CN110183474B - 一种新型荧光探针及其制备方法和在检测尿液中“瘦肉精”克仑特罗的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分析化学领域，具体公开了一种新型荧光探针及其制备方法和在检测尿液中“瘦肉精”克仑特罗的应用。制备方法如下：取二乙三胺五乙酸，乙酸酐，吡啶在65℃下搅拌回流24h。冷却，减压抽滤，洗涤，干燥。将得到的二乙三胺五乙酸二酐(dtpaa)与三乙胺，二甲基甲酰胺(DMF)，3,5‑二氯苯胺(DCA)，于100℃搅拌回流24h。冷却，旋蒸，洗涤，干燥。得到的dtpa‑bis(3,5‑dichloroaniline)与Eu(NO3)3·6H2O于60℃加热搅拌2h，得到目标产物。本发明采用上述的荧光探针，利用荧光光谱法检测“瘦肉精”克仑特罗。本发明方法简单新颖，成本低，效率高，且可应用在实际尿样当中。
Description
技术领域
本发明属于分析化学领域，涉及一种新型荧光探针及其制备方法再检测尿液中“瘦肉精”克仑特罗的应用。
背景技术
克仑特罗(Clenbuterol)是一种β-肾上腺素激动剂，用于支气管等慢性病的治疗。在牧业生产中，通过阻止脂肪的合成提高饲料的转化率，改进肌肉质量，减少脂肪组织沉积，增强瘦肉的比例。因此，克仑特罗也被叫做“瘦肉精”，常被非法用作饲料添加剂。然而，因为克仑特罗的半衰期较长，一旦动物喂食了克仑特罗，就会在动物体内残留很长时间，最终通过代谢出现在尿液中。当人体摄入含有瘦肉精的动物食品后，瘦肉精会遍布全身，出现头疼、心悸、恶心、发烧等中毒症状，导致严重的健康问题，例如心血管和中枢神经疾病。健康人摄入瘦肉精超过20μg就有药效，5倍-10倍的摄入量则会导致中毒。因此，很多国家包括中国，美国和大部分欧洲国家禁止将克仑特罗用作饲料添加剂。
生物样品中克仑特罗的检测方法有很多，包括酶联免疫吸附测定法，高效液相色谱法,液质联用法，气质联用法，免疫层析法，电化学免疫传感器法，电化学生物探针法和荧光生物传感器法。尽管这些对克仑特罗的检测方法效果令人满意，但也有很多缺点，比如仪器设备昂贵，操作时间较长，样品准备较复杂，灵敏度和选择性较差等，所以急需寻找一种快速的，简单的，灵敏的检测方法用于实际样品中克仑特罗的检测。
发明内容
本发明的目的之一是设计合成一种可用于有效检测尿液中“瘦肉精”克仑特罗的新型荧光探针EuIII-dtpa-bis(DCA)。
本发明的目的之二是提供一种操作简单，成本低，敏感快速，且选择性好的检测“瘦肉精”克仑特罗的方法。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种新型荧光探针，所述的荧光探针是稀土氨基多羧酸配合物荧光探针EuШ-dtpa-bis(DCA)。
上述的新型荧光探针的制备方法，方法如下：
1)将二乙三胺五乙酸、乙酸酐和吡啶混合均匀，在65-75℃下搅拌回流24-30h，冷却至室温，减压抽滤，依次用乙酸酐和无水乙醚洗涤，在60-70℃下干燥，得二乙三胺五乙酸二酐(dtpaa)；
2)将二乙三胺五乙酸二酐、三乙胺、无水DMF和3,5-二氯苯胺(DCA)混合均匀，在100-110℃下搅拌回流24-30h，冷却至室温，旋转蒸发，依次用丙酮和无水乙醚洗涤，减压抽滤，于50-60℃干燥，得到配体(dtpa-bis(DCA))；
3)将dtpa-bis(DCA)和Eu(NO3)3·6H2O分别加去离子水溶解，然后混合，于60-70℃搅拌加热2-4h，冷却，得到EuШ-dtpa-bis(dtpa-bis(DCA))。
