CN114712394A - 间充质干细胞联合血小板血浆的组合物及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种间充质干细胞联合血小板血浆的组合物及其制备方法，属于生物技术领域。该组合物由第一子组合物和第二子组合物混合得到；所述第一子组合物和所述第二子组合物的体积比为1‑2:1；所述第一子组合物包括壳聚糖溶液、间充质干细胞、第一氯化钙和凝血酶溶液；所述第二子组合物包括第二氯化钙、胶原蛋白和血小板血浆。该组合物的制备方法，包括：将壳聚糖溶液、间充质干细胞、第一氯化钙和凝血酶溶液在15‑30℃下混合得到第一子组合物；将第二氯化钙、胶原蛋白和血小板血浆混合得到第二子组合物；将所述第一子组合物与所述第二子组合物混合得到所述组合物。该组合物提高了治疗效果且延长了治疗时效。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种间充质干细胞联合血小板血浆的组合物及其制备方法。
背景技术
骨关节炎是一种退行性病变，系由于增龄、肥胖、劳损、创伤、关节先天性异常、关节畸形等诸多因素引起的关节软骨退化损伤、关节边缘和软骨下骨反应性增生。本病多见于中老年人群，好发于负重关节及活动量较多的关节（如，颈椎、腰椎、膝关节、髋关节等）。过度负重或过度使用这些关节，均可促进退行性变化的发生。临床表现为缓慢发展的关节疼痛、压痛、僵硬、关节肿胀、活动受限和关节畸形等。
另外关节软骨损伤也会引起关节疼痛、肿胀及功能障碍，严重影响患者的生活质量及身体健康。
目前骨关节炎或者关节软骨损伤的常规的治疗以物理治疗、中医治疗、药物治疗、封闭治疗等为主流方向，但疗效不理想，远期疗效更差，也有应用富血小板血浆关节腔注射、玻璃酸钠关节腔注射，各种细胞再生疗法。争对富血小板血浆关节腔注射存在因药物快速扩散导致治疗效果不佳的问题。
发明内容
本发明的目的在于克服上述技术不足，提供一种间充质干细胞联合血小板血浆的组合物及其制备方法，解决现有技术中治疗骨关节炎或者修复软骨损伤的效果不佳的技术问题。
我们在前期研究中通过混合不同浓度的氯化钙得到组合物，实现了组合物在注射后变为凝胶，避免了血小板的扩散，从而显著提高了治疗和修复效果。但该组合物变成凝胶的时间较长，通常需要40-50min，导致其中的液态组分部分流失的问题，进而影响修复效果，如何加快注射后的组合物形成凝胶的速度是一大难题。
通过不断试验，我们发现通过加入壳聚糖和胶原蛋白反应能够快速形成凝胶，而且壳聚糖和胶原蛋白形成的复合物在液体组分流失后能够充当具有一定支撑作用的支架，为软骨组织的生长提供载体，进而有更好的修复效果。
为达到上述技术目的，本发明的技术方案提供一种间充质干细胞联合血小板血浆的组合物，所述组合物由第一子组合物和第二子组合物混合得到；所述第一子组合物和所述第二子组合物的体积比为1-2:1；所述第一子组合物包括壳聚糖溶液、间充质干细胞、第一氯化钙和凝血酶溶液；所述第二子组合物包括第二氯化钙、胶原蛋白和血小板血浆；所述壳聚糖溶液由壳聚糖溶解于生理盐水得到，所述壳聚糖溶液中壳聚糖的质量浓度为2%-4%，所述壳聚糖的分子量为200-250KDa，脱乙酰度80-85％，所述壳聚糖溶液与所述血小板血浆的体积比为0.1-0.3:1。
进一步地，所述间充质干细胞与所述血小板血浆的体积比为1-3:1。
进一步地，所述凝血酶溶液与所述间充质干细胞的体积比为1:10-15。
