CN110201011A - 圆齿野鸦椿提取物在制备降血脂药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及圆齿野鸦椿提取物在制备降血脂药物中的应用。本发明通过乙醇提取和大孔吸附树脂提取制备的方法，获得圆齿野鸦椿提取物，所述提取物能有效抑制高血脂模型小鼠体重的异常增加，降低高血脂小鼠血清中的总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）和低密度脂蛋白（LDL‑C）的含量，提高高密度脂蛋白（HDL‑C）的含量；同时对各组小鼠的肝组织进行病理学切片观察发现，圆齿野鸦椿提取物能改善肝脏的脂肪组织和细胞形态的变化，表明圆齿野鸦椿提取物具有显著的降血脂作用，可应用于预防和治疗高血脂药物的制备中。

Description

圆齿野鸦椿提取物在制备降血脂药物中的应用
技术领域
本发明属于植物活性物质的提取及应用领域，具体涉及圆齿野鸦椿提取物在制备降血脂药物中应用。
背景技术
近年来，由于中国经济的迅速发展，人们的物质生活水平得到巨大的提高，高血脂的人群迅速发展，据统计中国高血脂人群已达到六亿人，占总体的四成以上。高血脂是引起动脉硬化、心血管疾病和脑部疾病等的重要危险因素，也是导致肝纤维化、脂肪肝、胰腺炎等慢性疾病的诱因，已成为中国人口健康的重大危害之一。目前高血脂的治疗主要分成两类，一种是通过降低血清中低密度脂蛋白（LDL）和总胆固醇（TC）的浓度，主要为他汀类药物；另一种是通过减少血清中甘油三酯（TG）为主，主要治疗药物为烟酸类和贝特类。由于这些药物存在着耐药性和副作用大等问题，近几年来从传统药用植物中获得具有降血脂活性产物的研究越来越受到人们的广泛重视与青睐。
圆齿野鸦椿（Euscaphis Konishii Hayata，又名福建野鸦椿）为省沽油科野鸦椿属（Euscaphis）植物，别名鸡肫子、鸡眼睛、狗头椒。根据《中国植物志》的记载，我国有2 种省沽油科野鸦椿属植物，为野鸦椿[Euscaphis japonica (Thunb.) Dippel]和福建野鸦椿（圆齿野鸦椿）。野鸦椿是传统的中草药，主要治疗胃痛、跌打损伤、风湿疼痛、眩晕、泻疾、痢疾等，而圆齿野鸦椿主要用于观赏植物，目前对其药用价值研究较少，两者为同一属的两种植物。我们通过高脂饲料喂养，构建实验性高血脂小鼠模型，将圆齿野鸦椿提取物对高血脂模型小鼠进行给药，发现圆齿野鸦椿提取物能显著控制高血脂小鼠体重的异常增加，降低小鼠血清中的总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）和低密度脂蛋白（LDL-C）的含量，提高高密度脂蛋白（HDL-C）的含量，同时能改善高血脂小鼠肝脏的脂肪组织和细胞形态，可为预防和治疗高血脂的药物提供新的选择。
发明内容
本发明的目的在于提供一种圆齿野鸦椿提取物在制备降血脂药物中的应用。从圆齿野鸦椿植物体中通过乙醇提取和大孔吸附树脂制备获得具有显著降血脂功效的圆齿野鸦椿提取物，将其应用于降血脂药物的制备中。
一种圆齿野鸦椿提取物在制备降血脂药物中的应用。
上述圆齿野鸦椿提取物的制备方法，包括如下步骤：
（1）取圆齿野鸦椿植物体，切碎、50℃烘干，粉碎得到圆齿野鸦椿植物体粉末；
（2）圆齿野鸦椿植物体粉末中按重量比加入5-20倍浓度为10vol%-95vol%的乙醇加热至50-95℃回流提取两次，每一次提取1-3小时，合并提取液，减压浓缩至无醇味，干燥，得圆齿野鸦椿醇提物。
（3）将圆齿野鸦椿醇提物用水溶解后，上样到大孔树脂层析柱，用水洗去未吸附的物质，再用10vol%-100vol% 乙醇溶液进行洗脱，以薄层色谱板进行检测，直至薄层色谱上无明显的样品为止。
