CN110143987A - 一种异丙基-β-硫代半乳糖苷的纯化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种异丙基‑β‑硫代半乳糖苷的纯化方法，先将异丙基‑β‑硫代半乳糖苷和互不相溶的两种溶剂制成双相均没有不溶性固体的溶液，再将该双相体系降温，析出异丙基‑β‑硫代半乳糖苷晶体。本发所公开的方法操作简单，易于工业化，结晶纯度高，具有很好的外观特性，结晶后的IPTG具有更强的诱导能力。

Description

一种异丙基-β-硫代半乳糖苷的纯化方法
技术领域
本发明涉及有机化合物的纯化领域，特别涉及一种异丙基-β-硫代半乳糖苷的纯化方法。
背景技术
异丙基-β-硫代半乳糖苷(简称IPTG，CAS No.367-93-1，结构如下式所示：
IPTG是一种性能极为优越的诱导剂，由于其不易被细菌代谢，用于诱导蛋白表达具有良好的稳定性，在实验室和工业生产中广泛使用。由于其广泛的需求，人们对其合成研究很多。中国专利CN 201310010582.7,CN 201610015040.X,CN 201810019641.X，CN201811016673.0以及CN 201810793198.1等都公开了以五乙酰基半乳糖为原料制备IPTG的方法。然而，作为一种分子生物学试剂，IPTG的性能与其产品质量密切相关。一些不必要杂质的存在会严重影响其诱导能力。
又由于IPTG合成过程中容易产生诸如异丙基-α-硫代半乳糖苷等异构体杂质，且这些杂质与IPTG结构和物理化学性质相似，难以通过常规的分离方法将其除去，导致通过这些方法合成的或市面上在售的IPTG其诱导表达能力被削弱。
因此，急需一种方便的IPTG纯化方法，提高通过目前方法合成的或市面上可购买的IPTG的纯度与诱导能力。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了一种异丙基-β-硫代半乳糖苷的纯化方法，以达到可以方便快速地分离纯化异丙基-β-硫代半乳糖苷，提高异丙基-β-硫代半乳糖苷的纯度与诱导能力的目的。
为达到上述目的，本发明的技术方案如下：
一种异丙基-β-硫代半乳糖苷的纯化方法，先将异丙基-β-硫代半乳糖苷和互不相溶的两种溶剂制成双相均没有不溶性固体的溶液，再将该双相体系降温，析出异丙基-β-硫代半乳糖苷晶体。
上述方案中，先将异丙基-β-硫代半乳糖苷和互不相溶的两种溶剂在加热或常温条件下制成双相均没有不溶性固体的溶液，再将该双相体系降温，析出异丙基-β-硫代半乳糖苷晶体。
上述方案中，所述互不相溶的两种溶剂中一种为水，另一种为与水不溶的有机溶剂。
上述方案中，将异丙基-β-硫代半乳糖苷、水以及有机溶剂一起加热制备双相均没有不溶性固体的溶液，或者将异丙基-β-硫代半乳糖苷和水先加热一段时间再加入有机溶剂，或者将异丙基-β-硫代半乳糖苷和有机溶剂先加热一段时间再加入水。
上述方案中，所述有机溶剂包括乙醚、叔丁基甲基醚、二氯甲烷、氯仿、1，2-二氯乙烷、乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸丁酯、正丁醇、异丁醇、仲丁醇、叔丁醇、含4-10个碳原子的烷烃、石油醚、苯、含取代基的苯以及丁酮中的一种或几种。
进一步的方案中，所述含4-10个碳原子的烷烃具有以下结构特征：CxHy，其中，x＝4～10，y＝8～22。
进一步的方案中，所述含取代基的苯具有以下结构特征：
其中R为F、Cl、Br、I、NO2、OR1、NR2R3、R4中的一种；
R1为氢原子，或为含1～10个碳原子的烷基；
R2和R3为氢原子，或为含1～10个碳原子的烷基；