进一步地，所述胶原蛋白在所述第二子组合物中的质量浓度为1%-5%。
进一步地，所述第一氯化钙在所述第一子组合物中的浓度为20-40mg/mL。
进一步地，所述第二氯化钙在所述第二子组合物中的浓度为60-70mg/mL。
进一步地，还包括玻璃酸钠，所述玻璃酸钠与所述第一子组合物的体积比为0.1:-0.2:1。
此外，本发明还提出一种上述间充质干细胞联合血小板血浆的组合物的制备方法，包括以下步骤：
将壳聚糖溶液、间充质干细胞、第一氯化钙和凝血酶溶液在15-30℃下混合得到第一子组合物；
将第二氯化钙、胶原蛋白和血小板血浆混合得到第二子组合物；
将所述第一子组合物与所述第二子组合物混合得到所述组合物。
进一步地，将所述第二氯化钙、所述胶原蛋白和所述血小板血浆在15-30℃下混合得到所述第二子组合物。
进一步地，所述血小板血浆由以下步骤制得：将全血离心得到血清层、血浆层和红细胞层，取所述血浆层即为所述血小板血浆。
与现有技术相比，本发明的有益效果包括：将第一子组合物和第二子组合物混合后得到的组合物注射至治疗对象的作用位置，氯化钙和凝血酶能够将血小板的凝血与释放生长细胞因子的功能激活，而且又可促进间充质干细胞在膝关节腔内成软骨分化修复软骨损伤，且分泌多种关节润滑成分调节免疫和抗炎，壳聚糖和胶原蛋白反应很快形成具有包覆作用的凝胶，通常只需要5-8min即可形成凝胶，避免了血小板等液态组分的流失，将血小板和间充质干细胞包覆，从而更加缓慢的释放生长细胞因子，随着时间的推移，第一氯化钙和第二氯化钙进一步促进凝胶的形成，从而进一步稳固其中的血小板和间充质干细胞，而且随着液体的流失，凝胶固化成为具有一定支撑作用的支架，为软骨组织的生长提供支撑，进而有利于软骨的修复，进而每四周注射一次，共注射两次即可有较为明显的改善效果，而且治疗时效长达一年半。
具体实施方式
本具体实施方式提供了一种间充质干细胞联合血小板血浆的组合物，该组合物由第一子组合物和第二子组合物混合得到；所述第一子组合物和所述第二子组合物的体积比为1-2:1；所述第一子组合物包括壳聚糖溶液、间充质干细胞、第一氯化钙和凝血酶溶液；所述第二子组合物包括第二氯化钙、胶原蛋白和血小板血浆；所述壳聚糖溶液由壳聚糖溶解于生理盐水得到，所述壳聚糖溶液中壳聚糖的质量浓度为2%-4%，所述壳聚糖的分子量为200-250KDa，脱乙酰度80-85％，所述壳聚糖溶液与所述血小板血浆的体积比为0.1-0.3:1；所述间充质干细胞与所述血小板血浆的体积比为1-3:1；所述凝血酶溶液与所述间充质干细胞的体积比为1:10-15；所述胶原蛋白在所述第二子组合物中的质量浓度为1%-5%；所述第一氯化钙在所述第一子组合物中的浓度为20-40mg/mL；所述第二氯化钙在所述第二子组合物中的浓度为60-70mg/mL。
在某些实施例中，所述组合物还包括玻璃酸钠，所述玻璃酸钠与所述第一子组合物的体积比为0.1-0.2:1。玻璃酸钠能够随着细胞生长因子缓慢释放，进而能明显改善滑液组织的炎症反应，增强关节液的粘稠性和润滑功能，保护关节软骨，促进关节软骨的愈合与再生，增加关节活动度。
本具体实施方式还提出一种上述间充质干细胞联合血小板血浆的组合物的制备方法，包括以下步骤：
将壳聚糖溶液、间充质干细胞、第一氯化钙和凝血酶溶液在15-30℃下混合得到第一子组合物；
