CN110157719B

CN110157719B - 核盘菌SsMAS3基因及其在植物菌核病抗性育种中的应用

Info

Publication number: CN110157719B
Application number: CN201910466942.1A
Authority: CN
Inventors: 丁一娟; 钱伟; 柴亚茹; 申浩晶; 杨文静; 闫宝琴
Original assignee: Southwest University
Current assignee: Southwest University
Priority date: 2019-05-31
Filing date: 2019-05-31
Publication date: 2023-05-16
Anticipated expiration: 2039-05-31
Also published as: CN110157719A

Abstract

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及核盘菌SsMAS3基因及其在植物菌核病抗性育种中的应用。将该基因的部分编码序列的正义序列和反义序列分别与沉默载体pCIT的内含子的两端连接形成SsMAS3的RNAi结构，将该RNAi结构接入植物表达载体得到寄主诱导表达沉默载体，该寄主诱导表达载体转染宿主后，能够产生靶向SsMAS3基因的dsRNA片段，从而在核盘菌侵染过程中诱发SsMAS3基因的沉默，显著增加宿主的核盘菌抗性。使得该基因及采用该基因构建的寄主诱导沉默表达载体在植物菌核病抗性育种具有巨大的应用前景。

Description

核盘菌SsMAS3基因及其在植物菌核病抗性育种中的应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及核盘菌SsMAS3基因及其在植物菌核病抗性育种中的应用。

背景技术

由核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum(Lib.)de Bary)导致的菌核病不仅是模式植物拟南芥的一种病害，也是危害我国很多重要农作物生产的重要病害之一，比如该病害每年导致油菜10～30％的产量损失，严重时减产80％(吴健等2013)，并且导致种子含油量和品质降低。

在核盘菌的侵染过程中，菌核可以直接萌发成菌丝，侵染植物；或者是通过萌发子囊盘，产生子囊孢子萌发形成菌丝，从而侵染植物。菌丝在入侵到植物组织前，首先在寄主表面扩展，形成侵染垫或附着胞，渗透健康的植物表皮，而菌丝则产生更多的分枝(Amselem，2011；Liang and Rollins，2018)。随后，核盘菌通过合成、分泌多种水解酶及毒素草酸攻破寄主表层防护、降解细胞壁、浸软和致死寄主组织，为病菌提供营养，便于菌丝进一步入侵和增殖(Bashi et al.2012；Kim et al.2008；Seifbarghi et al.2017)。因此，如果菌丝生长、或侵染垫形成受阻，菌核病可以有效控制。

目前，防治油菜抗菌核病主要有如下途径：农药与生物防治、选育抗(耐)菌核病材料、基因工程方法。通过这些途径，取得了一些成绩，筛选到一些抗(耐)病性比较好的材料，但是生产中菌核病危害严重的问题依然存在(刘正立,刘春林.甘蓝型油菜抗菌核病研究进展.中国农学通报,2015,31(15):114-123)。

专利文献CN106397555A和CN106518992A分别公开了核盘菌凝集素SSL-6蛋白和核盘菌异核体不亲和YD-7蛋白，通过构建蛋白编码基因的过表达质粒，并转入宿主植物中，获得具有抗菌核病的植物种质资源。

发明内容

为减少核盘菌对植株侵害，本发明提供一种影响核盘菌菌丝生长和侵染垫形成的核盘菌SsMAS3基因，该基因的部分编码序列的正义序列和反义序列分别与沉默载体pCIT的内含子的两端连接形成SsMAS3的RNAi结构，将该RNAi结构接入植物表达载体得到寄主诱导表达沉默载体，该寄主诱导表达载体转染宿主后，能够产生靶向SsMAS3基因的dsRNA片段，从而在核盘菌侵染过程中诱发SsMAS3基因的沉默，显著增加宿主的核盘菌抗性。

核盘菌SsMAS3基因，其编码氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的蛋白；

优选的，所述核盘菌SsMAS3基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

上述核盘菌SsMAS3基因在构建沉默SsMAS3基因的寄主诱导表达沉默载体中应用也属于本发明的保护范围。

本发明还提供了沉默SsMAS3基因的寄主诱导沉默表达载体的构建方法，该方法包括以下步骤：克隆SsMAS3基因的部分编码序列，将其正义序列和反义序列分别与SEQ IDNo.3所示核苷酸序列的两端相连得到SsMAS3基因的RNAi(RNA干扰，RNA interference)结构，将所述RNAi结构接入植物表达载体的启动子和终止子之间得到所述寄主诱导沉默表达载体。

上述SsMAS3基因的部分编码序列，是SsMAS3基因的保守序列的一段核苷酸序列，长度为300-500bp之间，所述正义和反义序列分别连接到内含子两端，在植物中转录后形成发卡结构，产生SsMAS3基因的dsRNA片段，该dsRNA被识别后即被核酸内切酶(RNAseⅢ)切割成长度为21～35个核苷酸的RNA片段(siRNA)。双链siRNA在RNA解旋酶的作用下解链成正义链和反义链，继之由反义siRNA再与体内一些酶(包括内切酶、外切酶、螺旋酶)或蛋白结合，形成RNA诱导沉默复合体(RNA-inducedsilencing complex,RISC)。在ATP存在的情况下，被激活的RISC以单链siRNA作为向导，通过碱基互补配对原则，以序列特异性的方式引导Argonaute蛋白与靶标分子结合去寻找与之互补的靶基因SsMAS3。SsMAS3的mRNA分子被Argonaute蛋白识别之后会被切割或者抑制翻译，最终被细胞降解。

