CN110184315B - 一种制备高浓度2-甲氧基-4-乙烯基苯酚的方法 - Google Patents

一种制备高浓度2-甲氧基-4-乙烯基苯酚的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种制备高浓度2‑甲氧基‑4‑乙烯基苯酚的方法，以含有来自萎缩芽孢杆菌的酚酸脱羧酶BaPAD的重组大肠杆菌为生物催化剂，以5L生物反应器为反应容器，采用流加高浓度底物阿魏酸的方法，通过水/正辛醇两相体系制备高浓度2‑甲氧基‑4‑乙烯基苯酚；在本发明中，2‑甲氧基‑4‑乙烯基苯酚会选择性的进入有机相正辛醇中而阿魏酸却会保留在水相中，阿魏酸干粉既是该催化反应的底物，也可以用来调节体系的pH平衡，正辛醇是通过实验筛选出的最适用于催化阿魏酸制备2‑甲氧基‑4‑乙烯基苯酚的有机试剂，最终2‑甲氧基4‑乙烯基苯酚浓度为1.6M，摩尔转化率为100％，已达到能够满足工业化生产需求的水平。

Description

一种制备高浓度2-甲氧基-4-乙烯基苯酚的方法
技术领域
本发明涉及2-甲氧基-4-乙烯基苯酚的制备技术领域，尤其涉及一种制备高浓度2-甲氧基-4-乙烯基苯酚的方法。
背景技术
2-甲氧基-4-乙烯基苯酚(4-VG)，又名对乙烯基愈创木酚，4-乙烯基愈创木酚，其分子式为C9H10O2，密度1.11×103kg/m3，熔点26℃～29℃，沸点100℃/667Pa。常温常压下为无色或淡黄色油状液体，呈发酵香气，略带甜味，微带酚的气息。天然2-甲氧基-4-乙烯基苯酚主要存在于玉米酒精发酵的挥发物中，具有类似丁香类芳香气味，是决定酒类、酱油、茶叶、咖啡、干酪等食品品质的主要香味成分，也是日化、医药、香精合成等行业较为常用的高档香料之一，具有广泛的应用价值和发展前景。
市场上的2-甲氧基-4-乙烯基苯酚多为化学法合成，需要较多的前体物质，有些还需要较为剧烈的条件。2-甲氧基-4-乙烯基苯酚很大一部分用于香精，医药及食品工业，而化学合成品用于这些方面有很大的不安全性，所以，寻找一条快速，高效生产这种物质的生物合成途径是很有必要的。目前已有利用一些菌株通过利用阿魏酸(FA)生成2-甲氧基-4-乙烯基苯酚的报道，如汉逊德巴氏酵母(Debaryomyces hansenii)，假丝酵母(GenusCandida)，香肠乳杆菌(Lactobacillus farciminus)，肠杆菌(Enterobacter)等，其中2-甲氧基-4-乙烯基苯酚的市场价格约为前体物质阿魏酸的40倍左右。但阿魏酸或产物2-甲氧基-4-乙烯基苯酚对大多数菌株和酶都有毒性，浓度过高会抑制菌株和酶的活性，从而导致2-甲氧基-4-乙烯基苯酚产量的降低及生产效率低下，目前报道的最高产物浓为129.9g L-1，转化率85.6％，这对工业化大生产来说是极其不利的。
因此，如何寻找性能更为优异的生物催化剂以及催化体系和工艺，实现高浓度的2-甲氧基-4-乙烯基苯酚的生产具有重要意义。
发明内容
针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种制备高浓度2-甲氧基-4-乙烯基苯酚的方法，通过在水/正辛醇两相体系中生物转化阿魏酸生产天然2-甲氧基-4-乙烯基苯酚，具有生产周期短，产物收率高等特点。
为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
一种制备高浓度2-甲氧基-4-乙烯基苯酚的方法，包括以下步骤：
1)通过酶切位点NcoI/XhoI将目的基因bapad合成到载体pET28a上得到重组质粒bapad-pET28a，取1μL浓度为20ng/μL的重组质粒bapad-pET28a在冰上转到BL21(DE3)感受态细胞中，冰浴30min后在42℃热击90s，加入0.5mL种子液培养基于37℃摇床200rpm培养1h后取200μL涂布于含有50μg/mL卡那霉素抗性的LB固体培养基上，于37℃恒温培养箱培养约12h，得到含有重组质粒bapad-pET28a的单菌落，再挑取单菌落接种到种子液培养基中，培养制得种子培养液；
