CN110205298A

CN110205298A - 一种靶向kras突变的异体抗原递呈细胞、构建方法及肠癌特异性ctl细胞的制备方法

Info

Publication number: CN110205298A
Application number: CN201910500890.5A
Authority: CN
Inventors: 焦顺昌; 张嵘; 周子珊
Original assignee: Beijing Dingcheng Taiyuan Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Beijing Dingcheng Taiyuan Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2019-06-11
Filing date: 2019-06-11
Publication date: 2019-09-06
Anticipated expiration: 2039-06-11
Also published as: CN110205298B

Abstract

本发明提供了一种靶向KRAS突变的异体抗原递呈细胞、构建方法和肠癌特异性CTL细胞的制备方法，属于肿瘤靶向治疗技术领域，所述靶向KRAS突变的异体抗原递呈细胞的构建方法包括以下步骤：1)分析某一肠癌患者的HLA分型和KRAS突变序列组合的亲和力，选择亲和力最高的组合合成融合基因；2)将合成的融合基因连接到表达载体上获得重组载体；3)将所述重组载体转入健康来源的单核细胞，进行诱导培养获得靶向KRAS突变的异体抗原递呈细胞。所述靶向KRAS突变的异体抗原递呈细胞，解决了异体DC与患者HLA分型不匹配的问题，可以刺激更强的免疫反应。所述肠癌特异性CTL细胞对靶细胞具有良好的杀伤效果。

Description

一种靶向KRAS突变的异体抗原递呈细胞、构建方法及肠癌特异性CTL细胞的制备方法

技术领域

本发明属于肿瘤靶向治疗技术领域，尤其涉及一种靶向KRAS突变的异体抗原递呈细胞、构建方法和肠癌特异性CTL细胞的制备方法。

背景技术

肠癌患者中，KRAS突变，是对靶向药抗药的原因之一；因此，KRAS突变患者很难从靶向药中获益，生存期短，因此，迫切需要开发针对KRAS突变的免疫细胞治疗手段。同时，患者来源的树突状细胞DC，数量少，能力差，如果以自体的DC作为KARS的抗原提呈，制备的细胞毒性T淋巴细胞CTL中，特异性细胞比例少，杀伤能力弱。如果是异体DC，HLA又不匹配，无法使用。

因此，如何制备高效提呈KRAS突变抗原的DC，并以此DC制备靶向各种KRAS突变的CTL，以杀伤各种KRAS突变的实体肿瘤是目前急需解决的技术难题。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种靶向KRAS突变的异体抗原递呈细胞的构建方法。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

一种靶向KRAS突变的异体抗原递呈细胞的构建方法，包括以下步骤：

1)分析某一肠癌患者的HLA分型和KRAS突变序列组合的亲和力，选择亲和力最高的组合合成融合基因；

2)将步骤1)中合成的融合基因连接到表达载体上获得重组载体；

3)将步骤2)所述重组载体转入健康来源的单核细胞，进行诱导培养获得靶向KRAS突变的异体抗原递呈细胞。

优选的，所述分析亲和力的工具为NetMHCpan 4.0Server在线软件。

优选的，所述融合基因还包括连接HLA分型和KRAS突变序列的剪切肽的编码序列。

优选的，所述肠癌患者的HLA分型包括HLA-A0206、HLA-A2601、HLA-B4001、HLA-B1301、HLA-C0304和HLA-C0702。

优选的，所述KRAS突变包括KRAS-G12A、KRAS-G12C、KRAS-G12D、KRAS-G12S、KRAS-G12V、KRAS-G13D和KRAS-Q61H。

优选的，亲和力最高的组合为HLA-A0206和KRAS-G12D。

优选的，所述剪切肽包括P2A、T2A和E2A中的一种。

优选的，所述融合基因表达的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No:1所示。

本发明还提供了所述制备方法制备获得的靶向KRAS突变的异体抗原递呈细胞。

本发明还提供了一种肠癌特异性CTL细胞的制备方法，包括以下步骤：用所述的靶向KRAS突变的异体抗原递呈细胞与外周血单个核细胞中的T细胞进行共培养20～22d获得肠癌特异性CTL细胞