优选的，所述沉默SsMAS3基因的寄主诱导沉默表达载体的构建方法，包括以下具体步骤：

(1)克隆SsMAS3基因的部分编码序列，将其正义序列和反义序列分别连入载体pCIT的内含子两端，构建沉默表达载体pSimas3，所述正义序列、pCIT的内含子(SEQ IDNo.3)和反义序列连接形成的核苷酸片段为SsMAS3基因的RNAi结构；

(2)将SsMAS3基因的沉默表达载体中的RNAi结构连入植物表达载体的启动子和终止子之间，得到所述寄主诱导沉默表达载体。

上述载体pCIT(Yu et al.2012,PLoS One,7,e34962)，包含来源于Aspergillusnidulans的trpC基因的启动子PtrpC及终止子TtrpC，以及来源于Gibberella zeae的EAA75655.1基因的402bp的内含子片段(SEQ ID No.3)。

优选的，所述沉默表达载体pSimas3中含有潮霉素(Hyg)和氨苄青霉素(Amp)抗性元件。其中筛选标记潮霉素(Hyg)可以用遗传霉素(G418)代替。

优选的，所述植物表达载体为pBinGlyRed3，含有种子特异型的Glycinin启动子和Gly-term终止子的载体，所述Glycinin启动子可以用CaMV 35S启动子代替，Gly-term终止子可以用NOS终止子代替。所述植物表达载体的具体结构参见“叶绿素合成酶基因在甘蓝型油菜及拟南芥种子生育酚合成过程中的作用研究，周元委，2017，硕士学位论文)”。

优选的，所述SsMAS3基因的RNAi结构通过多克隆位点插入所述Glycinin启动子和所述Gly-term终止子之间，所述多克隆位点具体为EcoRI、XbaI、XmaI、SmaI和XhoI。

优选的，所述植物表达中还含有卡那霉素(Kana)抗性元件，同时包含一个红色荧光蛋白(DsRed)的筛选标记，DsRed的启动子为CMV启动子，终止子为Nos终止子。所述红色荧光蛋白筛选标记可以由潮霉素(Hyg)抗性元件代替。

上述构建方法构建的寄主诱导沉默表达载体，经浸花法(Flower dip)转化拟南芥，菌核病抗性鉴定表明，活体接种的转基因拟南芥的菌斑面积相比对照显著减小了53％-71％。

因此，上述构建方法构建的寄主诱导沉默载体属于本发明的保护范围。

上述构建方法制备的寄主诱导沉默表达载体和上述核盘菌SsMAS3基因在植物菌核病抗性育种中的应用也属于本发明的保护范围。

优选的，所述植物菌核病抗性育种是指十字花科植物菌核病抗性育种。

本发明还提供上述寄主诱导沉默表达载体在植物菌核病抗性育种中的应用方法，采用寄主诱导沉默表达载体转化农杆菌，农杆菌浸花法转化植物的花序得转化后的花序，将植物培养至种子成熟，利用基因标记挑选转化成功的植株。

本发明的有益效果在于：

1.本发明提供了发明提供了核盘菌SsMAS3基因的基因组及蛋白序列，该基因影响核盘菌菌丝生长、侵染垫形成，在核盘菌致病过程中起着重要作用；

2.本发明的构建方法构建的寄主诱导沉默表达载体，将其转化十字花科植物后，T₀代收获的种子长成的植株(T₁代)具有菌核病抗性，且可被遗传至后代，其在十字花科植物菌核病抗性育种具有巨大的应用前景。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述，其中：

图1为电泳图，其中A为RNA电泳图；B为cDNA检测。

图2为电泳图，其中A为SsMAS3基因片段扩增图，泳道1和2为重复扩增；B为SsMAS3克隆菌液PCR检测，泳道1-12为12个单克隆菌液。

图3为载体构建图，其中A为SsMAS3基因的RNAi载体构建图；B为SsMAS3基因的HIGS载体构建图；C为SsMAS3基因的RNAi载体(pSimas3，泳道1)及HIGS载体(pRed-HIGS-SsMAS3，泳道2)酶切验证电泳图。

图4为SsMAS3基因的沉默转化子鉴定图，其中A为利用潮霉素抗性基因进行SsMAS3基因的沉默转化子的DNA鉴定图，WT为野生型菌株1980，编号9，10，12，13，14，15，16，17，18，20及25为筛选出的11个SsMAS3基因的假定沉默转化子Simas3；B为利用RT-PCR鉴定SsMAS3基因的沉默转化子中SsMAS3基因的表达水平。

图5为SsMAS3基因的沉默转化子表型鉴定图，其中A为SsMAS3基因的沉默转化子Simas3-9及Simas3-20的菌丝尖端，菌丝生长及菌核形成表型；B为Simas3-9及Simas3-20的菌丝生长速度测定；C为Simas3-9及Simas3-20在parafilm及油菜叶片上侵染垫形成情况(接种8h后)；D为Simas3-9及Simas3-20的致病性鉴定。

图6为HIGS转基因拟南芥DNA检测电泳图，其中A为引物组合QW586F+QW586R的PCR扩增电泳图；B为引物组合QW586F+QW1447R的PCR扩增电泳图，M为DNA maker2000，WT为野生型拟南芥Col-0，其余泳道为HIGS转基因拟南芥。

