CN110183418B - 一类山胡椒植物根来源的倍半萜及其分离方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一类山胡椒植物根来源的倍半萜及其分离方法和应用。所述倍半萜化合物的结构如式Ⅰ、式Ⅱ和式Ⅲ所示。本发明所述3个半萜化合物来自于山胡椒(Lindera glauca)植物根部，能够显著的抑制细胞中NO的产生，尤其是LPS诱导的NO的产生，其IC₅₀分别为2.43±0.27μM、4.00±1.15μM和1.38±0.30μM，同时对于细胞的安全性高，可制备成为抗炎药物应用，在临床上的应用具有极大的前景。

Description

一类山胡椒植物根来源的倍半萜及其分离方法和应用

技术领域

本发明涉及医药化合物技术领域，更具体地，涉及一类山胡椒植物根来源的倍半萜及其分离方法和应用。

背景技术

炎症是具有血管系统的活体组织在致炎因子的作用下，机体采取的自我组织修复，排除损伤细胞和外来抗原的一种以防御为主的复杂防御反应。这种防御反应分为急性和慢性两种，急性反应主要表现为淋巴细胞浸润和激活，具有免疫和防御功能，可以防控病原体的侵入和损害。但是如果致炎因子持续作用，则可引起慢性炎症，产生组织损伤，进而产生各种如肥胖，糖尿病，血栓，甚至癌症等疾病。

目前临床常用的抗炎药物主要有两类：非甾体抗炎药和甾体类抗炎药。尽管其在一定程度上具有较好的抗炎效果，但长期大量使用会产生一系列不良反应和耐受性，如严重的胃肠道损伤、肝脏损伤、心血管毒性风险、肾脏损害等。为解决药物的不良反应及耐受性，寻找新的抗炎药物类型以及相关新颖骨架类型的药物一直以来是抗炎药物研究领域的热点。

天然产物是新药发现的重要来源，由于其具有结构多样性和广泛的生物活性，是人类预防和治疗疾病的重要药物前体分子。据美国食品药品监督管理局(FDA)统计，在1981年到2014年期间，大约有62％药物来源于天然产物或者来源于天然产物的结构修饰物。植物是天然药物的重要组成部分，地球上植物资源多种多样，代谢产物丰富，从植物中发现先导化合物是获得新药候选化合物和新药的重要途径。其次，植物的代谢产物具有广泛的生理活性，如抗炎，抗菌，抗肿瘤，免疫调节，酶抑制等多种活性。因此，从植物中寻找新的药源分子一直是药物研究领域的热点。

发明内容

本发明的目的在于提供一类山胡椒植物根来源的倍半萜。本发明所述倍半萜来源于山胡椒植物根部，其可显著抑制LPS诱导巨噬细胞产生NO，同时对于正常细胞还具有很好的安全性，可制备成为抗炎药物进行应用。

本发明的另一目的在于提供所述山胡椒植物根来源的倍半萜的分离方法。

本发明的再一目的在于提供所述山胡椒植物根来源的倍半萜的应用。

本发明的上述目的是通过以下方案予以实现的：

一类山胡椒植物根来源的倍半萜，其结构如以下任一结构所示：

本发明同时还保护所述山胡椒植物根来源的倍半萜的分离方法，具体包括如下步骤：

S1.取干燥的山胡椒根部，磨成粉末；加甲醇提取，得到甲醇提取的浸膏，并用石油醚萃取浸膏，得到石油醚萃取粗提物；

S2.将石油醚萃取粗提物用硅胶柱层析进行梯度洗脱分离，流动相为石油醚/丙酮，体积比为100～10:1梯度洗脱，收集体积比为10:1的馏份，浓缩得到粗提物1；

S3.将粗提物1采用凝胶Sephadex LH-20层析进行等度洗脱分离，流动相为体积比为1:1的甲醇-氯仿，收集洗脱液，浓缩得到粗提物2；

S4.将粗提物2采用反相柱色谱进行梯度洗脱分离，流动相为甲醇/水，体积比为50:50～70:30梯度洗脱，收集体积比为70:30的馏份，浓缩得到粗提物3；

S4.将粗提物3采用制备型高效液相色谱进行等度洗脱分离，流动相和体积比为75:25的甲醇/水，即分离得到式Ⅰ、式Ⅱ和式Ⅲ所示化合物。

优选地，步骤S2中，石油醚/丙酮梯度洗脱的体积比例变化为100:1、50:1、30:1、20:1、10:1。

优选地，步骤S4中，甲醇/水梯度洗脱的体积比例变化为50:50、60:40、70:30。

优选地，步骤S1中，所述山胡椒根部粉末提取前先过20目筛；甲醇提取3次，每次提取过程中浸泡时间为48h。

优选地，步骤S1中，石油醚萃取过程为：先将得到的浸膏加水混合均匀，得到均匀的混悬液；然后加石油醚静置分层后，分离石油醚层；重复加入石油醚并分离石油醚层至石油醚层无色。