优选的，所述的外周血单个核细胞来源于步骤1)中所述的肠癌患者或者步骤3)中所述的单核细胞的提供者。

本发明的有益效果：本发明所述的靶向KRAS突变的异体抗原递呈细胞，利用基因工程的手段，通过将肠癌患者的的HLA分型和KRAS突变序列组合合成融合基因，并将所述融合基因导入健康来源的DC中获得；解决了异体DC与患者HLA分型不匹配的问题，所述靶向KRAS突变的异体抗原递呈细胞，与患者来源的DC相比，具有正常的抗原提呈能力，可以刺激更强的免疫反应。

另外本发明提供的肠癌特异性CTL细胞的制备方法，通过异体DC诱导获得肠癌特异性CTL细胞，对KRAS突变的靶细胞，具有良好的杀伤效果。流式细胞分析仪检测CTL的细胞表型结果表明，异体DC诱导的CTL细胞，6.16％为NK，16.7％为NKT，76.9％为T细胞，而CD8+细胞超过70％；靶细胞杀伤实验表明，自体DC和异体DC诱导的CTL细胞，对靶细胞均有一定的杀伤作用，且异体DC诱导的CTL对靶细胞的杀伤效率更高。

附图说明

图1为电泳检测融合基因的表达结果；

图2为流式细胞分析仪检测实施例2中制备获得的CTL肠癌特异性的细胞表型；

图3为自体DC和异体DC诱导的CTL细胞对靶细胞的杀伤效果。

具体实施方式

本发明提供了一种靶向KRAS突变的异体抗原递呈细胞的构建方法，包括以下步骤：1)分析某一肠癌患者的HLA分型和KRAS突变序列组合的亲和力，选择亲和力最高的组合合成融合基因；2)将步骤1)中合成的融合基因连接到表达载体上获得重组载体；3)将步骤2)所述重组载体转入健康来源的单核细胞，进行诱导培养获得靶向KRAS突变的异体抗原递呈细胞。

在本发明中，分析某一肠癌患者的HLA分型和KRAS突变序列组合的亲和力，选择亲和力最高的组合合成融合基因。本发明对所述肠癌患者没有特殊要求，任意肠癌患者均可。在本发明中，HLA分型和KRAS突变序列组合的亲和力分析优选的采用NetMHCpan 4.0Server在线软件；本发明中所述NetMHCpan4.0Server在线软件的操作采用本领域常规的操作即可。本发明在HLA分型和KRAS突变序列组合的亲和力分析后，对所述HLA分型和KRAS突变序列的组合进行亲和力高低排序，从中选择亲和力最高的组合合成融合基因。本发明中，所述亲和力最高的组合因人而异，不同肠癌患者筛选出的亲和力最高的组合并不相同。在本发明中，所述融合基因还包括连接述HLA分型和KRAS突变序列的剪切肽的编码序列；所述剪切肽优选的包括P2A、T2A和E2A中的一种；本发明中，所述P2A的氨基酸序列优选的如SEQ IDNO：12所示(ATNFSLLKQA GDVEENPGP)；所述T2A的氨基酸序列优选的如SEQ ID NO：13所示(EGRGSLLTCG DVEENPGP)；所述E2A的氨基酸序列如SEQ ID NO：14所示(QCTNYALLKLAGDVESNPGP)。