图7为HIGS转基因拟南芥的菌核病抗性鉴定图，其中A为SsMAS3基因的三个HIGS转基因拟南芥株系HIGS-Simas3-25、HIGS-Simas3-39、HIGS-Simas3-42的离体及活体接种核盘菌后的表型；B为接种24h后A中的菌斑统计；C为SsMAS3基因在侵染HIGS转基因拟南芥过程中的基因表达情况。WT为野生型拟南芥Col-0，EV为空载转基因株系。

具体实施方式

下面将结合本发明具体的实施例，对本发明技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规步骤，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)中所述的步骤，或按照试剂盒制造厂商所建议的操作步骤。

实施例采用的植物材料：拟南芥为哥伦比亚生态型野生型Col-0，甘蓝型油菜为中双11号。甘蓝型油菜为常规大田试验条件种植，拟南芥为培养箱常规培养。

实施例采用的菌株：核盘菌野生型菌株1980，核盘菌沉默表达载体pCIT，植物表达载体pBinGlyRed3由重庆市油菜工程技术研究中心提供。DH5α大肠杆菌和GV3101根瘤农杆菌均购自全式金生物公司。

实施例采用的试剂及相关试剂盒：pGEM-T Easy Vector T载体，近岸蛋白质科技2x Taq Master Mix，天根的TRNzol-A+RNA提取试剂盒，天根生化公司胶回收试剂盒，天根生化公司质粒小提取试剂盒，BioRAD的iScript^TMcDNA Synthesis Kit试剂盒，BioRAD的iTaq^TM Universal

Green Supermix试剂盒，赛默飞(Thermo Scientific)的快切酶(FastDigest)SmaI、HindIII、PstI、EcoRV，XbaI及XhoI，氯仿、无水乙醇、甘油、矿物油、蔗糖、CTAB、β-巯基乙醇、异戊醇、核酸染料、琼脂糖、loading buffer、DNA marker、表面活性剂SILWET L-77等。

实施例采用的相关试剂配制：

LB液体培养基(1L)：胰蛋白胨(Tryptone)10g；酵母粉(Yeast Extract)5g；氯化钠(NaCl)10g，pH 6.8，121℃灭菌20min。

LB固体培养基(1L)：LB液体培养基的基础上，加琼脂粉(agar)10g，pH 6.8。

YEB液体培养基(1L)：牛肉浸膏(Beef extract)5g，酵母粉(Yeast extract)1g，胰蛋白胨(Tryptone)，蔗糖(Sucrose)5g，一水硫酸镁MgSO₄·H₂O 0.5g，PH 6.8，121℃灭菌20min。

YEB固体培养基(1L)：YEB液体培养基的基础上，加琼脂粉(agar)10g，pH 6.8。

CTAB Buffer(1L)：CTAB 20g，Nacl 81.88g，EDTA(0.5M，pH8.0)40mL，Tris-HCl(1M，pH 8.0)100mL，121℃灭菌20min。

50x TAE Buffer(1L)：Tris 242g，Na₂EDTA·2H₂O 37.2g，冰醋酸57.1mL。

抗生素：卡那霉素(kan)100mg/mL、链霉素(str)25mg/mL。

RM顶部培养基：蔗糖342.3g，酵母提取物0.5g，酪蛋白水解物0.5g，琼脂粉12g，定容至1L；

RM底部培养基：蔗糖239.6g，酵母提取物0.5g，酪蛋白水解物0.5g，琼脂粉16g，定容至1L。

原生质体缓冲液(0.8M MgSO4)：MgSO4·7H2O 39.47g，加蒸馏水定容至200mL，PH调至5.5，灭菌保存；

原生质体酶解液：裂解酶0.2g，蜗牛酶0.02g，溶于0.8M MgSO4溶液中，定容至20mL，过滤灭菌；

STC：D-山梨醇29.15g，Tris 1.2114g，CaCl2 2.191g，定容至200mL，灭菌保存；

PEG(40％w/v)：40g PEG3350，定容至100mL，灭菌保存；

PTC(40％w/v)：40g PEG3350溶解于STC中，定容至100mL，灭菌保存。

实施例中所用的引物信息：

实施例1总RNA的提取及cDNA第一链的合成

选用天根的TRNzol-A+RNA提取试剂盒，按照试剂盒步骤操作，提取核盘菌菌丝或植物叶片RNA。

琼脂糖凝胶电泳：按1％胶浓度比称取琼脂糖倒入三角瓶中，加入1x TAE缓冲液后微波炉中加热，待琼脂糖彻底溶解变澄清后取出冷却至50℃-60℃后按每100mL 1x TAE中加5μL核酸染料混匀，倒入插好小孔梳子的电泳槽中；待胶块完全凝固后小心拔出梳子，将胶块置于冰上；用移液枪取2μL RNA样品加入到2μl的Loading Buffer中，混匀后点入小孔中；移液枪取3μL DNA Mark点入到空白小孔中做对照；电泳仪中加1x TAE并且没过胶块，启动电泳仪140V、400A 25分钟；停止电泳，将胶块放入凝胶成像系统进行观察和拍照。