2)按体积比2％的接种量将种子培养液接种到含有50μg/mL卡那霉素抗性的LB液体培养基中，于37℃，200rpm摇床培养，在菌体量达到OD600＝0.6时，加入终浓度0.4mM的异丙基β-D硫代半乳糖苷诱导培养，在30℃条件下，200rpm振荡培养12h，得到大量表达了酚酸脱羧酶BaPAD的重组大肠杆菌菌液；
3)取重组大肠杆菌菌液，在6500rpm离心10min收集菌体，称量菌体湿重，并用磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液重悬清洗3次，得到静息细胞；
4)用10mL磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液重悬静息细胞，加入到1L含有200mM阿魏酸钠的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液中，倒入5L生物反应器中，同时加入1L正辛醇，在30℃条件下，150rpm搅拌催化，根据仪器控制面板上监测的pH变化不断补加阿魏酸干粉，使得pH在6.5±0.1范围内变化直到pH不再增加为止，每隔1h有机相和水相分别取样，用甲醇稀释后用高效液相色谱法检测体系中阿魏酸和2-甲氧基4-乙烯基苯酚的含量。
步骤3)中，磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液的配制方法是：先分别配制200mM的磷酸氢二钠溶液以及200mM柠檬酸缓冲液，再将柠檬酸溶液缓慢加入磷酸氢二钠溶液中，调整pH为6.0。
步骤4)中，采用高效液相色谱法检测阿魏酸和2-甲氧基-4-乙烯基苯酚的浓度，高效液相色谱的流动相为100％甲醇：0.1％冰醋酸＝35:65，高效液相色谱的检测条件为：柱温30℃，流速0.8mL/min，进样量5μL，阿魏酸和2-甲氧基-4-乙烯基苯酚的检测波长分别为320nm和255nm。
本发明具有有益效果：本发明的制备2-甲氧基-4-乙烯基苯酚的方法，采用重组大肠杆菌为生物催化剂，重组大肠杆菌中含有发明人合成的来自萎缩芽孢杆菌的酚酸脱羧酶BaPAD，本方法采用由水相和水不溶性正辛醇组成的两相反应体系，在这个反应体系中，2-甲氧基-4-乙烯基苯酚会选择性的进入有机相而阿魏酸却会保留在水相中，从而提高产物的产量以及转化率；同时，重组大肠杆菌转化高浓度阿魏酸高效制备2-甲氧基-4-乙烯基苯酚的方法有条件温和，环境污染小，产物得率高，副产物少，生产步骤简单等优点，具有很大应用前景。
附图说明
图1为全细胞催化反应在不同有机溶剂存在的体系中反应；
图2为不同浓度底阿魏酸对BaPAD及全细胞催化活性的抑制情况；
图3为不同浓度4-VG对BaPAD及全细胞催化活性的抑制情况；
图4为饱和有机溶剂和10g/L4-VG对BaPAD和全细胞活性的影响；
图5为饱和有机溶剂和100g/L4-VG对BaPAD和全细胞活性的影响；
图6是在5L生物反应器中含有酚酸脱羧酶BaPAD的重组大肠杆菌7.0g湿重在水/正辛醇两相体系中转化阿魏酸生成2-甲氧基-4-乙烯基苯酚的关系图；
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。
以下实施例中使用的重组大肠杆菌为发明人构建，含有发明人合成的来自萎缩芽孢杆菌的酚酸脱羧酶(BaPAD)。
生物材料、试剂、实验仪器来源：
LB培养基和种子液培养基配方均为：酵母提取物5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L，固体培养基是在种子液培养基中添加质量体积比为1.6～2.0％的琼脂获得。
磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液的配制方法是：先分别配制200mM的磷酸氢二钠溶液以及200mM柠檬酸缓冲液，再将柠檬酸溶液缓慢加入磷酸氢二钠溶液中，并同时不断搅拌测定pH，当pH达到6.0时停止加入，混匀。
0.1％冰醋酸的配制方法为：用移液枪吸取1mL冰醋酸加入800mL超纯水中定容至1000mL，100Hz超声30min。
冰醋酸购自永华化学科技(江苏)有限公司；阿魏酸、异丙基-β-D硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)购自Sigma-Aldrich；卡那霉素购自Amresco公司；胰蛋白胨和酵母提取物购自Oxoid公司；Ni-NTA琼脂糖购自Qiagen公司；pET28a载体购自Novagen公司。