优选地，上述的新型荧光探针的制备方法，步骤1)中，按摩尔比，二乙三胺五乙酸(dtpa)：乙酸酐：吡啶＝1:2-6:4-10。
优选地，上述的新型荧光探针的制备方法，步骤1)中，按摩尔比，二乙三胺五乙酸(dtpa)：乙酸酐：吡啶＝1:4:6。
优选地，上述的新型荧光探针的制备方法，步骤2)中，按摩尔比，二乙三胺五乙酸二酐(dtpaa)：三乙胺：3,5-二氯苯胺＝1:2-6:1-5。
优选地，上述的新型荧光探针的制备方法，步骤2)中，按摩尔比，二乙三胺五乙酸二酐(dtpaa)：三乙胺：3,5-二氯苯胺＝1:3:2。
优选地，上述的新型荧光探针的制备方法，步骤3)中，按摩尔比，dtpa-bis(DCA)：Eu(NO3)3·6H2O＝1:1-5。
述的新型荧光探针的制备方法，步骤3)中，按摩尔比，dtpa-bis(DCA)：Eu(NO3)3·6H2O＝1:2。
上述的新型荧光探针在检测尿样中“瘦肉精”克仑特罗的应用。
优选地，上述的应用，方法如下：取尿液，加入上述的新型荧光探针，混合均匀，以EuШ-dtpa-bis(DCA)溶液为实验参比，于280nm下进行荧光检测。
本发明的有益效果是：
1.本发明针对被检测物“瘦肉精”克仑特罗的结构特点，利用DNA/RNA单链碱基排序规则对dtpa进行修饰，设计合成了一种新型的荧光探针。
2.通过本发明的方法，该探针可以对克仑特罗进行灵敏地特异性检测。与其它检测克仑特罗的方法相比，具有简单，快速，成本低，选择性好，灵敏度高等优点。
附图说明
图1是荧光探针EuШ-dtpa-bis(DCA)的合成路线图。
图2a是dtpa的傅里叶变换红外光谱(FT-IR)图。
图2b是3,5-二氯苯胺(DCA)的傅里叶变换红外光谱(FT-IR)图。
图2c是dtpa-bis(DCA)的傅里叶变换红外光谱(FT-IR)图。
图3是dtpa-bis(DCA)，EuШ-dtpa-bis(DCA)和EuШ-dtpa-bis(DCA)-Clb的紫外吸收光谱图。
图4a是荧光探针对克仑特罗(Clb)检测的荧光光谱图。
图4b是荧光探针对克仑特罗(Clb)检测的荧光光谱对比柱状图。
图5a是荧光探针对克仑特罗(Clb)及共存物检测的干扰荧光光谱图。
图5b是荧光探针对克仑特罗(Clb)及共存物检测的干扰荧光光谱对比柱状图。
图6a是荧光探针对不同浓度克仑特罗(Clb)检测的荧光光谱图。
图6b是克仑特罗浓度与荧光强度的线性关系图。
图7是荧光探针对尿样(Ur)中克仑特罗(Clb)检测的荧光光谱柱状图。
具体实施方式
实施例1新型荧光探针EuШ-dtpa-bis(DCA)
(一)制备方法
1、二乙三胺五乙酸二酐(dtpaa)的合成
称取7.8670g(0.02mol)二乙三胺五乙酸(dtpa)，乙酸酐16.0mL(0.08mol)，吡啶10.0mL(0.12mol)置于三颈圆底烧瓶中，在65℃下缓慢搅拌加热，冷凝回流24h。停止加热和搅拌，冷却至室温后将产物减压抽滤，依次用乙酸酐和无水乙醚分别洗涤三次(3×10mL)，并减压抽滤，将产物于干燥箱中60℃干燥，即得二乙三胺五乙酸二酐(dtpaa)。
2、dtpa-bis(DCA)的合成
取二乙三胺五乙酸二酐(dtpaa)1.9635g(5.5mmol)，2.334mL的三乙胺(16.5mmol)，无水DMF(50mL)，3,5-二氯苯胺1.78g(11mmol)，于三颈圆底烧瓶中。恒温100℃条件下，快速搅拌，冷凝回流24h。反应完全后静置，冷却到室温后，旋转蒸发除去溶剂，得乳白色固体物质，减压抽滤，依次用丙酮和无水乙醚分别洗涤三次(3×10mL)。于50℃条件下干燥，即得dtpa-bis(DCA)。
3、荧光探针EuШ-dtpa-bis(DCA)的合成
