CN109468270A - 一种脂肪干细胞和脐带间充质干细胞的成软骨诱导方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种脂肪干细胞和脐带间充质干细胞的成软骨诱导方法，包括脂肪干细胞和脐带间充质干细胞的分离、脂肪干细胞和脐带间充质干细胞的培养、诱导生产无软骨组织的软骨细胞、诱导生产具有一定形态的软骨组织和诱导生产软骨组织。本发明的有益效果是：用浓度为0.1%的Ｉ型胶原酶与细胞组织混合，使得组织消化更彻底，细胞组织均剪为1立方厘米的小块组织，使组织能够分离完全，脂肪干细胞和脐带间充质干细胞均处于温度设有37℃，且内部充有含量为5%CO2气体的培养箱内进行培养，满足细胞生长繁殖所需环境及温度，藻酸盐在钙离子存在时可通过离子交联作用形成开放晶格的凝胶，具有三维高孔隙率结构，在三维结构中可以保存大量细胞。
Description
技术领域
本发明涉及一种成软骨诱导方法，具体为一种脂肪干细胞和脐带间充质干细胞的成软骨诱导方法，属于细胞培养技术领域。
背景技术
关节软骨是透明软骨，包被于长骨的骨端，在关节运动时起着重要的缓冲作用。创伤、炎症、退行性改变等常引起软骨的缺损或破坏。关节软骨的损伤不仅会引起剧烈疼痛，还会导致患者的运动机能障碍，影响工作和生活；在组织学上，透明软骨不含神经、血管、淋巴管，主要由软骨细胞和细胞外基质组成，透明软骨不含神经、血管、淋巴管，主要由软骨细胞和细胞外基质组成；透明软骨的组织学特点决定了它在受到损伤之后，自身难以进行修复，临床上此类患者缺乏有效的治疗手段。
在目前已有的治疗方法中，药物治疗、理疗等只能缓解病情，改善症状；微骨折、骨髓刺激术等常形成纤维性软骨而非透明软骨，且并发症多；软骨组织工程技术是实现关节软骨再生性修复的重要手段，寻找合适的种子细胞来源，明确其软骨分化相关调控仍是制约组织工程软骨临床应用的关键所在，也是业内研究与临床应用的焦点之一。
发明内容
本发明的目的就在于为了解决上述问题而提供一种脂肪干细胞和脐带间充质干细胞的成软骨诱导方法。
本发明通过以下技术方案来实现上述目的：一种脂肪干细胞和脐带间充质干细胞的成软骨诱导方法，包括以下步骤
步骤A：脂肪干细胞和脐带间充质干细胞的分离，分别从组织中分离出脂肪干细胞和脐带间充质干细胞，并经贴壁筛选法纯化细胞；
步骤B：脂肪干细胞和脐带间充质干细胞的培养，采用无血清培养基对脂肪干细胞和脐带间充质干细胞进行体外培养扩增；
步骤C：诱导生产无软骨组织的软骨细胞，在培养基中调整细胞在较高密度，以高密度细胞滴的形式培养在孔板中，待细胞贴壁微滴较为稳固时加入软骨诱导培养基对脂肪干细胞和脐带间充质干细胞进行诱导培养；
步骤D：诱导生产具有一定形态的软骨组织，将获得的脂肪干细胞和脐带间充质干细胞无软骨组织的软骨细胞离心于离心管底部，形成细胞微团，并加入诱导培养基成软骨细胞诱导；
步骤E：诱导生产软骨组织，将具有一定形态的脂肪干细胞和脐带间充质干细胞软骨组织高密度混悬培养于藻酸钙凝胶中，将藻酸钙-细胞微珠置于软骨诱导培养基中成软骨诱导。
优选的，为了确保分离的脂肪干细胞与脐带间充质干细胞能在体外维持高活力，所述步骤A中，分别对脂肪干细胞与脐带间充质干细胞建立完善的体外培养系统以及冻存方法。
优选的，为了提高对脂肪干细胞和脐带间充质干细胞的分离速率，所述步骤A中，用浓度为0.1%的Ｉ型胶原酶与脂肪干细胞组织和脐带间充质干细胞组织混合，并在37℃震荡条件下将组织内的细胞消化离散为单个细胞。
优选的，为了提高分离率，所述步骤A中，脂肪干细胞组织和脐带间充质干细胞组织均剪为1立方厘米的小块组织。