测浓度：采用紫外可见分光光度计，取1μL RNA测浓度。RNA-80℃保存。

选用BIO-RAD的iScript^TM cDNA Synthesis Kit试剂盒，反应体系如下：

注：RNA template加入的总量为1μg左右，加完样后混匀，在PCR仪中进入反应程序。

反应程序为：Priming 25℃5min；Reverse transcription 46℃20min；RTinactivation 95℃1min；Optional step 4℃。获得的cDNA-20℃保存。

取核盘菌生长1-7天的RNA，检测RNA提取结果(图1A)，片段清晰，可用于后续实验的操作。

以引物组合Sstub1-F+Sstub1-R检测cDNA的质量，反应体系如下：

反应程序：(1)预变性94℃5min；(2)变性94℃25s；(3)退火57℃25s；(4)延伸72℃20s；(5)再延伸72℃5min；(6)停止16℃1min；其中(2)-(4)循环30次，获得的产物可在4℃冰箱短期保存。

结果发现cDNA的片段清晰(图1B)，可用于后续实验的操作。

实施例2 SsMAS3基因片段的克隆

2.1 SsMAS3基因片段的扩增

以实施例1获得的核盘菌菌丝生长1-7天的cDNA混合样品为模板，采用引物组合SsMAS3-F+SsMAS3-R扩增SsMAS3基因的部分编码序列(418bp)，用PCR仪来扩增，PCR反应体系如下：

PCR反应程序：(1)预变性94℃5min；(2)变性94℃30s；(3)退火58℃30s；(4)延伸72℃30s；(5)再延伸72℃5min；(6)停止16℃1min；其中(2)-(4)循环35次。

琼脂糖凝胶电泳按照实施例1中的方法进行。将电泳结束后的胶块放入切胶仪中，切取目的基因(±418bp)片段。目的片段的回收选用天根胶回收试剂盒，具体操作步骤均按照公司试剂盒推荐步骤。

扩增进行两个重复，如图2A所示，两个泳道均在±418bp有明显条带，故成功扩增出SsMAS3的基因片段，测定序列如SEQ ID No.4所示(SsMAS3基因的部分编码序列)。

2.2连接产物转化至大肠杆菌感受态细胞

按照pGEM-T Easy Vector T载体试剂盒操作步骤将目的基因片段胶回收产物与pGEM-T Easy Vector T进行连接，随后按照全式金DH5α大肠杆菌感受态转化步骤，将连接产物转入DH5α大肠杆菌。涂板培养10h后，用10μL枪头挑取单菌落于600μL含kana抗性的LB液体培养基中，37℃，250rmp恒温摇床中震荡培养8h至浑浊。采用引物组合1)M13-F+M13-R，2)SsMAS3-F+SsMAS3-R，进行菌液PCR，检测阳性克隆。PCR反应体系如下：

PCR反应程序：(1)预变性94℃5min；(2)变性94℃30s；(3)退火58℃30s；(4)延伸72℃30s；(5)再延伸72℃5min；(6)停止16℃1min；其中(2)-(4)循环30次。

菌落PCR鉴定结果显示(图2B)，挑选的12个菌落中，两组引物均检测出目的条带，12个菌液均为阳性克隆，选取1，2，3号菌液进行测序验证。

实施例3 RNAi及HIGS载体的构建

3.1质粒的提取

分别提取测序正确含目的基因菌液的质粒T-SsMAS3，核盘菌沉默表达载体质粒pCIT，潮霉素(Hyg)表达盒载体质粒pSKH，和植物表达载体质粒pBinGlyRed3，选取天根生化公司质粒小提取试剂盒，按照试剂盒提供步骤操作。

3.2目的片段引入酶切位点

核盘菌沉默表达载体为pCIT，设计核盘菌沉默表达载体双酶切引物QW1445F/R，左右引物加入的酶切位点分别为SmaI，HindIII和PstI，EcoRV，将SsMAS3沉默片段的正向序列和反向序列分别插入pCIT载体内含子两端(图3A)。植物过表达载体为pBinGlyRed3载体，设计寄主诱导沉默(HIGS)表达载体双酶切引物QW1447F/R，左右引物加入的酶切位点分别为HindIII，XbaI和PstI，EcoRV。将SsMAS3的HIGS沉默片段(RNAi结构)插入pBinGlyRed3载体XbaI和SmaI位点间(图3B)。

3.3目的片段与载体的双酶切

含目的基因质粒双酶切体系：

表达载体质粒双酶切体系：

上述酶切体系在37℃培养箱中酶切1h。

以克隆质粒T-SsMAS3为模板，采用引物组合QW1445F+QW1445R，QW1447F+QW1447R分别扩增SsMAS3基因的RNAi片段及HIGS片段。PCR反应体系如下：

PCR反应程序：(1)预变性94℃5min；(2)变性94℃30s；(3)退火58℃30s；(4)延伸72℃30s；(5)再延伸72℃5min；(6)16℃1min；其中(2)-(4)循环35次。

扩增片段按照天根胶回收试剂盒的操作步骤进行胶回收，连接T载之后提取含目的基因RNAi及HIGS片段的质粒T-1445及T-1447。选用HindIII和EcoRV酶切T-1445、T-1447及pCIT，目的片段分别与pCIT载体进行连接，获得沉默中间载体pCIT-RNAi-1和pCIT-HIGS-1。随后用SmaI和PstI酶切T-1445，pCIT-RNAi-1和pCIT-HIGS-1，目的片段分别与pCIT-RNAi-1和pCIT-HIGS-1载体进行连接，获得重组质粒：pCIT-RNAi-SsMAS3及pCIT-HIGS-SsMAS3。

