CN102459291A - 神经保护性化合物和它们的应用 - Google Patents

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Abstract

作为哺乳动物脑中神经保护剂的夹竹桃麻素衍生物化合物、活性药物成分、剂型及其使用方法。

Description

神经保护性化合物和它们的应用
相关申请的交叉引用
本申请要求2009年4月27日提交的美国序列号61/172,842的优先权，其通过引用全文纳入本文。
政府权益的声明
本发明受到美国国家卫生研究院的资助，基金或合同号如下所示：R01NS039958和R01 NS04094。美国政府享有本发明的某些权利。
发明背景
线粒体疾病的实验模型通常涉及抑制参与电子传递链的酶(1)。还有报道说许多神经变性疾病与线粒体机能障碍有关(2-5)。已在阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病和葛雷克氏病检测到线粒体呼吸链的复合体I、II和IV中有缺陷(6-9)。
数种证据暗示帕金森病(PD)是自由基疾病，其涉及线粒体机能障碍从而导致无法产生能量(10-11)。氧化损伤、多巴胺消耗、蛋白质硝化、铁累积、蛋白质凝聚和凋亡的增加是帕金森病的特征性标志(12-14)。
许多抗氧化剂和铁螯合剂已用于帕金森病动物模型和患者，但成功寥寥(15-16)。夹竹桃麻素(Apocynin)是天然产生的甲氧基取代邻苯二酚，其显示抑制NADPH-氧化酶(17)。夹竹桃麻素的结构如下所示：
还有报道说夹竹桃麻素通过过氧化酶氧化形成二聚体(17)，例如以下所示：
Figure BPA00001491259100021
虽然参考文献已报道的各种夹竹桃麻素衍生物的用途(2-5)，但它们作为神经变性疾病，例如帕金森病的治疗性药物的潜能还未见确定。
发明概述
本发明一方面是以下结构所示的夹竹桃麻素衍生物或其前药、溶剂化物或水合物：
Figure BPA00001491259100022
式中，R1是C＝O、(CH＝CH)或CH2，R2是O、NH或COO，R3是H、COCH3或CO(CH2)mCH3，X-是Cl-、Br-或I-，n是2-16，m是1-16。本文所用的夹竹桃麻素衍生物化合物可以是活性药物成分。
本发明的另一方面是包含结构1所示夹竹桃麻素衍生物和药学上合适的载体系统的药物剂型。
本发明的另一方面是结构1所示的药物剂型，其中所述剂型包括口服、注射、输注、吸入、透皮或植入物剂型。
本发明的另一方面是增加哺乳动物脑中多巴胺含量的方法，包括给予治疗有效量的结构1所示夹竹桃麻素衍生物。
本发明的另一方面是增加哺乳动物脑细胞的线粒体中二羟基苯乙酸(dopac)含量的方法，包括给予治疗有效量的结构1所示夹竹桃麻素衍生物。
本发明的另一方面是以下任一结构所示夹竹桃麻素衍生物或其前药、溶剂化物或水合物：
Figure BPA00001491259100041
本发明的另一方面是包含结构2-8中至少一种和药学上合适的载体系统的药物剂型。
本发明的另一方面是结构2-8中至少一种的药物剂型，其中所述剂型包括口服、注射、输注、吸入、透皮或植入物剂型。
本发明的另一方面是增加哺乳动物脑中多巴胺含量的方法，包括给予治疗有效量的结构2-8中至少一种。
本发明的另一方面是增加哺乳动物脑细胞的线粒体中二羟基苯乙酸含量的方法，包括给予治疗有效量的结构2-8中至少一种。
在涉及增加哺乳动物脑中多巴胺含量或哺乳动物脑细胞的线粒体中二羟基苯乙酸含量的以上方法的一方面，口服给予结构1-8。
本发明的另一方面是以下结构所示夹竹桃麻素衍生物或其前药、盐、溶剂化物或水合物：
Figure BPA00001491259100051
式中，R1是C＝O、CH2或(CH＝CH)，R2是O、NH或COO，R3是H、COCH3或CO(CH2)mCH3，n是2-16，m是1-16。
本发明的另一方面是包含结构9和药学上合适的载体系统的药物剂型。
本发明的另一方面是结构9的药物剂型，其中所述剂型包括口服、注射、输注、吸入、透皮或植入物剂型。
本发明的另一方面是增加哺乳动物脑中多巴胺含量的方法，包括给予治疗有效量的结构9。
本文所述任何方法的另一方面是口服给予结构9。
本发明的另一方面是增加哺乳动物脑细胞的线粒体中二羟基苯乙酸含量的方法，包括给予治疗有效量的结构9。
