CN112493260A - 一种大花独蒜兰提取物及其在抑制植物病原真菌中的应用 - Google Patents
一种大花独蒜兰提取物及其在抑制植物病原真菌中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种能高效抑制植物病原真菌的大花独蒜兰提取物的制备方法及其应用，其是将大花独蒜兰假鳞茎经烘干、粉碎后，采用含水乙醇溶液回流提取、大孔吸附树脂柱色谱纯化、减压浓缩至干，制得所述大花独蒜兰提取物。本发明制备方法简单，易操作，其总得率在10.5%‑13.2%之间，适合大规模生产，且所得提取物对植物病原真菌具有显著抑制活性，其在抑制白菜炭疽病病原菌、芭乐炭疽病病原菌、链孢粘帚霉方面的活性优于目前大量使用的环境友好型植物源农药乙蒜素。
Description
技术领域
本发明涉及一种从植物体——大花独蒜兰假鳞茎上提取具有抑制植物病原真菌活性的提取物的制备方法。
背景技术
由于长期使用或滥用化学农药，已导致病原菌对许多化学药剂产生了严重的抗性；同时，病原真菌变异速度加快，使得传统化学杀菌剂药效减弱，农业生产中使用的农药浓度也越来越大，导致环境问题日益突出。许多研究已表明，在与植物病原真菌长期斗争过程中，植物自身能产生抑制植物病原菌的次生代谢产物，如乙蒜素、苦参碱、喜树碱、丁香酯酚等，均能较好抑制植物病原真菌，且不易产生抗性。因此，寻找高效抑制植物病原菌的天然植物源提取物已成为替代化学农药、研发环境友好型生物农药的重要途径之一。
大花独蒜兰Pleione grandiflora为兰科独蒜兰属植物，主产于云南。该植物较易种植，植物资源丰富，且花型美观，是兰科重要的观赏品种，深受人们喜爱。本课题组长期致力于兰科独蒜兰属植物资源开发与利用的研究，并经研究首次发现，大花独蒜兰提取物能较好抑制植物病原菌，为此，本发明提出一种能高效抑制植物病原菌的大花独蒜兰提取物的制备方法，该方法操作简单，成本较低，所得提取物活性显著，极具开发前景。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能抑制植物病原菌的大花独蒜兰提取物的制备方法及其在抑制白菜炭疽病病原菌、芭乐炭疽病病原菌、链孢粘帚霉等植物病原真菌上的应用。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种大花独蒜兰提取物，其具体制备方法如下：
1）取收集的新鲜大花独蒜兰假鳞茎，经50-60℃烘干后粉碎，过20目-50目筛，得干燥的粉末；
2）取步骤1）所得粉末1000 g，加入体积浓度为50%-75%的乙醇溶液6000-8000 mL，加热至沸腾并回流提取2小时，然后过滤，收集滤渣和提取液a；
3）将步骤2）所得滤渣再加入5000-7000 mL体积浓度为50%-75%的乙醇溶液，煮沸后再回流提取2小时，过滤，得提取液b；
4）合并提取液a和b，减压浓缩，得大花独蒜兰假鳞茎浸膏；
5）将步骤4）所得大花独蒜兰假鳞茎浸膏与浸膏质量1-2倍的大孔吸附树脂混合拌样，然后采用装有同类型大孔吸附树脂的色谱柱进行上样、洗脱纯化；洗脱时，先计算所用大孔吸附树脂色谱柱的柱体积，然后先用2-3倍柱体积的水洗脱，弃去，再用2-3倍柱体积、体积浓度为25%-30%的乙醇溶液洗脱，弃去，最后用3-5倍柱体积、体积浓度为50%-75%的乙醇溶液洗脱，收集该部分洗脱液，减压浓缩回收溶剂，得大花独蒜兰假鳞茎提取物。
所得大花独蒜兰提取物可用于抑制植物病原真菌，所述植物病原真菌包括白菜炭疽病病原菌、芭乐炭疽病病原菌、链孢粘帚霉中的任意一种。具体应用方法为：将所述大花独蒜兰提取物与水混合，配制成浓度为80~260 ppm的药液，用于喷施叶表至叶面滴水为止；或配制成浓度为40~130 ppm的药液，用于灌根。
本发明显著优势在于：
（1）本发明所用原材料——大花独蒜兰可以大量人工培育，资源丰富，其提取方法操作简单实用，总得率在10.5%-13.2%之间，可实现规模化生产。
（2）本发明所得提取物对白菜炭疽病病原菌、芭乐炭疽病病原菌、链孢粘帚霉等植物真菌的抑制活性显著，且在相同浓度下，其抑制活性优于目前防治植物病原菌大量使用的环境友好型植物源农药乙蒜素。
