(＞90％)。
·总体而言，这些数据表明PRMT5抑制作为乳腺癌，特别是TNBC亚型的潜在治疗策略。
成胶质细胞瘤(GBM)生物学
PRMT5蛋白在成胶质细胞瘤肿瘤中经常过表达，并且高PRMT5水平与GBM患者的等级(IV级)和较差的存活率强烈相关(Yan F，等人，Cancer Res.2014年3月15日；74(6)：1752-65)。PRMT5敲低减弱GBM细胞系的生长和存活并显著改善原位Gli36异种移植模型中的存活(Yan F，等人，Cancer Res.2014年3月15日；74(6):1752-65)。PRMT5还通过调节神经祖细胞的生长和分化在正常小鼠脑发育中起重要作用(Bezzi M，等人，Genes Dev.2013年9月1日；27(17)：1903-16)。
成胶质细胞瘤细胞系模型是软琼脂集落形成测定中最敏感的肿瘤类型之一(图35)。在2D，6天生长/死亡CTG测定中，GBM细胞系具有40-22000nM范围内的gIC50值，其中响应主要是细胞抑制，除SF539细胞系外(图32和33)。为了理解PRMT5抑制对更长时间暴露于PRMT5抑制剂后细胞生长和存活的影响，在2D、14天生长/死亡CTG测定中测试化合物C活性(图51)。总体而言，细胞抑制/细胞毒性响应的性质在长时间暴露于化合物后没有变化，并且响应于PRMT5抑制而经历凋亡的唯一细胞系是SF539。
接下来，通过测量SDMA、p53和p21蛋白水平和MDM4剪接，在用PRMT5抑制剂处理的GBM细胞中评估对细胞甲基化和p53途径的影响(图52)。PRMT5抑制导致所有测试细胞系中SDMA信号的减少(图52，图B)，而不考虑它们对PRMT5抑制的敏感性。在所有细胞系中检测到可变的MDM4剪接，除了SF539，其是p53突变体并且具有长MDM4同工型的低基础表达(图52，图A)。所有细胞系中p53水平均增加，而仅在具有野生型p53的细胞系(Z138(MCL)、U87-MG和A172(GBM))中观察到p21蛋白的诱导。这些数据表明PRMT5抑制剂可以激活GBM模型中的p53途径，可能通过MDM4活性的失活，类似于在淋巴瘤模型中观察到的效应。重要的是，GBM细胞系敏感性与p53突变状态无关，表明其他机制有助于PRMT5抑制诱导的生长抑制表型。有趣的是，PRMT5抑制导致野生型p53GBM细胞系中的细胞抑制响应。p53在GBM细胞系对PRMT5抑制的响应中的作用将在未来的研究中进一步测试。此外，正在探索PRMT5抑制对GBM模型中细胞周期和神经分化的影响。
成胶质细胞瘤概述
·PRMT5蛋白在成胶质细胞瘤肿瘤中经常过度表达，高PRMT5水平与GBM患者的高级别(IV级)和较差的生存率密切相关。
·成胶质细胞瘤细胞系模型是软琼脂集落形成测定中最敏感的肿瘤类型之一。
·在2D，6天和14天生长/死亡CTG测定中，GBM对PRMT5抑制的响应主要是细胞抑制的(4个细胞系中有3个，1个细胞系具有细胞毒性响应)。
·PRMT5抑制导致所有测试细胞系中SDMA信号的减少，而不考虑它们对PRMT5抑制的敏感性。
其他敏感性肿瘤类型
细胞系和患者衍生的模型筛选数据表明PRMT5抑制剂在广泛的肿瘤类型中减弱细胞生长和存活(图32-35)。
整体生物学概要
·化合物C抑制多种细胞蛋白上的对称精氨酸二甲基化，包括剪接体成分、组蛋白、转录因子和激酶。因此，PRMT5抑制剂通过多种机制影响RNA稳态，包括转录、剪接和mRNA翻译的变化。
·PRMT5抑制导致基因表达和剪接变化，最终导致p53的诱导。化合物C在p53泛素连接酶MDM4中诱导同工型转换，稳定p53蛋白，并在套细胞和弥漫性大B细胞淋巴瘤以及乳腺癌和胶质瘤癌细胞系(迄今唯一测试的肿瘤类型)中诱导p53靶基因表达信号传导。
·化合物C抑制广泛的实体和血液肿瘤细胞系中的增殖，并诱导一部分套细胞和弥漫型大B细胞淋巴瘤、乳腺癌、膀胱癌和神经胶质瘤细胞系的细胞死亡。在套细胞和弥漫型大B细胞淋巴瘤细胞系中观察到最有效的生长抑制。在套细胞淋巴瘤和乳腺癌的异种移植模型中测试化合物C功效，其中其显著抑制肿瘤生长。这些数据为使用化合物C作为套细胞淋巴瘤、弥漫型大B细胞淋巴瘤、乳腺癌和脑癌的治疗策略提供了强有力的理论依据。
