CN110114365B - 羟基苯甲酸衍生物、方法及其用途 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及基于羟基苯甲酸和类似物的新趋线粒体性抗氧化化合物的设计和合成。此外，本公开还涉及基于羟基苯甲酸的衍生物和类似物的方法和用途，例如，在人和动物疾病领域中，例如，治疗线粒体功能障碍或线粒体缺陷，以及在化妆品领域中，例如，预防或延缓皮肤衰老。

Description

羟基苯甲酸衍生物、方法及其用途
技术领域
本发明公开涉及基于羟基苯甲酸和类似物的新的趋线粒体性(线粒体靶向的，mitochondriotropic)抗氧化化合物的设计和合成。此外，本发明公开还涉及基于羟基苯甲酸的(羟基苯甲酸基，羟基苯甲酸类，hydroxybenzoic based)衍生物和类似物的方法和用途，例如，在人和动物疾病领域中，例如，治疗线粒体功能障碍或线粒体缺陷，以及在化妆品领域中，例如，预防或延缓皮肤衰老。
背景技术
线粒体在调节能量代谢、胞质钙浓度、ROS产生和细胞死亡途径中起到重要作用。如果不通过内在防御机制抵消，则过度的ROS产生可以导致细胞组分，如脂质、蛋白质和核酸的氧化损伤，其通过坏死或细胞凋亡导致后续细胞死亡。
由于氧化应激(氧胁迫，氧化压力，oxidative stress)增加所产生的线粒体变化在氧化应激相关疾病，如癌症、中风、心力衰竭、肥胖症和神经退行性病症中起到关键作用1。据信用细胞器特异性药物靶向线粒体是有效的治疗策略。更具体地，已将通过向线粒体选择性递送抗氧化剂来控制细胞ROS平衡描述为用于预防和/或治疗氧化应激相关疾病的有效且有前景的治疗策略2。
尽管通过内源抗氧化网络密切调节ROS产生，但是其过量产生可以导致线粒体氧化损伤和功能障碍。线粒体氧化功能障碍损害多个代谢和信号转导通路并且可以通过细胞凋亡或坏死引发细胞死亡。
氧化应激和线粒体功能障碍已与衰老和一些氧化应激相关病变，例如，糖尿病、非酒精性脂肪肝病、心血管疾病、急性胰炎和神经退行性疾病，包括阿尔兹海默症或帕金森病以及肌萎缩性侧索硬化相关。因此，目前线粒体氧化损伤的预防是已承认的延缓疾病发展的药理学策略。
在病理学事件中，内源抗氧化防御的组合可能不足以应对氧化剂产生的增加，因此已表明外源抗氧化剂的施用可以有益于降低细胞损伤，考虑到它们不仅补偿了内源防御系统的不足，而且还改善了整体抗氧化响应。理论上，外源抗氧化剂可以在不同水平上阻断氧化损害途径的复杂网络，从而获得治疗效果。因此，从饮食中外源获得的抗氧化剂可以在氧化还原细胞体内平衡中具有重要功能并且可以对细胞功能和疾病预防是重要的。
尽管线粒体在疾病的病理发生中的作用是一致认可的，但是靶向细胞器以防止破环并不总是明确的。通过预防/最大程度减少氧化损伤的线粒体功能改善是有效且有前景的治疗策略。由于维持ROS/抗氧化剂的比例和氧化还原的维持对于细胞信号转导是重要的，因此使抗氧化剂靶向功能障碍的线粒体受到了药理学关注。
正在开发一些线粒体靶向的抗氧化剂，具体地，使用三苯基鏻(TPP)作为载体的那些。利用内膜电势梯度，这类亲脂性阳离子可以穿过线粒体膜并在线粒体基质内积累3-5。
研究最多的线粒体靶向的抗氧化剂之一是米托蒽醌(MitoQ，MitoQ10，[10-(4,5-二甲氧-2-甲基-3,6-二氧代-l,4-环己二烯-1-基)癸基]三苯基鏻甲烷磺酸盐)。MitoQ由共价连接至10-碳烷基链(dTPP)间臂和连接至三苯基鏻(TPP)阳离子的内源抗氧化剂部分(辅酶Q)组成。MitoQ正处于对不同病理事件的临床试验，即对丙肝的临床试验。然而，使用MitoQ作为神经退行性疾病的治疗方案的临床试验已产生了令人失望的结果4,5。
另一个相关的线粒体靶向的抗氧化剂是SKQ1[10-(4,5-二甲基-3,6-二氧环己-1,4-二烯-1-基)癸基)三苯基溴化鏻)]，其基于质体醌(参与叶绿体电子传递链的苯醌)。SkQl显示降低线粒体内部的氧化应激并且对于眼部干燥病况提供了显著的保护益处。
尽管如此，仍需要在疗法和其它应用，如作为补充剂(supplement)或营养剂(nutraceutical)和在美容领域中使用的更有效和安全的线粒体调节剂。
多酚是植物次级代谢产物，其通常参与抵抗氧化应激物的防御，多酚大部分存在于组成人类饮食的水果、蔬菜、谷类和饮料中。常规西方饮食中多酚的每日饮食摄入量估计为约1g。流行病学研究和相关整合分析强烈表明了富含多酚的饮食的消费与氧化应激相关疾病，如癌症、糖尿病、心血管和神经退行性疾病的预防之间的相关性。
作为酚酸亚类的羟基苯甲酸(HBA)包含连接到至少一个羟基的七个碳原子(C6-C1)。目前，将一些HBA衍生物用作食品抗氧化剂添加剂以预防或最大程度减小营养物的氧化并维持或改善食品的营养价值。由于它们的抗氧化性质，羟基苯甲酸和衍生物还在美容和药物工业中用作赋形剂。然而，已指出了主要与它们的效力有关的一些缺点。
HBA的抗氧化活性与它们的螯合和自由基清除性有关，即通过抑制脂质过氧化过程进行抗氧化。目前还认识到HBA衍生物可以在一些参与活性氧(ROS)产生的助氧化酶的抑制中起作用。科学证据指出HBA抗氧化剂的效力与位于芳香环上的羟基的数目和位置有关。这些不同的作用机制可以致使ROS形成的抑制或减少、中断自由基链反应的进行或者延缓它们的起始或反应速率。
由于生物利用率和成药性的限制，HBA及其衍生物单独或作为佐剂在疗法中的有用性主要受到限制。尽管它们具有假定的健康促进性质，但是口服施用的多酚的生物利用率似乎不足以使全身疗法达到足够的浓度，这是主要与它们的物理化学性质(例如，亲油性)以及大量和快速代谢有关的问题。目前已发展了不同的策略来提高HBA的亲油性和稳定性，从而使得能够获得更好的生物利用率和改善它们向胞内靶标，如线粒体的递送。
公开了这些事实以说明通过本发明公开解决的技术问题。
发明内容
线粒体对于一些分子是有吸引力的靶标，这些分子可以在不同的病理学情境下最大程度减小细胞器损伤。
不断增加的证据表明线粒体功能障碍加强了在不同病变和老化过程中起决定性作用的氧化应激事件。线粒体铁硫中心、膜多不饱和脂肪酸、蛋白质和线粒体DNA对通常会导致细胞器和细胞破环的氧化损伤敏感。
本发明公开报道了基于膳食性羟基苯甲酸和类似物(AntiOxBEN)的新的趋线粒体性抗氧化化合物的设计和合成。
作为与基于天然模型(natural model)的有效抗氧化剂的开发有关的本发明公开的一部分，在本文中报道了基于天然膳食性HBA的新的针对线粒体的抗氧化剂的开发，其具有稳健的抗氧化性和铁螯合性，同时维持低细胞毒性谱。
本发明公开涉及式I的化合物
Figure BDA0002110082180000041
或者盐、溶剂化物、水合物、互变异构体、立体异构体；优选地，药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物、互变异构体、立体异构体；用于在医学中使用，
其中
R1、R2、R3、R4、R5、R6和R7独立地选自彼此；
R1、R2、R3、R4和R5选自H、卤素、羟基、甲基、甲氧基、氨基、羧酸基团或硝基；
R6为仲酰胺或叔酰胺；
R7为烷基链、烯基链、炔基链、取代的芳基、或仲酰胺，并且
Z-为可接受的阴离子，优选地可接受的药物阴离子，具体地，卤素，更具体地，Cl。
本发明公开还涉及式I的化合物
Figure BDA0002110082180000051
或者盐、溶剂化物、水合物、互变异构体、立体异构体；优选地，药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物、互变异构体、立体异构体；
其中
R1、R2、R3、R4、R5、R6和R7独立地选自彼此；
R1、R2、R3、R4和R5选自H、卤素、羟基、甲基、甲氧基、氨基、羧酸基团或硝基；
R6为仲酰胺或叔酰胺；
R7为烷基链、烯基链、炔基链、取代的芳基、或仲酰胺，并且
Z-为可接受的阴离子，优选地可接受的药物阴离子，具体地，卤素，更具体地，Cl；
前提条件是不包括
Figure BDA0002110082180000052
基于国际纯粹与应用化学联合会(International Union of Pure and AppliedChemistry，IUPAC)的定义，烷基的定义为通过从任何碳原子除去氢原子从而衍生自烷烃的单价基团-CnH2n+1。通过从非支链烷烃的末端碳原子除去氢原子所获得的基团形成正烷基(n-烷基)基团H(CH2)n亚类。基团RCH2、R2CH(R≠H)和R3C(R≠H)分别为伯、仲和叔烷基基团。芳基基团通过从环碳原子除去氢原子从而衍生自芳烃(单环和多环芳烃)。
“烷基”包括“低级烷基”并且扩展以覆盖具有至多30个碳原子的碳片段。烷基的实例包括辛基、壬基、降冰片基、十一烷基、十二烷基、十三烷基、十四烷基、十五烷基、二十烷基、3,7-二乙基-2,2-二甲基-4-丙基壬基、2-(环十二烷基)乙基、金刚烷基等。
“低级烷基”表示具有1至7个碳原子的烷基。低级烷基基团的实例包括甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、仲丁基和叔丁基、戊基、己基、庚基、环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、2-甲基环丙基、环丙基甲基等。
在一个实施方式中，式I所表示的化合物为
Figure BDA0002110082180000061
在一个实施方式中，式I所表示的化合物为
Figure BDA0002110082180000062
在一个实施方式中，
R7为R8-(C＝O)NH-R9酰胺的仲酰胺；
R8和R9独立地选自彼此，并且
R8和R9为烷基链、烯基链、炔基链或取代的芳基。
在一个实施方式中，取代的芳基为烷烃芳基取代的、烯烃芳基取代的或者炔烃芳基取代的。
在一个实施方式中，烷烃芳基取代的、烯烃芳基取代的或者炔烃芳基取代的为
C1-C6-烷基、C3-C8-环烷基、C6-C10-芳基、C6-C10-芳基-C1-C8-烷基、C1-C6-烷氧基、C6-C10-芳氧基、C6-C10-芳基-C1-C8-烷氧基、羟基、CO2H、C1-C6-烷氧基羰基、C6-C10-芳氧基羰基、C6-C10-芳基-C1-C8-烷氧基羰基、C1-C6-烷基羰基、C6-C10-芳基羰基、C6-C10-芳基-C1-C8-烷基羰基、C1-C6-烷基羧基、C6-C10-芳基羧基、C1-C6-烷基硫基(mercaptyl)、C6-C10-芳基硫基、C1-C6-烷基硫基羰基、C3-C8-环烷基硫基羰基、C6-C10-芳基硫基羰基、C1-C6-烷基硫基羧基、C6-C10-芳基硫基羧基、C1-C6-烷基磺酰基、C6-C10-芳基磺酰基、C1-C6-烷基硫氧基(sulfoxy)、C6-C10-芳基硫氧基；