在本发明的一个具体实施过程中，所述肠癌患者的HLA分型包括HLA-A0206、HLA-A2601、HLA-B4001、HLA-B1301、HLA-C0304和HLA-C0702；所述KRAS突变包括KRAS-G12A、KRAS-G12C、KRAS-G12D、KRAS-G12S、KRAS-G12V、KRAS-G13D和KRAS-Q61H，氨基酸序列优选的依次如SEQ ID NO：3～SEQ ID NO：9所示。本发明中，所述HLA分型与KRAS突变抗原组合包括：HLA-A0206+KRAS-G12D、HLA-A0206+KRAS-G13D、HLA-A0206+KRAS-G12V、HLA-A0206+KRAS-G12C、HLA-A0206+KRAS-G12S、HLA-A0206+KRAS-G12A、HLA-A0206+KRAS-Q61H、KRAS-G12D+HLA-A0206、KRAS-G13D+HLA-A0206、KRAS-G12V+HLA-A0206、KRAS-G12C+HLA-A0206、KRAS-G12S+HLA-A0206、KRAS-G12A+HLA-A0206和KRAS-Q61H+HLA-A0206；其中亲和力最高的组合为HLA-A0206和KRAS-G12D。在本发明中，所述融合基因表达的蛋白质的氨基酸序列优选的如SEQ ID No:1所示。在本发明中，编码所述蛋白质的DNA序列可以有多种选择，对此不作限定；优选的为密码子优化后的人工序列如SEQ ID NO：2所示。本发明中所述融合基因优选的委托生物科技公司进行合成。

本发明在获得所述融合基因后，将合成的融合基因连接到表达载体上获得重组载体。本发明对所述重组载体的制备方法没有特殊限定，采用本领域常规的重组载体的制备方法即可；在本发明具体实施过程中，委托生物科技公司进行制备。本发明对所述表达载体没有特殊限定，采用本领域常规表达载体即可，在本发明具体实施过程中，采用pCDH载体。本发明在获得重组载体后，优选的将所述重组载体转入到Stabl3感受态细胞中，进行克隆培养获得重组细胞。本发明在获得所述重组细胞后，对所述重组细胞进行测序验证；验证所述重组细胞中确实存在融合基因后，再进行后续实验。本发明优选的从所述重组细胞中提取重组载体；本发明对所述重组载体的提取方法没有特殊限定，优选的采用质粒提取试剂盒进行。

本发明在获得所述重组载体后，所述重组载体转入健康来源的单核细胞，进行诱导培养获得靶向KRAS突变的异体抗原递呈细胞。在本发明中，所述重组载体转入健康来源的单核细胞的方法优选的电击转化法。在本发明中，所述健康来源的单核细胞为外周血单个核细胞(PBMC)；所述健康来源的单核细胞的提供者优选的为根据肠癌患者的HLA分型结果，选取A、B、C三个等位基因中，各有一个与肠癌患者相同的异体供者。本发明对所述采集外周血单个核细胞的方法没有特殊限定，采用本领域常规方法即可。本发明在采集到所述外周血单个核细胞后优选的对所述外周血单个核细胞进行浓度调整和培养；调整后的浓度优选为1×10⁷细胞/mL；所述浓度调整用的培养基优选为添加10wt％FBS的1640培养基；所述培养优选的为将所述浓度调整后的外周血单个核细胞至于培养皿中，于37℃5％CO₂培养箱，静置过夜。本发明在所述培养后，收集贴壁的单核细胞进行后续的电击转化。本发明中，所述电击转化的电压优选为100～350V，更优选为200～300V，最优选为250V；所述电击转化的时间优选为0.3ms-0.5ms；所述电击转化采用的电极优选为2mm电极。在本发明中，所述重组载体的浓度优选为5～20μg/mL，更优选为8～15μg/mL，最优选为10μg/mL。

本发明在所述电击转化后，诱导培养所述电击转化后的细胞获得靶向KRAS突变的异体抗原递呈细胞。在本发明中，所述诱导培养包括以下步骤：S1)将所述电击转化后的细胞加入到添加了1wt％人血白蛋白的新鲜培养液X-VIVO中，调整细胞浓度为1×10⁶细胞/mL至于培养皿中，于37℃5％CO₂培养箱培养24～72h；S2)向所述培养皿中加入1000IU/mL IL-4和800IU/mLGM-CSF继续培养3d，收集成熟的DC即为靶向KRAS突变的异体抗原递呈细胞。在本发明中，步骤S1)中培养时间优选为36～60h，更优选为48h。