实施例3
组合
采用两种合理的方法来研究与化合物A的潜在组合。首先，使用化合物A与PRMT5的抑制剂(主要的II型PRMT抑制剂(化合物B))的组合研究抑制两种不同类型的精氨酸甲基转移酶的组合效应。在这些研究中，黑素瘤、乳腺癌和淋巴瘤细胞系用化合物A和化合物B单一药物或组合使用每种抑制剂的固定1：1比例进行20点滴定的处理。Cell Titer Glo用于测量生长抑制，如前所述。与单一药物相比，这种组合在15/22的细胞系中产生了≥ 5-倍的更有效的gIC50，在6种细胞系中有≥ 10-倍增加。在显示对两种单一药物的细胞抑制响应的15种细胞系中，用组合处理的7种具有负Ymin-T0，表明转变为细胞毒性(图53，表8)。在所测试的6种淋巴瘤细胞系中，其中5种对单一药物中的任一种或两种具有细胞毒性，组合治疗导致3种细胞系中gIC100的变化≥5倍。这些数据表明可以实现对抑制生长的极大组合作用，其通过同时抑制I型和主要的II型PRMT。
化合物C(PRMT5临床候选物)目前处于1期临床开发阶段；因此，如果有必要，可以对这种组合进行评估。使用小鼠异种移植模型进行该组合的额外临床前测试。最后，该组合活性似乎不限于特定的肿瘤类型，这表明它可以提供扩展到超出化合物C或化合物A具有有效的单一药物功效的适应症的机会。正在研究调查这一假设。
表8化合物A和化合物B组合的效力的倍数变化。相对于每种细胞系的最有效的单一药物显示倍数变化。粗体表示效力增加＞5倍，斜体表示＞10倍。
*从细胞抑制转移至细胞毒性
实施例4
组合
测定化合物B与标准化学治疗剂和化合物B与化合物D的组合在三阴性乳腺癌(TNBC)和膀胱细胞系中的活性。
图54显示用化合物B与顺铂、卡铂、多柔比星、BET抑制剂、MEK抑制剂和化合物D的固定比例的组合处理的多种三阴性乳腺癌(TNBC)细胞系中相对于单一药物(化合物B)治疗的gIC50和gIC100倍数变化。没有观察到标准化学治疗剂的协同作用。在化合物B和化合物D组合中，7种TNBC细胞系中的6种表现出gIC50＞3倍的变化，其中6种中的4种显示出gIC50＞5倍的变化。
图55显示用化合物B与顺铂、卡铂、多柔比星、BET抑制剂、MEK抑制剂和化合物D的固定比例的组合处理的各种膀胱癌细胞系中相对于单一药物(化合物B)处理的gIC50和gIC100倍数变化。在化合物B和化合物D组合中，10个膀胱癌细胞系中的8个表现出gIC50＞3倍的变化，8个中的3个表现出gIC50的＞5倍变化。
图56显示用各种浓度的化合物B、化合物D和化合物B与化合物D的组合处理的膀胱癌细胞系(T24)的增殖测定结果。
图57显示用化合物B和化合物D单独和组合处理的膀胱癌细胞系SW-780和T24的增殖测定(Ymin-T0％变化)的结果。
图58显示用化合物B和化合物D的组合处理的10个膀胱癌细胞系和7个TNBC细胞系的增殖测定结果。显示了经历细胞毒性(负Ymin-T0％)和细胞抑制响应的膀胱癌和TNBC细胞系的百分比。。
使用以下材料和方法获得实施例4中描述的结果。
材料和方法
细胞系
细胞系获自GSK BioCat，American Type Culture Collection，或DeutscheSammlung von Mikroorganismen und Zellbulturen(DSMZ)。将所有细胞系在37℃、5％CO2中维持在推荐的细胞培养基中。在大多数情况下，这是补充有10％胎牛血清(FBS；Sigma)的RPMI-1640培养基。
标准的6天生长-死亡测定
根据AP12628v2(384-孔)中提及的方案，在一组细胞系上进行细胞增殖测定。通过监测384孔格式的一系列接种密度的增殖并确定细胞在6天内以对数方式生长的接种密度，确定所有细胞系的最佳细胞接种。将50uL细胞在培养基中以最佳接种密度手动铺在384孔板中。