本发明的另一方面是以下结构所示夹竹桃麻素衍生物或其前药、溶剂化物或水合物：
式中，R1是H、COCH3或CO(CH2)mCH3，R2是O或NH，X-是Cl-、Br-或I-，n是2-16，m是1-16。
本发明的另一方面是结构10所示夹竹桃麻素衍生物或其前药、盐、溶剂化物或水合物，式中，R1是H、COCH3或CO(CH2)mCH3，R2是O或NH，X-是Br-，n是2-16，m是1-16。
在本发明的另一方面，药物剂型包含结构10、其衍生物和药学上合适的载体系统中的至少一种。
本发明的另一方面是结构10或其衍生物的药物剂型，其中所述剂型包括口服、注射、输注、吸入、透皮或植入物剂型。
本发明的另一方面是增加哺乳动物脑中多巴胺含量的方法，包括给予治疗有效量的结构10或其衍生物。
本文所述任何方法的另一方面是口服给予结构10或其衍生物。
本发明的另一方面是增加哺乳动物脑细胞的线粒体中二羟基苯乙酸含量的方法，包括给予治疗有效量的结构10或其衍生物。
本发明的另一方面是以下结构所示夹竹桃麻素衍生物或其前药、溶剂化物或水合物：
Figure BPA00001491259100071
式中，n是1-16。
本发明的另一方面是包含结构11和药学上合适的载体系统的药物剂型。
本发明的另一方面是结构11的药物剂型，其中所述剂型包括口服、注射、输注、吸入、透皮或植入物剂型。
本发明的另一方面是增加哺乳动物脑中多巴胺含量的方法，包括给予治疗有效量的结构11。
本发明的另一方面是增加哺乳动物脑细胞的线粒体中二羟基苯乙酸含量的方法，包括给予治疗有效量的结构11。
本文所述任何方法的另一方面是口服给予结构11。
本发明的另一方面是以下结构所示夹竹桃麻素衍生物或其前药、盐、溶剂化物或水合物：
Figure BPA00001491259100072
本发明的另一方面是包含结构12和药学上合适的载体系统的药物剂型。
本发明的另一方面是结构12的药物剂型，其中所述剂型包括口服、注射、输注、吸入、透皮或植入物剂型。
本发明的另一方面是增加哺乳动物脑中多巴胺含量的方法，包括给予治疗有效量的结构12。
本发明的另一方面是增加哺乳动物脑细胞的线粒体中二羟基苯乙酸含量的方法，包括给予治疗有效量的结构12。
本文所述任何方法的另一方面是口服给予结构12。
本发明的另一方面是减轻哺乳动物中脑炎症或其影响的方法，包括给予该哺乳动物有效量的夹竹桃麻素衍生物，从而相比于具有脑炎症的未治疗动物减轻脑炎症或其影响。在该方法中，夹竹桃麻素衍生物包括夹竹桃麻素、二夹竹桃麻素、二夹竹桃麻素-乙酸酯、二夹竹桃麻素-二乙酸酯、线粒体(mito-)夹竹桃麻素、线粒体-二夹竹桃麻素、夹竹桃麻素-乙酸酯、线粒体-夹竹桃麻素-乙酸酯、线粒体-二夹竹桃麻素-乙酸酯和线粒体-二夹竹桃麻素-二乙酸酯中的至少一种。
本发明的另一方面是防止患者中脑炎症相关的病理生理性神经递质缺陷的方法，包括给予该患者有效量的夹竹桃麻素衍生物以防止病理生理性神经递质缺陷。在该方法中，夹竹桃麻素衍生物包括夹竹桃麻素、二夹竹桃麻素、二夹竹桃麻素-乙酸酯、二夹竹桃麻素-二乙酸酯、线粒体(mito-)夹竹桃麻素、线粒体-二夹竹桃麻素、夹竹桃麻素-乙酸酯、线粒体-夹竹桃麻素-乙酸酯、线粒体-二夹竹桃麻素-乙酸酯和线粒体-二夹竹桃麻素-二乙酸酯中的至少一种。
本发明的另一方面是防止帕金森病患者的大脑中多巴胺水平降低的方法，包括给予该患者有效量的夹竹桃麻素衍生物以防止多巴胺水平降低。在该方法中，夹竹桃麻素衍生物包括夹竹桃麻素、二夹竹桃麻素、二夹竹桃麻素-乙酸酯、二夹竹桃麻素-二乙酸酯、线粒体(mito-)夹竹桃麻素、线粒体-二夹竹桃麻素、夹竹桃麻素-乙酸酯、线粒体-夹竹桃麻素-乙酸酯、线粒体-二夹竹桃麻素-乙酸酯和线粒体-二夹竹桃麻素-二乙酸酯中的至少一种。
本发明的另一方面是延迟哺乳动物中神经变性的方法，包括给予该哺乳动物有效量的夹竹桃麻素衍生物，其中所述神经变性由至少一种以下疾病所致：神经炎症、亨廷顿病、帕金森病、肌萎缩性侧索硬化症、多发性硬化症和阿尔茨海默病，其中延迟神经变性推迟了与至少一种以下疾病相关的疾病症状的发作或减轻其影响：神经炎症、亨廷顿病、帕金森病、肌萎缩性侧索硬化症、多发性硬化症和阿尔茨海默病。在该方法中，夹竹桃麻素衍生物包括夹竹桃麻素、二夹竹桃麻素、二夹竹桃麻素-乙酸酯、二夹竹桃麻素-二乙酸酯、线粒体(mito-)夹竹桃麻素、线粒体-二夹竹桃麻素、夹竹桃麻素-乙酸酯、线粒体-夹竹桃麻素-乙酸酯、线粒体-二夹竹桃麻素-乙酸酯和线粒体-二夹竹桃麻素-二乙酸酯中的至少一种。