选用XbaI单酶切pCIT-RNAi-SsMAS3及pSKH，用CIP(牛小肠碱性磷酸酶)处理酶切骨架产物，随后目的片段与载体骨架进行连接，获得SsMAS3的RNAi载体：pSimas3。

选用XbaI和SmaI双酶切pCIT-HIGS-SsMAS3及pBinGlyRed3，目的片段与载体骨架进行连接，获得SsMAS3的HIGS载体(寄主诱导沉默表达载体)：pRed-HIGS-SsMAS3。

随后，选用HindIII和PstI对pCIT-RANi-SsMAS3进行酶切验证，选用XbaI和SmaI对pRed-HIGS-SsMAS3进行酶切验证。验证结果如图3C所示，均能检测到1300bp左右(正向SsMAS3+内含子+反向SsMAS3)的条带，表明成功构建SsMAS3的RNAi表达载体和HIGS表达载体。

实施例4 PEG介导的核盘菌原生质体转化

4.1核盘菌的活化

PDA配制：将新鲜去皮土豆200g，切成小块，置于900mL蒸馏水中煮沸30min，用纱布过滤后，去残渣留上清，加入20g蔗糖和15g琼脂粉，加入蒸馏水定容至1000mL。湿热灭菌(121℃，30min)后在无菌条件下分装入直径为9cm的无菌培养皿，用高分子封口膜缠绕后置于4℃冰箱备用。

本实验所用核盘菌为野生型菌株1980，将菌核在75％乙醇中作用1min，再在10％次氯酸钠溶液作用7-10min后用无菌水漂洗3-5次。消毒后的菌核置于PDA培养基中央，25℃萌发2-3天。切一小块萌发出的菌丝块，转接到新的PDA培养基上，25℃培养。转接两次后的边缘菌丝可以用于核盘菌原生质体制备。用直径6mm的打孔器沿培养皿边缘一圈打孔，获得的PDA菌丝块即可用于后续接种鉴定实验。

4.2核盘菌原生质体的制备

(1)在超净工作台上，挑取新鲜菌丝于研钵中研磨，转入三角瓶中，加入PDB培养基混匀，放在20℃摇床上培养32h；

(2)将培养好的菌丝液体离心(4000rpm，10min，4℃)，去上清，用0.8M MgSO₄洗涤两次；

(3)将菌丝球挑出，加入酶解液中混匀，于30℃摇床中酶解2-3h，期间抽取1mL酶解液在计数板上观察酶解情况；

(4)将酶解后的溶液倒在灭过菌的漏斗中过滤，滤液即为原生质溶液；

(5)将上述溶液用0.8M MgSO₄清洗两次，3000rpm，10min，4℃离心，弃上清，沉淀即为核盘菌的原生质体；

(6)原生质体沉淀用STC悬浮液稀释，1mL悬浮液：800μL STC，10μL DSMO，60μL肝素钠，200μL PEG(40％w/v)，最后分装为100μL每管；

(7)原生质体保存在-80℃。

4.3 PEG介导的原生质转化

(1)采用XhoI将质粒pSimas3线性化，并加入2μL亚精胺和2μL肝素钠；

(2)将上述质粒产物加入100μl原生质体(5×10⁶个)，置于冰上40min；

(3)向上述原生质体-质粒预混液中加入1mL PTC溶液，轻轻混匀，室温放置30min；

(4)将上述溶液加入60℃左右的RM底部培养基上，混匀，迅速倒在培养皿中，每皿20mL左右，在22℃培养箱中倒置培养；

(5)培养24h后，向底部培养基表面倒入5mL含潮霉素50μg/L的RM顶部培养基；

(6)在22℃培养箱中倒置培养5-7天至可以用肉眼看到重新长出的单菌落。

4.4重组转化子的抗性筛选

当顶部培养基表面陆续长出菌落后，将核盘菌单菌落进行编号，用接种针挑取菌丝，接种含潮霉素的PDA平板(100μg/mL)上进行抗性筛选培养，然后在22℃培养箱中暗培养2d，总共在含潮霉素的PDA平板(100μg/mL)上筛选3次，最终我们获得11个对潮霉素抗性稳定的转化子菌落。

4.5阳性转化子鉴定

4.5.1转化子DNA提取及鉴定

将经过3次抗性筛选后所得的转化子接种到铺有玻璃纸的PDA平板上，22℃培养2d，收集菌丝，提取DNA：

(1)取0.2g菌丝于液氮中研磨成白色粉末；

(2)加入1mL(700μL)65℃预热的CTAB(2％CTAB，100mM Tris pH＝8，1.4M NaCl)(灭菌)提取缓冲液于65℃水浴5min,中间轻轻混匀两次；

(3)加入等体积苯酌:氯仿:异戊醇(25:24:1)混匀，于12000rpm离心10min；

(4)取上清并加入等体积氯仿：异戊醇(24:1)混匀，12000rpm离心10min；

(5)取上清加入等倍体积的异丙醇(预冷效果更好一点)，室温沉淀30min后于12000rpm离心10min；

(6)沉淀用70％乙醇洗涤两次，于37℃温箱干燥；干燥后加入30μl TE于37℃条件下溶解30min，于-20℃保存备用。

随后选用引物HygF+HygR对转化子DNA进行PCR扩增，电泳结果如图4A所示，其中编号为9，10，15，16，17及20的转化子能检测到潮霉素抗性基因，而编号为12，13，14，18及25的转化子则检测不出潮霉素抗性基因的目的条带。故编号为9，10，15，16，17及20的转化子进行后续的RT-PCR验证SsMAS3基因的表达水平。