将0.1533g dtpa-bis(DCA)(0.25mmol)和0.1115g Eu(NO3)3·6H2O(0.25mmol)分别加入到圆底烧瓶中，加入100mL的Tris-HCl([Tris-HCl]＝0.05mol/L，pH＝7.40)缓冲溶液，于100℃搅拌加热回流1.0h，溶液冷却至室温，转移至500ml容量瓶中，用去离子水洗涤圆底烧瓶三次，将上述洗涤液全部转移至容量瓶中，用Tris-HCl([Tris-HCl]＝0.05mol/L，pH＝7.40)缓冲溶液定容，得到浓度为5.00×10-4mol/L的EuШ-dtpa-bis(DCA)溶液。合成过程如图1所示。
(二)检测
(1).Dtpa、3,5-二氯苯胺(DCA)、dtpa-bis(DCA)(dtpa-DCA)的FT-IR图，如图2a，2b，2c所示，与dtpa和3,5-二氯苯胺(DCA)相比，配体dtpa-bis(DCA)的特征吸收峰都发生了明显的变化。对比图2a和图2b发现，图2c中配体dtpa-bis(DCA)的vs(C-O)和vs(C＝O)分别出现在1242cm-1和1705cm-1，vas(CONH)和vas(N-H)分别出现在1734cm-1和3109cm-1。在图2a中，dtpa酰胺键的vas(C＝O)出现在1637cm-1。在图2b中，3,5-二氯苯胺(DCA)中vas(NH2)出现在3430cm-1，这两种特征峰的变化说明酰胺键的形成，即dtpa-bis(DCA)由dtpa和3,5-二氯苯胺(DCA)通过酰化反应被成功合成。
(2).Dtpa-bis(DCA)(dtpa-DCA)，EuШ-dtpa-bis(DCA)(EuШ-dtpa-DCA)和EuШ-dtpa-bis(DCA)-瘦肉精(EuШ-dtpa-BA-Clb)的紫外吸收光谱图如图3所示。从图3可以看出，配体dtpa-bis(DCA)和配合物EuШ-dtpa-bis(DCA)没有明显的吸收峰。然而，当克仑特罗(Clb)加入到配合物EuШ-dtpa-bis(DCA)溶液中时，检测体系EuШ-dtpa-bis(DCA)-Clb在242nm及295nm处出现明显的紫外吸收峰，可以预测当克仑特罗(Clb)加入到配合物EuШ-dtpa-bis(DCA)溶液中后，荧光强度会明显减弱，这也为荧光方法检测克仑特罗(Clb)做了铺垫。
实施例2荧光探针EuШ-dtpa-bis(DCA)在检测克仑特罗中的应用(一)荧光探针对克仑特罗检测的荧光光谱
实验条件：取一定量的克仑特罗用Tris-HCl([Tris-HCl]＝0.05mol/L，pH＝7.40)缓冲溶液配置成浓度为5.0×10-4mol/L的溶液，作为克仑特罗储备液。
取3支样品管，将1mL浓度为5.0×10-4mol/L的克仑特罗和1mL浓度为5.0×10- 4mol/L的探针EuШ-dtpa-bis(DCA)溶液加入到第一支样品管中，再取1mL浓度为5.0×10- 4mol/L的克仑特罗溶液加入另一支样品管中，用Tris-HCl缓冲溶液定容至5mL。最终检测浓度为1.0×10-4mol/L，以EuШ-dtpa-bis(DCA)溶液为参比，在280nm波长光的激发下，观察探针EuШ-dtpa-bis(DCA)的荧光光谱的变化。
结果如图4a，4b所示。在280nm波长光的激发下，荧光探针EuШ-dtpa-bis(DCA)在561nm处发射出强荧光，而克仑特罗在561nm处几乎不发出荧光。当把克仑特罗加入到探针溶液中后，探针的荧光被明显猝灭。
(二)共存物质存在对荧光探针EuШ-dtpa-bis(DCA)检测克仑特罗的影响