具体实施方式
一种大花独蒜兰提取物，其具体制备方法如下：
1）取收集的新鲜大花独蒜兰假鳞茎，经50-60℃烘干后粉碎，过20目-50目筛，得干燥的粉末；
2）取步骤1）所得粉末1000 g，加入体积浓度为50%-75%的乙醇溶液6000-8000 mL，加热至沸腾并回流提取2小时，然后过滤，收集滤渣和提取液a；
3）将步骤2）所得滤渣再加入5000-7000 mL体积浓度为50%-75%的乙醇溶液，煮沸后再回流提取2小时，过滤，得提取液b；
4）合并提取液a和b，减压浓缩，得大花独蒜兰假鳞茎浸膏；
5）将步骤4）所得大花独蒜兰假鳞茎浸膏与浸膏质量1-2倍的大孔吸附树脂混合拌样，然后采用装有同类型大孔吸附树脂的色谱柱进行上样、洗脱纯化；洗脱时，先计算所用大孔吸附树脂色谱柱的柱体积，然后先用2-3倍柱体积的水洗脱，弃去，再用2-3倍柱体积、体积浓度为25%-30%的乙醇溶液洗脱，弃去，最后用3-5倍柱体积、体积浓度为50%-75%的乙醇溶液洗脱，收集该部分洗脱液，减压浓缩回收溶剂，得大花独蒜兰假鳞茎提取物。
大花独蒜兰假鳞茎提取物抑制植物病原真菌活性研究：
利用菌丝生产速率法测定大花独蒜兰假鳞茎提取物的抑菌活性。其具体是使用配制并灭菌的PDA培养基制作培养平板，设置空白对照组、阳性对照药乙蒜素组、大花独蒜兰假鳞茎提取物试验组；阳性对照药乙蒜素组和大花独蒜兰假鳞茎提取物试验组各设置3个浓度，每个浓度设置3个重复；分别采用白菜炭疽病病原菌、芭乐炭疽病病原菌、链孢粘帚霉进行接种，接种好的培养皿需用保鲜膜封口倒置，以免菌种生长过程中产生的水分或空气中的杂质影响菌种的正常生长。放置于28±5℃的智能人工培养箱中培养3~7 d，每24 h观察一次。空白对照平板菌种菌丝直径长至2/3左右时进行测量。测量时，先观察菌落形状，然后采用十字交叉测量法，不规则菌落量取其最大直径，分别测量并记录各组菌落生长直径。按照公式计算抑菌率（计算公式如下），结果见表1-3。
阳性对照药乙蒜素组或大花独蒜兰假鳞茎提取物试验组抑菌率=（阳性对照药乙蒜素组或大花独蒜兰假鳞茎提取物试验组菌落直径-空白对照组菌落直径）/（空白对照组菌落直径-0.5）×100%
表1 乙蒜素和大花独蒜兰假鳞茎提取物对白菜炭疽病病原菌的抑菌率对比
表2 乙蒜素和大花独蒜兰假鳞茎提取物对芭乐炭疽病病原菌的抑菌率对比
表3 乙蒜素和大花独蒜兰假鳞茎提取物组对链孢粘帚霉的抑菌率对比
由上述结果可见，相同浓度下，大花独蒜兰假鳞茎提取物对病原菌的抑制活性明显优于乙蒜素。
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员更容易理解，实施例所描述的具体物料比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1
取大花独蒜兰假鳞茎，置于55℃的烘箱中烘干，然后用粉碎机粉碎并过20目筛，收集粉末备用；称取粉末1000g，加入体积浓度70%的乙醇溶液8000 mL，加热至沸腾并回流提取2小时，过滤收集滤渣和提取液a；将滤渣再加入6000 mL体积浓度70%的乙醇溶液，再次煮沸后回流提取2小时，过滤，得提取液b；合并两次提取液，减压浓缩，得大花独蒜兰假鳞茎浸膏320g；将所得大花独蒜兰假鳞茎浸膏与600g D101大孔吸附树脂混合拌样；拌好的样品经湿法装柱于D101大孔吸附树脂色谱柱上进行纯化，该色谱柱的体积为12.0 L；洗脱时，先用36 L水洗脱，弃去；再使用36 L体积浓度25%的乙醇溶液进一步纯化，弃去；最后使用60 L体积浓度75%的乙醇溶液洗脱，收集该部分洗脱液，减压浓缩回收溶剂，得大花独蒜兰假鳞茎提取物115.8 g，其总得率为11.6%。
利用菌丝生产速率法测定大花独蒜兰假鳞茎提取物的抑菌活性，结果显示：浓度为0.2 mg/mL的提取物对白菜炭疽病病原菌的抑菌率为68.88±3.29%；浓度为2.0mg/mL的提取物抑对芭乐炭疽病病原菌和链孢粘帚霉的抑菌率分别为93.88±5.61%和60.93±8.51%。
实施例2