用20点、两倍稀释系列的化合物D和化合物B(≤15μM最高剂量)和≤0.15％DMSO手动处理细胞，一式两份。将板在上述条件下培养6天。使用等体积的CellTiter-Glo(Promega)和发光信号测量细胞生长。在加入化合物时读取一块未处理的细胞板，以确定代表细胞起始数的T＝0值。

Claims (31)

1.I型蛋白质精氨酸甲基转移酶(I型PRMT)抑制剂和II型蛋白质精氨酸甲基转移酶(II型PRMT)抑制剂的组合。
2.权利要求1的组合，其中所述I型PRMT抑制剂为蛋白质精氨酸甲基转移酶1(PRMT1)抑制剂、蛋白质精氨酸甲基转移酶3(PRMT3)抑制剂、蛋白质精氨酸甲基转移酶4(PRMT4)抑制剂、蛋白质精氨酸甲基转移酶6(PRMT6)抑制剂、或蛋白质精氨酸甲基转移酶8(PRMT8)抑制剂。
3.权利要求1的组合，其中所述II型PRMT抑制剂为蛋白质精氨酸甲基转移酶5(PRMT5)抑制剂或蛋白质精氨酸甲基转移酶9(PRMT9)抑制剂。
4.权利要求1或2的组合，其中所述I型PRMT抑制剂为式(I)的化合物:
或其药学上可接受的盐，
其中
X为N，Z为NR4，且Y为CR5；或
X为NR4，Z为N，且Y为CR5；或
X为CR5，Z为NR4，且Y为N；或
X为CR5，Z为N，且Y为NR4；
RX为任选取代的C1-4烷基或任选取代的C3-4环烷基；
L1为键、-O-、-N(RB)-、-S-、-C(O)-、-C(O)O-、-C(O)S-、-C(O)N(RB)-、-C(O)N(RB)N(RB)-、-OC(O)-、-OC(O)N(RB)-、-NRBC(O)-、-NRBC(O)N(RB)-、-NRBC(O)N(RB)N(RB)-、-NRBC(O)O-、-SC(O)-、-C(＝NRB)-、-C(＝NNRB)-、-C(＝NORA)-、-C(＝NRB)N(RB)-、-NRBC(＝NRB)-、-C(S)-、-C(S)N(RB)-、-NRBC(S)-、-S(O)-、-OS(O)2-、-S(O)2O-、-SO2-、-N(RB)SO2-、-SO2N(RB)-、或任选取代的C1-6饱和或不饱和烃链，其中该烃链的一个或多个亚甲基单元任选且独立被以下替代：-O-、-N(RB)-、-S-、-C(O)-、-C(O)O-、-C(O)S-、-C(O)N(RB)-、-C(O)N(RB)N(RB)-、-OC(O)-、-OC(O)N(RB)-、-NRBC(O)-、-NRBC(O)N(RB)-、-NRBC(O)N(RB)N(RB)-、-NRBC(O)O-、-SC(O)-、-C(＝NRB)-、-C(＝NNRB)-、-C(＝NORA)-、-C(＝NRB)N(RB)-、-NRBC(＝NRB)-、-C(S)-、-C(S)N(RB)-、-NRBC(S)-、-S(O)-、-OS(O)2-、-S(O)2O-、-SO2-、-N(RB)SO2-、或-SO2N(RB)-；
各个RA独立地选自氢、任选取代的烷基、任选取代的烯基、任选取代的炔基、任选取代的碳环基、任选取代的杂环基、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基、连接至氧原子时的氧保护基和连接至硫原子时的硫保护基；
各个RB独立地选自氢、任选取代的烷基、任选取代的烯基、任选取代的炔基、任选取代的碳环基、任选取代的杂环基、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基和氮保护基，或相同氮原子上的RB和RW可与介于其间的氮一起形成任选取代的杂环；
RW为氢、任选取代的烷基、任选取代的烯基、任选取代的炔基、任选取代的碳环基、任选取代的杂环基、任选取代的芳基、或任选取代的杂芳基；条件是当L1为键时，RW不为氢、任选取代的芳基、或任选取代的杂芳基；
R3为氢、C1-4烷基、或C3-4环烷基；
R4为氢、任选取代的C1-6烷基、任选取代的C2-6烯基、任选取代的C2-6炔基、任选取代的C3-7环烷基、任选取代的4-至7-元杂环基；或任选取代的C1-4烷基-Cy；