优选的，为了能够提高脂肪干细胞和脐带间充质干细胞的培养速度，所述步骤B中，脂肪干细胞和脐带间充质干细胞，均处于温度设有37℃，且内部充有含量为5%CO2气体的培养箱内进行培养。
优选的，为了可以保存大量细胞并能够为软骨细胞提供立体培养空间，所述步骤E中，藻酸盐是从褐藻中分离和纯化的一类多糖，在钙离子存在时可通过离子交联作用形成开放晶格的凝胶。
本发明的有益效果是：该脂肪干细胞和脐带间充质干细胞的成软骨诱导方法设计合理，步骤A中，分别对脂肪干细胞与脐带间充质干细胞建立完善的体外培养系统以及冻存方法，确保分离的脂肪干细胞与脐带间充质干细胞能在体外维持高活力，步骤A中，用浓度为0.1%的Ｉ型胶原酶与脂肪干细胞组织和脐带间充质干细胞组织混合，并在37℃震荡条件下将组织内的细胞消化离散为单个细胞，使得组织消化更彻底，提高对脂肪干细胞和脐带间充质干细胞的分离速率，步骤A中，脂肪干细胞组织和脐带间充质干细胞组织均剪为1立方厘米的小块组织，使脂肪干细胞组织和脐带间充质干细胞组织能够分离完全，提高分离率，步骤B中，脂肪干细胞和脐带间充质干细胞，均处于温度设有37℃，且内部充有含量为5%CO2气体的培养箱内进行培养，满足细胞生长繁殖所需环境及温度，进而能够提高脂肪干细胞和脐带间充质干细胞的培养速度，步骤E中，藻酸盐是从褐藻中分离和纯化的一类多糖，在钙离子存在时可通过离子交联作用形成开放晶格的凝胶，具有三维高孔隙率结构，在三维结构中可以保存大量细胞，并有利于营养物质和氧气进入与细胞代谢废物排出，并能够为软骨细胞提供立体培养空间。
附图说明
图1为本发明结构示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
请参阅图1，一种脂肪干细胞和脐带间充质干细胞的成软骨诱导方法，包括以下步骤
步骤A：脂肪干细胞和脐带间充质干细胞的分离，分别从组织中分离出脂肪干细胞和脐带间充质干细胞，并经贴壁筛选法纯化细胞；
步骤B：脂肪干细胞和脐带间充质干细胞的培养，采用无血清培养基对脂肪干细胞和脐带间充质干细胞进行体外培养扩增；
步骤C：诱导生产无软骨组织的软骨细胞，在培养基中调整细胞在较高密度，以高密度细胞滴的形式培养在孔板中，待细胞贴壁微滴较为稳固时加入软骨诱导培养基对脂肪干细胞和脐带间充质干细胞进行诱导培养；
步骤D：诱导生产具有一定形态的软骨组织，将获得的脂肪干细胞和脐带间充质干细胞无软骨组织的软骨细胞离心于离心管底部，形成细胞微团，并加入诱导培养基成软骨细胞诱导；
步骤E：诱导生产软骨组织，将具有一定形态的脂肪干细胞和脐带间充质干细胞软骨组织高密度混悬培养于藻酸钙凝胶中，将藻酸钙-细胞微珠置于软骨诱导培养基中成软骨诱导。
所述步骤A中，分别对脂肪干细胞与脐带间充质干细胞建立完善的体外培养系统以及冻存方法，确保分离的脂肪干细胞与脐带间充质干细胞能在体外维持高活力，所述步骤A中，用浓度为0.1%的Ｉ型胶原酶与脂肪干细胞组织和脐带间充质干细胞组织混合，并在37℃震荡条件下将组织内的细胞消化离散为单个细胞，使得组织消化更彻底，提高对脂肪干细胞和脐带间充质干细胞的分离速率，所述步骤A中，脂肪干细胞组织和脐带间充质干细胞组织均剪为1立方厘米的小块组织，使脂肪干细胞组织和脐带间充质干细胞组织能够分离完全，提高分离率，所述步骤B中，脂肪干细胞和脐带间充质干细胞，均处于温度设有37℃，且内部充有含量为5%CO2气体的培养箱内进行培养，满足细胞生长繁殖所需环境及温度，进而能够提高脂肪干细胞和脐带间充质干细胞的培养速度，所述步骤E中，藻酸盐是从褐藻中分离和纯化的一类多糖，在钙离子存在时可通过离子交联作用形成开放晶格的凝胶，具有三维高孔隙率结构，在三维结构中可以保存大量细胞，并有利于营养物质和氧气进入与细胞代谢废物排出，并能够为软骨细胞提供立体培养空间。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
