CN110172443A - 利用骨髓间充质干细胞构建组织工程软骨的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种利用骨髓间充质干细胞构建组织工程软骨的方法，其包括：(1)制备软骨细胞聚集体，(2)对全血进行离心以制备富血小板血浆；(3)将骨髓间充质干细胞和所述软骨细胞聚集体置于所述富血小板血浆中，混合均匀，向得到的混合物中加入含有氯化钙的凝血酶溶液，形成细胞复合体；以及(4)将所述细胞复合体注射进受试者，进行体内生长，从而获得组织工程软骨，其中步骤(3)中所述骨髓间充质干细胞和所述软骨细胞聚集体所含有的软骨细胞的数量比例为1:1。本发明的构建组织工程软骨的方法操作简单，能够维持最优的新生软骨形态以及软骨向分化特征，在有效抵御中心空泡化的同时抑制了新生软骨边缘骨化的发生。
Description
技术领域
本发明涉及构建组织工程软骨的方法，尤其是利用骨髓间充质干细胞(BMSC)和软骨细胞(chondrocyte)来构建组织工程软骨的方法。
背景技术
目前，在一些构建组织工程软骨的技术中，利用了骨髓间充质干细胞。骨髓间充质干细胞具有软骨分化潜能，它们与软骨细胞共培养时，软骨细胞及其分泌的细胞因子构成的微环境有利于BMSC的软骨向分化。但是，这些技术通常在在体培养之前需要使用大量的外源性生长因子和大量的BMSC体外培养操作，同时，如何抑制骨髓间充质干细胞在体内肥大化进而骨化以及如何防止新生组织工程软骨空泡化仍亟待解决。
发明内容
为了克服上述问题，本发明提供了一种利用骨髓间充质干细胞构建组织工程软骨的方法，其包括：
(1)制备软骨细胞聚集体，包括：将软骨细胞培养成膜；将所述膜置于褐藻酸钠溶液中，通过滴加氯化钙溶液让褐藻酸钠溶液凝结为胶冻状复合体；将所述胶冻状复合体切割成块状物，并置于褐藻酸盐溶解缓冲液中溶解，获得软骨细胞聚集体；
(2)对全血进行离心以制备富血小板血浆；
(3)将骨髓间充质干细胞和所述软骨细胞聚集体置于所述富血小板血浆中，混合均匀，向得到的混合物中加入含有氯化钙的凝血酶溶液，形成细胞复合体；以及
(4)将所述细胞复合体注射进受试者，进行体内生长，从而获得组织工程软骨，
其中，步骤(3)中所述骨髓间充质干细胞和所述软骨细胞聚集体所含有的软骨细胞的数量比例为1:1。
在一些实施方案中，步骤(2)获得的所述富血小板血浆的血小板终浓度为19.8×108个/mL至22×108个/mL。
在一些实施方案中，步骤(2)包括：将所述全血以1800rpm离心8min，弃去下层红细胞层；将剩余部分以3600rpm离心8min，弃去上层3/4的乏血小板血浆，余下部分用滴管反复吹打均匀，以获得所述富血小板血浆。
在一些实施方案中，所述软骨细胞、全血、骨髓间充质干细胞均来自同一受试者。这里所用的受试者包括哺乳动物，尤其是人。
在一些实施方案中，所述块状物的面积为1mm2，厚度为50至80μm。
在一些实施方案中，所用的骨髓间充质干细胞为传代3次的培养细胞。
在一些具体实施方案中，步骤(3)中所述骨髓间充质干细胞的数量为1.5×108个，所述所述软骨细胞聚集体所含有的软骨细胞的数量为1.5×108个；所述富血小板血浆为500μL，其中血小板终浓度为19.8×108个/mL至22×108个/mL；所述凝血酶溶液为50μL，其中含有100mg/mL的氯化钙。
本发明的构建组织工程软骨的方法操作简单，能够维持最优的新生组织工程软骨形态以及软骨向分化特征，在有效抵御中心空泡化的同时抑制了新生组织工程软骨边缘骨化的发生。
附图说明
图1为软骨细胞聚集体(细胞砖，CB)的制备流程示意图。
图2为显示利用多片刀制备细胞砖的操作步骤的照片。
图3为显示细胞砖大小的显微照片。
图4显示了代表性新生组织工程软骨的形态学结果。
图5显示了代表性新生组织工程软骨的软骨向分化染色结果。
图6显示了代表性新生组织工程软骨的肥大化骨化染色结果。
图7显示了代表性新生组织工程软骨的II型胶原和糖胺聚糖(GAG)水平检测结果。
具体实施方式
除非另有说明，本文使用的所有技术和科学术语具有本领域普通技术人员所通常理解的含义。
以下通过具体实施例对本发明进一步详细说明。
实施例1.软骨细胞聚集体(细胞砖)的制备