实验条件：取5支样品管，分别加入1mL浓度为5.0×10-4mol/L的脲(U)，葡萄糖(G)，马尿酸(Ha)，苯丙氨酸(Pha)和尿酸(Ua)溶液，再分别加1mL浓度为5.0×10-4mol/L的荧光探针EuШ-dtpa-bis(DCA)和克仑特罗溶液，定容至5mL。最终检测浓度为1.0×10-4mol/L，以EuШ-dtpa-bis(DCA)溶液为参比，在280nm波长光的激发下，观察探针EuШ-dtpa-bis(DCA)检测克仑特罗的荧光光谱变化。
结果如图5a、图5b所示。从图5a中可以看出，探针溶液在561nm处发出强荧光，当克仑特罗加入到探针溶液中后，探针的荧光被猝灭。当脲(U)，葡萄糖(G)，马尿酸(Ha)，苯丙氨酸(Pha)和尿酸(Ua)等共存物质分别加入到探针和克仑特罗的混合溶液中后，混合溶液的荧光几乎不发生改变。这说明，尿液中其他与克仑特罗共存的物质不会干扰探针对克仑特罗的检测。图5b为共存物对EuШ-dtpa-bis(DCA)-Clb溶液荧光强度影响的柱状图。
(三)不同浓度克仑特罗对EuШ-dtpa-bis(DCA)荧光强度的影响
实验条件：取10支样品管，分别加入1mL浓度为5.0×10-4mol/L的荧光探针EuШ-dtpa-bis(DCA)，再加入不同量的克仑特罗溶液，定容至5mL。以EuШ-dtpa-bis(DCA)溶液为参比，在280nm波长光的激发下，测得探针EuШ-dtpa-bis(DCA)检测不同浓度克仑特罗的荧光光谱变化。
结果如图6a所示，在280nm波长光的激发下，荧光探针EuШ-dtpa-bis(DCA)在561nm处发射出强荧光，当有克仑特罗加入时，随着克仑特罗浓度不断增加，探针的荧光强度逐渐减弱。如图6b所示，在浓度范围0-300μmol/L，荧光强度比F0/F(F0为配合物EuШ-dtpa-bis(DCA)的荧光强度，F为克仑特罗(Clb)存在下配合物的荧光强度)与克仑特罗(Clb)浓度(C[CLB])呈现良好的线性关系，线性方程为y＝0.0558x+1.0157(R2＝0.9984)，可以用来测定克仑特罗的浓度。
(四)荧光探针EuШ-dtpa-bis(DCA)检测实际尿样中的克仑特罗
本实验采用标准加入法制备含有瘦肉精的实际尿样。
实验条件：取3支样品管，加入1mL婴儿尿液和1mL荧光探针溶液，再分别加入体积为0.1、0.5、1.0mL浓度为5.00×10-4mol/L的克仑特罗标准溶液，用Tris-HCl([Tris-HCl]＝50mmol/L，pH＝7.40)缓冲溶液定容于5mL样品管中，制成含有不同量克仑特罗的实际样品；以含有1mL尿液的探针溶液作为实验参比。在280nm波长光的激发下，观察荧光光谱的变化。
结果如图7所示。在280nm波长光的激发下，以EuШ-dtpa-bis(DCA)溶液做参比，加入克仑特罗后的尿液，荧光强度明显降低。克仑特罗本身没有荧光，加入克仑特罗的尿液在561nm处也没有明显的荧光。然而，当探针溶液被添加到尿液中时，在561nm附近发出明显荧光。继续向溶液中加入克仑特罗，探针的荧光强度明显被猝灭。此外，随着克仑特罗浓度的增加，探针在561nm处的荧光强度逐渐降低。因此，可以推测，此荧光探针可以检测实际尿样中的克仑特罗。通过标准加入法，制备含有不同量克仑特罗的实际尿样，利用配合物EuШ-dtpa-bis(DCA)作为荧光探针，检测其中的克仑特罗，实际尿样中克仑特罗的检测结果见表1，回收率在90.8％-96.2％之间，相对标准偏差在0.49％-1.51％之间，检测结果令人满意。
表1实际尿样中克仑特罗检测结果
a Average of three determinations(mean±SD；n＝3).