用于高效液相色谱(HPLC)的所有溶剂均为HPLC级，其他化学品为分析级且可商购(均可从普通生化试剂公司购买得到)。
大肠杆菌BL21(DE3)购自北京越洋生物科技有限公司。
5L生物反应器为Sartorius公司，型号为
Figure BDA0002058503980000041
Aplus。
BaPAD基因(Genbank号：AKL86192.1)由南京思普金生物科技公司合成，核苷酸序列如SEQID NO.1所示，氨基酸序列如SEQID NO.2所示。
实施例1
一种制备高浓度2-甲氧基-4-乙烯基苯酚的方法，包括以下步骤：
1)制备种子培养液：将合成的BaPAD基因通过PCR扩增，得到扩增基因产物，PCR扩增引物序列如下：
上游引物：
CATGCCATGGCCCATCATCATCATCATCATATGAAGAGCCTGAAGAA
下游引物：CCGCTCGAGTTACTTTAATTTGCCCGCAC
将扩增基因产物经纯化后用限制性内切酶NcoI和XhoI双酶切，与同样经限制性内切酶NcoI和XhoI双酶切的质粒pET28a连接，构建成重组质粒bapad-pET28a，将1μL浓度为20ng/μL的重组质粒bapad-pET28a导入大肠杆菌BL21(DE3)中，涂布于含有50μg/mL卡那霉素抗性的LB固体培养基上培养得到单菌落，再挑取单菌落接种到种子液培养基中，培养制得种子培养液；
2)转化细胞培养：使用步骤1)所得的种子培养液，按体积比2％的接种量将种子培养液接种到800ml含有50μg/mL卡那霉素抗性的LB液体培养基中，于37℃，200rpm摇床培养，在菌体量达到OD600＝0.6时，加入终浓度0.4mM的异丙基β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导培养，在30℃条件下，200rpm振荡培养12h，得到大量表达了酚酸脱羧酶BaPAD的重组大肠杆菌菌液；
3)收集转化细胞：使用步骤2)得到的转化菌液，在6500rpm离心10min收集菌体7.0g湿重，用磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液重悬清洗3次，得到静息细胞；
4)转化：使用步骤3)所得的静息细胞，加入到1L含有200mM阿魏酸钠的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液中，倒入5L生物反应器中，同时加入1L正辛醇，在30℃条件下，150rpm搅拌催化，根据仪器控制面板上监测的pH变化不断补加阿魏酸干粉，使得pH在6.5±0.1范围内变化直到pH不再增加为止，一共添加阿魏酸1.6M,反应时间13h，每隔1h有机相和水相分别取样，经甲醇稀释后采用高效液相色谱法检测阿魏酸和2-甲氧基-4-乙烯基苯酚的浓度，高效液相色谱的流动相为100％甲醇：0.1％冰醋酸＝35:65，高效液相色谱的检测条件为：柱温30℃，流速0.8mL/min，进样量5μL，阿魏酸和2-甲氧基-4-乙烯基苯酚的检测波长分别为320nm和255nm；
5)2-甲氧基4-乙烯基苯酚浓度检测：阿魏酸转化液样品经高效液相色谱检测，结果如图6所示，最终2-甲氧基4-乙烯基苯酚浓度为1.6M,摩尔转化率为100％。
在反应过程中加入的阿魏酸干粉既是该催化反应的底物，也可以用来调节体系的pH平衡,避免引入其他试剂对体系中各组分的浓度产生影响。在该过程中，正辛醇是通过前期实验选出的最适用于催化阿魏酸制备2-甲氧基-4-乙烯基苯酚的有机试剂，一方面高浓度底物下正辛醇对菌体毒性较小，另一方面2-甲氧基-4-乙烯基苯酚在正辛醇中的分配系数远大于其他测试有机试剂，能够达到在反应过程中快速萃取产物2-甲氧基-4-乙烯基苯酚使反应持续且快速进行的目的。本发明制备2-甲氧基-4-乙烯基苯酚的产量和摩尔转化率已达到能够满足工业化生产需求的水平。
实施例2
本发明对来自萎缩芽孢杆菌的酚酸脱羧酶(BaPAD)进行了动力学常数研究。