本发明还提供了一种肠癌特异性CTL细胞的制备方法，包括以下步骤：用所述的靶向KRAS突变的异体抗原递呈细胞与外周血单个核细胞中的T细胞进行共培养20～22d获得肠癌特异性CTL细胞。在本发明中，所述的外周血单个核细胞来源于步骤1)中所述的肠癌患者或者步骤3)中所述的单核细胞的提供者。本发明对所述外周血单个核细胞的采集方法没有特殊限定，采用本领域常规的外周血单个核细胞的采集方法即可(Ficoll-Pague，GE：17544202)。在本发明具体实施过程中，对从所述外周血单个核细胞中分离T细胞的方法没有特殊限定，采用本领域常规方法即可(美天旎细胞分离试剂盒)。

在本发明中，所述共培养的时间优选为21d；所述靶向KRAS突变的异体抗原递呈细胞与外周血单个核细胞中的T细胞的数量比例优选为1：(100～500)，更优选为1：(150～300)，最优选为1:200。本发明在所述共培养48h后，优选的每天加入IL-2，所述IL-2在共培养体系中的终浓度优选为40～1000IU/mL，更优选为50IU/mL；本发明在所述共培养5d后，优选的在培养基变黄时进行半量换液(X-VIVO+50IU/mL IL 2)；并根据细胞生长情况补充培养基，确保细胞密度维持在0.5～1×10⁶/mL。本发明在所述共培养结束后收获细胞即为肠癌特异性CTL细胞。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

一种靶向KRAS突变的异体抗原递呈细胞的构建

根据患者的HLA分型结果，和KRAS突变序列，以在线预测软件NetMHCpan 4.0Server分析所有HLA分型与KRAS组合的亲和力，并进行排序；

HLA分型包括：HLA-A0206、HLA-A2601、HLA-B4001、HLA-B1301、HLA-C0304、HLA-C0702

KRAS突变包括：

KRAS-12A：TEYKLVVVGAAGVGKSALTIQ(SEQ ID NO：3)

KRAS-12C：TEYKLVVVGACGVGKSALTIQ(SEQ ID NO：4)

KRAS-12D：TEYKLVVVGADGVGKSALTIQ(SEQ ID NO：5)

KRAS-12S：TEYKLVVVGASGVGKSALTIQ(SEQ ID NO：6)

KRAS-12V：TEYKLVVVGAVGVGKSALTIQ(SEQ ID NO：7)

KRAS-13D：EYKLVVVGAGDVGKSALTIQL(SEQ ID NO：8)

KRAS-61H：CLLDILDTAGHEEYSAMRDQY(SEQ ID NO：9)

HLA分型与KRAS突变抗原组合包括：HLA-A0206+KRAS-G12D、HLA-A0206+KRAS-G13D、HLA-A0206+KRAS-G12V、HLA-A0206+KRAS-G12C、HLA-A0206+KRAS-G12S、HLA-A0206+KRAS-G12A、HLA-A0206+KRAS-Q61H、KRAS-G12D+HLA-A0206、KRAS-G13D+HLA-A0206、KRAS-G12V+HLA-A0206、KRAS-G12C+HLA-A0206、KRAS-G12S+HLA-A0206、KRAS-G12A+HLA-A0206和KRAS-Q61H+HLA-A0206；其中亲和力最高的组合为HLA-A0206和KRAS-G12D。

构建HLA与KRAS融合蛋白重组表达载体：

1)选区高亲和力组合HLA-A0206和KRAS-G12D，以P2A剪切肽连接，进行基因合成(金维智生物科技有限公司)，并由金维智生物科技有限公司直接克隆到pCDH表达载体上；

2)上述得到的表达载体转化Stabl3感受态细胞，挑取单克隆，进行测序，选择测序结果正确的克隆，进行后续实验。

重组载体转入健康来源的单核细胞

制备重组载体：

以质粒提取试剂盒(天根生物科技有限公司)进行质粒的提取，方法按照厂家说明书；

分离异体DC细胞：

1)根据患者的HLA分型结果，选取A、B、C三个等位基因中，各有一个与患者相同的异体供者(HLA-A0206、B4001、C0304)，进行单个核细胞的采集，分离PBMC；