b N.D:not detected.
Claims (10)
1.一种荧光探针，其特征在于，所述的荧光探针是稀土氨基多羧酸配合物荧光探针EuШ-dtpa-bis(DCA)结构式如式(Ⅰ)所示：
2.权利要求1所述的荧光探针的制备方法，其特征在于，方法如下：
1)将二乙三胺五乙酸、乙酸酐和吡啶混合均匀，在65-75℃下搅拌回流24-30h，冷却至室温，减压抽滤，依次用乙酸酐和无水乙醚洗涤，在60-70℃下干燥，得二乙三胺五乙酸二酐(dtpaa)，结构式如式(Ⅱ)所示：
2)将二乙三胺五乙酸二酐、三乙胺、无水DMF和3,5-二氯苯胺(DCA)混合均匀，在100-110℃下搅拌回流24-30h，冷却至室温，旋转蒸发，依次用丙酮和无水乙醚洗涤，减压抽滤，于50-60℃干燥，得到配体(dtpa-bis(DCA))，结构式如式(Ⅲ)所示：
3)将dtpa-bis(DCA)和Eu(NO3)3·6H2O分别加去离子水溶解，然后混合，于60-70℃搅拌加热2-4h，冷却，得到EuШ-dtpa-bis(dtpa-bis(DCA))。
3.如权利要求2所述的荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤1)中，按摩尔比，二乙三胺五乙酸(dtpa)：乙酸酐：吡啶＝1:2-6:4-10。
4.如权利要求3所述的荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤1)中，按摩尔比，二乙三胺五乙酸(dtpa)：乙酸酐：吡啶＝1:4:6。
5.如权利要求2所述的荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤2)中，按摩尔比，二乙三胺五乙酸二酐(dtpaa)：三乙胺：3,5-二氯苯胺＝1:2-6:1-5。
6.如权利要求5所述的荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤2)中，按摩尔比，二乙三胺五乙酸二酐(dtpaa)：三乙胺：3,5-二氯苯胺＝1:3:2。
7.如权利要求2所述的荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤3)中，按摩尔比，dtpa-bis(DCA)：Eu(NO3)3·6H2O＝1:1-5。
8.如权利要求7所述的荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤3)中，按摩尔比，dtpa-bis(DCA)：Eu(NO3)3·6H2O＝1:2。
9.权利要求1所述的荧光探针在制备检测尿样中“瘦肉精”克仑特罗试剂中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，方法如下：取尿液，加入权利要求1所述的荧光探针，混合均匀，以EuШ-dtpa-bis(DCA)溶液为实验参比，于280nm下进行荧光检测。
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| DTPA衍生物_Eu配合物在分析与检测食品添加剂中的应用;姜晓庆;《辽宁大学博士学位论文》;20190609;第2-5章 * |
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