它们各自被以下取代一次或几次：C1-C6-烷基、C1-C6-烷氧基、COOH；被C1-C6-烷基取代一次或两次的CONH2；SO3H、氨基、硫醇基团、羟基、硝基、氰基、氟、氯、溴、碘、CF3或OCF3；
其中这些任选的取代基中的几个组合以形成环状的(稠合的，增环的，anellated)饱和、不饱和或芳族同素环或杂环系统；或者
被以下取代一次或几次的饱和、不饱和或芳族杂环：C1-C6-烷基、C1-C6-烷氧基、COOH；被取代一次或两次的CONH2。
在一个实施方式中，烷基链、烯基链或炔基链为C1-C30链，优选地C1-C18链。
在一个实施方式中，烷基链、烯基链或炔基链为C2-C16链，优选地C3-C16链，更优选地C5-C14链，更优选地C6-C14。
在一个实施方式中，烷基链为C5烷基链、C6烷基链、C7烷基链、C8烷基链、C9烷基链、C10烷基链、C11烷基链、C12烷基链、C13烷基链或C14烷基链。
在一个实施方式中，R1和R5为H。
在一个实施方式中，R2和R3为OH。
在一个实施方式中，R4为H或OH。
在一个实施方式中，R7为C6烷基链。
在一个实施方式中，R8和R9彼此独立地为C5烷基链或C6烷基链。
在一个实施方式中，卤素为F、Cl、Br、I或At。
在一个实施方式中，化合物为6-(3,4-二羟基苯甲酰胺基)己基三苯基溴化鏻。
在一个实施方式中，化合物为6-(3,4,5-三羟基苯甲酰胺基)己基三苯基溴化鏻。
在一个实施方式中，化合物为5-(6-(3,4,5-三羟基苯甲酰胺基)己基氨基)羰基戊基]三苯基溴化鏻。
本发明公开还涉及用于在医学、兽医或美容领域中使用的目前所公开的任何化合物，或者相关化合物。
在一个实施方式中，所公开的化合物或相关化合物可以用于调节线粒体形态和/或OXPHOS酶表达中的至少一种。
在一个实施方式中，所公开的化合物或相关化合物可以用于治疗或预防或抑制与线粒体紊乱(失调，病症，disorder)或与一般性的线粒体功能障碍相关病况、包括由线粒体呼吸链缺陷所引起的疾病有关的症状。
在一个实施方式中，线粒体病症为选自由以下各项组成的组的病症：肌肉阵挛性癫痫、具有破碎样红纤维的肌肉阵挛性癫痫；Leber遗传性视神经病变；神经病、共济失调和色素性视网膜炎；线粒体肌病、脑病、高乳酸血症、中风；Leigh综合征；Leigh样综合征；显性视神经萎缩；科恩-塞亚综合征(Kearns-Sayre Syndrome)；母系遗传性糖尿病与耳聋；Alpers-Huttenlocher综合征；共济失调神经病谱；慢性进行性眼外肌麻痹；Pearson综合征；线粒体神经-胃-肠型脑病；Sengers综合征；3-甲基戊烯二酸尿症、感觉神经性耳聋、脑病和Leigh样综合征的神经放射学病况(检查结果，发现，findings)；骨骼肌变性；线粒体肌病；心肌病；和由于复合体IV过度蛋白缺陷所造成的脑肌病、缺陷型Leigh综合征；具有至今未解决的遗传缺陷、包括受干扰的丙酮酸盐氧化和ATP加PC产生速率的单独和组合的OXPHOS缺陷。
在一个实施方式中，线粒体功能障碍相关病况为选自由以下各项组成的病况：弗里德棘希氏共济失调；肾小管性酸中毒；帕金森氏病；阿尔茨海默氏病；肌萎缩性侧索硬化；亨廷顿病；广泛性发育障碍；听力丧失；耳聋；糖尿病；衰老；和阻碍线粒体功能的药物副作用。
在一个实施方式中，目前所公开的化合物或者相关化合物可以用于在治疗或预防或抑制神经退行性疾病、非酒精性脂肪肝病、瘤形成、癌症、肾病、硬皮病、肝脏铁过载病、肝脏铜过载病、脱发、人不育、急性胰炎、纤维性肌痛、线粒体紊乱、或者线粒体功能障碍或线粒体疾病相关病况中使用。
在一个实施方式中，目前所公开的化合物或者相关化合物可以用于在治疗或预防神经退行性疾病，具体地肌萎缩性侧索硬化中使用。
在一个实施方式中，目前所公开的化合物或者相关化合物可以用于在治疗或预防癌症中使用，其中癌症为肝癌、胰腺癌或胆管癌。
在一个实施方式中，目前所公开的化合物或者相关化合物可以用于在治疗或预防非酒精性脂肪肝病中使用，其中非酒精性脂肪肝疾病为非酒精性脂肪肝病、非酒精性脂肪性肝炎或者肝硬化。
在一个实施方式中，目前所公开的化合物或者相关化合物可以用于在治疗或预防肾病中使用，其中肾病为肾癌或肾衰竭。
在一个实施方式中，瘤形成疾病可以是癌症，具体地，基底细胞癌、骨癌、肠癌、脑癌、乳腺癌、宫颈癌、白血病、肝癌、肺癌、淋巴瘤、黑素瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、甲状腺癌或者胆管癌。
在一个实施方式中，目前所公开的化合物或者相关化合物可以用作抗微生物剂，具体地用作消毒剂。
在一个实施方式中，目前所公开的化合物或者相关化合物可以用于在多能细胞培养物的维持中作为细胞培养物补充剂，具体地作为生长培养基化合物使用。
本发明公开还涉及用于使多能干细胞维持在未分化状态的细胞培养基，包含目前所公开的任何化合物或者相关化合物。
在一个实施方式中，目前所公开的化合物或者相关化合物可以用作体育锻炼后的肌肉保护剂(muscle protector)或者肌肉恢复剂(muscle recovery)。
在一个实施方式中，目前所公开的化合物或者相关化合物可以用作美容剂，或者补充剂，或者营养剂、即抗衰老剂，或者用作抗皱皮肤护理产品。
在一个实施方式中，目前所公开的化合物或者相关化合物可以在成像研究，具体地监测线粒体的成像研究中用作探针。
本发明公开还涉及组合物，优选地药物组合物或美容组合物，其包含目前所公开的任何化合物或者相关化合物，和一种或多种药学上可接受的载体、佐剂、赋形剂、稀释剂或它们的混合物。
在一个实施方式中，药学上可接受的载体可以选自以下列表：盐水、阿拉伯树胶、明胶、淀粉糊、滑石、角蛋白、胶体二氧化硅(硅胶，colloidal silica)、脲等，或它们的混合物。
在一个实施方式中，佐剂可以选自以下列表：水包油乳剂佐剂、铝佐剂、TLR-4配体、皂苷等，及它们的混合物。
在一个实施方式中，赋形剂可以选自以下列表：葡萄糖、乳糖、蔗糖、单硬脂酸甘油酯、氯化钠、甘油、丙二醇、水、乙醇等，或它们的混合物。
在一个实施方式中，举例来说，可以通过口服、肠胃外、吸入或局部施用药物组合物。就非药物组合物，即美容组合物而言，优选的途径为局部施用。
在一个实施方式中，优选的药物施用途径包括(但不限于)口服、肠胃外、肌内、静脉内、原位注射、鼻内、舌下、气管内和吸入或局部施用。
在一个实施方式中，药物组合物可以用于(例如)在治疗或预防神经退行性疾病、非酒精性脂肪肝病、瘤形成、肾病、硬皮病、肝脏铁过载病、肝脏铜过载病、脱发、人不育、急性胰炎或纤维性肌痛的方法中使用，其中以每日剂量施用药物组合物。
在一个实施方式中，药物组合物的每日剂量可以为20mg/天或10mg/天等。
在一些实施方式中，可以将剂量或剂型向受试者(例如)每天施用一次、每天施用两次或每天施用三次。在其它实施方式中，可以将剂量向受试者每周施用一次、每月施用一次、每两月施用一次、每年施用4次、每年施用3次、每年施用2次或者每年施用1次。
在一个实施方式中，组合物可以以在受试者中将其它疗法，包括免疫疗法或任药理学方法的效力改善至少5％，至少10％，至少15％，至少20％，至少25％，至少30％，至少40％，至少50％，至少60％，至少70％，至少75％，至少80％，至少90％，至少95％，至少95.7％，至少98％或至少99％的有效量包含一种或多种本发明主题中所公开的化合物或者相关化合物。
在一些实施方式中，组合物包含0.1-1000mg的剂量。例如，在一些实施方式中，制剂(preparation)包含0.1mg/kg、0.2mg/kg、0.3mg/kg、0.4mg/kg、0.5mg/kg、0.7mg/kg、0.8mg/kg、0.9mg/kg、1mg/kg、2mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、5mg/kg、6mg/kg、7mg/kg、8mg/kg、9mg/kg、10mg/kg、11mg/kg、12mg/kg、13mg/kg、14mg/kg、15mg/kg、16mg/kg、17mg/kg、18mg/kg、19mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、30mg/kg、40mg/kg、50mg/kg、60mg/kg、70mg/kg、80mg/kg、90mg/kg、100mg/kg、200mg/kg、250mg/kg、300mg/kg、400mg/kg、500mg/kg、600mg/kg、700mg/kg、750mg/kg、800mg/kg、900mg/kg或者1000mg/kg的剂量。在一些实施方式中，组合物包含0.1-10mg/kg、0.1-100mg/kg、1-10mg/kg、1-100mg/kg、1-1000mg/kg、10-100mg/kg、10-1000mg/kg、100-1000mg/kg、10-50mg/kg、10-25mg/kg、10-20mg/kg、50-100mg/kg或者100-250mg/kg的剂量。
本发明公开还提供了纳米载体，例如，脂质体，其中纳米载体包含目前所公开的化合物或相关化合物，或者组合物。
在整个说明书和权利要求中，词语“包含”及该词语的变化形式不意欲排除其它技术特征、添加剂、组分或者步骤。
通过检查说明书，对于本领域技术人员来说，目前所公开的技术方案的其它目标、优势和特征将变得显而易见，或者可以通过实践该技术方案来习得。
在整个说明书和权利要求中，词语“包含”及该词语的变化形式不意欲排除其它技术特征、添加剂、组分或者步骤。通过检查说明书，对于本领域技术人员来说，本发明公开的其它目标、优势和特征将变得显而易见，或者可以通过实践本发明公开来习得。
附图说明
以下附图提供了用于说明描述内容的优选实施方式并且不应将其视作对本发明公开范围的限制。
图1：用于多种趋线粒体性抗氧化剂A-AntiOxBEN1和AntiOxBEN2；B-AntiOxBEN3的开发的合成策略。