Claims (6)
1.一种脂肪干细胞和脐带间充质干细胞的成软骨诱导方法，其特征在于：包括以下步骤
步骤A：脂肪干细胞和脐带间充质干细胞的分离，分别从组织中分离出脂肪干细胞和脐带间充质干细胞，并经贴壁筛选法纯化细胞；
步骤B：脂肪干细胞和脐带间充质干细胞的培养，采用无血清培养基对脂肪干细胞和脐带间充质干细胞进行体外培养扩增；
步骤C：诱导生产无软骨组织的软骨细胞，在培养基中调整细胞在较高密度，以高密度细胞滴的形式培养在孔板中，待细胞贴壁微滴较为稳固时加入软骨诱导培养基对脂肪干细胞和脐带间充质干细胞进行诱导培养；
步骤D：诱导生产具有一定形态的软骨组织，将获得的脂肪干细胞和脐带间充质干细胞无软骨组织的软骨细胞离心于离心管底部，形成细胞微团，并加入诱导培养基成软骨细胞诱导；
步骤E：诱导生产软骨组织，将具有一定形态的脂肪干细胞和脐带间充质干细胞软骨组织高密度混悬培养于藻酸钙凝胶中，将藻酸钙-细胞微珠置于软骨诱导培养基中成软骨诱导。
2.根据权利要求1所述的一种脂肪干细胞和脐带间充质干细胞的成软骨诱导方法，其特征在于：所述步骤A中，分别对脂肪干细胞与脐带间充质干细胞建立完善的体外培养系统以及冻存方法。
3.根据权利要求1所述的一种脂肪干细胞和脐带间充质干细胞的成软骨诱导方法，其特征在于：所述步骤A中，用浓度为0.1%的Ｉ型胶原酶与脂肪干细胞组织和脐带间充质干细胞组织混合，并在37℃震荡条件下将组织内的细胞消化离散为单个细胞。
4.根据权利要求1所述的一种脂肪干细胞和脐带间充质干细胞的成软骨诱导方法，其特征在于：所述步骤A中，脂肪干细胞组织和脐带间充质干细胞组织均剪为1立方厘米的小块组织。
5.根据权利要求1所述的一种脂肪干细胞和脐带间充质干细胞的成软骨诱导方法，其特征在于：所述步骤B中，脂肪干细胞和脐带间充质干细胞，均处于温度设有37℃，且内部充有含量为5%CO2气体的培养箱内进行培养。
6.根据权利要求1所述的一种脂肪干细胞和脐带间充质干细胞的成软骨诱导方法，其特征在于：所述步骤E中，藻酸盐是从褐藻中分离和纯化的一类多糖，在钙离子存在时可通过离子交联作用形成开放晶格的凝胶。
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| CN111518751A (zh) * | 2019-11-20 | 2020-08-11 | 广东先康达生物科技有限公司 | 一种体外激活脂肪干细胞转化成原软骨细胞的方法 |
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2018
- 2018-12-20 CN CN201811560136.2A patent/CN109468270A/zh not_active Withdrawn
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| CN111518751A (zh) * | 2019-11-20 | 2020-08-11 | 广东先康达生物科技有限公司 | 一种体外激活脂肪干细胞转化成原软骨细胞的方法 |
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