4.5.2 RT-PCR鉴定

核盘菌菌丝RNA的提取采用天根的TRNzol-A+RNA提取试剂盒，具体方法参照试剂盒操作步骤。cDNA的合成采用BIO-RAD的iScript^TM cDNA Synthesis Kit试剂盒，具体方法参照实施例1。

采用BioRAD的iTaq^TM Universal

Green Supermix试剂盒进行RT-PCR，反应体系为：

选用引物RT-F+RT-R，利用CFX96^TM Real-Time PCR仪进行荧光定量扩增，RT-PCR扩增程序为：95℃ 30s，(95℃ 5s，55-70℃ 30s)×39；溶解程序：65℃-95℃，每5s增加0.5℃。RT-PCR显示6个SsMAS3基因的沉默转化子中，Simas3-9及Simas3-20中SsMAS3的基因表达相比野生型中降低了50％左右(图4B)。故选择Simas3-9及Simas3-20用于后续实验。

实施例5 SsMAS3沉默转化子的表型分析

5.1菌丝生长速度测定及表型观察

将野生型核盘菌菌株1980和核盘菌铜离子相关基因的RNAi转化子接种到PDA培养基上活化，到菌丝第二代时，用直径为6mm的打孔器在菌丝生长边缘打孔，将新鲜菌丝块接种到20mL PDA培养基中央，各设置三次重复，每次重复三皿，置于22℃培养箱中，每隔12h采用十字交叉法测量其生长直径(以接种点为圆心，测量两个垂直方向上的生长直径)，比较野生型核盘菌和转化子生长速度。同时在36h取菌丝边缘在显微镜下进行菌丝形态观察，在7d后观察菌核形成情况。结果发现，SsMAS3的沉默影响了核盘菌菌丝形态，形成菌核的能力(图5A)，生长速度也比野生型显著减慢，野生型1980为2.5cm/12h，SsMAS3的沉默转化子Simas3-9为2.1cm/12h，Simas3-20为2.2cm/12h(图5B)。

5.2菌丝侵染结构的观察

将菌丝块接种于parafilm覆盖的PDA上，8h后去除PDA菌丝块，将parafilm置于光学显微镜下，拍摄。

将菌丝接种于甘蓝型油菜叶片，8h后去除PDA菌丝块，取以接种点为中心，向外延至病斑外围1cm范围以内的叶片圆片为样品。将样品置于HITACHIS-3000N型扫描电镜，扫描、拍摄。结果如图5C所示，在接种8h后，无论是在parafilm上还是在油菜叶片上，野生型菌株1980均能明显观察到侵染垫形成，而SsMAS3沉默转化子则形成较浅的侵染垫。

5.3菌丝致病力检测方法

选用甘蓝型油菜中双11号来检测转化子的致病力，接种方法为：在9-12叶期，取植株倒数第三片展开的真叶进行接种，每个菌株设置5片完整叶片，5片创伤叶片(在叶片的左右叶腹的中央接种点用接种针创伤叶片表面)。叶片鉴定在一个面积20平方米，可控制温度的房间内进行。将预先准备好的野生型及转化子菌株的PDA菌丝块接种于叶片左右叶腹的中央或创伤处，带菌面紧贴叶片。接种后，将温度设置为22℃，湿度85％。于接种后第3天统计菌斑的长径和短径，利用公式S＝π*a*b/4计算菌斑面积。结果显示(图5D)，无论是在完整叶片还是创伤叶片，相比野生型菌株，SsMAS3的沉默转化子形成的菌斑均显著减小。

实施例6农杆菌介导的拟南芥转化

6.1拟南芥的培养

(1)营养土在121℃高温灭菌40min，冷却后，移至花盆中，再用配好的营养液浸透灭菌后的土壤；

(2)4℃春化2d的拟南芥种子播种于灭菌后的土壤中，并用保鲜膜封好，以防水分丢失；

(3)播种后移至光照培养箱中(时间：16h/8h；湿度：40％/60％；温度：22℃/16℃；光照：10000LX/0LX)，种子萌发后去掉保鲜膜，每周浇一次营养液和一次水，直至拟南芥开花结果。

6.2浸花法转化拟南芥

(1)取1mL含能表达红色荧光蛋白的重组质粒pRed-HIGS-SsMAS3的农杆菌菌液于100mL含Kana的LB液体培养基中28℃，200rmp震荡培养12h；

(2)5000rmp室温离心20min，弃上清，用等体积的5％蔗糖溶液重悬农杆菌沉淀，再加0.2‰的表面活性剂，混匀；

(3)剪掉拟南芥荚果及开花，将拟南芥花序浸于重悬的农杆菌菌液30s，盖上保鲜膜，暗处理1d；

(4)去掉保鲜膜，移到光照培养箱中正常培养；

(5)一周后，重复步骤(1)～(5)再次转化，并且如此重复两周。

(6)当拟南芥荚果开始变黄裂开时，搜集脱落的种子，并于干燥通风的地方干燥种子。当植株整体上干枯时，将整个植株剪下，包好，置于烘箱中30℃烘2d，收集T0代的种子，种子4℃存放。