本发明的另一方面是延长患有神经变性疾病的哺乳动物的运动功能的方法，包括给予该哺乳动物有效量的夹竹桃麻素衍生物以延长该哺乳动物的运动功能。在该方法中，夹竹桃麻素衍生物包括夹竹桃麻素、二夹竹桃麻素、二夹竹桃麻素-乙酸酯、二夹竹桃麻素-二乙酸酯、线粒体(mito-)夹竹桃麻素、线粒体-二夹竹桃麻素、夹竹桃麻素-乙酸酯、线粒体-夹竹桃麻素-乙酸酯、线粒体-二夹竹桃麻素-乙酸酯和线粒体-二夹竹桃麻素-二乙酸酯中的至少一种。
本文所用的口服剂型包括药学上合适的口服载体系统，注射剂型包括药学上合适的注射载体系统，输注剂型包括药学上合适的输注载体系统，吸入剂型包括药学上合适的吸入载体系统(和/或药学上合适的吸入装置)，透皮剂型包括药学上合适的透皮载体系统(和/或药学上合适的透皮装置)。此外，植入物剂型包括将植入物临时或永久附着于患者内的医学装置，包括，例如涂布、浸渍或填充有夹竹桃麻素衍生物或分散有夹竹桃麻素衍生物的支架、导管、分流器(shunt)、电极、电学器件、储器或医学工具。
附图简述
图1显示了单胺氧化酶催化MPTP经中间体MPDP+(未显示)向MPP+的氧化；
图2是显示大的负膜电位促进靶向阳离子抗氧化剂在线粒体中累积的真核细胞示意图；
图3显示了线粒体-夹竹桃麻素乙酸酯和线粒体-夹竹桃麻素的一系列合成反应；
图4显示了两幅柱状图，比较了亚慢性MPTP小鼠模型中线粒体-夹竹桃麻素和夹竹桃麻素对纹状体多巴胺(A)和二羟基苯乙酸(B)水平的作用；
图5显示了通过黑质中小神经胶质细胞激活(IBA-1表达)和星形胶质细胞激活(GFAP)检测到二夹竹桃麻素在PD的MPTP小鼠模型中对神经炎症的保护作用。黑质组织切片作IBA-1(图A，10x放大率和图B，30x放大率)和GFAP(图C，10x放大率和图D，30x放大率)免疫标记；
图6显示MPTP-处理小鼠中二夹竹桃麻素减弱黑质中gp91phox(NADPH氧化酶-介导炎性应答的标记物)的表达。对黑质组织作蛋白质印迹分析以检查gp91phox(图A)表达水平，或将其切片并通过DAB-免疫染色作gp91phox免疫标记(图B，10x放大率)和作gp91phox及IBA-1双重标记(图C，30x放大率)；
图7显示二夹竹桃麻素减弱小鼠黑质中MPTP诱导的3-硝基酪氨酸(3-NT：iNOS/NOS2激活的标记物)表达。黑质组织作蛋白质印迹分析以检查3-硝基酪氨酸的表达水平(图A)或将其切片并通过DAB-免疫染色作3-硝基酪氨酸(3-NT)免疫标记(图B，10x放大率)和作3-NT及IBA-1双重标记(图C，60x放大率)；
图8显示二夹竹桃麻素抑制MPTP-中毒小鼠的黑质中的4-HNE(氧化损伤的标记物)水平。黑质组织作蛋白质印迹分析以检查4-羟基壬烯醇(4-HNE)的表达水平(图A)或将其切片并作4-HNE免疫标记(图B，10x放大率)和作3-HNE及IBA-1双重标记(图C，60x放大率)；
图9显示二夹竹桃麻素的口服治疗减弱MPTP所致黑质中iNOS的表达增加。黑质组织作蛋白质印迹分析以检查诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的表达水平(图A)或将其切片并作iNOS免疫标记(图B，30x放大率)；
图10显示二夹竹桃麻素抑制黑质中MPTP-诱导的神经胶质细胞表达。黑质组织切片作IBA-1和iNOS(图A，30x放大率)及GFAP和iNOS(图B，30x放大率)双重标记；
图11显示二夹竹桃麻素改善MPTP-中毒小鼠中的运动功能。利用VersaMax分析仪和转杆(rotarod)检测运动活性[小鼠的运动轨迹(Versaplot)(图A)；水平运动(图B)；垂直运动(图C)；在转杆上花的时间(图D)]。数据是平均值+SEM，n＝每组10只。*＝与对照相比p＜0.001；#＝与MPTP处理相比p＜0.01；**＝与MPTP处理相比p＜0.05；
图12显示二夹竹桃麻素防止小鼠纹状体中MPTP-诱导的多巴胺及其代谢物丧失。通过HPLC检测纹状体的多巴胺(图A)、DOPAC(图B)和HVA(图C)。数据是平均值+SEM，n＝每组10只。*＝与对照相比p＜0.001；**＝与MPTP处理相比p＜0.01；