优选地，所述山胡椒(Lindera glauca)根部采自于湖北省巴东县野三关镇黄连坪村阮家坡林边(东经110.4470°；北纬30.7057°；海拔1203m)。

优选地，步骤S4中，所述反相柱色谱为ODS反相柱YMC*GEL ODS-A-HG 12nm S-50μm。

优选地，步骤S4中，制备型高效液相色谱的色谱柱为Kromasil 100-5C₁₈(250×10mm，5μm)。

所述山胡椒植物根来源的倍半萜在制备抗炎药物中的应用也在本发明的保护范围之内。

本发明同时还保护所述山胡椒植物根来源的倍半萜在制备抑制NO产生的药物中的应用。

优选地，所述NO是由LPS诱导产生的。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明所述3个半萜化合物(式Ⅰ、式Ⅱ和式Ⅲ)来自于山胡椒(Lindera glauca)植物根部，能够显著的抑制细胞中NO的产生，尤其是LPS诱导的NO的产生，其IC₅₀分别为2.43±0.27μM、4.00±1.15μM和1.38±0.30μM，同时对于细胞的安全性高，可制备成为抗炎药物应用。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1

一类山胡椒植物根来源的倍半萜，其结构如下所示：

上述3个化合物分离自山胡椒(Lindera glauca)植物的根部，采用的山胡椒(Lindera glauca)植物根部采集自湖北省巴东县野三关镇黄连坪村阮家坡林边(东经110.4470°；北纬30.7057°；海拔1203m)，经鉴定为樟科山胡椒属植物山胡椒(Linderaglauca)的根部，然后按照以下步骤进行分离：

S1.取山胡椒根部，晒干、粉碎成粉末，并过20目筛；然后加甲醇提取，每次浸泡48h，重复提取3次，得到甲醇提取液，浓缩后得到浸膏，并用石油醚萃取浸膏，得到石油醚萃取粗提物；

具体的萃取过程为：先将得到的浸膏加水混合均匀，得到均匀的混悬液；然后加石油醚静置分层后，分离石油醚层；重复加入石油醚并分离石油醚层至石油醚层无色；

S2.将石油醚萃取粗提物用硅胶柱层析进行梯度洗脱分离，流动相为石油醚/丙酮，体积比为100:1、50:1、30:1、20:1、10:1，收集体积比为10:1的馏份，浓缩得到粗提物1；

S3.将粗提物1采用凝胶Sephadex LH-20层析进行等度洗脱分离，流动相为体积比为1:1的甲醇-氯仿，收集洗脱液，浓缩得到粗提物2；

S4.将粗提物2采用反相柱色谱进行梯度洗脱分离，采用的色谱柱为ODS反相柱(YMC*GEL ODS-A-HG 12nm S-50μm)，流动相为甲醇/水，体积比为50:50、60:40、70:30，收集体积比为70:30的馏份，浓缩得到粗提物3；

S4.将粗提物3采用制备型高效液相色谱进行等度洗脱分离，色谱柱Kromasil100-5C₁₈(250×10mm，5μm)，流动相为体积比为75:25的甲醇/水，即分离得到式Ⅰ、式Ⅱ和式Ⅲ所示化合物。

对分离得到的3个化合物进行结构测试解析，得到以下实验数据：

式Ⅰ化合物：C₁₅H₂₂O₃，HRESI-MS：249.1496[M-H]^-(计算值249.1491)。

式Ⅱ化合物：C₁₅H₂₂O₃，HRESI-MS：249.1499[M-H]^-(计算值249.1491)。

式III化合物：C₁₅H₂₂O₃,HRESI-MS:249.1498[M-H]^-(计算值249.1491)。

3个化合物的NMR数据见表1。

表1. 3个化合物的NMR数据(CDCl₃，400MHz/100MHz,ppm)

因此，确定3个化合物的结构分别如式Ⅰ、式Ⅱ和式Ⅲ所示。

实施例2活性测试

一、测试3个化合物的抗炎活性，具体过程如下：

1.细胞的培养与处理

体外培养RAW 264.7细胞(小鼠单核巨噬细胞)，使用含10％FBS的DMEM高糖培养基，在37℃、5％二氧化碳浓度条件下进行常规维持培养和传代。

2.化合物干预

(1)实验方法

分别将式Ⅰ、式Ⅱ、式Ⅲ所示化合物和吲哚美辛溶解于DMSO中，用培养基配成不同的药物浓度，每个浓度设3个平行复孔，并设置模型对照孔(只加LPS)，空白对照孔(细胞和培养基)。

选择处于对数生长期的RAW264.7细胞，以2×10⁴cells/孔的密度种板，共培养12h后，将不同浓度的药物加入相应的96孔板中，2h后加入终浓度为1μg/mL的LPS，诱导巨噬细胞分化成炎症状态。培养48h后，取细胞上清液50μL，加入一氧化氮检测试剂盒的试剂Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ各50μL，利用Griess法测定NO的含量。