2)将PBMC以培养基1640+10％FBS调整至1×10⁷细胞/mL，至于培养皿中，于37℃5％CO₂培养箱，静止过夜；

3)以培养基1640+10％FBS对贴在培养皿底部的细胞进行吹打，收集贴壁的单核细胞，备用，标记为DC；

重组载体电击转化DC

将得到的重组载体，电击转入分离得到的单核细胞DC(1×10⁷cells/mL)；电击转化条件如下：重组载体浓度调整至10μg/mL，2mm电极，电压为250V，时间0.3ms。

提取电击48h后的DC的RNA，进行反转录，再以融合基因的特异性引物进行PCR鉴定，结果如图1所示，可以鉴定出目的条带，说明，HLA和KRAS突变均可表达；

融合基因鉴定引物：F：A TGGCCGTCAT GGCGCCCCGAACCCTCGTCC(SEQ ID NO：10)；R：GGATCCCTGG ATGGTTAAAGCGCTCTTTCC CACT(SEQ ID NO：11)

鉴定体系20μL：具体如下：

cDNA 2μL

引物F+R 2μL

酶混合物 10μL

水 6μL

鉴定的扩增程序：(1)95℃5min；(2)95℃1min，62℃1min，72℃2min，25个循环；(3)72℃5min。

诱导DC成熟

向上述电击转化的细胞，加入新鲜的培养液X-VIVO+1％人血白蛋白，计数，调整至1×10⁶细胞/mL，至于平皿中，于37℃5％CO2培养箱，培养48h，加入1000IU/mL IL-4和800IU/mL GM-CSF，培养3d后，收集成熟的DC。

实施例2

肠癌特异性CTL细胞

1.分离T细胞：

1)离心收集患者本人的PBMC，以PBS重悬，细胞过30μm细胞筛，计数；

2)离心，300g 10min，完全去除上清；

3)以分离缓冲液(PBS，pH 7.2，0.5％BSA2mM EDTA)重悬细胞，每10⁷个细胞以80μL分离缓冲液重悬；

4)每10⁷个细胞，加入CD3磁珠(德国美天旎生物技术有限公司)；

5)混匀后，孵育15min(2-8℃)

6)每10⁷个细胞，加入1～2mL分离buffer重悬细胞，300g 10min离心，完全去除上清；

7)将10⁸个以内的细胞以500μL分离buffer重悬；

8)以分离buffer润洗分离柱；MS：500μL，LS：3mL

9)将细胞转移至分离柱；

10)收集未结合的细胞，并以分离buffer冲洗3次，液体完全流出时，再加入分离buffer；MS：3×500μL；

11)从分离器上卸下柱子，放到适合的分离管上；

12)加入适量的分离缓冲液，立即将细胞推出，收集细胞备用；

2.DC诱导靶向KRAS突变的CTL细胞

将CD8+T细胞以X-VIVO培养基调整至1×106/mL，2mL接种于6孔板中，将DC按1：200比例加入孔中标记为Day 0。

2)共培养48h后，按培养基体积，每天加入IL-2，终浓度为优选50IU/mL；

4)Day 5后，培养基变黄时进行半量换液(X-VIVO+50IU/mL IL 2)。根据细胞生长情况补充培养基，细胞密度维持在0.5～1×106/mL；

5)Day 21收获细胞，既为肠癌特异性CTL细胞。

实施例3

肠癌特异性CTL细胞的细胞性能检测

1)收集实施例2中的肠癌特异性CTL细胞，1000rpm离心5min；

2)1×10⁶细胞/管，加入CD3、CD4、CD8和CD56的抗体，室温避光30min；

3)PBS洗两次，1000rpm离心5min

PBS重悬，进行流式分析细胞表型。

流式细胞分析仪检测CTL的细胞表型结果如图2所示，实施例2中的异体DC诱导的肠癌特异性CTL细胞种，6.16％为NK细胞，16.7％为NKT细胞，76.9％为T细胞，而T细胞中CD8+细胞超过70％。