（4）收集洗脱液，减压浓缩，干燥，得到圆齿野鸦椿提取物。
所述的大孔树脂选用D101、D301、HPD-100、HPD-300、AB-8、NKA-9或ADS-7中的一种。
上述圆齿野鸦椿植物体是圆齿野鸦椿枝、叶、根、花、种子、种皮、果实及果皮中的任意一种或多种。
本发明的有益效果在于：本发明的圆齿野鸦椿提取物，能显著控制高血脂小鼠体重的异常增加，降低小鼠血清中的总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）和低密度脂蛋白（LDL-C）的含量，提高高密度脂蛋白（HDL-C）的含量，同时能改善高血脂小鼠肝脏的脂肪组织和细胞形态，能用于高血脂的预防和治疗。
附图说明：
图1 圆齿野鸦椿各部位醇提物对高血脂小鼠肝脏组织的影响。a：正常对照组，b：模型组，c：阳性对照组，d:果皮提取物组，e：枝条提取物组，f：叶片提取物组，g：种子提取物组。
具体实施方式
为进一步公开而不是限制本发明，以下结合实例对本发明作进一步的详细说明。
下述实验用圆齿野鸦椿（Euscaphis Konishii）来源于福建省邵武市天成岩。
实施例1
取干燥的圆齿野鸦椿果皮，切碎，50℃烘干，粉碎得到粉末。按重量比加入10倍95vol%的乙醇加热至80℃回流提取两次，每一次提取2小时，合并提取液，回收乙醇并减压浓缩至无醇味，干燥，得圆齿野鸦椿果皮醇提物。将圆齿野鸦椿果皮醇提物用水溶解后，上样到大孔树脂层析柱，用水洗去未吸附的物质，再用10vol%-100vol% 乙醇溶液进行洗脱，以薄层色谱板进行检测，直至薄层色谱上无明显的样品为止，收集洗脱液，减压浓缩，干燥，得到圆齿野鸦椿果皮提取物。
实施例2
取干燥的圆齿野鸦椿枝条，切碎，50℃烘干，粉碎得到粉末。按重量比加入10倍95vol%的乙醇加热至80℃回流提取两次，每一次提取2小时，合并提取液，回收乙醇并减压浓缩至无醇味，干燥，得圆齿野鸦椿枝条醇提物。将圆齿野鸦椿枝条醇提物用水溶解后，上样到大孔树脂层析柱，用水洗去未吸附的物质，再用10vol%-100vol% 乙醇溶液进行洗脱，以薄层色谱板进行检测，直至薄层色谱上无明显的样品为止，收集洗脱液，减压浓缩，干燥，得到圆齿野鸦椿枝条提取物。
实施例3
取干燥的圆齿野鸦椿叶片，切碎，50℃烘干，粉碎得到粉末。按重量比加入10倍体积浓度为95vol%的乙醇加热至80℃回流提取两次，每一次提取2小时，合并提取液，回收乙醇并减压浓缩至无醇味，干燥，得圆齿野鸦椿叶片醇提物。将圆齿野鸦椿叶片醇提物用水溶解后，上样到大孔树脂层析柱，用水洗去未吸附的物质，再用10vol%-100vol% 乙醇溶液进行洗脱，以薄层色谱板进行检测，直至薄层色谱上无明显的样品为止，收集洗脱液，减压浓缩，干燥，得到圆齿野鸦椿叶片提取物。
实施例4
取干燥的圆齿野鸦椿种子，切碎，50℃烘干，粉碎得到粉末。按重量比加入10倍95vol%的乙醇加热至80℃回流提取两次，每一次提取2小时，合并提取液，回收乙醇并减压浓缩至无醇味，干燥，得圆齿野鸦椿种子醇提物。将圆齿野鸦椿种子醇提物用水溶解后，上样到大孔树脂层析柱，用水洗去未吸附的物质，再用10vol%-100vol% 乙醇溶液进行洗脱，以薄层色谱板进行检测，直至薄层色谱上无明显的样品为止，收集洗脱液，减压浓缩，干燥，得到圆齿野鸦椿种子提取物。
实施例5【药效学实验】
1 试剂和药品
取实施例1-4制备所得的圆齿野鸦椿提取物，加入到0.5wt%羧甲基纤维素钠溶液中配制成1g/Kg的圆齿野鸦椿提取物混悬液备用。阳性对照为辛伐他汀，购自国药集团汕头金石制药有限公司。低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)试剂盒、谷丙转氨酶(ALT)试剂盒、总胆固醇(TC)试剂盒、甘油三酯(TG) 试剂盒、谷草转氨酶(AST)试剂盒、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)试剂盒均购自南京建成生物工程研究所公司。