取大花独蒜兰假鳞茎，置于55℃的烘箱中烘干，然后用粉碎机粉碎并过20目筛，收集粉末备用；称取粉末1000g，加入体积浓度75%的乙醇溶液8000 mL，加热至沸腾并回流提取2小时，过滤收集滤渣和提取液a；将滤渣再加入6000 mL体积浓度75%的乙醇溶液，再次煮沸后回流提取2小时，过滤，得提取液b；合并两次提取液，减压浓缩，得大花独蒜兰假鳞茎浸膏311g；将所得大花独蒜兰假鳞茎浸膏与600g D101大孔吸附树脂混合拌样；拌好的样品经湿法装柱于D101大孔吸附树脂色谱柱上进行纯化，该色谱柱的体积为12.0 L；洗脱时，先用36 L水洗脱，弃去；再使用36 L体积浓度25%的乙醇溶液进一步纯化，弃去；最后使用60 L体积浓度70%的乙醇溶液洗脱，收集该部分洗脱液，减压浓缩回收溶剂，得大花独蒜兰假鳞茎提取物105.4 g，其总得率为10.5%。
利用菌丝生产速率法测定大花独蒜兰假鳞茎提取物的抑菌活性，结果显示：浓度为0.2 mg/mL的提取物对白菜炭疽病病原菌的抑菌率为70.25±2.28%；浓度为2.0 mg/mL的提取物对芭乐炭疽病病原菌和链孢粘帚霉的抑菌率分别为94.05±5.20%和64.27±4.33%。
实施例3
取大花独蒜兰假鳞茎，置于55℃的烘箱中烘干，然后用粉碎机粉碎并过20目筛，收集粉末备用；称取粉末1000g，加入体积浓度65%的乙醇溶液8000 mL，加热至沸腾并回流提取2小时，过滤收集滤渣和提取液a；将滤渣再加入6000 mL体积浓度65%的乙醇溶液，再次煮沸后回流提取2小时，过滤，得提取液b；合并两次提取液，减压浓缩，得大花独蒜兰假鳞茎浸膏336g；将所得大花独蒜兰假鳞茎浸膏与600g D101大孔吸附树脂混合拌样；拌好的样品经湿法装柱于D101大孔吸附树脂色谱柱上进行纯化，该色谱柱的体积为12.0 L；洗脱时，先用36 L水洗脱，弃去；再使用36 L体积浓度25%的乙醇溶液进一步纯化，弃去；最后使用60 L体积浓度75%的乙醇溶液洗脱，收集该部分洗脱液，减压浓缩回收溶剂，得大花独蒜兰假鳞茎提取物132.3 g，其总得率为13.2%。
利用菌丝生产速率法测定大花独蒜兰假鳞茎提取物的抑菌活性，结果显示：浓度为0.2 mg/mL的提取物对白菜炭疽病病原菌的抑菌率为65.81±4.27%；浓度为2.0 mg/mL的提取物对芭乐炭疽病病原菌和链孢粘帚霉的抑菌率分别为89.85±6.46%和57.35±3.92%。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
Claims (4)
1.一种大花独蒜兰提取物的制备方法，其特征在于：具体包括以下步骤：
1）取收集的新鲜大花独蒜兰假鳞茎，经50-60℃烘干后粉碎，过20目-50目筛，得干燥的粉末；
2）步骤1）所得粉末1000 g，加入体积浓度为50%-75%的乙醇溶液6000-8000 mL，加热至沸腾并回流提取2小时，然后过滤，收集滤渣和提取液a；
3）将步骤2）所得滤渣再加入5000-7000 mL体积浓度为50%-75%的乙醇溶液，煮沸后再回流提取2小时，过滤，得提取液b；
4）合并提取液a和b，减压浓缩，得大花独蒜兰假鳞茎浸膏；
5）将步骤4）所得大花独蒜兰假鳞茎浸膏与浸膏质量1-2倍的大孔吸附树脂混合拌样，然后采用装有同类型大孔吸附树脂的色谱柱进行上样、洗脱纯化；洗脱时，先计算所用大孔吸附树脂色谱柱的柱体积，然后先用2-3倍柱体积的水洗脱，弃去，再用2-3倍柱体积、体积浓度为25%-30%的乙醇溶液洗脱，弃去，最后用3-5倍柱体积、体积浓度为50%-75%的乙醇溶液洗脱，收集该部分洗脱液，减压浓缩回收溶剂，得大花独蒜兰假鳞茎提取物。
2.一种如权利要求1所述方法制备的大花独蒜兰提取物。
3.一种如权利要求2所述大花独蒜兰提取物在抑制植物病原真菌中的应用，其特征在于：所述植物病原真菌包括白菜炭疽病病原菌、芭乐炭疽病病原菌、链孢粘帚霉中的任意一种。
4.一种如权利要求3所述的大花独蒜兰提取物在抑制植物病原真菌中的应用，其特征在于：其具体应用方法为：将所述大花独蒜兰提取物与水混合，配制成浓度为80~260ppm的药液，用于喷施叶表至叶面滴水为止；或配制成浓度为40~130ppm的药液，用于灌根。
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