图13显示二夹竹桃麻素对MPTP-诱导黑质纹状体多巴胺能神经元丧失的神经保护作用。对纹状体和黑质组织作蛋白质印迹分析以检查纹状体和黑质中酪氨酸羟化酶(TH)的表达水平(图1)。在纹状体(图B，放大率是x2)和黑质(图C，2x放大率和图D，10x放大率)中作酪氨酸羟化酶-DAB免疫染色。CN：尾状核，Pu：壳，GP：苍白球，SNc：黑质致密部，SNr：网状黑质(Substantianigra reticularis)，SNl：黑质侧部(Substantia nigra lateralis)；
图14显示通过酪氨酸羟化酶(TH)和FLUORO-JADE B(FJB)双重标记检测到二夹竹桃麻素在PD的MPTP模型中保护神经元变性。对黑质切片作酪氨酸羟化酶(TH)和FJB双重标记物染色。用Hoechst 33442染色核；
图15A显示二夹竹桃麻素能减弱BV2小胶质细胞模型中LPS-诱导的硝化应激(nitrative stress)。用不同浓度的二夹竹桃麻素处理BV-2细胞，孵育30分钟，然后加入1μg/ml LPS。然后利用Griess试剂评估细胞的亚硝酸盐水平。数值是平均值±SEM(n＝6)；
图15B显示图15A所示数据的二夹竹桃麻素(Diapo)剂量应答曲线，标出了二夹竹桃麻素的EC50。按照log剂量换算数据，按照最高和最低浓度标准化，然后根据非线性回归曲线作图；
图16A显示夹竹桃麻素能减弱BV2小胶质细胞模型中LPS-诱导的硝化应激(nitrative stress)。用不同浓度的夹竹桃麻素处理BV-2细胞，孵育30分钟，然后加入1μg/ml LPS。然后利用Griess试剂评估细胞的亚硝酸盐水平。数值是平均值±SEM(n＝6)；
图16B显示图16A所示数据的夹竹桃麻素剂量应答曲线，标出了二夹竹桃麻素的EC50。按照log剂量换算数据，按照最高和最低浓度标准化，然后根据非线性回归曲线作图。利用GRAPHPAD PRISM
Figure BPA00001491259100112
软件计算EC50。
图17比较了二夹竹桃麻素和夹竹桃麻素对BV2小胶质细胞模型中LPS-诱导硝化应激的作用。用二夹竹桃麻素(10μM)和夹竹桃麻素(100μM)预处理BV-2细胞30分钟，然后用LPS(1μg/ml)刺激24小时，随后通过Griess方法检测亚硝酸盐水平。数值是平均对照百分数±SEM(n＝6)；
图18比较了二夹竹桃麻素(diapo)和夹竹桃麻素对小鼠原代小胶质细胞中LPS-诱导硝化应激的作用。用二夹竹桃麻素(10μM)和夹竹桃麻素(100μM)预处理小鼠原代小胶质细胞30分钟，然后用LPS(1μg/ml)刺激24小时，随后通过Griess方法检测亚硝酸盐水平。数值是平均对照百分数±SEM(n＝7)；
图19A显示二夹竹桃麻素(diapo)抑制原代小鼠小胶质细胞中LPS-诱导的IL-1β释放。用二夹竹桃麻素(10μM)和夹竹桃麻素(100μM)预处理小鼠原代小胶质细胞30分钟，然后用LPS刺激(1μg/ml，24小时)，随后检测IL-1β水平。数值是平均值pg/ml±SEM(n＝4)；
图19B显示二夹竹桃麻素(diapo)抑制原代小鼠小胶质细胞中LPS-诱导的IL-10释放。用二夹竹桃麻素(10μM)和夹竹桃麻素(100μM)预处理小鼠原代小胶质细胞30分钟，然后用LPS(1μg/ml)刺激24小时，随后检测IL-10水平。数值是平均值pg/ml±SEM(n＝4)；
图19C显示二夹竹桃麻素(diapo)抑制原代小鼠小胶质细胞中LPS-诱导的IL-12释放。用二夹竹桃麻素(10μM)和夹竹桃麻素(100μM)预处理小鼠原代小胶质细胞30分钟，然后用LPS(1μg/ml)刺激24小时，随后检测IL-12水平。数值是平均值pg/ml±SEM(n＝4)；
图19D显示二夹竹桃麻素(diapo)抑制原代小鼠小胶质细胞中LPS-诱导的TNF-α释放。用二夹竹桃麻素(10μM)和夹竹桃麻素(100μM)预处理小鼠原代小胶质细胞30分钟，然后用LPS(1μg/ml)刺激24小时，随后检测TNF-α水平。数值是平均值pg/ml±SEM(n＝4)；和
图20显示二夹竹桃麻素(diapo)抑制BV2小胶质细胞中LPS-诱导的NOS-2和p67phox表达。用二夹竹桃麻素(10μM)预处理BV2小胶质细胞30分钟，然后用LPS(1μg/ml)刺激24小时，随后通过蛋白质印迹检测NOS-2和p67phox水平。β-肌动蛋白用作加载对照。