实验方法
2.1 动物分组
取70只昆明种小鼠，雌雄各半，体重（20±2）g，雄性和雌性小鼠分别随机分为7组，每组10只，雌雄各5只，分别设置正常对照组、模型组、阳性对照组（5 mg•Kg-1）、圆齿野鸦椿果皮提取物、枝条提取物、叶片提取物和种子提取物（1g/Kg）。除正常对照组外，其余各组小鼠均喂饲高脂饲料（高脂饲料配方，按质量百分比之和为100%计为：78.8%基础饲料、1%胆固醇、10%蛋黄粉和10%猪油、0.2%胆盐）并同步给药。圆齿野鸦椿果皮提取物、枝条提取物、叶片提取物、种子提取物给药组和阳性对照组按0.1 mL/10g进行灌胃给药，正常对照组和模型组按0.1mL/10g灌胃给予0.5wt%羧甲基纤维素钠溶液，连续给药4周，每天观察小鼠状况，每三天换一次垫料，每周称量一次体重并记录。
血脂测定及各脏器指数计算：
给药最后一天，对小鼠禁食不禁水过夜。摘除眼球取血，颈椎脱臼处死动物。小鼠全血用1wt%肝素钠包被过的EP管收集，静置45 min后，以1500 转/min离心10 min后取血清，按照试剂盒说明进行血清总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白（HLD-C）和低密度脂蛋白（LDL-C）的含量测定。使用SPSS 21.0对实验数据进行One-way ANOVA统计学分析，结果以表示。
组织病理学研究：
小鼠肝脏固定于10wt%福尔马林中，以流水冲洗过夜，在组织脱水机（Leica TP1020）中进行脱水包埋，并进行切片和HE染色。具体步骤如下：（1）脱水：按照60vol%乙醇1h、70vol%乙醇1h、85vol%乙醇2h、95vol%乙醇2h、95vol%乙醇2h、100vol%乙醇I 1h和100vol%乙醇Ⅱ1h进行脱水。（2）透明：二甲苯I 45 min和二甲苯Ⅱ 45 min进行透明。（3）包埋：石蜡I 1h和石蜡Ⅱ 1h（56-62℃）进行包埋，再置于冷台上凝固。（4）切片和烤片：包埋好的蜡块用切片机（Leica RM2235）进行切片，切片厚度5 μm，用毛笔轻轻在50℃的温水中展开，并平铺于载玻片上，置于60℃温箱中干燥。（5）脱蜡：干燥后的切片置于二甲苯Ⅰ、Ⅱ各10min，无水乙醇、95vol%乙醇各5min，80vol%乙醇3min，70vol%乙醇3min，进行脱蜡。（6）染色：切片放入苏木素染色液中染色5 min，置于流水冲洗后，放入1vol%盐酸中分化几秒，用流水浸洗15 min，使细胞核染色；再用伊红染色液染1-2 min，在放入流水中冲洗。（7）脱水、透明和封片：按80vol%乙醇、95vol%乙醇、无水乙醇依次浸泡3 min进行脱水，再用二甲苯Ⅰ和Ⅱ分别浸泡5min进行透明，滴一滴树脂进行封片。晾干后即可在显微镜下观察切片。
实验结果：
3.1 圆齿野鸦椿提取物对高血脂小鼠体重和肝脏指数的影响
实验期间，各组小鼠的饮食、饮水均正常，毛发光亮，排便量和粪便颜色也正常，精神状态良好，未出现死亡。各实验组小鼠体重和肝脏指数变化结果见表1。实验过程中各组小鼠的体重均有明显增长的趋势，且各组间小鼠的体重和肝重没有显著差异（P>0.05）。
表1 圆齿野鸦椿提取物对高血脂小鼠体重和肝脏指数的影响（ , n=10）
注：与模型组比较：* P＜0.05，** P＜0.01；与正常对照组相比：# P＜0.05，## P＜0.01。