将第二氯化钙、胶原蛋白和血小板血浆在15-30℃下混合得到第二子组合物；所述血小板血浆由以下步骤制得：将全血离心得到血清层、血浆层和红细胞层，取所述血浆层即为所述血小板血浆；
将所述第一子组合物与所述第二子组合物混合得到所述组合物。
本具体实施方式中，所述间充质干细胞可来源于脐带血、胎盘组织和自体脂肪组织，采用现有技术的培养方法得到。
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
需要说明的是，下述实施例中的间充质干细胞由以下步骤制得：
用蒸馏水将脐带冲洗干净，然后用酒精棉将脐带表面擦拭干净；
依次用0.3％的胰蛋白酶（30 min）和0.3的％胶原酶P（2 h）在37℃、体积分数为5%的CO2培养箱中消化； 消化结束后，经100目钢网过滤，1500 r/min离心3min弃去上清液。清洗3次，重悬细胞并计数； 以4.5×104个有核细胞平铺于培养瓶中，37℃、5%的CO2作为原代SMSCs培养；24 h后换液，除去未贴壁细胞，继续培养12 d；待细胞达到80％融合时，吸出原有干细胞培养上清，加入10ml生理盐水将残留培养基，洗出；用2ml0.025%胰酶稀释液消化2min，加入5ml消化终止液，终止胰酶的消化；收集P0间充质干细胞计数，按照细胞数1x106/T175瓶接种于T175培养瓶中进行P1代培养，并再次传代；传代至第4代时，即为可用于治疗的间充质干细胞。
下述实施例中凝血酶溶液的活性是10000U/ml。
实施例1
本实施例提出一种间充质干细胞联合血小板血浆的组合物，该组合物由第一子组合物和第二子组合物混合得到；所述第一子组合物和所述第二子组合物的体积比为1:1；所述第一子组合物包括壳聚糖溶液、间充质干细胞、第一氯化钙和凝血酶溶液；所述第二子组合物包括第二氯化钙、胶原蛋白和血小板血浆；所述壳聚糖溶液由壳聚糖溶解于生理盐水得到，所述壳聚糖溶液中壳聚糖的质量浓度为2%，所述壳聚糖的分子量为200KDa，脱乙酰度80％，所述壳聚糖溶液与所述血小板血浆的体积比为0.1:1；所述间充质干细胞与所述血小板血浆的体积比为1:1；所述凝血酶溶液与所述间充质干细胞的体积比为1:10；所述胶原蛋白在所述第二子组合物中的质量浓度为1%；所述第一氯化钙在所述第一子组合物中的浓度为20mg/mL；所述第二氯化钙在所述第二子组合物中的浓度为60mg/mL。
本实施例还提出一种上述间充质干细胞联合血小板血浆的组合物的制备方法，包括以下步骤：
将壳聚糖溶液、间充质干细胞、第一氯化钙和凝血酶溶液在15℃下混合得到第一子组合物；
将第二氯化钙、胶原蛋白和血小板血浆在15℃下混合得到第二子组合物；
将所述第一子组合物与所述第二子组合物混合得到所述组合物。
实施例2
本实施例提出一种间充质干细胞联合血小板血浆的组合物，该组合物由第一子组合物和第二子组合物混合得到；所述第一子组合物和所述第二子组合物的体积比为2:1；所述第一子组合物包括壳聚糖溶液、间充质干细胞、第一氯化钙和凝血酶溶液；所述第二子组合物包括第二氯化钙、胶原蛋白和血小板血浆；所述壳聚糖溶液由壳聚糖溶解于生理盐水得到，所述壳聚糖溶液中壳聚糖的质量浓度为3%，所述壳聚糖的分子量为250KDa，脱乙酰度85％，所述壳聚糖溶液与所述血小板血浆的体积比为0.2:1；所述间充质干细胞与所述血小板血浆的体积比为3:1；所述凝血酶溶液与所述间充质干细胞的体积比为1:12；所述胶原蛋白在所述第二子组合物中的质量浓度为3%；所述第一氯化钙在所述第一子组合物中的浓度为40mg/mL；所述第二氯化钙在所述第二子组合物中的浓度为70mg/mL。