测定BaPAD对不同浓度(0-12.5mM)的底物阿魏酸、对香豆酸、咖啡酸的初始反应速度，结果如表1所示；测定体系为1mL，包含2μg纯酶，5mM阿魏酸和200mM pH 5.5的Na2HPO4-柠檬酸缓冲液，在最适温度50℃和最适pH5.5条件下反应2.5min，测定各自条件下的酶活并计算比酶活，利用软件GraphpadPrism7.0进行非线性回归拟合，得到Vmax和Km的值，再根据酶的理论分子量计算Kcat的值。结果得到BaPAD对于对香豆酸，阿魏酸和咖啡酸的Km值分别为3.45±1.28,2.57±2.21和1.68±1.86mM，Vmax分别为775.90±0.87,440.61±0.56和173.63±2.31U mg-1，Kcat分别为131.23±2.38，77.12±1.56，32.52±0.89s-1。
表1 BaPAD对不同浓度的阿魏酸、对香豆酸、咖啡酸的动力学参数
Figure BDA0002058503980000061
实施例3
为了筛选两相反应体系的最适有机溶剂，全细胞催化反应在不同有机溶剂存在的体系中进行，阿魏酸的浓度为200mM，体系为15mL水相加15mL用缓冲液饱和的不同有机溶剂，反应时间为2h和6h，结果用HPLC检测，结果如图1所示，以正辛醇为有机溶剂在反应2h后转化率达到93％，6h后得到最高转化率为100％，然后是正辛烷，转化率为95％，环己烷92％，正癸烷90％，正庚烷88％，甲苯87％，石油醚81％，正己烷80％。所以最终选择正辛醇作为两相反应的有机溶剂。
实施例4
本实施例中对高浓度底物，产物和有机溶剂对BaPAD和全细胞催化阿魏酸活性的影响进行了研究。
如图2所示，为了测定不同浓度底物对BaPAD及全细胞催化活性的抑制作用，将不同浓度的底物阿魏酸(5，10，25，50，100，200，300，400，500Mm)与含10μg蛋白的纯酶和全细胞分别在50℃和30℃反应5min，加2mL甲醇终止反应，HPLC检测后根据结果计算各浓度底物下BaPAD及全细胞转化生成的4-VG浓度，分别以最高4-VG浓度为100％；由图3可知，随着阿魏酸浓度的增加，酶的活性表现出先快速增加后缓慢降低的趋势，在50mM阿魏酸下有最大酶活，说明高浓度底物对酶活有抑制作用。而对于全细胞来说，在1-50mM阿魏酸下，其催化活性快速增加；随后在50-500mM下阿魏酸缓慢上升，说明高浓度底物(阿魏酸)对BaPAD酶活有明显的抑制作用，但对全细胞毒性较小。
如图3所示，为了测定不同浓度产物对BaPAD及全细胞催化活性的抑制情况，在不同浓度的4-VG(1，5，10，20，30，40，50，75Mm)存在下，以5mM阿魏酸为底物与含10μg蛋白的纯酶和全细胞分别在50℃和30℃反应5min，加2mL甲醇终止反应，HPLC检测后根据结果计算各浓度底物下BaPAD及全细胞转化得到的4-VG浓度，以不加产物的对照组生成的4-VG浓度为100％，由图4可知，随着4-VG浓度的增加，BaPAD和全细胞对阿魏酸的催化活性快速降低，而后分别在最大活性的20％和40％趋于稳定；说明高浓度产物(4-VG)对BaPAD和全细胞均有较大毒性。
如图4、5所示，为了测定饱和有机溶剂和4-VG对BaPAD和全细胞活性的影响，分别用10g/L和100g/L4-VG与不同有机溶剂以体积比1：1混合，200rpm，37℃震荡48h，将水相取出，在其存在下，以5mM阿魏酸为底物与含10μg蛋白的纯酶和全细胞分别在50℃和30℃反应5min，加2mL甲醇终止反应，HPLC检测后根据结果计算BaPAD及全细胞转化得到的4-VG浓度，以没有被4-VG和有机溶剂饱和的缓冲液为100％。
结果：检测了饱和有机溶剂和4-VG对BaPAD和全细胞催化阿魏酸活性的影响；由图4可知，当4-VG浓度为10g/L时，相较于甲苯，其他有机溶剂都对BaPAD和全细胞的催化活性有较强的抑制作用，尤其是正辛醇(分别为甲苯的38％和60％)；由图5可知，当4-VG浓度为100g/L时，相比于其他有机溶剂，正辛醇对BaPAD和全细胞催化活性的抑制作用减弱(分别为甲苯的360％和82％)。说明在高浓度产物存在下，甲苯和正辛醇更有利于BaPAD和全细胞对阿魏酸的催化；可能的原因是4-VG在甲苯和正辛醇中分配系数较高，降低了4-VG对BaPAD和全细胞的毒性。
SEQUENCE LISTING