6.3阳性苗检测

在T₀代收获的种子中，利用绿色荧光透过红色滤光片，肉眼可见暗色和显红光的种子，挑选显红光的种子出来单独播种。

6.4 PCR鉴定

将发红光的种子播种后，获得T₁代转基因植株，取2周龄左右的叶片提取DNA进行PCR鉴定，选用引物组合为：1)QW586F+QW586R，2)QW586F+QW1447R。对播种材料进行PCR鉴定，若其在±1200bp有明显条带，则他们为转基因成功的阳性苗。琼脂糖凝胶电泳结果如图6所示，结果显示除编号为8，10，12，14，15，21及38的植株为假阳性外，其余27株T₁代植株均为阳性苗。

实施例7转基因拟南芥的菌核病抗性分析

我们从T₁代植株中选取部分红色种子：暗色种子比为3：1的单株种植T₂代，T₂代继续进行红色种子筛选，从而获得单株种子全部为红色的纯和株系，并从中随机选择3个株系种植至T₃代。选择叶片离体及活体接种核盘菌来评价转基因拟南芥的菌核病抗性。接种方法为：用野生型菌株1980在PDA平板上连续活化三代后，用2mm打孔器打取边缘的菌丝块，分别接种拟南芥叶片以及活体拟南芥上，菌丝面紧贴叶片表面。每个株系选择10片离体叶片及5株活体植株。将温度设置为22℃，湿度85％。于接种后24h统计菌斑的长径和短径，利用公式S＝π*a*b/4计算菌斑面积。同时收集活体接种后9，12，24h的菌斑及周围叶片，以实施例1中的方法提取RNA，并反转录成cDNA作为模板，用引物RT-F+RT-R，实施例4.5.2中的方法进行SsMAS3的基因表达分析。结果显示(图7)，相比阳性对照空载转基因株系(EV)，转基因株系HIGS-Simas3-25、HIGS-Simas3-39和HIGS-Simas3-42的叶片菌斑面积均显著减小，离体接种，三个转基因株系的菌斑面积分别降低35％，45％和33％，活体接种，三个转基因株系的菌斑面积分别降低61％，71％和53％。RT-PCR分析证明核盘菌SsMAS3的基因表达水平在侵染转基因株系过程中相比侵染野生型及阳性对照均显著降低。

拟南芥是分子生物学研究的模式植物，与油菜、萝卜、卷心菜等农作物同属于十字花科，具有较近的亲缘关系。在拟南芥中进行SsMAS3基因的HIGS，成功获得了菌核病抗性显著增强的转基因植株，该实验结果为SsMAS3基因在油菜等十字花科植物的菌核病抗病育种中的应用提供了实验支撑。

该实例的结果表明，核盘菌SsMAS3与核盘菌菌丝生长及侵染垫的形成相关，在核盘菌致病力中起着重要作用，在植物中表达靶向该基因的dsRNA将显著增强植物的菌核病抗性。在农作物菌核病抗性育种中具有一定的应用前景。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