本实施例还提出一种上述间充质干细胞联合血小板血浆的组合物的制备方法，包括以下步骤：
将壳聚糖溶液、间充质干细胞、第一氯化钙和凝血酶溶液在20℃下混合得到第一子组合物；
将第二氯化钙、胶原蛋白和血小板血浆在20℃下混合得到第二子组合物；
将所述第一子组合物与所述第二子组合物混合得到所述组合物。
实施例3
本实施例提出一种间充质干细胞联合血小板血浆的组合物，该组合物由第一子组合物和第二子组合物混合得到；所述第一子组合物和所述第二子组合物的体积比为1.5:1；所述第一子组合物包括壳聚糖溶液、间充质干细胞、第一氯化钙和凝血酶溶液；所述第二子组合物包括第二氯化钙、胶原蛋白和血小板血浆；所述壳聚糖溶液由壳聚糖溶解于生理盐水得到，所述壳聚糖溶液中壳聚糖的质量浓度为4%，所述壳聚糖的分子量为230KDa，脱乙酰度85％，所述壳聚糖溶液与所述血小板血浆的体积比为0.2:1；所述间充质干细胞与所述血小板血浆的体积比为2:1；所述凝血酶溶液与所述间充质干细胞的体积比为1:14；所述胶原蛋白在所述第二子组合物中的质量浓度为4%；所述第一氯化钙在所述第一子组合物中的浓度为30mg/mL；所述第二氯化钙在所述第二子组合物中的浓度为65mg/mL。
本实施例还提出一种上述间充质干细胞联合血小板血浆的组合物的制备方法，包括以下步骤：
将壳聚糖溶液、间充质干细胞、第一氯化钙和凝血酶溶液在30℃下混合得到第一子组合物；
将第二氯化钙、胶原蛋白和血小板血浆在30℃下混合得到第二子组合物；
将所述第一子组合物与所述第二子组合物混合得到所述组合物。
实施例4
本实施例提出一种间充质干细胞联合血小板血浆的组合物，该组合物由第一子组合物和第二子组合物混合得到；所述第一子组合物和所述第二子组合物的体积比为1:1；所述第一子组合物包括壳聚糖溶液、间充质干细胞、第一氯化钙和凝血酶溶液；所述第二子组合物包括第二氯化钙、胶原蛋白和血小板血浆；所述壳聚糖溶液由壳聚糖溶解于生理盐水得到，所述壳聚糖溶液中壳聚糖的质量浓度为2.5%，所述壳聚糖的分子量为210KDa，脱乙酰度80％，所述壳聚糖溶液与所述血小板血浆的体积比为0.3:1；所述间充质干细胞与所述血小板血浆的体积比为2:1；所述凝血酶溶液与所述间充质干细胞的体积比为1:15；所述胶原蛋白在所述第二子组合物中的质量浓度为5%；所述第一氯化钙在所述第一子组合物中的浓度为25mg/mL；所述第二氯化钙在所述第二子组合物中的浓度为65mg/mL。
本实施例还提出一种上述间充质干细胞联合血小板血浆的组合物的制备方法，包括以下步骤：
将壳聚糖溶液、间充质干细胞、第一氯化钙和凝血酶溶液在25℃下混合得到第一子组合物；
将第二氯化钙、胶原蛋白和血小板血浆在25℃下混合得到第二子组合物；
将所述第一子组合物与所述第二子组合物混合得到所述组合物。
实施例5
本实施例与实施例1的区别在于所述间充质干细胞联合血小板血浆的组合物还包括玻璃酸钠，具体地，本实施例提出一种间充质干细胞联合血小板血浆的组合物，该组合物由玻璃酸钠、第一子组合物和第二子组合物混合得到；所述第一子组合物和所述第二子组合物的体积比为1:1，所述玻璃酸钠与所述第一子组合物的体积比为0.1:1；所述第一子组合物包括壳聚糖溶液、间充质干细胞、第一氯化钙和凝血酶溶液；所述第二子组合物包括第二氯化钙、胶原蛋白和血小板血浆；所述壳聚糖