Cy为任选取代的C3-7环烷基、任选取代的4-至7-元杂环基、任选取代的芳基、或任选取代的杂芳基；且
R5为氢、卤素、-CN、任选取代的C1-4烷基、或任选取代的C3-4环烷基。
5.权利要求1的组合，其中所述I型PRMT抑制剂为式(II)的化合物:
或其药学上可接受的盐。
6.权利要求4或5的组合，其中所述I型PRMT抑制剂为式(I)或式(II)的化合物，其中-L1-RW为任选取代的碳环基。
7.权利要求1-2和4-6任一项的组合，其中所述I型PRMT抑制剂为化合物A:
或其药学上可接受的盐。
8.权利要求1或3的组合，其中所述II型PRMT抑制剂为式(III)的化合物:
或其药学上可接受的盐,
其中
表示单键或双键；
R1为氢、Rz或-C(O)Rz，其中Rz为任选取代的C1-6烷基；
L为-N(R)C(O)-、-C(O)N(R)-、-N(R)C(O)N(R)-、-N(R)C(O)O-、或-OC(O)N(R)-；
各个R独立地为氢或任选取代的C1-6脂族基团；
Ar为具有0-4个独立选自氮、氧和硫的杂原子的单环或双环芳环，其中Ar取代有0、1、2、3、4或5个Ry基团，只要化合价允许；
各个Ry独立地选自卤素、-CN、-NO2、任选取代的脂族基团、任选取代的碳环基、任选取代的芳基、任选取代的杂环基、任选取代的杂芳基、-ORA、-N(RB)2、-SRA、-C(＝O)RA、-C(O)ORA、-C(O)SRA、-C(O)N(RB)2、-C(O)N(RB)N(RB)2、-OC(O)RA、-OC(O)N(RB)2、-NRBC(O)RA、-NRBC(O)N(RB)2、-NRBC(O)N(RB)N(RB)2、-NRBC(O)ORA、-SC(O)RA、-C(＝NRB)RA、-C(＝NNRB)RA、-C(＝NORA)RA、-C(＝NRB)N(RB)2、-NRBC(＝NRB)RB、-C(＝S)RA、-C(＝S)N(RB)2、-NRBC(＝S)RA、-S(O)RA、-OS(O)2RA、-SO2RA、-NRBSO2RA或-SO2N(RB)2；
各个RA独立地选自氢、任选取代的脂族基团、任选取代的碳环基、任选取代的杂环基、任选取代的芳基和任选取代的杂芳基；
各个RB独立地选自氢、任选取代的脂族基团、任选取代的碳环基、任选取代的杂环基、任选取代的芳基和任选取代的杂芳基，或两个RB基团与介于它们之间的原子一起形成任选取代的杂环；
R5、R6、R7和R8独立地为氢、卤素或任选取代的脂族基团；
各个RX独立地选自卤素、-CN、任选取代的脂族基团、-OR'和-N(R")2；
R'为氢或任选取代的脂族基团；
各个R"独立地为氢或任选取代的脂族基团，或两个R"与介于它们之间的原子一起形成杂环；且
n为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，只要化合价允许。
9.权利要求1、3或8的组合，其中所述II型PRMT抑制剂为式(X)的化合物:
或其药学上可接受的盐。
10.权利要求1、3、8和9任一项的组合，其中所述II型PRMT抑制剂为化合物C：
或其药学上可接受的盐。
11.I型蛋白质精氨酸甲基转移酶(I型PRMT)抑制剂和II型蛋白质精氨酸甲基转移酶(I型PRMT)抑制剂的组合，其中所述I型PRMT抑制剂为化合物A:
或其药学上可接受的盐，
且其中所述II型PRMT抑制剂为化合物C：
或其药学上可接受的盐。
12.在需要的人中治疗癌症的方法，该方法包括向人施用权利要求1-11任一项的组合，以及以下至少一种：药学上可接受的载体和药学上可接受的稀释剂，从而治疗所述人的癌症。
13.药物组合物，其包含治疗有效量的I型蛋白质精氨酸甲基转移酶(I型PRMT)抑制剂和第二药物组合物，该第二药物组合物包含治疗有效量的II型蛋白质精氨酸甲基转移酶(II型PRMT)抑制剂。
14.权利要求13所述的药物组合物，其中所述I型PRMT抑制剂为蛋白质精氨酸甲基转移酶1(PRMT1)抑制剂、蛋白质精氨酸甲基转移酶3(PRMT3)抑制剂、蛋白质精氨酸甲基转移酶4(PRMT4)抑制剂、蛋白质精氨酸甲基转移酶6(PRMT6)抑制剂、或蛋白质精氨酸甲基转移酶8(PRMT8)抑制剂。