图2：苯甲酸和衍生物(AntiOxBEN1、AntiOxBEN2和AntiOxBEN3)以及MitoQ的铁螯合性质的评价。将EDTA(螯合剂)用作参比。使用单因素ANOVA，与对照组比较，统计学显著(P<0.0001，n.s.，不显著)。
图3：(A)使用TPP-选择电极测量的能化(energised)大鼠肝线粒体的AntiOxBEN吸收。(B)大鼠肝线粒体的AntiOxBEN积累。MIT，线粒体；SUC，琥珀酸盐；VAL，缬氨霉素。
图4：不同氧化条件下，苯甲酸、AntiOxBEN和MitoQ对线粒体脂质过氧化的影响：(A)TBARS水平和(B)氧消耗改变。通过使用单因素ANOVA进行对照相对于AntiOxCIN(5μΜ)预温育之间的比较。
图5：含有(A)儿茶酚(原儿茶酸和AntiOxBEN1)或者(B)焦性没食子酸(没食子酸、AntiOxBEN2和AntiOxBEN3)核和(C)dTPP和MitoQ的苯甲酸和AntiOxBEN衍生物对通过ADP和Fe2+然后通过氧消耗所引起的RLM膜的脂质过氧化的影响的典型记录。
图6：通过线粒体渗透性转换孔(mPTP)的诱导，AntiOxBEN和MitoQ对线粒体膨胀的影响。在添加钙之前，将(A)2.5μΜ、(B)5μΜ和(C)10μΜ的AntiOxBEN和MitoQ与RLM预温育5min。使用单因素ANOVA，在对照(仅Ca2+)与其中在Ca2+之前将AntiOxBEN衍生物预温育的测定之间进行比较。CsA-环孢菌素A
图7：AntiOxBEN和MitoQ对通过(A)10mM谷氨酸盐+5mM苹果酸盐或者(B)5mM琥珀酸盐支持的RLM呼吸的影响。空心柱，对照；具有水平线的柱，2.5μΜ，具有垂直线的柱，5μΜ，具有棋盘形图案的柱，10μΜ)。使用Student’s双尾t检验确定相对于不同呼吸速率/状态的统计显著性。
图8：AntiOxBEN1(□)、AntiOxBEN2(●)和AntiOxBEN3(○)对人肝细胞癌细胞(HepG2)增殖的细胞毒性谱。使用单因素ANOVA，与对照组相比较，统计学显著。
具体实施方式
在一个实施方式中并且举例来说，图1中显示了用于开发一些羟基苯甲酸衍生物(AntiOxBEN)的合成策略。
在一个实施方式中并且举例来说，按照图1A中所示的四步合成策略获得了趋线粒体性抗氧化剂AntiOxBEN1和AntiOxBEN2。在本实施例中，使用氯甲酸乙酯作为偶联剂，通过酰胺化反应将起始材料二(1)或三甲氧基苯甲酸(2)连接至双官能化的烷基间臂(6-氨基己-1-醇)上。第二步反应旨在将醇官能团(化合物3或4)转化为卤化物，该卤化物是优良的离去基团。使用l,2-双(二苯基膦)乙烷(diphos)，通过Appel改性反应，以高得率，具体地70-90％获得了所期望的化合物(5或6)。在第三步中，通过三苯基膦(PPh3)替代的SN2反应获得三苯基鏻盐(化合物7或8)。使用三溴化硼(BBr3)，通过脱甲基法进行羟基化类似物(AntiOxBEN1和AntiOxBEN2)的合成。
在一个实施方式中并且举例来说，按照图1B中所示的四步合成策略获得趋线粒体性抗氧化剂AntiOxBEN3，其中将三甲氧基苯甲酸(2)连接至单保护的二胺间臂以获得衍生物9，随后将衍生物9在酸性介质中脱保护以获得化合物10。然后，通过其中原位产生酰化剂的酰胺化反应，将胺10偶联至三苯基鏻阳离子化合物11。然后，使用三溴化物(BBr3)溶液使化合物12脱甲基以获得AntiOxBEN3。总体上，已获得了良好至适中的得率。
在一个实施方式中并且举例来说，报道了AntiOxBEN抗氧化剂和氧化还原性质。在本研究中还包括原儿茶酸和没食子酸。将维生素E和trolox用作标准品。
在一个实施方式中，通过体外非细胞方法建立了AntiOxBEN抗氧化剂的活性排名级别。所选择的总抗氧化能力(TAC)测定(DPPH、ABTS和GO)包括由于通过抗氧化剂的原位自由基失活所造成的自由基吸光度降低的分光光度测定。具有较高抗氧化活性的化合物显示出较低的IC50值。表1中显示了结果。
抗氧化数据能够得出以下结论：AntiOxBEN是有效的抗氧化剂并且所得的IC50值在三种不同测定中遵循相同趋势。根据所得数据，可以得到以下结论：具有焦性没食子酸部分的化合物，具体地AntiOxBEN2和AntiOxBEN3显示出优于儿茶酚系统，具体地AntiOxBEN1的抗氧化活性。总体而言，当与原儿茶酸和没食子酸相比时，三苯基鏻(TPP)脂肪族侧链的引入导致抗氧化活性轻微降低。
表1.线粒体靶向的苯甲酸抗氧化剂的抗氧化活性和氧化还原电势(Ep)。
Figure BDA0002110082180000151
在一个实施方式中并且举例来说，评价了AntiOxBEN的氧化还原性质(表1)。氧化还原电势与抗氧化剂向自由基给出氢原子和/或电子的能力有关。通常，低氧化电势(Ep)与优良的抗氧化性有关。
在一个实施方式中，使用玻璃化炭黑工作电极，通过微分脉冲和循环伏安法，在生理学pH 7.4评价了母体抗氧化剂(原儿茶酸和没食子酸)和AntiOxBEN的氧化行为。氧化还原数据能够得出以下结论：原儿茶酸和AntiOxBEN1显示出存在儿茶酚基团的氧化还原电势(Ep)特征(Ep分别＝0.257和0.224V)(表1)。对于焦性没食子酸衍生物(没食子酸、AntiOxBEN2、AntiOxBEN3)，观察到氧化还原电势显著降低(Ep＝0.163-0.168V)(表1)。
在一个实施方式中，在趋线粒体性抗氧化剂AntiOxBEN1的微分脉冲伏安研究中仅观察到一个阳极波。单个伏安波的发生似乎表示当与母体酸相比时，AntiOxBEN1具有较低的吸附在电极表面上的倾向。没食子酸及其衍生物(AntiOxBEN2和AntiOxBEN3)的微分脉冲伏安研究显示在生理学pH存在两种明确定义的阳极波。氧化峰与存在于它们的结构中的焦性没食子酸单元的氧化有关。
在一个实施方式中，对于原儿茶酸和AntiOxBEN1两者所获得的循环伏安图显示出一个阳极峰和相应的阴极峰。阳极和阴极峰的电势值之间的差显示了不可逆的电子-转移过程。循环伏安实验提供了单个氧化峰，且反向扫描时无明显的还原波，从而表明没食子酸和AntiOxBEN2和AntiOxBEN3也是不可逆氧化的。
在一个实施方式中，所得结果能够得出以下结论：与对于原儿茶酸和AntiOxBEN1所观察到的那些相比，没食子酸和AntiOxBEN2和AntiOxBEN3显示出较低的氧化还原电势。氧化电势的降低似乎是由于没食子酸及其衍生物(焦性没食子酸单元)中额外的酚基的存在所造成的。额外的羟基促进了通过氧化所产生的自由基中间体的稳定，其转化为所得的氧化还原电势的显著降低。
在一个实施方式中，三苯基鏻阳离子侧链的引入对针对AntiOxBEN所得的氧化还原电势不具有显著影响。所得数据表明所进行的结构改变导致对儿茶酚或焦性没食子酸环的电子密度产生轻微或甚至未产生影响。
在一个实施方式中，通过TAC测定所得的数据与AntiOxBEN的氧化还原谱图一致。整体上，结果更加支持了以下假设：苯甲酸芳香环上存在的羟基取代基的数目与抗氧化和电化学性质直接相关。
在一个实施方式中并且举例来说，在生理学pH，使用微分脉冲伏安法(DPV)评价了AntiOxBEN1和AntiOxBEN2的亲脂性性质。所使用的技术通常用于模拟离子药物通过生物膜的传递，这是因为该过程在两种不混溶的电解质溶液之间的界面(ITIES)发生。通过微分脉冲伏安法(DPV)测量了初始存在于水相中的离子药物(C＝0.32mM)传递至1,6-二氯己烷(DCH)相的传递电势(Etr)。在ITIES模型中，随着药物亲脂性的升高，传递电势(Etr)的正电势降低。
在一个实施方式中并且举例来说，AntiOxBEN1和AntiOxBEN2的传递电势(Etr)分别为0.405V和0.495V。根据数据得出以下结论：与AntiOxBEN1(基于原儿茶酸的线粒体靶向的抗氧化剂)相比，AntiOxBEN2(基于没食子酸的线粒体靶向的抗氧化剂)中额外的OH官能性的存在提高了亲水性，其转化为传递电势的升高。如所期望的，由于它们的亲水性，羟基苯甲酸不会渗透。
在一个实施方式中并且举例来说，确定了AntiOxBEN的螯合性质，即它们螯合铁的能力。铁是可以催化Fenton和Haber-Weiss反应从而产生作为与对人体健康和疾病具有严重影响的氧化损伤事件有关的强氧化物质的羟基自由基(·OH)的氧化还原活性金属。注意，线粒体铁体内平衡的损失和后续铁过载可以有助于线粒体功能障碍并且反过来有助于不同的病变。因此，通过这种或多于一种机制控制的金属螯合剂或抗氧化剂的使用可以用作预防金属引起的毒性的治疗方法。可以通过不同作用机制，即通过清除有害活性反应组分，通过给出氢和/或电子传递和/或通过助氧化过渡金属(即Cu和Fe)的螯合的组合控制的酚类抗氧化剂可以具有巨大的显著性。
在一个实施方式中，通过使用EDTA(乙二胺四乙酸)作为参比的菲洛嗪(ferrozine)测定评价了新的AntiOxBEN的铁(II)螯合能力。还评价了原儿茶酸和没食子酸以及趋线粒体性抗氧化剂MitoQ的铁螯合性质(图2)。EDTA能够螯合所有在溶液中可用的铁，因为它可以完全抑制有色菲洛嗪-Fe(II)复合物的形成。
在一个实施方式中，与MitoQ相反，AntiOxBEN(儿茶酚或焦性没食子酸系列)和羟基苯甲酸能够螯合二价铁(图2)。羟基苯甲酸(原儿茶酸和没食子酸)能够有效螯合铁；然而，具有焦性没食子酸部分的那些更有效。AntiOxBEN(儿茶酚或焦性没食子酸系列)也能够螯合二价铁，具有焦性没食子酸部分的那些更有效。当与各自前体相比较时，AntiOxBEN的螯合性质似乎在一定程度上受到TPP阳离子间臂的引入的影响。然而，AntiOxBEN2和AntiOxBEN3能够螯合超过80％的溶液中存在的总的铁。
在一个实施方式中并且面对AntiOxBEN的有效抗氧化能力和铁螯合性质，预计在药物发现优化程序之后，这些新抗氧化剂可以致使产生可以应用以减轻线粒体铁过载的影响和/或减少氧化应激相关疾病和病况中线粒体铁储存的药物候选。
在一个实施方式中并且举例来说，在对膜电位响应的分离的大鼠肝线粒体(RLM)中评价了一些AntiOxBEN的线粒体吸收。通过Δψ驱动，AntiOxBEN可以在线粒体内部积累(图3A)。已测量了线粒体基质内不同AntiOxBEN的积累谱图。发现该过程与间臂长度的增加以及芳香族取代类型相关(图3B)。通过增加间臂长度，对于焦性没食子酸衍生物AntiOxBEN2所观察到的小的积累比得到显著改善。获得了以下排名顺序：AntiOxBEN2<AntiOxBEN1<AntiOxBEN3。所有AntiOxBEN显示出与MitoQ相当的积累比例(图3B)。