溶液由壳聚糖溶解于生理盐水得到，所述壳聚糖溶液中壳聚糖的质量浓度为2%，所述壳聚糖的分子量为200KDa，脱乙酰度80％，所述壳聚糖溶液与所述血小板血浆的体积比为0.1:1；所述间充质干细胞与所述血小板血浆的体积比为1:1；所述凝血酶溶液与所述间充质干细胞的体积比为1:10；所述胶原蛋白在所述第二子组合物中的质量浓度为1%；所述第一氯化钙在所述第一子组合物中的浓度为20mg/mL；所述第二氯化钙在所述第二子组合物中的浓度为60mg/mL。
本实施例还提出一种上述间充质干细胞联合血小板血浆的组合物的制备方法，包括以下步骤：
将壳聚糖溶液、间充质干细胞、第一氯化钙和凝血酶溶液在15℃下混合得到第一子组合物；
将第二氯化钙、胶原蛋白和血小板血浆在15℃下混合得到第二子组合物；
将所述第一子组合物、所述第二子组合物和玻璃酸钠混合得到所述组合物。
实施例6
本实施例与实施例5的区在于玻璃酸钠与第一子组合物的体积比，本实施例中，玻璃酸钠与第一子组合物的体积比为0.2:1。
考虑到人体的温度为36到37℃，我们在36℃下记录了实施例1-6制得的组合物由液态转变为凝胶所需的时间，结果如表1所示。
表1 实施例1-6制得的组合物变为凝胶所需时间
| 所需时间（min） | |
| 实施例1 | 5 |
| 实施例2 | 6 |
| 实施例3 | 6 |
| 实施例4 | 6.5 |
| 实施例5 | 7.5 |
| 实施例6 | 8 |
从表1可以看出，本发明提出的组合物变为凝胶的时间较快，只需要5-8分钟，为了进一步确认在没有第一氯化钙或者第二氯化钙的情况下是否也能实现快速凝固，我们做了相关对比试验，详情参照对比例1和对比例2。
对比例1
本对比例与实施例1的区别在于没有第一氯化钙，具体地，本对比例提出一种间充质干细胞联合血小板血浆的组合物，该组合物由第一子组合物和第二子组合物混合得到；所述第一子组合物和所述第二子组合物的体积比为1:1；所述第一子组合物包括壳聚糖溶液、间充质干细胞和凝血酶溶液；所述第二子组合物包括第二氯化钙、胶原蛋白和血小板血浆；所述壳聚糖溶液由壳聚糖溶解于生理盐水得到，所述壳聚糖溶液中壳聚糖的质量浓度为2%，所述壳聚糖的分子量为200KDa，脱乙酰度80％，所述壳聚糖溶液与所述血小板血浆的体积比为0.1:1；所述间充质干细胞与所述血小板血浆的体积比为1:1；所述凝血酶溶液与所述间充质干细胞的体积比为1:10；所述胶原蛋白在所述第二子组合物中的质量浓度为1%；所述第二氯化钙在所述第二子组合物中的浓度为60mg/mL。
本对比例还提出一种上述间充质干细胞联合血小板血浆的组合物的制备方法，包括以下步骤：
将壳聚糖溶液、间充质干细胞和凝血酶溶液在15℃下混合得到第一子组合物；
将第二氯化钙、胶原蛋白和血小板血浆在15℃下混合得到第二子组合物；
将所述第一子组合物与所述第二子组合物混合得到所述组合物。
对比例2
本对比例与实施例1的区别在于没有第二氯化钙，具体地，本对比例提出一种间充质干细胞联合血小板血浆的组合物，该组合物由第一子组合物和第二子组合物混合得到；所述第一子组合物和所述第二子组合物的体积比为1:1；所述第一子组合物包括壳聚糖溶液、间充质干细胞、第一氯化钙和凝血酶溶液；所述第二子组合物包括胶原蛋白和血小板血浆；所述壳聚糖溶液由壳聚糖溶解于生理盐水得到，所述壳聚糖溶液中壳聚糖的质量浓度为2%，所述壳聚糖的分子量为200KDa，脱乙酰度80％，所述壳聚糖溶液与所述血小板血浆的体积比为0.1:1；所述间充质干细胞与所述血小板血浆的体积比为1:1；所述凝血酶溶液与所述间充质干细胞的体积比为1:10；所述胶原蛋白在所述第二子组合物中的质量浓度为1%；所述第一氯化钙在所述第一子组合物中的浓度为20mg/mL。