R4为含1～10个碳原子的烷基。
更优选的，所述加热的温度为40～110℃。
优选的，互不相溶的两种溶剂的总质量与异丙基-β-硫代半乳糖苷的质量比为0.5～50:1。
通过上述技术方案，本发明提供的异丙基-β-硫代半乳糖苷的纯化方法采用重结晶的方法进行纯化，通过控制结晶参数，可以得到不同晶型、不同纯度的晶体。初始形成的晶核对所得晶体的晶型和纯度有重要影响。
根据本发明提供的方法对IPTG进行重结晶，由于结晶体系中存在油水界面，和一般结晶条件下晶核形成机制不同，所形成的晶体的晶型和纯度也不同。这是本发明提供的方法能提供优良IPTG产品的理论基础。
本发明提供通过重结晶提高IPTG质量的方法，操作简便，易于工业化。且采用本发明提供的方法对IPTG进行重结晶，所获得的IPTG产品比采用单相溶剂体系对IPTG进行重结晶获得IPTG产品具有更好的外观和纯度。所得晶体可用于细菌内蛋白表达的诱导，且具有更强的诱导能力，因此具有更高的附加价值。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为本发明实施例重结晶所得的IPTG的诱导效果图；
图2为市售IPTG的诱导效果图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
实施例1：
将100g市售IPTG，100g水，200g丁酮依次投入500ml圆底烧瓶，加热至回流，制成双相均没有不溶性固体的溶液，保温30min溶清。降温至25℃，析出白色晶体，保持25℃搅拌析晶1小时，过滤，收集所得晶体，烘干得IPTG 65g，HPLC纯度>99％。
实施例2
将100g市售IPTG，100g水，200g丁酮依次投入500ml圆底烧瓶，加热至回流，制成双相均没有不溶性固体的溶液，保温30min溶清。降温至25℃，析出白色晶体，保持25℃搅拌析晶1小时，进一步降温至0-5℃，继续析晶1小时，过滤，收集所得晶体，烘干得IPTG 80g,HPLC纯度>99％。
实施例3
将100g市售IPTG，100g水，150g甲苯依次投入500ml圆底烧瓶，加热至回流，制成双相均没有不溶性固体的溶液，保温30min溶清。降温至30℃，析出白色晶体，保持30℃搅拌析晶1小时，进一步降温至0-5℃，继续析晶1小时。过滤，收集所得晶体，烘干得IPTG 85g，HPLC纯度>99％。
实施例4
将100g市售IPTG，100g水，200g乙酸乙酯依次投入500ml圆底烧瓶，加热至回流，制成双相均没有不溶性固体的溶液，保温30min溶清。降温至25℃，析出白色晶体，保持25℃搅拌析晶1小时，过滤，收集所得晶体，烘干得IPTG 62g，HPLC纯度>99％。
实施例5
将200g市售IPTG，100g水投入500ml圆底烧瓶，加热至80℃溶解，加入120g乙酸乙酯，降温至0℃析晶2小时，过滤，收集所得晶体，烘干得IPTG 80g，HPLC纯度>99％。
实施例6
实施例1所得母液投入500ml烧瓶，加入100g IPTG，加热至回流，保温30min溶清。降温至25℃，析出白色晶体，保持25℃搅拌析晶1小时，过滤，收集所得晶体，烘干得IPTG101g，HPLC纯度>99％。
实施例7
将1kg市售IPTG，1kg水，1.5kg异丁醇依次投入5L玻璃反应釜，加热至回流，保温30min溶清。降温至25℃，析出白色晶体，保持25℃搅拌析晶1小时，过滤，收集所得晶体，烘干得IPTG 0.55Kg，HPLC纯度>99％。
IPTG用于蛋白表达诱导实验
IPTG溶液的配制：
分别准确称取市售IPTG，以及根据本发明提供的方法重结晶所得的IPTG各1.19g溶于5ml水，摇匀，定容至10ml，用0.22μm滤器过滤除菌备用。