线粒体膜具有高浓度的多不饱和脂肪酸，由于它们位于产生ROS的位点附近，因此它们特别易于氧化。
在一个实施方式中并且举例来说，确定了AntiOxBEN对于保护RLM膜的脂质过氧化的抗氧化性能。已分别使用了两种不同的氧化应激剂，FeSO4/H2O2/抗坏血酸盐和ADP/FeSO4，和两种终点，TBARS的产生和氧消耗。将MitoQ用作参比(图4和5)。
在一个实施方式中，在FeSO4/H2O2/抗坏血酸盐测定中，没食子酸、AntiOxBEN2和AntiOxBEN3是防止线粒体脂质过氧化的最有效的趋线粒体性苯甲酸衍生物(图4A)。在RLM中防止TBARS形成时，AntiOxBEN1和原儿茶酸不是有效的(图4A)。在ADP/FeSO4测定中，AntiOxBEN中无一能够有效预防脂质过氧化(图4B和5)。在RLM中，AntiOxBEN相比于MitoQ抑制脂质过氧化的能力以MitoQ＞＞AntiOxBEN3≈没食子酸≈AntiOxBEN2>AntiOxBEN1≈原儿茶酸的顺序降低。一般地，在延缓脂质过氧化膜过程中，基于焦性没食子酸的AntiOxBEN(图4和5)更有效。
在一个实施方式中并且举例来说，评价了一些AntiOxBEN对线粒体渗透性转换孔(mPTP)开放的影响。一般地，对于所有所测试的浓度，所测试的AntiOxBEN本身对mPTP开放无影响。
在一个实施方式中，发现AntiOxBEN3导致了钙依赖性mPTP开放的浓度依赖性抑制，但AntiOxBEN1和AntiOxBEN2以及MitoQ不能(图6A-C)。该效果与典型的mPTP脱敏剂(desensitizer)环胞霉素A(1μΜ)的效果相当，并且可以与其抗氧化活性相关或者可以是通过可能的钙离子螯合作用。这种性质可以受到治疗方面的关注，例如，在移植中用于预防和治疗移植物抗宿主排斥，该过程通常包括移植物中线粒体的破环。
由于细胞代谢取决于最优的线粒体功能，因此化合物对线粒体功能参数的影响可以提供有关它们毒性谱的信息。因此，评价了它们通过损害线粒体内膜或者通过抑制呼吸链、ATP合成、线粒体渗透性转换孔(mPTP)过程或者排出机制引起线粒体功能障碍的能力。
在一个实施方式中并且举例来说，测量了一些AntiOxBEN和MitoQ对线粒体生物能学，即对RLMΔψ和呼吸参数的毒性影响。Δψ代表通过线粒体呼吸所产生的电化学梯度的主要组成，并且占总可用能量的超过90％。对于线粒体呼吸测定，将谷氨酸盐/苹果酸盐(对于复合物I)和琥珀酸盐(对于复合物II)用作底物。另外，还计算了线粒体氧化磷酸化耦合指数(coupling index)，也称为呼吸调节比率(RCR，状态3/状态4呼吸)和ADP/O指数(ATP合成和氧消耗之间的耦合)。在抗氧化剂-相关浓度下测试了AntiOxBEN和MitoQ，其中最高浓度为10μΜ。
在一个实施方式中，表2显示了对MitoQ所获得的线粒体生物能学数据。将所获得的结果用于比较分析。
表2.MitoQ对线粒体生物能学：线粒体呼吸控制率(mitochondrial respiratorycontrol ratio，RCR)、磷酸化(phosphorylative)系统的效力(ADP/O)和线粒体跨膜电位(Δψ)的影响。使用Student’s双尾t检验，与对照相比，*、**、***、****统计学显著。
Figure BDA0002110082180000201
在一个实施方式中，据观察对于所有测试浓度，MitoQ都导致RCR和ADP/O参数显著降低(表2)。此外，当将RLM与高达2.5μΜ的MitoQ浓度一起温育时，使用谷氨酸盐/苹果酸盐作为底物，观察到状态2、状态4和寡霉素抑制的呼吸增加，而状态3和FCCP未耦合的呼吸降低(图7A)。当使用琥珀酸盐时，在存在处于所测试的最高浓度的情况下，RLM完全去耦合(图7B)。与浓度不断升高的MitoQ一起温育导致能化后所获得的最大Δψ逐步降低(表2)。在ADP添加后，由于在ADP诱导的去极化之后未发生复极化，因此使用10μΜ MitoQ观察到Δψ的骤降(表2)。
在一个实施方式中并且举例来说，在AntiOxBEN毒性研究中使用的最高浓度是其中MitoQ完全破坏线粒体生物能学的浓度。表3-5显示了AntiOxBEN毒性研究的数据。
在一个实施方式中并且举例来说，在谷氨酸盐/苹果酸盐能化之后，AntiOxBEN导致轻微的Δψ剂量依赖性去极化(10-20mV)，而在琥珀酸盐能化下，促进5-20mV的轻微超极化。仍然，重要的是注意AntiOxBEN未显著影响RLMΔψ。
表3.AntiOxBEN1对线粒体生物能学：线粒体呼吸控制率(RCR)、磷酸化(phosphorylative)系统的效力(ADP/O)和线粒体跨膜电位(Δψ)的影响。使用Student’s双尾t检验，与对照相比，*、**、****统计学显著。
Figure BDA0002110082180000211
表4.AntiOxBEN2对线粒体生物能学：线粒体呼吸控制率(RCR)、磷酸化(phosphorylative)系统的效力(ADP/O)和线粒体跨膜电位(Δψ)的影响。使用Student’s双尾t检验，与对照相比，*、**、****统计学显著。
Figure BDA0002110082180000221
表5.AntiOxBEN3对线粒体生物能学：线粒体呼吸控制率(RCR)、磷酸化(phosphorylative)系统的效力(ADP/O)和线粒体跨膜电位(Δψ)的影响。使用Student’s双尾t检验，与对照相比，*、**、****统计学显著。
Figure BDA0002110082180000231
在一个实施方式中并且举例说明，图7A和B中显示了状态2、状态3、状态4、寡霉素抑制的呼吸和线粒体呼吸测定和琥珀酸盐(用作底物FCCP刺激的呼吸)的AntiOxBEN和MitoQ速率。
在一个实施方式中，发现AntiOxBEN以剂量依赖性方式引起呼吸链的变化。一般地，在主要依赖于它们的亲油性而不是依赖于它们的芳香族模式(儿茶酚相对于焦性没食子酸)的过程中，处于高于2.5μΜ的浓度的AntiOxBEN提高了状态2、状态4和寡霉素抑制的呼吸。然而，必须强调通过使用复合物I底物，所观察到的影响更明显。(图7A和B)。
在一个实施方式中并且举例来说，已表明AntiOxBEN在分离的RLM的呼吸谱中引起了剂量依赖性变化。一些所观察到的影响可以有可能是由于膜渗透性影响或者质子穿梭活性所产生的。这种影响可以导致非磷酸化呼吸的刺激和小的Δψ去极化。因此，对于所有测试浓度，AntiOxBEN导致RCR显著降低。此外，AntiOxBEN(10μΜ)还影响线粒体的磷酸化系统，如通过ADP/O比的变化所评价的。
在一个实施方式中并且举例来说，在高浓度所观察到的AntiOxBEN线粒体毒性可能与间臂的亲油性和/或TPP部分的存在有关，并且与它们的关系不大(如果有的话)(儿茶酚相对于焦性没食子酸)。仍然，TPP阳离子和亲脂性间臂的存在对于有效并且有时大量的线粒体积累是必不可少的。
在一个实施方式中并且举例来说，发现在高浓度时，线粒体靶向的抗氧化剂AntiOxBEN和MitoQ可以通过导致线粒体内膜破坏或者通过抑制呼吸链、ATP合成或排出机制来破坏线粒体呼吸。
在一个实施方式中，必须强调在5μΜ时，MitoQ有效抑制了RLM中的脂质过氧化(图4和5)，但是在2.5μΜ导致了对RLM的线粒体生物能机构的毒性(图7A和B和表2)。
在一个实施方式中，得出以下结论：对于所研究的AntiOxBEN，与它们的机制无关，在高于发挥抗氧化作用所需的浓度检测到RLM毒性。
在一个实施方式中并且举例来说，得到以下结论：一般地，AntiOxBEN显示出优于MitoQ的安全谱。
在一个实施方式中并且举例来说，使用来自肝细胞癌的人肝细胞的单层培养物(HepG2)和SRB法评价了AntiOxBEN的细胞毒性(图8)。从数据来看，得出以下结论：AntiOxBEN对HepG2细胞显示出低毒性(图8)。尽管对于低浓度来说，AntiOxBEN1促进了小的细胞增殖抑制，但是在高于100μΜ的浓度，其刺激细胞增殖。明显地，在低于250μΜ的浓度，AntiOxBEN2显著刺激细胞增殖，而在高于250μΜ的浓度，其显著抑制细胞增殖。在高于250μΜ的浓度，AntiOxBEN3显著抑制细胞增殖。
在一个实施方式中并且举例来说，得出以下结论：可以通过化合物的亲油性调节基于其性质的AntiOxBEN毒性(表1)和RLM积累速率(图3)。一般地，AntiOxBEN对HepG2细胞具有安全限。
在一个实施方式中并且举例来说，得到以下结论：苯甲酸(原儿茶酸和没食子酸)的结构改变导致它们的趋线粒体性显著改善。AntiOxBEN具有提高的抗氧化活性、较高的线粒体积累和较低的毒性。
在一个实施方式中，整体结果显示通过细胞器跨膜电势驱动，AntiOxBEN在线粒体内部积累并且防止脂质过氧化，从而显示出低固有毒性。AntiOxBEN显示出高于其母体化合物，例如，原儿茶酸和没食子酸的亲油性，和类似的抗氧化以及铁螯合性质。
在一个实施方式中，AntiOxBEN是旨在预防或减缓与衰老和一些病变，例如，糖尿病、非酒精性脂肪肝病、心血管疾病、急性胰炎和神经退行性疾病，包括阿尔兹海默症或帕金森病和肌萎缩性侧索硬化有关的线粒体氧化应激的趋线粒体性抗氧化剂。
在一个实施方式中并且根据作为实例使用的AntiOxBEN系列，预测基于焦性没食子酸的类似物是开发在线粒体氧化相关病症中具有治疗应用的第一类药物的潜在候选。
按照合成程序实例获得并且提供了多种中间体和AntiOxBEN。
在一个实施方式中，通过光谱分析方法获得了化合物的结构表征。在室温下采集1H和13C NMR光谱并在分别以400和100MHz操作的Bruker Avance III上记录。相对于作为内标的四甲基硅烷(TMS)，以δ(ppm)值表示化学位移，并且以Hz提供耦合常数(J)。还根据DEPT(无畸变极化转移增强)(下划线值)进行分配。在Bruker Microtof(ESI)或者Varian 320-MS(EI)装置上记录质谱(MS)并以重要片段的m/z(相对％)表示。