SEQUENCE LISTING

<110> 西南大学

<120> 核盘菌SsMAS3基因及其在植物菌核病抗性育种中的应用

<130> 1

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 248

<212> PRT

<213> Sclerotinia sclerotiorum

<400> 1

Met Arg Tyr Thr Ile Val Ile Ala Ala Ile Ile Pro Phe Val Ala Ala

1 5 10 15

His Gly Lys Ile Ala Val Leu Ser Gly Asp Met Gly Gly Asn Thr Thr

20 25 30

Gly Leu Gly Ile Gln Gly Ala Val Ile Pro Gly Ala Gly Thr Asn Lys

35 40 45

Gln Thr Glu Val Asp Thr Thr Val Phe Asn Ser Lys Asn Ala Ala Thr

50 55 60

Asp Gly Leu Gly Lys Thr Lys Ala Gly Pro Asn Thr Met Ala Asn Met

65 70 75 80

Lys Ser Val Met Ala Met Ser Gly Glu Thr Leu Pro Gln Val Ser Ser

85 90 95

Asn Gly Gly Glu Leu Ser Gly Thr Ile His Ile Val Thr Thr Asp Gly

100 105 110

Ala Gly Pro Tyr Ser Ala Ile Val Asp Pro Thr Ala Thr Gly Thr Phe

115 120 125

Ser Gln Gly Thr Glu Ala Lys Val Thr Thr Gln Val Pro Gly Arg Arg

130 135 140

Gly Asn Ile Ala Ala Pro Lys Gln Arg Ser Leu Met Met Arg Ser Leu

145 150 155 160

Val Asn Leu Gly Ile Val Lys Arg Ala Lys Asn Val Asn Glu Asp Tyr

165 170 175

Pro Ile Lys Val Ala Ile Pro Ala Gly Met Ser Cys Thr Gly Thr Val

180 185 190

Gly Asp Gln Lys Asn Val Cys Leu Val Lys Leu Ala Asn Pro Ser Gly

195 200 205

Ala Gly Pro Phe Gly Gly Val Ala Ala Phe Gln Met Ala Ser Ala Ser

210 215 220

Ser Asp Ala Ala Ala Gly Asn Gly Thr Thr Ala Ala Thr Thr Lys Arg

225 230 235 240

Thr Ile Gly Ala Lys Phe Arg Ala

245

<210> 2

<211> 844

<212> DNA

<213> Sclerotinia sclerotiorum

<400> 2

atgcgttata ctatcgtcat cgccgctatc atcccattcg ttgccgccca tggcaagatc 60

gcagtcttgg ttagtaatct atctcattcc ttctcaatct cgtctcatca ttaatcccat 120

tcctcattct ccacttccaa taattcacac taactcatta cttcagtctg gtgacatggg 180

tggaaacacc actggtcttg gtatccaagg tgccgtcatc cctggtgccg gaaccaacaa 240

gcaaactgag gtcgacacca ctgtcttcaa cagcaagaat gccgctactg atggtctcgg 300

aaagaccaag gctggtccca acaccatggc taacatgaag agtgtcatgg ccatgtctgg 360

tgaaactctt cctcaagtta gcagcaatgg aggtgaactc agcggaacca tccacatcgt 420

caccactgac ggagctggac catactccgc catcgtcgac ccaactgcta ccggtacatt 480

ctctcaaggt actgaagcaa aggtcactac tcaagtacca ggcagaaggg gtaacatcgc 540

cgcacccaag caacgctccc tcatgatgag atccctcgtc aacctgggta tcgtcaagcg 600

tgccaagaac gtcaacgagg actaccccat caaagtcgcc atcccagctg gtatgtcctg 660

caccggtacc gtcggtgatc aaaagaacgt ctgcttggtt aagcttgcca acccatctgg 720

cgctggacca ttcggtggtg tcgcagcctt ccaaatggcc tcggcttcca gcgatgctgc 780

tgctggtaat ggcactactg ctgccactac caagcgcacc atcggtgcca agttccgtgc 840

ttaa 844

<210> 3

<211> 402

<212> DNA

<213> Gibberella zeae

<400> 3

aggcagcgtg agtttactct aggagcctaa caaggccggc tcttcaaggc cacatcagga 60

agtcaacccc ctgtcaaaat cgagctagtc catttttcga aattctcaat atgaaataga 120

acgatttact tctaaaaatg gatggacctt gaccacgaaa ttcacgattg gctgaaagag 180

agccccacat atccaaaaag ggtcacatct tgaccgctaa attctgattg gctgcaatgc 240

ttgaggccga cgacgaggtc agcaacttcc aaaacgaata taccaacaac aagctataag 300

gtctcataag aatataaata atttgagtct aaaggctata ttgtatatat ttatacaata 360

gtgataagtt ttatactgta tttagtgtcc agtctgagta gg 402

<210> 4

<211> 418

<212> DNA

<213> Sclerotinia sclerotiorum

<400> 4

ctatcatccc attcgttgcc gcccatggca agatcgcagt cttgtctggt gacatgggtg 60

gaaacaccac tggtcttggt atccaaggtg ccgtcatccc tggtgccgga accaacaagc 120

aaactgaggt cgacaccact gtcttcaaca gcaagaatgc cgctactgat ggtctcggaa 180

agaccaaggc tggtcccaac accatggcta acatgaagag tgtcatggcc atgtctggtg 240

aaactcttcc tcaagttagc agcaatggag gtgaactcag cggaaccatc cacatcgtca 300

ccactgacgg agctggacca tactccgcca tcgtcgaccc aactgctacc ggtacattct 360

ctcaaggtac tgaagcaaag gtcactactc aagtaccagg cagaaggggt aacatcgc 418

Claims

1. 核盘菌SsMAS3基因或寄主诱导沉默表达核盘菌SsMAS3基因的载体在十字花科植物菌核病抗性育种中的应用，其特征在于，核盘菌SsMAS3基因编码氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的蛋白。

2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述核盘菌SsMAS3基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

3. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述载体的构建方法包括以下步骤：克隆如权利要求1或2所述的核盘菌SsMAS3基因的部分编码序列，将其正义序列和反义序列分别与SEQ ID No.3所示核苷酸序列的两端相连得到SsMAS3基因的RNAi结构，将所述RNAi结构接入植物表达载体的启动子和终止子之间得到所述寄主诱导沉默表达载体。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述载体的构建方法包括以下具体步骤：

（1）克隆SsMAS3基因的部分编码序列，将其正义序列和反义序列分别连入载体pCIT的内含子两端，构建沉默表达载体pSimas3，所述正义序列、pCIT 的内含子和反义序列连接形成的核苷酸片段为SsMAS3基因的RNAi结构；

（2）将SsMAS3基因的沉默表达载体中的RNAi结构连入植物表达载体的启动子和终止子之间，得到所述寄主诱导沉默表达载体。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述沉默表达载体pSimas3中含有潮霉素和氨苄青霉素抗性元件。

6. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述植物表达载体为pBinGlyRed3，含有种子特异型的Glycinin启动子和Gly-term终止子的载体，所述SsMAS3基因的RNAi结构通过多克隆位点插入所述Glycinin启动子和所述Gly-term终止子之间，所述多克隆位点具体为EcoRI、XbaI、XmaI、SmaI和XhoI；所述植物表达的载体中还含有卡那霉素（Kana）抗性元件，同时包含一个红色荧光蛋白的筛选标记，DsRed的启动子为 CMV启动子，终止子为Nos终止子。

7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，采用寄主诱导沉默表达核盘菌SsMAS3基因的载体转化农杆菌，农杆菌浸花法转化植物的花序得转化后的花序，将植物培养至种子成熟，利用基因标记挑选转化成功的植株。