本对比例还提出一种上述间充质干细胞联合血小板血浆的组合物的制备方法，包括以下步骤：
将壳聚糖溶液、间充质干细胞、第一氯化钙和凝血酶溶液在15℃下混合得到第一子组合物；
将胶原蛋白和血小板血浆在15℃下混合得到第二子组合物；
将所述第一子组合物与所述第二子组合物混合得到所述组合物。
我们在36℃下也记录了对比例1和对比例2制得的组合物由液态变为凝胶所需的时间，结果如表2所示。
表2 对比例1和对比例2制得的组合物变为凝胶所需时间
| 所需时间（min） | |
| 对比例1 | 20 |
| 对比例2 | 25 |
从表2可以看出，没有第一氯化钙或者第二氯化钙会延长组合物转变为凝胶所需的时间。另外我们还探讨了没有胶原蛋白是否影响制剂转变为凝胶所需的时间，发现没有加入胶原蛋白制剂转变为凝胶所需的时间为15-20min，确实有影响。
为了便于与没有添加壳聚糖和胶原蛋白的组合物进行对比，本发明还提出了相关对比例，详情参照对比例3。
对比例3
本对比例与实施例1的区别仅在于，没有添加壳聚糖和胶原蛋白，具体如下：
本对比例提出一种间充质干细胞联合血小板血浆的组合物，该组合物由第一子组合物和第二子组合物混合得到；所述第一子组合物和所述第二子组合物的体积比为1:1；所述第一子组合物包括间充质干细胞、第一氯化钙和凝血酶溶液；所述第二子组合物包括第二氯化钙和血小板血浆；所述间充质干细胞与所述血小板血浆的体积比为1:1；所述凝血酶溶液与所述间充质干细胞的体积比为1:10；所述第一氯化钙在所述第一子组合物中的浓度为20mg/mL；所述第二氯化钙在所述第二子组合物中的浓度为60mg/mL。
本对比例还提出一种上述间充质干细胞联合血小板血浆的组合物的制备方法，包括以下步骤：
将间充质干细胞、第一氯化钙和凝血酶溶液在15℃下混合得到第一子组合物；
将第二氯化钙和血小板血浆在15℃下混合得到第二子组合物；
将所述第一子组合物与所述第二子组合物混合得到所述组合物。
将实施例1-6和对比例3制得的组合物用于治疗骨关节炎和修复软骨损伤，具体地，选取60个年龄在50-60岁具有骨关节炎和/或软骨损伤的患者进行相关试验，分为6组，每个实施例对应一组，注射组合物的用量为5毫升/次，2次/疗程，间隔四周注射一次，从注射起始日算起两个月后回访患者，治疗改善效果如表1所示。改善率为每组中治疗效果明显的人数占总人数（10人）的占比。
表3 实施例1-4的组合物对患者的骨关节炎或者软骨损伤的治疗情况
| 改善率(%) | |
| 实施例1 | 100 |
| 实施例2 | 100 |
| 实施例3 | 100 |
| 实施例4 | 100 |
| 实施例5 | 100 |
| 实施例6 | 100 |
| 对比例3 | 50 |
从表3可以看出，本发明提出的组合物对于骨关节炎或者软骨损伤都有较好的改善作用，另外实施例5和6添加的玻璃酸钠虽然稍微延迟了变为凝胶的时间，但改善效果没受其影响，另外对比例3因为没有添加壳聚糖和胶原蛋白，影响了其治疗效果，改善率只有50%。