<110> 南京林业大学
<120> 一种制备高浓度2-甲氧基-4-乙烯基苯酚的方法
<130> 2019
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 551
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<221>
<223> bapad核苷酸序列
<400> 1
ccatgggcaa gagcctgaag aaagaacaga ttgagatgac gaaccagccc cgtgaagacg 60
taaaagactt tgttggaagt cacatgattt atacttatga aaacggttgg gaatacgaga 120
tctatattaa gaatgacaaa acgattgact atcgcatcca ttcgggaatg gtggccggac 180
gttgggtacg tgatcaggag gtggatctgg tgaaattaac cgaaggggtc tacaaggtct 240
catggaccga accgaccgga acagatgtca gtttgaactt catgcctaac gagaagcgca 300
tgcatggcat tatcttcttc ccaaagtggg tacatgagca cccggagatt actgtctgct 360
accaaaatga ctatattgat gttatggaag agagccgtga aaaatatgag acatacccaa 420
aattcgtagt cccagaattt gccgacatca ccttccttga gaatgcaggc atcgacaacc 480
aggaaactat ctccaaggca ccttatgagg gaatgaccga tgacatccgt gcgggcaaat 540
taaagctcga g 551
<210> 2
<211> 180
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<221>
<223> bapad氨基酸序列
<400> 2
Met Lys Ser Leu Lys Lys Glu Gln Ile Glu Met Thr Asn Gln Pro Arg
1 5 10 15
Glu Asp Val Lys Asp Phe Val Gly Ser His Met Ile Tyr Thr Tyr Glu
20 25 30
Asn Gly Trp Glu Tyr Glu Ile Tyr Ile Lys Asn Asp Lys Thr Ile Asp
35 40 45
Tyr Arg Ile His Ser Gly Met Val Ala Gly Arg Trp Val Arg Asp Gln
50 55 60
Glu Val Asp Leu Val Lys Leu Thr Glu Gly Val Tyr Lys Val Ser Trp
65 70 75 80
Thr Glu Pro Thr Gly Thr Asp Val Ser Leu Asn Phe Met Pro Asn Glu
85 90 95
Lys Arg Met His Gly Ile Ile Phe Phe Pro Lys Trp Val His Glu His
100 105 110
Pro Glu Ile Thr Val Cys Tyr Gln Asn Asp Tyr Ile Asp Val Met Glu
115 120 125
Glu Ser Arg Glu Lys Tyr Glu Thr Tyr Pro Lys Phe Val Val Pro Glu
130 135 140
Phe Ala Asp Ile Thr Phe Leu Glu Asn Ala Gly Ile Asp Asn Gln Glu
145 150 155 160
Thr Ile Ser Lys Ala Pro Tyr Glu Gly Met Thr Asp Asp Ile Arg Ala
165 170 175
Gly Lys Leu Lys
180
<210> 3