15.权利要求13所述的药物组合物，其中所述II型PRMT抑制剂为蛋白质精氨酸甲基转移酶5(PRMT5)抑制剂或蛋白质精氨酸甲基转移酶9(PRMT9)抑制剂。
16.权利要求13或14所述的药物组合物，其中所述I型PRMT抑制剂为式(I)的化合物:
或其药学上可接受的盐，
其中
X为N，Z为NR4，且Y为CR5；或
X为NR4，Z为N，且Y为CR5；或
X为CR5，Z为NR4，且Y为N；或
X为CR5，Z为N，且Y为NR4；
RX为任选取代的C1-4烷基或任选取代的C3-4环烷基；
L1为键、-O-、-N(RB)-、-S-、-C(O)-、-C(O)O-、-C(O)S-、-C(O)N(RB)-、-C(O)N(RB)N(RB)-、-OC(O)-、-OC(O)N(RB)-、-NRBC(O)-、-NRBC(O)N(RB)-、-NRBC(O)N(RB)N(RB)-、-NRBC(O)O-、-SC(O)-、-C(＝NRB)-、-C(＝NNRB)-、-C(＝NORA)-、-C(＝NRB)N(RB)-、-NRBC(＝NRB)-、-C(S)-、-C(S)N(RB)-、-NRBC(S)-、-S(O)-、-OS(O)2-、-S(O)2O-、-SO2-、-N(RB)SO2-、-SO2N(RB)-、或任选取代的C1-6饱和或不饱和烃链，其中该烃链的一个或多个亚甲基单元任选且独立被以下替代：-O-、-N(RB)-、-S-、-C(O)-、-C(O)O-、-C(O)S-、-C(O)N(RB)-、-C(O)N(RB)N(RB)-、-OC(O)-、-OC(O)N(RB)-、-NRBC(O)-、-NRBC(O)N(RB)-、-NRBC(O)N(RB)N(RB)-、-NRBC(O)O-、-SC(O)-、-C(＝NRB)-、-C(＝NNRB)-、-C(＝NORA)-、-C(＝NRB)N(RB)-、-NRBC(＝NRB)-、-C(S)-、-C(S)N(RB)-、-NRBC(S)-、-S(O)-、-OS(O)2-、-S(O)2O-、-SO2-、-N(RB)SO2-、或-SO2N(RB)-；
各个RA独立地选自氢、任选取代的烷基、任选取代的烯基、任选取代的炔基、任选取代的碳环基、任选取代的杂环基、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基、连接至氧原子时的氧保护基和连接至硫原子时的硫保护基；
各个RB独立地选自氢、任选取代的烷基、任选取代的烯基、任选取代的炔基、任选取代的碳环基、任选取代的杂环基、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基和氮保护基，或相同氮原子上的RB和RW可与介于其间的氮一起形成任选取代的杂环；
RW为氢、任选取代的烷基、任选取代的烯基、任选取代的炔基、任选取代的碳环基、任选取代的杂环基、任选取代的芳基、或任选取代的杂芳基；条件是当L1为键时，RW不为氢、任选取代的芳基、或任选取代的杂芳基；
R3为氢、C1-4烷基、或C3-4环烷基；
R4为氢、任选取代的C1-6烷基、任选取代的C2-6烯基、任选取代的C2-6炔基、任选取代的C3-7环烷基、任选取代的4-至7-元杂环基；或任选取代的C1-4烷基-Cy；
Cy为任选取代的C3-7环烷基、任选取代的4-至7-元杂环基、任选取代的芳基、或任选取代的杂芳基；且
R5为氢、卤素、-CN、任选取代的C1-4烷基、或任选取代的C3-4环烷基。
17.权利要求13、14或16所述的药物组合物，其中所述I型PRMT抑制剂为式(II)的化合物:
或其药学上可接受的盐。
18.权利要求16或17所述的药物组合物，其中所述I型PRMT抑制剂为式(I)或式(II)的化合物，其中-L1-RW为任选取代的碳环基。
19.权利要求13-14和16-18任一项所述的药物组合物，其中所述PRMT1抑制剂为化合物A:
或其药学上可接受的盐。
20.权利要求13或15所述的药物组合物，其中所述II型抑制剂为式(III)的化合物:
或其药学上可接受的盐,
其中
表示单键或双键；
R1为氢、Rz或-C(O)Rz，其中Rz为任选取代的C1-6烷基；
L为-N(R)C(O)-、-C(O)N(R)-、-N(R)C(O)N(R)-、-N(R)C(O)O-、或-OC(O)N(R)-；
各个R独立地为氢或任选取代的C1-6脂族基团；
Ar为具有0-4个独立选自氮、氧和硫的杂原子的单环或双环芳环，其中Ar取代有0、1、2、3、4或5个Ry基团，只要化合价允许；
各个Ry独立地选自卤素、-CN、-NO2、任选取代的脂族基团、任选取代的碳环基、任选取代的芳基、任选取代的杂环基、任选取代的杂芳基、-ORA、-N(RB)2、-SRA、-C(＝O)RA、-C(O)ORA、-C(O)SRA、-C(O)N(RB)2、-C(O)N(RB)N(RB)2、-OC(O)RA、-OC(O)N(RB)2、-NRBC(O)RA、-NRBC(O)N(RB)2、-NRBC(O)N(RB)N(RB)2、-NRBC(O)ORA、-SC(O)RA、-C(＝NRB)RA、-C(＝NNRB)RA、-C(＝NORA)RA、-C(＝NRB)N(RB)2、-NRBC(＝NRB)RB、-C(＝S)RA、-C(＝S)N(RB)2、-NRBC(＝S)RA、-S(O)RA、-OS(O)2RA、-SO2RA、-NRBSO2RA或-SO2N(RB)2；
各个RA独立地选自氢、任选取代的脂族基团、任选取代的碳环基、任选取代的杂环基、任选取代的芳基和任选取代的杂芳基；
各个RB独立地选自氢、任选取代的脂族基团、任选取代的碳环基、任选取代的杂环基、任选取代的芳基和任选取代的杂芳基，或两个RB基团与介于它们之间的原子一起形成任选取代的杂环；
R5、R6、R7和R8独立地为氢、卤素或任选取代的脂族基团；
各个RX独立地选自卤素、-CN、任选取代的脂族基团、-OR'和-N(R")2；
R'为氢或任选取代的脂族基团；
各个R"独立地为氢或任选取代的脂族基团，或两个R"与介于它们之间的原子一起形成杂环；且
n为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，只要化合价允许。
21.权利要求13、15或20所述的药物组合物，其中所述II型PRMT抑制剂为式(X)的化合物:
或其药学上可接受的盐。
22.权利要求13、15、20或21所述的药物组合物，其中所述II型PRMT抑制剂为化合物C：
或其药学上可接受的盐。
23.药物组合物，其包含治疗有效量的I型蛋白质精氨酸甲基转移酶(I型PRMT)抑制剂和第二药物组合物，该第二药物组合物包含治疗有效量的II型蛋白质精氨酸甲基转移酶(II型PRMT)抑制剂，其中所述PRMT1抑制剂为化合物A:
或其药学上可接受的盐，且其中所述II型PRMT抑制剂为化合物C：
或其药学上可接受的盐。
24.在需要的人中治疗癌症的方法，该方法包括向人施用治疗有效量的权利要求13-23任一项所述的药物组合物，从而治疗所述人的癌症。
25.权利要求24所述的方法，其中所述I型PRMT抑制剂和II型PRMT抑制剂以选自以下的途径给药于患者：同时、相继、以任何顺序、全身、口服、静脉内和瘤内。
26.权利要求24-25任一项所述的方法，其中所述I型PRMT抑制剂和/或II型PRMT抑制剂口服给药。
27.权利要求24-26任一项所述的方法，其中所述I型PRMT抑制剂和II型PRMT抑制剂以约1:1的比例给药。
28.权利要求24-27任一项所述的方法，其中所述癌症为实体瘤或血液癌症。
29.权利要求24-28任一项所述的方法，其中所述癌症为黑素瘤、乳腺癌、淋巴瘤或膀胱癌。
30.权利要求1-11任一项的组合在制备药物中的用途。
31.权利要求1-11任一项的组合在治疗癌症中的用途。
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