诱导表达：
将转化pGEX-6P-1质粒的BL21(DE3)重组菌接种到含氨苄青霉素的3ml LB试管，37℃摇床培养过夜，按1:100接种于50ml LB培养基，在37℃，220rpm培养。监测OD600＝0.7-0.8时，加入终浓度为0.5mM IPTG诱导，16℃表达16h。离心，收集菌体，用400μl PBS重新分散，超声至澄清。取200μl裂解液作为总蛋白组分；剩余裂解液离心后吸取上清；沉淀再用200μl PBS重新分散。将总蛋白、超声上清、超声沉淀组分分别加入5x SDS-PAGE载样缓冲液,沸水煮5min，即为制备好的SDS-PAGE电泳样品。各取10μl，跑12％SDS-PAGE，分析表达情况。
跑胶结果见图1和图2。图1为采用本发明重结晶所得的IPTG的诱导效果，图2为市售IPTG的诱导效果。每图的三条带从左到右分别代表总蛋白、超声上清、超声沉淀样品。同一水平线代表同一蛋白，图中框内的表示目标蛋白。可以看到，采用本发明提供的方法结晶后的IPTG具有更强的诱导能力。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (9)

1.一种异丙基-β-硫代半乳糖苷的纯化方法，其特征在于，先将异丙基-β-硫代半乳糖苷和互不相溶的两种溶剂制成双相均没有不溶性固体的溶液，再将该双相体系降温，析出异丙基-β-硫代半乳糖苷晶体。
2.根据权利要求1所述的一种异丙基-β-硫代半乳糖苷的纯化方法，其特征在于，先将异丙基-β-硫代半乳糖苷和互不相溶的两种溶剂在加热或常温条件下制成双相均没有不溶性固体的溶液，再将该双相体系降温，析出异丙基-β-硫代半乳糖苷晶体。
3.根据权利要求2所述的一种异丙基-β-硫代半乳糖苷的纯化方法，其特征在于，所述互不相溶的两种溶剂中一种为水，另一种为与水不溶的有机溶剂。
4.根据权利要求3所述的一种异丙基-β-硫代半乳糖苷的纯化方法，其特征在于，将异丙基-β-硫代半乳糖苷、水以及有机溶剂一起加热制备双相均没有不溶性固体的溶液，或者将异丙基-β-硫代半乳糖苷和水先加热一段时间再加入有机溶剂，或者将异丙基-β-硫代半乳糖苷和有机溶剂先加热一段时间再加入水。
5.根据权利要求3所述的一种异丙基-β-硫代半乳糖苷的纯化方法，其特征在于，所述有机溶剂包括乙醚、叔丁基甲基醚、二氯甲烷、氯仿、1，2-二氯乙烷、乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸丁酯、正丁醇、异丁醇、仲丁醇、叔丁醇、含4-10个碳原子的烷烃、石油醚、苯、含取代基的苯以及丁酮中的一种或几种。
6.根据权利要求5所述的一种异丙基-β-硫代半乳糖苷的纯化方法，其特征在于，所述含4-10个碳原子的烷烃具有以下结构特征：CxHy，其中，x＝4～10，y＝8～22。
7.根据权利要求5所述的一种异丙基-β-硫代半乳糖苷的纯化方法，其特征在于，所述含取代基的苯具有以下结构特征：
其中R为F、Cl、Br、I、NO2、OR1、NR2R3、R4中的一种；
R1为氢原子，或为含1～10个碳原子的烷基；
R2和R3为氢原子，或为含1～10个碳原子的烷基；
R4为含1～10个碳原子的烷基。
8.根据权利要求2所述的一种异丙基-β-硫代半乳糖苷的纯化方法，其特征在于，所述加热的温度为40～110℃。
9.根据权利要求1所述的一种异丙基-β-硫代半乳糖苷的纯化方法，其特征在于，互不相溶的两种溶剂的总质量与异丙基-β-硫代半乳糖苷的质量比为0.5～50:1。
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