在一个实施方式中，在铝硅凝胶(硅胶，silica gel)板60F254板(Merck,Darmstadt,Germany)上，在处于几种比例的二氯甲烷、乙酸乙酯和二氯甲烷/甲醇中，通过薄层色谱(TLC)分析评价反应进行。使用UV检测(254和366nm)检测斑点。使用硅凝胶60(0.040-0.063mm)(Carlo Erba Reactifs-SDS,France)进行快速柱色谱。
在一个实施方式中，按照图1A中所示的四步合成策略进行AntiOxBEN1和AntiOxBEN2的获得。首先，如下所示合成了中间体化合物3和4：将3,4-二甲氧基苯甲酸(1)或者3,4,5-三甲氧基苯甲酸(2)，具体地1mmol，溶于二氯甲烷，具体地40mL二氯甲烷，并添加三乙胺，具体地2mmol三乙胺。将氯甲酸乙酯，具体地2mmol氯甲酸乙酯滴加至搅拌溶液，并保持在冰浴中。搅拌后，具体地，在室温下搅拌2h后，将混合物再次冷却，并添加6-氨基己-1-醇，具体地2mmol 6-氨基己-1-醇。搅拌反应，具体地，在室温下搅拌10h。用二氯甲烷萃取混合物，具体地，
Figure BDA0002110082180000261
合并有机相，用水，NaHCO3 5％，具体地20mL NaHCO3 5％和HCl 1M，具体地，20mL HCl 1M清洗。合并有机相，干燥，并在过滤之后蒸发溶剂以获得白色残余物。通过TLC，具体地，硅凝胶，乙酸乙酯跟踪反应。
在一个实施方式中，N-(6-羟基己基)-3,4-二甲氧基苯甲酰胺(3)的表征如下所示：得率74％；1H NMR(400MHz,CDCl3):δ＝1.39-1.41(4H,m,(CH 2)2(CH2)2OH),1.55-1.63(4H,m,NCH2CH 2(CH2)2CH 2),1.99(1H,s,OH),3.40-3.45(2H,m,NCH2),3.63(2H,t,J＝6.5Hz,CH 2OH),3.91(6H,s,2×OCH3),6.38(1H,t,J＝5.2Hz,CONH),6.85(1H,d,J＝8.4Hz,H(5)),7.29(1H,dd,J＝8.4Hz,J＝2.0Hz,H(6)),7.43(1H,d,J＝2.0Hz,H(2)).13C NMR(100MHz,CDCl3):δ＝25,4(CH2(CH2)2OH),26.7(N(CH2)2 CH2),29.8(NCH2 CH2),32.6(CH2CH2OH),40.0(NCH2),56.1(2×OCH3),62.7(CH2OH),110.4(C(5)),110.7(C(2)),119.4(C(6)),127.5(C(1)),149.0(C(3)),151.7(C(4)),167.3(CONH).EI-MS m/z(％):281(Μ·+),208(16),195(21),194(100),180(16),165(75),164(55),121(15)。
在一个实施方式中，N-(6-羟基己基)-3,4,5-三甲氧基苯甲酰胺(4)的表征如下所示：得率82％；1H NMR(400MHz,CDCl3):δ＝1.40-1.43(4H,m,(CH 2)2(CH2)2OH),1.54-1.66(4H,m,NCH2CH 2(CH2)2CH 2),1.81(1H,s,OH),3.41-3.46(2H,m,NCH2),3.64(2H,t,J＝6.4Hz,CH 2OH),3.87(3H,s,OCH3),3.89(6H,s,2×OCH3),6.28(1H,t,J＝5.1Hz,CONH),7.00(2H,s,H(2)和H(6))；13C NMR(100MHz,CDCl3):δ＝25.4(CH2(CH2)2OH),26.7(NCH2CH2 CH2),29.8(NCH2 CH2),32.6(CH2CH2OH),40.1(NCH2),56.4(2×OCH3),61.0(OCH3),62.8(CH2OH),104.5(C(2)和C(6)),130.4(C(1)),140.9(C(4)),153.3(C(3)和C(5)),167.5(CONH)和EI-MS m/z(％):312(Μ·+),225(38),224(34),211(59),196(49),195(100)。
在一个实施方式中，用于获得溴己基苯甲酰胺化合物5和6的一般合成程序如下所示：将N-(6-羟基己基)-3,4-二甲氧基苯甲酰胺(3)或者N-(6-羟基己基)-3,4,5-三甲氧基苯甲酰胺(4)，具体地，1mmol羟己基苯甲酰胺3或者羟己基苯甲酰胺4，和1,2-二溴四氯乙烷，具体地1mmol 1,2-二溴四氯乙烷溶于THF，具体地，溶于20mL THF。在添加l,2-双(二苯基膦)乙烷(diphos)，具体地0.5mmol之后，将所述反应具体地在室温下搅拌20小时。然后，将所述反应混合物过滤，具体地通过硅藻土垫过滤。将滤液蒸发后，获得残油。具体地，使用乙酸乙酯作为洗脱系统，通过硅凝胶快速色谱法纯化所述油。收集含有预期化合物的部分，将溶剂蒸发并将产物从正己烷中重结晶。通过TLC，具体地，硅凝胶，乙酸乙酯跟踪所述反应。
在一个实施方式中，N-(6-溴己基)-3,4-二甲氧基苯甲酰胺(5)的表征如下所示：得率66％；1H NMR(400MHz,CDCl3):δ＝1.38-1.53(4H,m,(CH 2)2(CH2)2Br),1.59-1.67(2H,m,NCH2CH 2),1.83-1.90(2H,m,CH 2CH2Br),3.39-3.46(4H,m,NCH 2(CH2)4CH 2Br),3.92(6H,s,2×OCH3),6.25(1H,t,J＝5.4Hz,CONH),6.85(1H,d,J＝8.4Hz,H(5)),7.27(1H,dd,J＝8.4Hz,J＝2.0Hz,,H(6)),7.43(1H,d,J＝2.0Hz,H(2))；13C NMR(100MHz,CDCl3):δ＝26.2(NCH2CH2 CH2),28.0(CH2(CH2)2Br),29.7(NCH2 CH2),32.7(CH2CH2Br),33.9(CH2Br),40.0(NCH2),56.1,(OCH3×2),110.3(C(5)),110.7(C(2)),119.2(C(6)),127.5(C(1)),149.1(C(3)),151.7(C(4)),167.2(CONH)和EI-MS m/z(％):345(Μ·+),343(24),264(36),195(34),194(19),181(40),166(24),165(100)。
在一个实施方式中，N-(6-溴己基)-3,4,5-三甲氧基苯甲酰胺(6)的表征如下所示：得率75％；1H NMR(400MHz,CDCl3):δ＝1.37-1.52(4H,m,(CH 2)2(CH2)2Br),1.59-1.66(2H,m,NCH2CH 2),1.83-1.90(2H,m,CH 2CH2Br),3.39-3.45(4H,m,NCH 2(CH2)4CH 2Br),3.87(3H,s,OCH3),3.88(6H,s,2×OCH3),6.40(1H,t,J＝5.3Hz,CONH),7.01(2H,s,H(2)和H(6))；13CNMR(100MHz,CDCl3):δ＝26.2(NCH2CH2 CH2),27.9(CH2(CH2)2Br),29.6(NCH2 CH2),32.6(CH2CH2Br),33.9(CH2Br),40.1(NCH2),56.4(2×OCH3),61.0(OCH3),104.4(C(2)和C(6)),130.3(C(1)),140.8(C(4)),153.2(C(3)和C(5)),167.3(CONH)和EM/EI m/z(％):374(Μ·+),372(15),225(18),224(100),210(18),195(32),194(48)。
在一个实施方式中，将溴己基苯甲酰胺5或6(1mmol)与三苯基膦(PPh3)(1mmol)在圆底烧瓶中混合并加热至约120℃的温度，保持48小时。使用梯度洗脱(乙酸乙酯:甲醇)，通过硅凝胶快速色谱法纯化残余物。收集含有所期望的化合物的部分并将溶剂蒸发至干燥。通过TLC(硅凝胶，乙酸乙酯:甲醇(9:1)和二氯甲烷:甲醇(9:1))跟踪所述反应。
在一个实施方式中，6-(3,4-二甲氧基苯甲酰胺)己基三苯基溴化鏻(7)的表征如下所示：得率65％；1H NMR(400MHz,CD3OD):δ＝1.40-1.72(8H,m,NCH2(CH 2)4),3.33-3.37(2H,m,CH 2P+Ph3),3.42-3.49(2H,m,NCH 2),3.83(6H,s,2×OCH3),6.98(1H,d,J＝8.5Hz,H(5)),7.46(1H,d,J＝2.1Hz,H(2)),7.49(1H,dd,J＝8.5,J＝2.1Hz,Hz,H(6)),7.73-7.89(15H,m,PPh3)；13C NMR(100MHz,CD3OD):δ＝22.7(d,JCP＝51.0Hz,CH2P+Ph3),23.5(d,JCP＝4.3Hz,CH2(CH2)2P+Ph3),27.2(CH2(CH2)3P+Ph3),30.3(NCH2 CH2),31.2(d,JCP＝16.3Hz,CH2CH2P+Ph3),40.8(NCH2),56.7(2×OCH3),112.0(C(5)),112.2(C(2)),120.0(d,JCP＝86.2Hz,C(1')),122.0(C(6)),128.1(C(1)),131.6(d,JCP＝12.6Hz,C(3')和C(5')),134.9(d,JCP＝10.0Hz,C(2')和C(6')),136.3(d,JCP＝3.0Hz,C(4')),150.2(C(3)),153.4(C(4)),169.5(CONH)和EI-MS m/z(％):511(Μ·+),277(37),263(40),262(100),183(87),165(47),151(35),108(44),107(29),77(26),52(26)。