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<221>
<223> 上游引物
<400> 3
catgccatgg cccatcatca tcatcatcat atgaagagcc tgaagaa 47
<210> 4
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<221>
<223> 下游引物
<400> 4
ccgctcgagt tactttaatt tgcccgcac 29

Claims (5)

1.一种制备高浓度2-甲氧基-4-乙烯基苯酚的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）制备种子培养液：将合成的BaPAD基因通过PCR扩增，得到扩增基因产物，所述BaPAD基因所编码蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，PCR扩增引物序列如下：
上游引物：CATGCCATGGCCCATCATCATCATCATCATATGAAGAGCCTGAAGAA
下游引物：CCGCTCGAGTTACTTTAATTTGCCCGCAC
将扩增基因产物经纯化后用限制性内切酶NcoI和XhoI双酶切，与同样经限制性内切酶NcoI和XhoI双酶切的质粒pET28a连接，构建成重组质粒bapad-pET28a，将1μL重组质粒bapad-pET28a导入大肠杆菌BL21（DE3）中，涂布于含有50μg/mL卡那霉素抗性的LB固体培养基上培养得到单菌落，再挑取单菌落接种到种子液培养基中，培养制得种子培养液；
2）按体积比2%的接种量将种子培养液接种到含有50μg/mL卡那霉素抗性的LB液体培养基中，于37℃，200rpm摇床培养，1.5h后，取200μL菌液于分光光度计测量菌体密度，在菌体量达到OD600=0.6时，加入终浓度0.4mM的异丙基β-D硫代半乳糖苷（IPTG）诱导培养，在30℃条件下，200rpm振荡培养12h，得到大量表达了酚酸脱羧酶BaPAD的重组大肠杆菌菌液；
3）取重组大肠杆菌菌液，在6500rpm离心10min收集菌体，称量菌体湿重，并用磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液重悬清洗3次，得到静息细胞；
4）用10mL的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液重悬静息细胞，加入到1L含有200mM阿魏酸钠的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液中，倒入5L生物反应器中，同时加入1L正辛醇，在30℃条件下，150rpm搅拌催化，根据仪器控制面板上监测的pH变化不断补加阿魏酸干粉，使得pH在6.5±0.1范围内变化直到pH不再增加为止，每隔1h有机相和水相分别取样，用甲醇稀释后检测体系中阿魏酸和2-甲氧基- 4-乙烯基苯酚的含量。
2.根据权利要求1所述的制备2-甲氧基-4-乙烯基苯酚的方法，其特征在于，步骤1）中，重组质粒bapad-pET28a的浓度为20ng/μL。
3.根据权利要求1所述的制备2-甲氧基-4-乙烯基苯酚的方法，其特征在于，步骤3）中，磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液的配制方法是：先分别配制200mM的磷酸氢二钠溶液以及200mM柠檬酸缓冲液，再将柠檬酸溶液加入磷酸氢二钠溶液中，调整pH为6.0。
4.根据权利要求1所述的制备2-甲氧基-4-乙烯基苯酚的方法，其特征在于，采用高效液相色谱法检测阿魏酸和2-甲氧基-4-乙烯基苯酚的浓度。
5.根据权利要求4所述的制备2-甲氧基-4-乙烯基苯酚的方法，其特征在于，高效液相色谱的流动相为100%甲醇：0.1%冰醋酸=35:65，高效液相色谱的检测条件为：柱温30℃，流速0.8mL/min，进样量5μL，阿魏酸和2-甲氧基-4-乙烯基苯酚的检测波长分别为320nm和255nm。
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