图21显示二夹竹桃麻素(diapo)二乙酸酯(diapo diace)抑制BV2小胶质细胞中LPS-诱导的NOS-2。用二夹竹桃麻素二乙酸酯预处理细胞30分钟，然后加入LPS(1μg/ml)。所有处理从加入LPS开始在37℃孵育24小时。比较各处理与对照相比的亚硝酸盐水平百分数。
发明详述
多巴胺能(产生多巴胺)神经元细胞的死因未知。提出的机理包括遗传突变、慢性炎症和接触环境毒素。有人假设炎性介质(炎症期间过度产生的分子)造成脑中固有免疫细胞(称为小胶质细胞)活化导致神经元死亡或变性(18-19)。该假设的证据来自PD患者大脑的尸检研究，显示细胞毒性促炎介质水平升高(18)。偶然接触MPTP(非法麻醉剂的污染性副产物)后产生PD的患者也显示黑质中有激活的小胶质细胞(20)。在PD患者的脑脊液中也检测到促炎介质(TNF-α、IL-1、IL-6)(18)。激活小胶质细胞的促炎介质包括细胞因子，例如肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)和干扰素γ，趋化因子(MCP-1)，活性氧中间体(ROS)和活性氮中间体(RNS)，包括一氧化氮和衍生自一氧化氮及过氧化物的氧化剂，氧化酶，例如NADPH氧化酶、环加氧酶-2(COX-2)、髓过氧化物酶和前列腺素。氧化酶(例如，COX-2和诱导型NOS)可能由促炎细胞因子刺激。还在PD的动物模型中重现了相似的促炎改变和神经炎性过程(18)。
神经保护性药物可大致分类为以下功能的药剂，能减轻大脑炎症的影响，包括大脑中的线粒体氧化和硝化损伤，增强和/或防止神经递质水平，例如神经元多巴胺水平的降低或其中的缺陷，或防止神经炎症相关大脑过程中的小胶质细胞和星形胶质细胞激活并抑制细胞因子释放。因此，神经保护性药物可抑制或延迟神经变性，进而可推迟神经变性疾病症状的发作或减轻其影响。例如，与传统治疗相比，给予神经保护剂可延长患神经变性疾病的动物的运动功能，从而使得它们长期保持正常或接近正常的功能。目前正在研究逆转其它神经变性疾病(例如，PD、阿尔茨海默病)的神经炎症的抗炎方案(21-23)。鉴于许多神经变性疾病与线粒体机能障碍之间明显的关联性(2-14)，靶向线粒体的神经保护性化合物证明是尤其有用的。
传统ROS解毒探针(例如维生素E、坦波尔(tempol)、泛醌)不在线粒体内显著累积，因此它们捕捉线粒体ROS(超氧化物、过氧化自由基)的能力有限。据报道，偶联于三苯基鏻阳离子的抗氧化剂(例如，维生素E和辅酶-Q)在线粒体内累积(24-26)。质膜电位(30-60mV，内部为负)促进此类亲脂性、膜可透过性阳离子从胞外空间摄取入细胞。如图2所示，穿过线粒体内膜的150-180mV的大膜电位(内部为负)使得胞内空间的亲脂性阳离子重现分布在线粒体内。(27)。从方程式，膜电位(mV)＝61.5log10(C/Co)可以预计膜电位中每有61.5mV差异，亲脂性阳离子的线粒体浓度增加10-倍，从而导致线粒体中阳离子浓度比胞质中高100-到500-倍(27)。
本发明的一个重要方面是采用亲脂性阳离子方法发现遭受氧化应激的神经元中的线粒体靶向硝基氧能恢复经历氧化应激的那些神经元中的多巴胺水平。已利用烷基膦硝基氧检测跨膜电位和膜动力学特性(28)。最近，有报道说烷基膦硝基氧(例如，线粒体-CP)可靶向于线粒体(29)。线粒体-CP选择性摄取入线粒体抑制内皮细胞中过氧化物-诱导的铁信号传导、氧化损伤和凋亡。
隔开循环血液与脑脊液的血脑屏障是药物对中枢神经系统的潜在有益作用的难点。脑脊液的直接治疗充满困难，药物引入循环系统时常可能有并发症。因此，更需要能有效穿过血脑屏障来治疗中枢神经系统的化合物。为此，如果适当设计或包埋在脂质体中，某些药物可穿过血脑屏障。例如，给治疗性分子加上长链烃部分能转运穿过血脑屏障。合适的例子包括二乙酸酯、柠檬酸酯、马来酸酯或戊二酸酯衍生物和长链烃取代基。不想局限于理论，但夹竹桃麻素衍生物可能通过特定受体吸收入大脑(例如，多巴胺能受体、氨基酸和葡萄糖转运蛋白)。
高浓度的夹竹桃麻素(植物衍生的抗氧化剂)已在SOD1突变型ALS小鼠模型中证明能保护神经元以免损伤(5)。本发明预计线粒体靶向的夹竹桃麻素能有效减轻线粒体损伤。此外，本发明预计能利用夹竹桃麻素衍生物抵御炎症，包括神经炎症以及亨廷顿病、帕金森病、肌萎缩性侧索硬化症、多发性硬化症、阿尔茨海默病、中风和疾病和/或促进或导致氧化相关后遗症的损伤。