在一个实施方式中，6-(3,4,5-三甲氧基苯甲酰胺)己基三苯基溴化鏻(8)的表征如下所示：得率79％；1H NMR(400MHz,CD3OD):δ＝1.41-1.73(8H,m,NCH2(CH 2)4),3.37-3.40(2H,m,CH 2P+Ph3),3.50-3.56(2H,m,NCH 2),3.94(3H,s,OCH3),3.95(9H,s,2×OCH3),7.28(2H,s,H(2)和H(6)),7.75-7.90(15H,m,PPh3)；13C NMR(100MHz,CD3OD):δ＝22.5(d,JCP＝50.8Hz,CH2P+Ph3),23.3(d,JCP＝4.0Hz,CH2(CH2)2P+Ph3),27.1(CH2(CH2)3P+Ph3),30.0(NCH2 CH2),30.9(d,JCP＝16.2Hz,CH2CH2P+Ph3),40.6(NCH2),57(2×OCH3),61.1(OCH3),106.0(C(2)和C(6)),119.7(d,JCP＝86.1Hz,C(1')),130.8(C(1)),131.4(d,JCP＝12.5Hz,C(3')和C(5')),134.7(d,JCP＝10.0Hz,C(2')和C(6')),136.1(d,JCP＝2.8Hz,C(4')),141.6(C(4)),154.1(C(3)和C(5)),168.7(CONH)和EI-MS m/z(％):448(Μ·+),446(41),278(35),277(81),276(27),275(58),263(29),262(100),185(31),184(25),183(94),152(21),108(36),96(53),94(54),77(24),58(41)。
在一个实施方式中，将三苯基鏻盐7或8，具体地1mmol三苯基鏻盐7，或者1mmol三苯基鏻盐8溶于无水二氯甲烷，具体地15mL无水二氯甲烷。将反应混合物在氩气下搅拌并在低于-70℃的温度下冷却。将三溴化硼，具体地5-7mmol三溴化硼，在二氯甲烷中的1M溶液加入至溶液并将反应具体地在-70℃保持10分钟。在达到室温后，将反应继续12小时。此后，通过小心添加水，具体地40mL水来终止反应。在除去水后，将所得产物溶于甲醇并干燥、过滤和蒸发溶剂。具体地，使用梯度洗脱，具体地二氯甲烷:甲醇，通过硅凝胶快速色谱法纯化残余物。收集含有所期望的化合物的部分并将溶剂蒸发至干燥。通过TLC，具体地，硅凝胶，二氯甲烷:甲醇(9:1)跟踪反应。将所得残余物从乙醚/甲醇中结晶以提供相应的三苯基溴化鏻盐。
在一个实施方式中，6-(3,4-二羟基苯甲酰胺基)己基三苯基溴化鏻(AntiOxBEN1)的结构表征如下所示：得率60％；1H NMR(400MHz,CD3OD):δ＝1.35-1.47(2H,m,N(CH2)4CH 2),1.50-1.75(6H,m,NCH2(CH 2)3),3.33-3.47(4H,m,NCH 2(CH2)4CH 2P+Ph3),6.79(1H,d,J＝8.3Hz,H(5)),7.18(1H,dd,J＝8.3Hz,J＝2.2Hz,H(6)),7.26(1H,d,J＝2.2Hz,H(2)),7.69-7.92(15H,m,PPh3)；13C NMR(100MHz,CD3OD):δ＝22.7(d,JCP＝51.2Hz,CH2P+Ph3),23.4(d,JCP＝4.5Hz,CH2(CH2)2P+Ph3),27.0(CH2(CH2)3P+Ph3),30.1(NCH2 CH2),31.0(d,JCP＝16.2Hz,CH2CH2P+Ph3),40.0(NCH2),115.7(C(5)),115.8(C(2)),120.0(d,JCP＝86.4Hz,C(1')),120.5(C(6)),126.9(C(1)),131.5(d,JCP＝12.5Hz,C(3')和C(5')),134.8(d,JCP＝9.9Hz,C(2')和C(6')),136.3(d,JCP＝3.0Hz,C(4')),146.3(C(3)),150.1(C(4)),170.3(CONH)和ME/ESI m/z(％):499(M++H-Br,51),498(M+-Br,98),399(31),397(31),291(100),277(67)。
在一个实施方式中，6-(3,4,5-三羟基苯甲酰胺基)己基三苯基溴化鏻(AntiOxBEN2)的结构表征如下所示：得率50％；1H NMR(400MHz,DMSO):δ＝1.23-1.50(8H,m,NCH2(CH 2)4),3.11-3.16(2H,m,CH 2P+Ph3),3.54-3.59(2H,m,NCH 2),6.81(2H,s,H(2)和H(6)),7.74-7.91(15H,m,PPh3),8.00(1H,t,J＝5.1Hz,CONH)；13C NMR(100MHz,DMSO):δ＝20.2(d,JCP＝49.8Hz,CH2P+Ph3),21.8(d,JCP＝4.1Hz,CH2(CH2)2P+Ph3),25.6(CH2(CH2)3P+Ph3),28.9(NCH2 CH2),29.6(d,JCP＝16.6Hz,CH2CH2P+Ph3),38.9(NCH2),106.7(C(2)和C(6)),118.6(d,JCP＝85.6Hz,C(1')),125.1(C(1)),130.3(d,JCP＝12.4Hz,C(3')和C(5')),133.6(d,JCP＝10.1Hz,C(2')和C(6')),134.9(d,JCP＝2.7Hz,C(4')),136.1(C(4)),145.4(C(3)和C(5)),166.3(CONH)和M E/ESI m/z(％):526(M++Na-Br,62),515(M++H-Br,30),514(M+-Br,100),277(24)。
在一个实施方式中，按照图1B中所示的四步合成策略制备AntiOxBEN3。首先，将3,4,5-三甲氧基苯甲酸(2)(500mg，2.3mmol)在4℃溶于DMF(3.9mL)，然后添加N,N-二乙基丙-2-胺(0.421ml，2.3mmol)和PyBOP(1668mg，2.3mmol)在CH2Cl2(3.9mL)中的溶液。将混合物在冰浴中保持并搅拌半小时。在此之后，加入叔丁基(6-氨基己基)氨基甲酸酯(0.529ml，2.3mmol)并将混合物加热至室温。反应在搅拌下保持持续18小时。然后，用二氯甲烷(20mL)稀释混合物并用饱和NaHCO3溶液(2×10mL)清洗。用Na2SO4干燥有机相，过滤并减压浓缩。通过快速色谱法(50％AcOEt/石油醚)纯化残余物并获得73％的得率。
在一个实施方式中，化合物叔丁基(6-(3,4,5-三甲氧基苯甲酰胺)己基)氨基甲酸酯)(9)的结构表征如下所示：1H NMR(400MHz,CDCl3):δ＝7.07(2H,s,H5,H6),6.55(1H,s,H1'),4.59(1H,s,H8'),3.91(6H,s,2×OCH3),3.88(3H,s,OCH3),3.43(2H,dd,J＝13.0,6.9Hz,H2'),3.13(1H,dd,J＝12.6,6.2Hz,H7'),1.67-1.58(2H,m,H3'),1.53-1.32(15H,m,H4',H5',H6',NHCOOC(CH 3))；和13C NMR(100MHz,CDCl3):δ＝167.3(CONH),156.3(NHCOOC(CH3)),153.3(C3,C5),140.9(C4),130.4(C1),104.5(C2,C6),79.3(NHCOOC(CH3)),61.0(OCH3),56.4(2×OCH3),40.0(C7'),39.7(C1'),30.2(C2'),29.5(C6'),28.5(NHCOOC(CH3)),26.1(C3'),25.8(C4')。
在一个实施方式中，N-(6-氨基己基)-3,4,5-三甲氧基苯甲酰胺(10)的合成如下所示：通过向9(1g，2.4mmol)在CH2Cl2(8ml)中的溶液添加TFA(4ml)进行脱保护步骤。将反应在室温下搅拌1小时。在用饱和NaHCO3溶液中和之后，分离有机相。用Na2SO4干燥有机相，过滤并减压浓缩。通过快速色谱法(10％MeOH/CH2Cl2)纯化残余物，得率98％。
在一个实施方式中，化合物N-(6-氨基己基)-3,4,5-三甲氧基苯甲酰胺(10)的结构表征如下所示：1H NMR(400MHz,MeOD):δ＝7.19(2H,s,H2,H6),3.89(6H,s,2×OCH3),3.80(3H,s,OCH3),3.39(1H,t,J＝7.1Hz,H2),2.99-2.90(2H,m,H7),1.77-1.55(4H,m,H3,H6),1.50-1.36(4H,m,H4,H5)；和13C NMR(100MHz,MeOD):δ＝169.4(CONH),154.3(C3,C5),141.8(C4'),131.1(C1),105.9(C2,C6),61.2(OCH3),56.7(2×OCH3),40.8(C7'),40.6(C1'),30.2(C6'),28.4(C3'),27.4(C4'),27.0(C5')。
在一个实施方式中，[5-(6-(3,4,5-三甲氧基苯甲酰胺)己基氨基)羰基戊基]三苯基溴化鏻(12)的合成如下所示：在4℃，向10(689mg，2.2mmol)在DMF(7.4ml)的溶液中添加N,N-二乙基丙-2-胺(0.476ml，2.7mmol)和PyBOP(1572mg，2.7mmol)在CH2Cl2(7.4mL)中的溶液。将混合物在冰浴中保持并搅拌半小时。在此之后，添加化合物11(1218，2.7mmol)，然后将反应加热至室温。将反应在搅拌下保持20小时。然后，用AcOEt(40ml)稀释混合物并用饱和NaHCO3溶液(2×10mL)清洗。用Na2SO4干燥有机相，过滤并减压浓缩。通过快速色谱法(10％MeOH/CH2Cl2)纯化残余物，得率：63％。
在一个实施方式中，化合物[5-(6-(3,4,5-三甲氧基苯甲酰胺)己基氨基)羰基戊基]三苯基溴化鏻(12)的结构表征如下所示：1H NMR(400MHz,CDCl3):δ＝7.85-7.76(3H,m,H4"),7.73-7.59(12H,m,H2",H3",H5",H6"),7.12(2H,s,H2,H6),6.93(1H,t,J＝5.7Hz,H1'),6.26(1H,t,J＝5.7Hz,H8'),3.88(6H,s,2×OCH3),3.85(1H,s,OCH3),3.39(dd,J＝13.2,6.7Hz,1H),3.19-3.05(4H,m,H7',H14'),2.14(1H,t,J＝7.1Hz,H10'),1.69-1.26(14H,m,H3',H4',H5',H6',H11',H12',H13')；和13C NMR(100MHz,CDCl3):δ＝173.3(C9'),167.2(PhCONH),153.1(C3,C5),140.4(C4),135.4(d,JCP＝2.9Hz,C4"),133.4(d,JCP＝9.9Hz,C2",C6"),130.7(d,JCP＝12.6Hz,C3",C5"),130.4(C1),117.9(d,JCP＝86.2Hz,C1"),104.5(C2,C6),60.9(OCH3),56.4(2×OCH3),39.7(C2'),39.0(C7'),36.3(C10'),30.0(C3'),29.8(C6'),28.9(d,J＝5.0Hz,C12'),26.6(C4'),25.9(C5'),24.9(C11'),22.3(d,J＝43.5Hz,C14'),22.1(d,J＝12.5Hz,C13')。