杀伤实验——LDH法

分别以自体的DC和异体的DC，进行CTL的诱导；将实施例1中的融合基因，以同样的方法，转入H358细胞中，构建H358-HLA-A0206-KRAS-G12D靶细胞，以LDH法检测诱导的CTL对靶细胞的杀伤情况。具体操作如下：

1)收集靶细胞(H358-HLA0206-KRAS-G12D，表达HLA0206和KRAS-G12D的H358)，1000rpm离心5min；

2)以PBS洗一遍，1000rpm离心5min；

3)以1640+2％FBS重悬后，计数调整至8×10⁴细胞/mL，分至96孔板中(U型底)，50μL/孔，备用；

4)收集CTL细胞，1000rpm离心5min；

5)以PBS洗一遍，1000rpm离心5min；

6)以1640+2％FBS重悬细胞计数后，分至96孔板中(U型底)，50μL/孔，设置效靶比为10：1、5：1、2.5：1和1.25：1；

7)37℃5％CO₂共孵育3.5h后，进行LDH检测；结果如图3所示，自体DC和异体DC诱导的CTL，对靶细胞均有一定的杀伤作用，且异体DC诱导的CTL对靶细胞的杀伤效率更高。

由上述实施例可知，本发明提供的靶向KRAS突变的异体抗原递呈细胞，解决了异体DC与患者HLA分型不匹配的问题，与患者来源的DC相比，具有正常的抗原提呈能力，可以刺激更强的免疫反应。本发明提供的肠癌特异性CTL细胞的制备方法制备获得的肠癌特异性CTL细胞对靶细胞具有良好的杀伤效果。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 焦顺昌

北京鼎成肽源生物技术有限公司

<120> 一种靶向KRAS突变的异体抗原递呈细胞、构建方法及肠癌特异性CTL细胞的制备方法

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 554

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Ala Val Met Ala Pro Arg Thr Leu Val Leu Leu Leu Ser Gly Ala

1 5 10 15

Leu Ala Leu Thr Gln Thr Trp Ala Gly Ser His Ser Met Arg Tyr Phe

20 25 30

Tyr Thr Ser Val Ser Arg Pro Gly Arg Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala

35 40 45

Val Gly Tyr Val Asp Asp Thr Gln Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ala