进一步地，为了探究治疗效果的时效，我们进一步在两个月回访后继续跟踪回访，发现一年后本发明实施例1-6提出的组合物治疗的患者依然感觉良好，没有复发，1年半后，实施例1-4提出的组合物治疗的患者开始出现之前的病症，而实施例5-6提出的组合物治疗的患者依然感觉良好没有复发。
另外采用对比例3制得的组合物改善的患者，在半年后就出现了之前的病症。本发明提出的制剂的治疗时效长可能与壳聚糖和胶原蛋白的作用有关，壳聚糖和胶原蛋白反应形成凝胶，之后随着液体的流失形成具有一定支撑作用的支架，支架作为载体，修复后的骨结构更为牢固，从而治疗时效长。
以上所述本发明的具体实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何根据本发明的技术构思所做出的各种其他相应的改变与变形，均应包含在本发明权利要求的保护范围内。
Claims (10)
1.一种间充质干细胞联合血小板血浆的组合物，其特征在于，所述组合物由第一子组合物和第二子组合物混合得到；所述第一子组合物和所述第二子组合物的体积比为1-2:1；所述第一子组合物包括壳聚糖溶液、间充质干细胞、第一氯化钙和凝血酶溶液；所述第二子组合物包括第二氯化钙、胶原蛋白和血小板血浆；所述壳聚糖溶液由壳聚糖溶解于生理盐水得到，所述壳聚糖溶液中壳聚糖的质量浓度为2%-4%，所述壳聚糖的分子量为200-250KDa，脱乙酰度80-85％，所述壳聚糖溶液与所述血小板血浆的体积比为0.1-0.3:1。
2.根据权利要求1所述的间充质干细胞联合血小板血浆的组合物，其特征在于，所述间充质干细胞与所述血小板血浆的体积比为1-3:1。
3.根据权利要求1所述的间充质干细胞联合血小板血浆的组合物，其特征在于，所述凝血酶溶液与所述间充质干细胞的体积比为1:10-15。
4.根据权利要求1所述的间充质干细胞联合血小板血浆的组合物，其特征在于，所述胶原蛋白在所述第二子组合物中的质量浓度为1%-5%。
5.根据权利要求1所述的间充质干细胞联合血小板血浆的组合物，其特征在于，所述第一氯化钙在所述第一子组合物中的浓度为20-40mg/mL。
6.根据权利要求1所述的间充质干细胞联合血小板血浆的组合物，其特征在于，所述第二氯化钙在所述第二子组合物中的浓度为60-70mg/mL。
7.根据权利要求1所述的间充质干细胞联合血小板血浆的组合物，其特征在于，还包括玻璃酸钠，所述玻璃酸钠与所述第一子组合物的体积比为0.1:-0.2:1。
8.一种权利要求1-7任一项所述的间充质干细胞联合血小板血浆的组合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将壳聚糖溶液、间充质干细胞、第一氯化钙和凝血酶溶液在15-30℃下混合得到第一子组合物；
将第二氯化钙、胶原蛋白和血小板血浆混合得到第二子组合物；
将所述第一子组合物与所述第二子组合物混合得到所述组合物。
9.根据权利要求8所述的组合物的制备方法，其特征在于，将所述第二氯化钙、所述胶原蛋白和所述血小板血浆在15-30℃下混合得到所述第二子组合物。
10.根据权利要求8所述的组合物的制备方法，其特征在于，所述血小板血浆由以下步骤制得：将全血离心得到血清层、血浆层和红细胞层，取所述血浆层即为所述血小板血浆。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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