在一个实施方式中，如下合成[5-(6-(3,4,5-三羟基苯甲酰胺基)己基氨基)羰基戊基]三苯基溴化鏻(AntiOxBEN3)：将1.0g；1.4mmol溶于7.6ml无水二氯甲烷。将反应混合物在氩气下搅拌并在低于-75℃的温度下冷却。滴加三溴化硼溶液(4.3ml的在二氯甲烷中的1M溶液；4.3mmol)，并将反应在-75℃保持10分钟。一旦完成添加，将反应在-70℃保持10分钟，然后使其加热至室温，并连续搅拌12小时。此后，通过小心添加水(20mL)来终止反应。在除去水后，将所得产物溶于甲醇并用无水Na2SO4干燥、过滤和蒸发溶剂。通过快速色谱法(10％MeOH/CH2Cl2)纯化残余物并获得55％的得率。
在一个实施方式中，化合物[5-(6-(3,4,5-三羟基苯甲酰胺基)己基氨基)羰基戊基]三苯基溴化鏻(AntiOxBEN3)的结构表征如下所示：1H NMR(400MHz,MeOD):δ＝7.92-7.83(3H,m,H4"),7.82-7.70(12H,m,12H,m,H2",H3",H5",H6"),6.83(2H,s,H2,H6),3.43-3.34(2H,m,H14'),3.33-3.25(2H,m,Η2'),3.14(1H,t,J＝6.9Hz,H7'),2.15(1H,t,J＝7.0Hz,H10'),1.72-1.28(14H,m,H3',H4',H5',H6'H11',H12',H13')；13C NMR(100MHz,MeOD):δ＝176.3(C9),170.5(PhCOONH),146.5(C3,C5),138.1(C4),136.1(d,J＝2.9Hz,C4"),134.7(d,JCP＝10.0Hz,C2",C6"),131.5(d,JCP＝12.6Hz,C3",C4"),125.4(C1),119.7(d,JCP＝86.3Hz,C1"),107.8(C2,C6),40.8(C2'),40.5(C7'),36.2(C10'),30.9(C3'),30.8(C6'),30.2(C4'),29.9(C5'),27.4(d,JCP＝2.5Hz,C12'),26.1(C11'),23.1(d,JCP＝4.2Hz,C13'),22.6(d,JCP＝51.3Hz,C14')；ESI/MS m/z(％):628(M++H-Br-,38),627(M+-Br,100),556(35),547(46)；和C37H44N2O5P+(M+-Br)的ESI/HRMS m/z的理论值：627.2982；实验值：627.2970。
通过基于DPPH·、ABTS·+和GO·自由基的总抗氧化能力评价了AntiOxCIN的自由基清除活性。所有这些方法包括由于抗氧化剂使自由基(DPPH·、ABTS·+或GO·)失活所造成的吸光度降低的分光光度测定。结果用IC50表示，其定义为使自由基的量减少50％所必需的最小抗氧化剂浓度。在来自Bio Tech instruments的酶标仪(Powerwave XS MicroplateReader)中进行抗氧化测定。
在一个实施方式中，如下所示进行DPPH自由基清除活性测定：在乙醇中制备浓度不断升高(范围在0μΜ至500μΜ)的测试化合物溶液。还制备了DPPH乙醇溶液(6.85mM)，然后稀释，从而在515nm达到0.72±0.02的吸光度。将每种化合物溶液(20μL)加入至180μLDPPH·溶液，重复三次，并在45分钟内精确记录515nm的吸光度。自由基的抑制百分比基于对应于100％的自由基的空白(20μL乙醇与180μL DPPH·溶液)与测试化合物溶液之间的比较。建立剂量-响应曲线以确定IC50值。数据为三个独立实验的平均值±SEM。
在一个实施方式中，如下所示评价ABTS·+清除活性：制备浓度不断升高(范围在10μΜ至500μΜ)的测试化合物的乙醇溶液。通过将150mM过硫酸钾水溶液(163μL)添加至10mL 7mM ABTS水溶液，然后在室温下避光储存16h(最终浓度2.45mM)获得了ABTS·自由基阳离子溶液。然后，将溶液在乙醇中稀释以达到0.72±0.02的吸光度。在重复三次，将化合物(20μL)添加至ABTS·+溶液(180μL)之后，在15分钟内每分钟进行分光光度测定。自由基的抑制百分比基于对应于100％的自由基的空白(20μL乙醇与180μL ABTS·+溶液)与测试化合物溶液之间的比较。建立剂量-响应曲线以确定IC50值。数据为三个独立实验的平均值±SEM。
在一个实施方式中，如下所示评价了GO·清除活性：在乙醇中制备了浓度在10μΜ至100μΜ的测试化合物溶液。制备5mM GO·乙醇溶液并稀释至428nm下1.00±0.02的吸光度。将化合物溶液(20μL)添加至GO·溶液(180μL)，重复三次，然后在30分钟内在室温下避光测量428nm的吸光度。自由基的抑制百分比基于对应于100％的自由基的空白(20μL乙醇与180μL GO·溶液)与测试化合物溶液之间的比较。建立剂量-响应曲线以确定IC50值。数据为三个独立实验的平均值±SEM。
在一个实施方式中，通过电化学技术评价了AntiOxBEN的氧化还原和亲脂性性质。
在一个实施方式中，使用电脑控制的恒电位Autolab PGSTAT302N(MetrohmAutolab,Utrecht,Netherlands)获得电化学分析数据。通常，以50mVs-1的扫描速率采集循环伏安法(CV)数据。以4mV的跨步电压，50mV的脉冲振幅和8mVs-1的扫描速率采集微分脉冲伏安法(DPV)结果。通过4.9版General Purpose Electrochemical System(GPES)软件包监测电化学信号。在室温下，在置于Faraday筒(以最大程度减小背景噪声对分析信号的贡献)中的电化学电池中进行所有电化学实验。
在一个实施方式中，如下所示进行AntiOxBEN氧化还原性质的评价方法：通过将适当的量溶于乙醇，制备了每种化合物的储液(10mM)。在电化学电池中制备最终浓度为0.1mM的伏安工作溶液。通过将6.2mL 0.2M的磷酸氢二钾和43.8mL 0.2M的磷酸二氢钾稀释至100mL制备了pH 7.4的载体电解质(supporting electrolyte)。在由作为工作电极的玻璃化炭黑电极(GCE，d＝2mm)、铂丝反电极和饱和Ag/AgCl参比电极所组成的三电极系统中采集伏安数据。在一个实施方式中，如下所示进行AntiOxBEN亲脂性性质的评价：电化学电池为具有含有两个Ag/AgCl参比电极和两个Pt反电极(每个相中含有一个电极)的微液-液界面阵列(μΙΤΙΕS)的四电极系统。用氟硅酮密封剂(Dow Corning 730)将微孔膜密封在充满4.0mL其中添加了AntiOxBEN溶液等份的水相的玻璃杯上。然后，将膜浸入在包含在电池中的有机相中。使有机相参比溶液(2mM BTPPACI+2mM NaCl水溶液)机械稳定。载体电解质水溶液为Tris-HCl缓冲液，10mM，pH 7.0。
在一个实施方式中，通过在Bio-Tech instruments的酶标仪(Powerwave XSMicroplate Reader)中实施的菲洛嗪分光光度法评价了AntiOxBEN铁螯合性质。
在一个实施方式中，如下所示评价了AntiOxBEN铁螯合性质：在每个孔中，添加测试化合物(100μΜ)和硫酸铁(II)铵(20μΜ)在乙酸铵中的溶液，温育10min，并在562nm读取吸光度。然后，将新鲜制备的菲洛嗪溶液(5mM)加入至每个孔中(最终浓度96μΜ)。在37℃再温育10min之后，在562nm测量[Fe(菲洛嗪)3]2+复合物的吸光度。使用DMSO代替测试化合物测定空白孔。将EDTA用作参比。在100μΜ的最终浓度测试所有化合物。将第一次读数的吸光度减去最终值以消除由于测试化合物所造成的任何吸光度。数据为三个独立实验的平均值±SEM，并且表示为Fe(II)螯合的％(EDTA＝100％)。
在一个实施方式中，在大鼠肝线粒体(RLM)中进行AntiOxBEN功能性线粒体毒性谱的评价。通过组织匀浆化，然后在含有250mM蔗糖、10mM HEPES(pH 7.4)、1mM EGTA和0.1％无脂牛血清白蛋白的冰冷缓冲液中差速离心制备RLM。在获得粗线粒体制剂后，将沉淀颗粒清洗两次并在清洗缓冲液(250mM蔗糖和10mM HEPES，pH 7.4)中再悬浮。使用BSA作为标准品，通过双缩脲测定确定蛋白浓度。
在一个实施方式中，评价了线粒体AntiOxBEN吸收。
在一个实施方式中，如下所示，评价了能化RLM的AntiOxBEN线粒体吸收：将RLM(0.5mg蛋白/mL)与AntiOxBEN在37℃，在恒定搅拌下，在1mL KCl培养基(120mM KCl，10mMHEPES，pH 7.2和1mM EGTA)中温育。在存在鱼藤酮(1.5μΜ)的情况下，进行5次顺序添加1μΜ的每种AntiOxBEN来校准电极反应。然后，添加琥珀酸盐(10mM)以产生Δψ。在测定结束时，添加缬氨霉素(0.2μg/mL)以使Δψ耗散。通过测量四苯基磷鎓阳离子(TPP+)分布的离子选择电极和作为参比的Ag/AgCl2电极进行测量。通过假设0.5μL/mg蛋白的线粒体内量的AntiOxBEN从线粒体外至线粒体内介质中的消失以及对于TPP化合物的线粒体吸收的结合修正计算线粒体积累比。
评价了AntiOxBEN对LM脂质过氧化的结果。使用了两种不同的方法。