50 55 60

Ala Ser Gln Arg Met Glu Pro Arg Ala Pro Trp Ile Glu Gln Glu Gly

65 70 75 80

Pro Glu Tyr Trp Asp Gly Glu Thr Arg Lys Val Lys Ala His Ser Gln

85 90 95

Thr His Arg Val Asp Leu Gly Thr Leu Arg Gly Tyr Tyr Asn Gln Ser

100 105 110

Glu Ala Gly Ser His Thr Val Gln Arg Met Tyr Gly Cys Asp Val Gly

115 120 125

Ser Asp Trp Arg Phe Leu Arg Gly Tyr His Gln Tyr Ala Tyr Asp Gly

130 135 140

Lys Asp Tyr Ile Ala Leu Lys Glu Asp Leu Arg Ser Trp Thr Ala Ala

145 150 155 160

Asp Met Ala Ala Gln Thr Thr Lys His Lys Trp Glu Ala Ala His Val

165 170 175

Ala Glu Gln Leu Arg Ala Tyr Leu Glu Gly Thr Cys Val Glu Trp Leu

180 185 190

Arg Arg Tyr Leu Glu Asn Gly Lys Glu Thr Leu Gln Arg Thr Asp Ala

195 200 205

Pro Lys Thr His Met Thr His His Ala Val Ser Asp His Glu Ala Thr

210 215 220

Leu Arg Cys Trp Ala Leu Ser Phe Tyr Pro Ala Glu Ile Thr Leu Thr

225 230 235 240

Trp Gln Arg Asp Gly Glu Asp Gln Thr Gln Asp Thr Glu Leu Val Glu

245 250 255

Thr Arg Pro Ala Gly Asp Gly Thr Phe Gln Lys Trp Ala Ala Val Val

260 265 270

Val Pro Ser Gly Gln Glu Gln Arg Tyr Thr Cys His Val Gln His Glu

275 280 285

Gly Leu Pro Lys Pro Leu Thr Leu Arg Trp Glu Pro Ser Ser Gln Pro

290 295 300

Thr Ile Pro Ile Val Gly Ile Ile Ala Gly Leu Val Leu Phe Gly Ala

305 310 315 320

Val Ile Thr Gly Ala Val Val Ala Ala Val Met Trp Arg Arg Lys Ser

325 330 335

Ser Asp Arg Lys Gly Gly Ser Tyr Ser Gln Ala Ala Ser Ser Asp Ser

340 345 350

Ala Gln Gly Ser Asp Val Ser Leu Thr Ala Cys Lys Val Asp Tyr Lys

355 360 365

Asp Asp Asp Asp Lys Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp

370 375 380

Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Ala Thr Met Ser Arg Ser Val Ala Leu

385 390 395 400

Ala Val Leu Ala Leu Leu Ser Leu Ser Gly Leu Glu Ala Ile Gln Arg

405 410 415

Thr Pro Lys Ile Gln Val Tyr Ser Arg His Pro Ala Glu Asn Gly Lys

420 425 430

Ser Asn Phe Leu Asn Cys Tyr Val Ser Gly Phe His Pro Ser Asp Ile

435 440 445

Glu Val Asp Leu Leu Lys Asn Gly Glu Arg Ile Glu Lys Val Glu His

450 455 460

Ser Asp Leu Ser Phe Ser Lys Asp Trp Ser Phe Tyr Leu Leu Tyr Tyr

465 470 475 480

Thr Glu Phe Thr Pro Thr Glu Lys Asp Glu Tyr Ala Cys Arg Val Asn

485 490 495

His Val Thr Leu Ser Gln Pro Lys Ile Val Lys Trp Asp Arg Asp Met

500 505 510

Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn

515 520 525

Pro Gly Pro Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Asp Gly Val

530 535 540

Gly Lys Ser Ala Leu Thr Ile Gln Gly Ser

545 550

<210> 2

<211> 1656

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atggccgtca tggcgccccg aaccctcgtc ctgctactct cgggggctct ggccctgacc 60