与正常组相比，模型组小鼠体重显著增高（P＜0.01），且明显高于圆齿野鸦椿各提取物给药组（P＜0.01），说明圆齿野鸦椿提取物能有效抑制高脂饮食小鼠体重的增长。
另外，与正常组相比，模型组肝脏明显变重（P＜0.01），肝脏指数增加明显（P＜0.01）。由于肝脏是重要的免疫器官，肝脏指数可反映药物对小鼠免疫系统的影响。圆齿野鸦椿各提取物给药后，能显著降低高脂饮食小鼠的肝脏指数（P＜0.05），表明圆齿野鸦椿提取物能提高高血脂小鼠的免疫力。
圆齿野鸦椿提取物对高血脂小鼠血清血脂水平的影响
通过对各组小鼠进行摘眼球取血，收集血清，按照试剂盒说明进行血清总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白（HLD-C）和低密度脂蛋白（LDL-C）的含量测定，结果见表2。
表2 圆齿野鸦椿提取物对高血脂小鼠血清血脂水平的影响（ , n=10）
与正常组相比，模型组小鼠的TG、TC和LDL-C显著增高（P＜0.05或P＜0.01），HDL-C明显下降，说明高脂饲料可引起小鼠的高血脂症，圆齿野鸦椿各提取物给药后可显著抑制TG、TC和LDC-C的升高，提高血清中HDL-C含量（P＜0.01），说明圆齿野鸦椿提取物能有效调控高脂饲料小鼠的血脂水平，具有显著的降血脂作用。
圆齿野鸦椿提取物对高血脂小鼠肝脏组织的影响
对小鼠的肝脏进行病理切片，采用H&E染色，观察不同圆齿野鸦椿提取物给药对小鼠肝脏结构的影响。正常对照组的小鼠肝细胞排列整齐，细胞结构清晰，细胞核位于细胞中央，无脂肪变性；模型组的小鼠肝脏组织中出现明显的脂肪空泡细胞，肝细胞肿大并出现气球样变性；圆齿野鸦椿各个提取物给药组的小鼠肝细胞脂肪空泡细胞显著减少，小鼠肝脏肿胀现象和脂肪变性程度有不同程度的缓解，说明圆齿野鸦椿提取物能通过调节体内脂质代谢，改善肝脏脂肪的变性程度。
结论
圆齿野鸦椿提取物能显著控制高血脂小鼠体重的异常增加，降低小鼠血清中的总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）和低密度脂蛋白（LDL-C）的含量，提高高密度脂蛋白（HDL-C）的含量，同时能改善高血脂小鼠肝脏的脂肪组织和细胞形态，能用于高血脂的预防和治疗。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims (4)

1.一种圆齿野鸦椿提取物在降血脂药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的一种圆齿野鸦椿提取物在降血脂药物中的应用，其特征在于：所述圆齿野鸦椿提取物的制备方法包括如下步骤：
（1）取圆齿野鸦椿植物体，切碎、50℃烘干，粉碎得到圆齿野鸦椿植物体粉末；
（2）圆齿野鸦椿植物体粉末中按重量比加入5-20倍10vol%-95vol%的乙醇加热至50-95℃回流提取两次，每一次提取1-3小时，合并提取液，减压浓缩至无醇味，干燥，得圆齿野鸦椿醇提物；
（3）将圆齿野鸦椿醇提物用水溶解后，上样到大孔树脂层析柱，用水洗去未吸附的物质，再用10vol%-100vol%乙醇溶液进行洗脱，以薄层色谱板进行检测，直至薄层色谱上无明显的样品为止；
（4）收集洗脱液，减压浓缩，干燥，得到圆齿野鸦椿提取物。
3.根据权利要求2所述的制备方法，所述的大孔树脂选用D101、D301、HPD-100、HPD-300、AB-8、NKA-9或ADS-7。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所用的圆齿野鸦椿植物体是枝、叶、根、花、种子、种皮、果实及果皮的一种或多种。
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