夹竹桃麻素衍生物包括夹竹桃麻素及其功能衍生物。例如，夹竹桃麻素衍生物包括二夹竹桃麻素、线粒体-夹竹桃麻素、线粒体-二夹竹桃麻素、夹竹桃麻素-乙酸酯、夹竹桃麻素-二乙酸酯、线粒体-夹竹桃麻素-乙酸酯、线粒体-夹竹桃麻素-二乙酸酯、线粒体-二夹竹桃麻素-乙酸酯和线粒体-二夹竹桃麻素-二乙酸酯，如本文它处说明的。其它夹竹桃麻素衍生物包括乙酸酯、二乙酸酯、戊二酸氢酯和己二酸氢酯，例如二夹竹桃麻素二乙酸酯、戊二酸氢酯和己二酸氢酯。在另一实施方式中，考虑了二夹竹桃麻素和衍生物的纳米颗粒。
帕金森病的动物模型.流行病学研究强烈提示作为线粒体毒素的杀虫剂与帕金森病的病因之间有关系(10)。一种常用的帕金森病动物模型是1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶(MPTP)模型(30-31)。MPTP首先作为非法麻醉剂的污染物被发现，有报道说其在实验动物中诱导帕金森病样症状(32-34)。
虽然PD的MPTP模型不同于初发性PD，但许多生物化学和病理性特性相似(34-40)。选择性破坏大脑黑质中的多巴胺能神经元也已见诸报道(38)。
测定到MPTP的最终毒性代谢物是1-甲基-4-苯基吡啶
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(MPP+)(参见图1)，其由表达多巴胺转运蛋白(DAT)的神经元选择性累积，包括黑质中的多巴胺能神经元。MPP+通过抑制电子传递链的复合物I活性而破坏线粒体功能(41-43)。全身性抑制复合物I显示导致帕金森综合征，从而再现PD的特征(44-46)。此外，MPTP导致线粒体复合物I活性降低、增加活性氧中间体(ROS)、消耗抗氧化剂并激活凋亡信号传导，包括促分裂原活化的蛋白(MAP)激酶(31、42、47和48)。
MPTP C57黑色小鼠模型可接受作为最佳的临床前PD模型(49)。虽然常用MPTP猴模型检验新PD疗法的效力，但MPTP小鼠模型是检测新疗法效力的可靠的、成本节约的模型。
虽然已报道了各种MPTP治疗方案，但充分了解的基本上是两种给药方案。MPTP的急性模型(腹膜内给予15mg/kg MPTP，4次，2小时间隔)诱导稳定和可高度再现的多巴胺缺陷，但也明显诱导严重毒性。亚慢性或亚急性模型诱导实质性凋亡细胞死亡而没有显著的坏死细胞死亡，采用的MPTP剂量范围可以在18-30mg/kg。在亚慢性模型中，小鼠接受MPTP(20毫克/千克体重，每日一次，5天)。最后，慢性MPTP小鼠模型模拟PD，其中黑质纹状体多巴胺能神经元缓慢而渐进地破坏，与初发性PD中发生的一样。在慢性模型中，给予小鼠MPTP(25mg/kg，每周两次，腹膜内)和丙磺舒(250mg/kg)以阻止排泄5周。
整体上，本发明涉及新的化学实体(NCE)作为活性药物成分(API)，其药物组合物、剂型和制备方法。本发明还包括利用API、其药物组合物和剂型，通过增加哺乳动物脑和线粒体中多巴胺和二羟基苯乙酸含量而作为神经保护剂的方法。本发明的NCE和API包括夹竹桃麻素衍生物，例如线粒体-夹竹桃麻素衍生物化合物和二聚体线粒体-夹竹桃麻素衍生物化合物。
本文所用的本发明化合物的“盐”可以是药学上合适(即药学上可接受)的盐，包括但不限于通过将本发明化合物的溶液与药学上可接受的酸溶液混合形成的酸加成盐。药学上可接受的酸可以是盐酸、甲磺酸、延胡索酸、马来酸、琥珀酸、乙酸、苯甲酸、草酸、柠檬酸、酒石酸、碳酸或磷酸。本领域熟知各种药学上可接受的盐，它们可用于本发明化合物，例如以前公开的(50-51)。例如，FDA-批准的商业投入市场的盐的清单包括乙酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、碳酸氢盐、酒石酸氢盐、溴化物、乙二胺四乙酸钙、樟脑磺酸盐、碳酸盐、氯化物、柠檬酸盐、二氢氯化物、乙二胺四乙酸盐、乙二磺酸盐(edisylate)、十二烷基磺酸盐(estolate)、乙磺酸盐(esylate)、延胡索酸盐、葡庚糖酸盐(gluceptate)、葡糖酸盐、谷氨酸盐、甘苯砷酸盐(glycollylarsanilate)、己基间苯二酚盐(hexylresorcinate)、哈胺盐(hydrabamine)、氢溴酸盐、盐酸盐、羟基萘酸盐(hydroxynaphthoate)、碘化物(iodide)、羟乙磺酸盐、乳酸盐、乳糖酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐、甲基溴化物、甲基硝酸盐、甲基硫酸盐、粘酸盐(mucate)、萘磺酸盐(napsylate)、硝酸盐、扑酸盐、泛酸盐、磷酸盐、二磷酸盐、聚半乳糖醛酸盐、水杨酸盐、硬脂酸盐、次醋酸盐(subacetate)、琥珀酸盐、硫酸盐、丹宁酸盐、酒石酸盐、茶氯酸(teoclate)和三乙基碘。