cagacctggg cgggctctca ctccatgagg tatttctaca cctccgtgtc ccggcccggc 120

cgcggggagc cccgcttcat cgcagtgggc tacgtggacg acacgcagtt cgtgcggttc 180

gacagcgacg ccgcgagcca gaggatggag ccgcgggcgc cgtggataga gcaggagggt 240

ccggagtatt gggacgggga gacacggaaa gtgaaggccc actcacagac tcaccgagtg 300

gacctgggga ccctgcgcgg ctactacaac cagagcgagg ccggttctca caccgtccag 360

aggatgtatg gctgcgacgt ggggtcggac tggcgcttcc tccgcgggta ccaccagtac 420

gcctacgacg gcaaggatta catcgccctg aaagaggacc tgcgctcttg gaccgcggcg 480

gacatggcag ctcagaccac caagcacaag tgggaggcgg cccatgtggc ggagcagttg 540

agagcctacc tggagggcac gtgcgtggag tggctccgca gatacctgga gaacgggaag 600

gagacgctgc agcgcacgga cgcccccaaa acgcatatga ctcaccacgc tgtctctgac 660

catgaagcca ccctgaggtg ctgggccctg agcttctacc ctgcggagat cacactgacc 720

tggcagcggg atggggagga ccagacccag gacacggagc tcgtggagac caggcctgca 780

ggggatggaa ccttccagaa gtgggcggct gtggtggtgc cttctggaca ggagcagaga 840

tacacctgcc atgtgcagca tgagggtttg cccaagcccc tcaccctgag atgggagccg 900

tcttcccagc ccaccatccc catcgtgggc atcattgctg gcctggttct ctttggagct 960

gtgatcactg gagctgtggt cgctgctgtg atgtggagga ggaagagctc agatagaaaa 1020

ggagggagct actctcaggc tgcaagcagt gacagtgccc agggctctga tgtgtctctc 1080

acagcttgta aagtggatta caaggatgac gacgataagg agggcagagg aagtcttcta 1140

acatgcggtg acgtggagga gaatcccggc cctgccacca tgtctcgctc cgtggcctta 1200

gctgtgctcg cgctactctc tctttctggc ctggaggcta tccagcgtac tccaaagatt 1260

caggtttact cacgtcatcc agcagagaat ggaaagtcaa atttcctgaa ttgctatgtg 1320

tctgggtttc atccatccga cattgaagtt gacttactga agaatggaga gagaattgaa 1380

aaagtggagc attcagactt gtctttcagc aaggactggt ctttctatct cttgtactac 1440

actgaattca cccccactga aaaagatgag tatgcctgcc gtgtgaacca tgtgactttg 1500

tcacagccca agatagttaa gtgggatcga gacatggcca cgaacttctc tctgttaaag 1560

caagcaggag atgttgaaga aaaccccggg cctaccgagt acaagctggt ggtggtggga 1620

gccgacggag tgggaaagag cgctttaacc atccag 1656

<210> 3

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Ala Gly Val Gly Lys Ser

1 5 10 15

Ala Leu Thr Ile Gln

20

<210> 4

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Cys Gly Val Gly Lys Ser

1 5 10 15

Ala Leu Thr Ile Gln

20

<210> 5

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Asp Gly Val Gly Lys Ser

1 5 10 15

Ala Leu Thr Ile Gln

20

<210> 6

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Ser Gly Val Gly Lys Ser

1 5 10 15

Ala Leu Thr Ile Gln

20

<210> 7

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Val Gly Val Gly Lys Ser

1 5 10 15

Ala Leu Thr Ile Gln

20

<210> 8

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Gly Asp Val Gly Lys Ser Ala

1 5 10 15

Leu Thr Ile Gln Leu

20

<210> 9

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Cys Leu Leu Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly His Glu Glu Tyr Ser Ala

1 5 10 15

Met Arg Asp Gln Tyr

20

<210> 10

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

atggccgtca tggcgccccg aaccctcgtc c 31

<210> 11

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ctggatggtt aaagcgctct ttcccact 28

<210> 12

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn

1 5 10 15

Pro Gly Pro

<210> 13

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro

1 5 10 15

Gly Pro

<210> 14

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

Gln Cys Thr Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser

1 5 10 15

Asn Pro Gly Pro

20

Claims

1.一种靶向KRAS突变的异体抗原递呈细胞的构建方法，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述分析亲和力的工具为NetMHCpan4.0 Server在线软件。

3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述融合基因还包括连接HLA分型和KRAS突变序列的剪切肽的编码序列。

4.根据权利要求1或3所述的构建方法，其特征在于，所述肠癌患者的HLA分型包括HLA-A0206、HLA-A2601、HLA-B4001、HLA-B1301、HLA-C0304和HLA-C0702。

5.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述KRAS突变包括KRAS-G12A、KRAS-G12C、KRAS-G12D、KRAS-G12S、KRAS-G12V、KRAS-G13D和KRAS-Q61H。

6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，亲和力最高的组合为HLA-A0206和KRAS-G12D。

7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，所述剪切肽包括P2A、T2A和E2A中的一种。

8.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，所述融合基因表达的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No:1所示。

9.权利要求1～8任意一项所述制备方法制备获得的靶向KRAS突变的异体抗原递呈细胞。

10.一种肠癌特异性CTL细胞的制备方法，包括以下步骤：用权利要求9中所述的靶向KRAS突变的异体抗原递呈细胞与外周血单个核细胞中的T细胞进行共培养20～22d获得肠癌特异性CTL细胞。