在一个实施方式中，如下所示，通过硫代巴比妥酸反应物质(TBARS)测定测量了AntiOxBEN对RLM脂质过氧化的影响：将RLM(2mg蛋白/ml)在37℃，在补充有5mM谷氨酸盐/2.5mM苹果酸盐作为底物的含有100mM KCl，10mM Tris-HCl，pH 7.6的0.8mL培养基中温育。将RLM与每种AntiOxBEN(5μΜ)温育5分钟，然后通过添加100μΜ FeSO4/500μΜ H2O2/5mM抗坏血酸，将线粒体在37℃暴露于氧化应激条件15min。在暴露于氧化应激后，添加60μL 2％(v/v)的丁基化羟基甲苯的DMSO溶液，接着添加200μL 35％(v/v)的高氯酸和200μL 1％(w/v)的硫代巴比妥酸。然后，将样品在100℃温育15min，使其冷却并将上清液转移到玻璃管中。在添加2mL MiliQ水和2mL丁-1-醇后，将样品剧烈涡旋几秒。使两相分离。在酶标仪中，对TBARS分析有机层等份(250μL)的荧光(λΕx＝515nm；λEm＝553nm)。发现谷氨酸盐/苹果酸盐能化的RLM中的TBARS背景产生是可忽略的。数据为三个独立实验的平均值±SEM，并且表示为对照的％(对照＝100％)。
在一个实施方式中，如下所示，通过第二种方法测量AntiOxBEN对RLM脂质过氧化的影响：在37℃，通过Clark氧电极监测2mg RLM在总体积1mL，使用谷氨酸盐/苹果酸盐(5mM/2.5mM)作为呼吸底物，由100mM KCl，10mM Tris-HCl，pH 7.6组成的反应介质中的氧消耗。将RLM与每种AntiOxBEN(5μΜ)温育5min，然后通过添加1mM ADP和0.1mM FeSO4(最终浓度)起始脂质过氧化过程。在37℃，O2在培养基中的饱和浓度假定为217μΜ。记录了由通过促氧化对(1mM ADP/0.1mM FeSO4)的RLM膜的过氧化所产生的氧消耗的时间依赖性变化。迹线为从6个独立实验所记录的平均值±SEM。将与添加ADP/Fe2+后较缓慢的氧消耗有关的迟滞期用于测量AntiOxBEN防止脂质过氧化的有效性。数据为6个独立实验的平均值±SEM，并且表示为对照的％(对照＝100％)。
在一个实施方式中，评价了AntiOxBEN对线粒体渗透性转换孔开放的影响。
在一个实施方式中，如下所示，测量了AntiOxBEN对线粒体渗透性转换孔开放的影响：如在540nm通过分光光度法所监测的，通过测量线粒体混悬液的光散射变化来估计线粒体膨胀。在存在RLM(1mg)的情况下，将浓度逐渐升高的AntiOxBEN(2.5-10μΜ)加入至反应介质(200mM蔗糖、1mM KH2PO4、10mM Tris(pH 7.4)、5mM琥珀酸盐和10μΜEGTA，补充有1.5μΜ鱼藤酮)，并使其在测定前温育5min。通过添加适合浓度的Ca2+(15-50μΜ)引发实验，并每天滴定。加入作为PTP脱敏剂的环孢菌素A(CsA)以显示mPTP打开。连续搅拌反应并将温度保持在37℃。数据为3个独立实验的平均值±SEM并且表示为540nm下的Δ吸光度。
在一个实施方式中，评价了AntiOxCIN对线粒体呼吸的影响。
在一个实施方式中，如下所示进行AntiOxBEN对线粒体呼吸的影响的评价：在37℃，在具有磁力搅拌的1mL恒温水夹套箱中，通过连接到适合的记录仪上的Clark型氧电极，通过极谱法评价分离的RLM的呼吸。标准呼吸介质由130mM蔗糖、50mM KCl、5mM KH2PO4、5mMHEPES(pH 7.3)和10μΜEGTA组成。将浓度不断升高的AntiOxBEN(2.5-10μΜ)加入至含有呼吸底物谷氨酸盐/苹果酸盐(分别为10mM和5mM)或琥珀酸盐(5mM)和RLM(1mg)的反应介质中，并在测定前使其温育5min。在与AntiOxBEN的5min温育时间期间，将状态2认为是呼吸。为了引起状态3呼吸，加入125nmol ADP(使用谷氨酸盐/苹果酸盐)或75nmol ADP(使用琥珀酸盐)。在ADP磷酸化结束后，确定状态4。连续添加寡霉素(2μg/ml)抑制ATP合酶并引起寡霉素抑制呼吸状态。最终，加入1μΜ FCCP以引起解偶联呼吸。对于对照实验，使用谷氨酸盐-苹果酸盐或者琥珀酸盐作为呼吸底物，RCR分别为7.3±0.6和4.1±0.3。使用相同呼吸底物，ADP/O指数分别为2.6±0.1和1.5±0.1。数据为7个独立实验的平均值±SEM。
在一个实施方式中，评价了AntiOxBEN对跨膜电势(Δψ)的影响。
在一个实施方式中，如下所示，进行了AntiOxBEN对线粒体跨膜电势(Δψ)的影响的评价：通过评价番红(5μΜ)的荧光变化估计线粒体跨膜电势(Δψ)并在以495和586nm的激发和发射波长，5nm的狭缝宽度运行的荧光分光光度计上记录。将浓度不断升高的AntiOxBEN(2.5-10μΜ)加入至含有呼吸底物谷氨酸盐/苹果酸盐(分别为5mM和2.5mM)或琥珀酸盐(5mM)和RLM(0.5mg，最终体积2mL)的反应介质(200mM蔗糖，1mM KH2PO4，10mM Tris(pH 7.4)和10μΜEGTA)中，并在引发测定前，在25℃温育5min。在该测定中，番红(5μΜ)和ADP(25nmol)分别用于引发测定和引起去极化。然后，在所有实验结束时，添加1μΜ FCCP以使线粒体去极化。使用当RLM在含有200mM蔗糖，1mM NaH2PO4，10mM Tris(pH 7.4)和10μΜEGTA且补充有0.4μg缬氨霉素的无K+反应介质中温育时所获得的标准曲线计算Δψ。发现在标准和无K+介质中，Δψ所引起的番红荧光变化的程度类似。“复极化”对应于在所添加的ADP完全磷酸化之后，膜电位的恢复。迟滞期反映了使所添加的ADP磷酸化所需的时间。当分别使用谷氨酸盐/苹果酸盐或琥珀酸盐时，分离的RLM显示出Δψ≈226mV和Δψ≈202mV(内部负电)。数据为5个独立实验的平均值±SEM。
在一个实施方式中，在人肝细胞癌HepG2细胞中评价了AntiOxBEN的细胞毒性谱。在由补充有丙酮酸钠(0.11g/L)、碳酸氢钠(1.8g/L)和10％胎牛血清(FBS)和1％抗生素青霉素-链霉素100×溶液的Dulbecco改良的伊格尔培养基(DMEM；D5648)组成的高葡萄糖培养基中培养人肝细胞癌HepG2细胞。将细胞保持在37℃，在具有5％CO2的加湿温育箱中。在处理之前，以4×104个细胞/毫升的密度接种HepG2细胞并使其生长24小时。
在一个实施方式中，如下所示进行细胞毒性筛选：将细胞置于48孔板(2×104个细胞/500μL)，然后在48小时期间，与浓度范围在25μΜ至500μΜ的AntiOxBEN温育。在温育后，基于细胞蛋白质含量测量，将磺酰罗丹明B(SRB)测定用于细胞密度确定。简要地，在温育后，除去培养基并用PBS(1×)漂洗孔。通过添加1％的乙酸在100％甲醇中的溶液，将细胞在-20℃固定至少2小时。随后，丢弃固定溶液，并将板在烘箱中，在37℃干燥。添加250微升0.5％的SRB在1％乙酸中的溶液，并在37℃温育1h。然后，用1％的乙酸水溶液清洗孔并干燥。然后，添加500μl Tris(pH 10)，并将板搅拌15min。最终，将200μl每种上清液转移至96孔板并在540nm测量光密度。数据为4个独立实验的平均值±SEM，并将结果表示为对照的百分比(对照＝100％)，对照表示在各个时间点没有任何处理的细胞密度。
在一个实施方式中，如下所示，分析所有生物数据：在GraphPad Prism 5.0软件(GraphPad Software,Inc.)中，所有结果表示为所指明数目的实验的平均值±SEM。对于两个平均值的比较，通过Student’s t检验并且通过具有Dunnet多重比较事后检验的单因素ANOVA来分析数据。最后一种检验用于比较具有一个自变量的大于2个组。以*P<0.05，**P<0.01，***P<0.0005，****P<0.0001满足显著性。
不应以任何方式将本发明公开视为受限于所述实施方式，并且本领域的常规技术人员将预见到对其进行改变的多种可能性。
上述实施方式是可组合的。以下权利要求进一步描述了本发明公开的具体实施方式。
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1.一种化合物，所述化合物为6-(3,4-二羟基苯甲酰胺基)己基三苯基溴化鏻或6-(3,4,5-三羟基苯甲酰胺基)己基三苯基溴化鏻或5-(6-(3,4,5-三羟基苯甲酰胺基)己基氨基)羰基戊基]三苯基溴化鏻。
2.根据权利要求1所述的化合物，用于在预防或抑制与线粒体紊乱有关的症状或者与线粒体功能障碍或线粒体疾病相关病况有关的症状中使用。
3.根据权利要求2所述的化合物，其中所述线粒体紊乱为选自由以下各项组成的组的紊乱：神经退行性疾病、硬皮病、肝脏铁过载病、肝脏铜过载病、脱发、人不育、急性胰炎、纤维性肌痛；或者癌症，其中所述癌症为肝癌、胰腺癌或胆管癌；非酒精性脂肪肝病，其中所述非酒精性脂肪肝病为非酒精性脂肪性肝炎或者肝硬化；肾病，其中所述肾病为肾癌或肾衰竭；或者瘤形成。
4.根据权利要求1所述的化合物，用于作为抗微生物剂使用；或者作为美容剂或补充剂或营养剂的活性成分；在多能细胞培养物的维持中作为细胞培养物的补充剂。
5.根据权利要求1所述的化合物，用于作为体育锻炼后的肌肉保护剂或者肌肉恢复剂使用，或者在成像研究中作为探针使用。
6.根据权利要求1所述的化合物，用于作为消毒剂使用；或在多能细胞培养物的维持中作为生长培养基化合物。
7.根据权利要求1所述的化合物，用于在监测线粒体的成像研究中作为探针使用。
8.根据权利要求1所述的化合物，用作抗衰老剂或抗皱皮肤护理产品的活性成分。
9.一种组合物，包含权利要求1-8中任一项所述的化合物中的任一种，以及药学上可接受的载体、佐剂、赋形剂、稀释剂或它们的混合物，其中所述药学上可接受的载体选自以下列表：盐水、阿拉伯树胶、明胶、淀粉糊、滑石、角蛋白、胶体二氧化硅、脲或它们的混合物；所述佐剂选自以下列表：水包油乳剂佐剂、铝佐剂、TLR-4配体、皂苷以及它们的混合物；所述赋形剂选自以下列表：葡萄糖、乳糖、蔗糖、单硬脂酸甘油酯、氯化钠、甘油、丙二醇、水、乙醇或它们的混合物。
10.根据权利要求9所述的组合物，用于在治疗或预防神经退行性疾病、非酒精性脂肪肝病、瘤形成、肾病、硬皮病、肝脏铁过载病、肝脏铜过载病、脱发、人不育、急性胰炎或纤维性肌痛的方法中使用，其中所述组合物以每日剂量施用，其中所述每日剂量为20mg/天或10mg/天。
11.根据权利要求9所述的组合物，其中所述组合物为药物组合物或美容组合物。
12.一种纳米载体或脂质体，包含权利要求1-8中任一项所述的化合物或权利要求9-10中任一项所述的组合物。
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