本文所用的本发明化合物的“水合物”可以是药学上合适(即药学上可接受)的水合物，即，通过向宿主分子(例如，该化合物的游离形式)加入水或其元素形成的化合物，包括但不限于一水合物、二水合物等。
本文所用的本发明化合物的“溶剂化物”可以是药学上合适(即药学上可接受)的溶剂化物，溶剂化是溶质与溶剂的相互作用，引起溶质在溶液中的稳定，溶剂化状态是溶液中的离子与溶剂分子络合。溶剂化物和水合物也可称为“类似物”。
本文所用的“前药”是药理学上惰性的化合物，但通过酶或化学作用可在预定的靶位点或接近预定的靶位点转化成药物的活性形式(即，活性药物成分)。换言之，前药是体内代谢后产生活性化合物的无活性化合物，其可以是或不是酶促控制的。前药还可以广泛分为两组：生物前体和载体前药。按照其作用性质，前药还可再细分。生物前体前药是早已在其结构中含有活性物质“胚胎”的化合物，从而在代谢后产生活性物质。
混合活性药物与载体形成具有所需化学和生物学特征的化合物，从而形成载体前药，连接键是酯或酰胺，因而载体前药在吸收或递送至靶位点后易于代谢。例如，可掺入亲脂性部分以提高经膜的转运。通过官能团连接于载体的载体前药称为双部分前药。载体通过单独的结构连接于药物的前药称为三部分前药，该载体要通过酶控制的代谢过程除去，而连接结构要通过酶系统或化学反应除去(52-53)。
短语“羟基保护基团”指任何合适的基团，例如叔丁氧基-羰基(t-BOC)和叔丁基-二甲基-甲硅烷基(TBS)。考虑的其它羟基保护基团是本领域已知的(54)。
药学上合适的口服载体系统(也称为药物递送系统，与药物产物一起分布或作为药物产物的一部分，该系统是现代技术，从而将药物均匀释放或靶向于身体)优选包括FDA-批准和/或USP-批准的无活性成分。根据21 CFR210.3(b)(8)，无活性的成分是药物产物中除活性成分外的任何组分。按照21CFR 210.3(b)(7)，活性成分是药物产物中意欲在疾病的诊断、治愈、缓解、治疗或预防中提供药理学活性或其它直接作用，或影响人或其它动物身体的结构或任何功能的任何组分。活性成分包括产物中可在药物产物的制备期间经历化学改变并在药物产物中以修饰形式存在以便提供指定活性或作用的那些组分。本文所用的试剂盒(也称为剂型)是相关材料的包装集合。
本文所用的口服剂型包括胶囊(由外壳和填充物组成的固体口服剂型，其中外壳由单一的密封壳体组成，或由组合在一起的两部分组成，该两部分有时用条带密封，胶囊外壳可以由明胶、淀粉或纤维素或其它合适的材料制得，可以是软或硬的，填充有能被倾倒或挤压的固体或液体成分)、胶囊或包衣丸粒(固体剂型，其中药物密封在适当形式的明胶制成的硬或软的可溶性容器或“外壳”内；药物本身是涂布了各种含量包衣的颗粒形式)，延长释放包衣胶囊(固体剂型，其中药物密封在适当形式的明胶制成的硬或软的可溶性容器或“外壳”内；此外，该胶囊覆盖了指定的包衣，其相比于传统剂型中存在的一种或多种药物，一种或多种药物的释放方式至少能降低给药频率)，延迟释放胶囊(固体剂型，其中药物密封在适当形式的明胶制成的硬或软的可溶性容器内，从而不在给药后立即释放一种药物(或多种药物)，肠包衣制品是延迟释放剂型)，胶囊延迟释放丸粒(固体剂型，其中药物密封在适当形式的明胶制成的硬或软的可溶性容器或“外壳”内；药物本身是涂布了肠衣的颗粒形式，因此，药物延迟释放直至其进入小肠)，延长释放胶囊(固体剂型，其中药物密封在适当形式的明胶制成的硬或软的可溶性容器内，该胶囊相比于传统剂型中存在的一种或多种药物，一种或多种药物的释放方式能降低给药频率)，薄膜包衣的延长释放胶囊(固体剂型，其中药物密封在适当形式的明胶制成的硬或软的可溶性容器或“外壳”内；此外，该胶囊覆盖了指定的薄膜包衣，其相比于传统剂型中存在的一种或多种药物，一种或多种药物的释放方式至少能降低给药频率)，明胶包衣的胶囊(固体剂型，其中药物密封在适当形式的明胶制成的硬或软的可溶性容器内；通过捆扎过程，胶囊包衣额外的明胶层从而形成完整的密封)，和液体填充胶囊(固体剂型，其中药物密封在可溶性、明胶外壳内，外壳加入多元醇，例如山梨醇或甘油使之增塑，因此稠度比硬外壳胶囊略高；活性成分通常溶解或悬浮在液体载体中)。