取1月龄新西兰白兔的入耳软骨，剪碎后用浓度0.2％(wt)的II型胶原酶(Gibco，美国)溶液在37℃下消化12h，之后，取单细胞悬液于15mL离心管内以1000rpm的转速离心5min。弃去上清，用PBS冲洗1次，再以1000rpm的转速离心5min，利用成膜诱导液重悬细胞。以6.5×105个细胞/cm2的浓度种植于6孔板中培养。之后采用成膜诱导液继续培养，每3天换液一次。所用的成膜诱导液为高糖DMEM培养基(Hyclone，美国)，包含20％胎牛血清(Gibco，美国)、272μg/mL谷氨酰胺(Amresco，美国)、50μg/mL抗坏血酸(Amresco，美国)、50μg/mL青霉素(Amresco，美国)、30μg/mL青霉素(Amresco，美国)。
10天后，软骨细胞成膜。将软骨细胞膜片刮下，浸入盛有浓度为1.2％(wt)的褐藻酸钠溶液的培养皿中铺平，滴入102mM的氯化钠溶液直至褐藻酸钠溶液完全凝结为胶冻状复合体，厚度为3至5mm。
用多片刀先横后纵切割该胶冻状复合体，并将其浸于藻酸盐溶解缓冲液中，释放获得细胞砖；以PBS冲洗两次，备用。所用的藻酸盐溶解缓冲液包含55mM柠檬酸钠(Sigma，美国)和0.15mM氯化钠(Sigma，美国)，pH 6.8。多片刀指在一块基板上固定有多个平行刀片的结构，刀片间距例如为1mm。细胞砖的制备过程参见图1，具体的切割操作参见图2。图3显示了细胞砖的大小，面积约1016μm×1032μm，厚度约50μm至80μm。
实施例2.富血小板血浆(PRP)的制备
取2月龄新西兰白兔耳缘静脉血，按总体积的10％加入浓度3.8％(wt)的柠檬酸钠溶液抗凝，采用两步离心法制备PRP：全血在室温下以1800rpm转速离心8min后，分为上中下三层，上层为乏血小板血浆，中层为富血小板血浆，下层为红细胞；将上中两层血浆转移至另一离心管中，以3600rpm转速离心8min，弃去上层3/4的乏血小板血浆，余下部分用滴管将血小板反复吹打均匀，即为富血小板血浆，其中血小板终浓度为20.9±1.1×108个/mL，置于冰上保存备用。
实施例3.BMSC-细胞砖-血小板细胞复合体的制备和体内生长以及检测结果
实验操作：
将传代培养至P3代的BMSC和实施例1制备的细胞砖(CB)悬浮于500μL实施例2制备的富血小板血浆中，混匀，向其中加入含有100mg/mL氯化钙的50μL凝血酶溶液。随后注射进裸鼠皮下，进行体内生长。在本项实验中，我们关注BMSC数量和细胞砖含有的软骨细胞数量之间的比例对所形成的新生组织工程软骨的影响。所用的BMSC和软骨细胞数量总和为3×108个。进行的试验分为三组，包括BMSC与软骨细胞之间的比例为1：2、1：1和2：1，以下分别记为B1CB2、B1CB1和B2BC1。体内生长8周后，取出样本，对其进行肉眼观察，并测量比较它们的体积、质量和厚度。之后将样本一分为二，一半进行组织学染色检测，另一半进行生物化学检测。
结果：
新生软骨的形态学代表性检测结果显示在图4中。从图4可看出，来自B1CB1组的样本形成的软骨颜色均匀，体积较大，形态稳定，边缘未有明显的骨化现象(图4B)。来自B1CB2组的新生软骨体积明显偏小(图4A)，而B2CB1组的新生软骨边缘骨化明显(图4C)。图4D、E、和F显示了新生软骨内部情况。B1CB2组的新生软骨空泡化严重(图4D)，B1CB1组的新生软骨内部和边缘比较均匀(图4E)，B2CB1组的新生软骨甚至内部都具有骨化现象(图4F)。新生组织工程软骨的湿重、体积和厚度的检测结果比较分别显示在图4G、H、I中，与上述的肉眼观测结果一致。
B/CB比例是否会对BMSC体内异位软骨发生有显著影响，是与未来实际临床应用有着直接相关的一个重要问题。为了研究新生组织的软骨特性，我们对新生生组织进行了HE、番红-O(Safranin-O)染色和II型胶原(Collagen-II)免疫组化染色，以进一步揭示新生软骨组织的不同组织学结构。代表性染色结果见图5。体内培养8周后，来自B1BC1组的样本在整个移植物中呈现出新生软骨组织形成特征，这与B1CB2组样本的中心坏死形成鲜明对照(对比图5A和图5E)。B1BC1和B2CB1组的新生软骨组织内部的细胞得以存活和发育。在B1CB2组中，软骨组织稀疏分布在带腔隙的圆形细胞区域内。B1CB1组番红O染色和II型胶原免疫组化染色更重，显示BMSC的软骨向分化效果优于另外两组。此外，B1CB1组中出现新生软骨区域融合，外周软骨壳形成。尽管B2CB1组也可观察到外周软骨壳，但在BMSC暴露区出现了骨化。