抑制率＝[1-(NO_treat-NO_control)/(NO_model-NO_control)]×100％。

二、测试3个化合物的细胞毒性，具体过程如下：

MTT可被活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶还原为水不溶性的蓝色结晶，并沉积在活细胞中，而死细胞并无此功能。

(1)实验方法

分别将式Ⅰ、式Ⅱ、式Ⅲ所示化合物和吲哚美辛溶解于DMSO中，用培养基配成不同的药物浓度，每个浓度设3个平行复孔，并设置空白对照孔(细胞和培养基)。

选择处于对数生长期的RAW264.7细胞，以2×10⁴cells/孔的密度种板，共培养12h后，将不同浓度的药物加入相应的96孔板中，培养48小时后，每孔加入5mg/mL的MTT溶液10μL，培养4小时后，吸出培养基，再向每孔加入150μL的DMSO。震荡摇匀。用酶标仪测定在570nm波长处的吸光度值(A)。药物对细胞生长的抑制作用以存活率表示，存活率越高，表示药物毒性越低。

存活率(％)＝[(A₁–A₀)/(A₂-A₀)]×100％，其中A₀空白对照的吸光度值，A₁为样品的吸光度值，A₂为阳性对照孔的吸光度值。

测定5个浓度的样品，绘制剂量-抑制率曲线，得出其CC₅₀值。每个样品重复测定三次。

上述两个试验的测试结果如表2所示。

表2 3个化合物对炎症因子NO的抑制率和细胞毒性

化合物编号	IC<sub>50</sub>，μM	CC<sub>50</sub>，μM
			式Ⅰ	2.43±0.27	>100
式Ⅱ	4.00±1.15	>100
			式Ⅲ	1.38±0.30	>85
吲哚美辛	23.89±1.48

结果表明：式Ⅰ、式Ⅱ、式Ⅲ所示化合物均显示了较强的抗NO产生的活性，其IC₅₀分别为2.43±0.27μM，4.00±1.15μM，1.38±0.30μM，其活性强于阳性对照吲哚美辛(IC₅₀23.89±1.48)。同时，3个化合物分别在100，100和85μM浓度下，不显示有细胞毒活性。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (10)

1.一类山胡椒植物根来源的倍半萜，其特征在于，其结构如以下任一结构所示：

2.权利要求1所述山胡椒植物根来源的倍半萜的分离方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1.取干燥的山胡椒根部，磨成粉末；加甲醇提取，得到甲醇提取的浸膏，并用石油醚萃取浸膏，得到石油醚萃取粗提物；

S2.将石油醚萃取粗提物用硅胶柱层析进行梯度洗脱分离，流动相为石油醚/丙酮，体积比为100～10:1梯度洗脱，收集体积比为10:1的馏份，浓缩得到粗提物1；

S3.将粗提物1采用凝胶Sephadex LH-20层析进行等度洗脱分离，流动相为体积比为1:1的甲醇-氯仿，收集洗脱液，浓缩得到粗提物2；

S4.将粗提物2采用反相柱色谱进行梯度洗脱分离，流动相为甲醇/水，体积比为50:50～70:30梯度洗脱，收集体积比为70:30的馏份，浓缩得到粗提物3；

S4.将粗提物3采用制备型高效液相色谱进行等度洗脱分离，流动相为体积比为75:25的甲醇/水，即分离得到式Ⅰ、式Ⅱ和式Ⅲ所示化合物。

3.根据权利要求2所述山胡椒植物根来源的倍半萜的分离方法，其特征在于，步骤S2中，石油醚/丙酮梯度洗脱的体积比例变化为100:1、50:1、30:1、20:1、10:1；

步骤S4中，甲醇/水梯度洗脱的体积比例变化为50:50、60:40、70:30。

4.根据权利要求2所述山胡椒植物根来源的倍半萜的分离方法，其特征在于，步骤S1中，所述山胡椒根部粉末提取前先过20目筛；甲醇提取3次，每次提取过程中浸泡时间为48h。

5.根据权利要求2所述山胡椒植物根来源的倍半萜的分离方法，其特征在于，步骤S1中，石油醚萃取过程为：先将得到的浸膏加水混合均匀，得到均匀的混悬液；然后加石油醚静置分层后，分离石油醚层；重复加入石油醚并分离石油醚层至石油醚层无色。

6.根据权利要求2所述山胡椒植物根来源的倍半萜的分离方法，其特征在于，步骤S4中，所述反相柱色谱为ODS反相柱YMC*GEL ODS-A-HG 12nm S-50μm。

7.根据权利要求2所述山胡椒植物根来源的倍半萜的分离方法，其特征在于，步骤S4中，制备型高效液相色谱的色谱柱为Kromasil 100-5 C₁₈。

8.权利要求1所述山胡椒植物根来源的倍半萜在制备抗炎药物中的应用。

9.权利要求1所述山胡椒植物根来源的倍半萜在制备抑制NO产生的药物中的应用。

10.根据权利要求9所述应用，其特征在于，所述NO是由LPS诱导产生的。