骨化一直是阻碍BMSC异位软骨发生应用的一个重要问题。我们采用马松三色染色法、Von kossa染色法、I型和X型胶原免疫组化染色法，分析了BMSC/细胞砖软骨细胞比例对皮下异位软骨形成时预防BMSC肥大化和骨化作用的影响。染色结果显示在图6中。Vonkossa染色显示，B2CB1样本外周沉积的黑色晶体说明新生组织外周出现了肥大化、骨化现象(图6J)。骨化现象主要发生在暴露于宿主体内的BMSC区域。马松三色染色染色显示B2CB1组有骨胶原的产生，这证实了成熟骨的形成(图6I)。相比之下，B1CB1和B1CB2组未发现钙沉积，并且以软骨胶原生成为主，因此呈现较优的新生软骨特征(图6A、B、E、F)。为了进一步鉴别不同组植入物内BMSC的肥厚性转变和骨化情况，进行了I型和X型胶原免疫组化染色。免疫组化染色结果显示，B2CB1组新形成的细胞外基质(ECM)对I型胶原和X型胶原有较深的染色。以上两种胶原的高表达表明，B2CB1组暴露于宿主体内的BMSC正在经历肥厚转化和骨化过程(图6K，L)。相比之下，B1CB1和B1CB2组胶原的微弱染色表明，这两组的BMSC保持了I型和X型胶原的低水平，并在8周内阻止皮下异位软骨生成过程中的新生软骨细胞肥大化、骨化等问题(图6C、D、G、H)。
为了进一步研究BMSC/细胞砖软骨细胞比例对诱导促进BMSC软骨向分化的影响，对三组样本中的胶原和GAG进行了定量分析。B1CB1组样本(14.16±1.15μg/mg)和B1CB2组样本(15.26±1.32μg/mg)的GAG含量明显高于B2CB1组(11.18±1.09μg/mg，P<0.01)。同时，B2CB1组样本(1.11±0.09μg/mg)的胶原含量也明显低于B1CB1组(1.32±0.12μg/mg，P<0.05)和B1CB2组(1.39±0.10μg/mg，P<0.01)，提示B2CB1组样本对软骨生成的促进作用不如另两组。B1CB1组与B1CB2组的GAG与胶原定量结果无明显统计学差异。这说明，在使用供体软骨细胞更少的B1CB1组即可获得最优的成软骨效果。
由上述结果可知，注射前BMSC-细胞砖-血小板细胞复合体中BMSC和软骨细胞比例明显影响所形成的新生软骨的形态和分化特征，而1：1的BMSC和软骨细胞比例具有最佳效果。
以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
Claims (8)
1.一种利用骨髓间充质干细胞构建组织工程软骨的方法，包括：
(1)制备软骨细胞聚集体，包括：将软骨细胞培养成膜；将所述膜置于褐藻酸钠溶液中，通过滴加氯化钙溶液让褐藻酸钠溶液凝结为胶冻状复合体；将所述胶冻状复合体切割成块状物，并置于褐藻酸盐溶解缓冲液中溶解，获得软骨细胞聚集体；
(2)对全血进行离心以制备富血小板血浆；
(3)将骨髓间充质干细胞和所述软骨细胞聚集体置于所述富血小板血浆中，混合均匀，向得到的混合物中加入含有氯化钙的凝血酶溶液，形成细胞复合体；以及
(4)将所述细胞复合体注射进受试者，进行体内生长，从而获得组织工程软骨，
其中，步骤(3)中所述骨髓间充质干细胞和所述软骨细胞聚集体所含有的软骨细胞的数量比例为1:1。
2.如权利要求1所述的方法，其中步骤(2)获得的所述富血小板血浆的血小板终浓度为19.8×108个/mL至22×108个/mL。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中步骤(2)包括：将所述全血以1800rpm离心8min，弃去下层红细胞层；将剩余部分以3600rpm离心8min，弃去上层3/4的乏血小板血浆，余下部分用滴管反复吹打均匀，以获得所述富血小板血浆。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述软骨细胞、全血、骨髓间充质干细胞均来自同一受试者。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述块状物的面积为1mm2，厚度为50至80μm。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述骨髓间充质干细胞为传代3次的培养细胞。
7.如权利要求1所述的方法，其中步骤(3)中所述骨髓间充质干细胞的数量为1.5×108个，所述所述软骨细胞聚集体所含有的软骨细胞的数量为1.5×108个；所述富血小板血浆为500μL，其中血小板终浓度为19.8×108个/mL至22×108个/mL；所述凝血酶溶液为50μL，其中含有100mg/mL的氯化钙。
8.如权利要求1所述的方法，其中步骤(4)中体内生长进行12周。
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