本文考虑的口服剂型还包括颗粒剂(小的颗粒或粒子)、丸粒(高度纯化药物构成的无菌固体小块，含或不含赋形剂，通过造粒或压制和模塑制成)，延长释放包衣丸粒(固体剂型，其中药物本身是涂布了各种含量包衣的颗粒形式，相比于以传统剂型中存在的一种或多种药物，一种或多种药物的释放方式能降低给药频率)，丸剂(含有医药试剂以便口服给予的小的圆形固体剂型)，粉末(打算内部或外部使用的干燥、精细分级药物和/或化学品的紧密混合物)，酏剂(含有溶解的医学试剂的清澈、舒适调味、加甜的水醇液体)，咀嚼胶(各种形状的加甜和调味的不可溶塑料材料，咀嚼时将药物释放入口腔)或糖浆(含有高浓度蔗糖或其它糖的口服溶液；该术语还用于包括用甜味和粘性载体制备的任何其它液体剂型，包括口服悬液)。
本文考虑的口服剂型还可包括片剂(含有医药物质的固体剂型，含或不含合适的稀释剂)、咀嚼片(打算咀嚼的含有医药物质的固体剂型，其含或不含合适的稀释剂，在口腔中产生舒适的残余味道，从而易于吞咽且不留下苦味或不适的后味)，包衣片(含有医药物质的固体剂型，含或不含合适的稀释剂，覆盖有指定的包衣)，包衣颗粒片剂(含有医药颗粒的聚集体的固体剂型，所述颗粒各覆盖有包衣)，延长释放的片剂(不在给予后立即释放一种或多种药物的固体剂型，肠衣制品是延长释放的剂型)，延长释放颗粒片剂(含有医药颗粒的聚集体的固体剂型，所述颗粒覆盖有包衣，该包衣不在给予后立即释放一种或多种药物，肠衣制品是延长释放的剂型)，可分散片剂(在给予前要置于液体中的片剂，其内含物均匀分散在整个液体中，术语“可分散的片剂”不再用于批准的药物产物，其被术语“用于悬浮的片剂”替代)，泡腾片(含有酸，例如柠檬酸、酒石酸和碳酸氢钠的混合物的固体剂型，其溶解于水时释放二氧化碳，给予前要溶解或分散在水中)，延长释放的片剂(含有药物的固体剂型，相比于传统剂型中存在的药物，其至少能降低给药频率)，薄膜包衣的片剂(含有医药物质的固体剂型，含或不含合适的稀释剂，包衣有水不溶性或水溶性聚合物的薄层)，薄膜包衣延长释放的片剂(含有医药物质的固体剂型，含或不含合适的稀释剂，包衣有水不溶性或水溶性聚合物的薄层；该片剂的配制方式使得能在摄取后的长时间内使用所含药物)，溶液片剂(置于液体中时形成溶液的片剂)，用于悬浮的片剂(置于液体中时形成悬液的片剂，原来称为“可分散片剂”)，多层片剂(含有医药物质的固体剂型，所述医药物质压缩成多层片剂或片剂套片剂，内部片剂是核心，外部是外壳)，延长释放的多层片剂(含有医药物质的固体剂型，所述医药物质压缩成多层片剂或片剂套片剂，内部片剂是核心，外部是外壳，其还覆盖了指定的包衣；相比于以传统剂型存在的药物，该片剂的配制方式至少能降低给药频率)，口服崩解的片剂(含有医药物质的固体剂型，置于舌上时，其通常在数秒内快速崩解)，延长释放的口服崩解片剂(含有医药物质的固体剂型，置于舌上时，其通常在数秒内快速崩解，但不在给药后立即释放一种或多种药物)，可溶性片剂(含有医药物质的固体剂型，含或不含合适的稀释剂，能溶解于液体)，糖衣片(含有医药物质的固体剂型，含或不含合适的稀释剂，包衣有着色或无色水溶性糖)，渗透性片剂，等等。
口服剂型组合物含有活性药物成分，并可含有一种或多种无活性药物成分，例如稀释剂、增溶剂、醇类、粘合剂、控释聚合物、肠聚合物、崩解剂、赋形剂、着色剂、调味剂、甜味剂、抗氧化剂、防腐剂、色素、添加剂、填充剂、悬浮剂、表面活性剂(例如，阴离子、阳离子、两性和非离子型)，等等。各种FDA-批准的局部无活性成分见FDA的“无活性成分数据库(The InactiveIngredients Database)”，其中包括专为制造商所用的无活性成分，按照21 CFR210.3(b)(7)给出的活性成分定义，在某些情况下，无活性成分也可视作活性成分。醇类是根据产品配方而可视作活性或无活性的成分的好例子。
本文所用的注射和输注剂型(即，胃肠外剂型)包括但不限于以下剂型。脂质体注射剂包括或形成包封活性药物物质的具有磷脂的脂质体或脂双层囊。注射剂包括打算胃肠外使用的无菌制备物。
USP规定了5类不同的注射剂。乳液注射剂包括含有打算胃肠外给药的无菌无热源制备物。用于溶液注射剂的脂质复合物和粉末是打算重建以形成胃肠外使用的溶液的无菌制备物。
用于悬浮液注射的粉末是打算重建以形成胃肠外使用的悬浮液的无菌制备物。用于脂质体悬浮液注射的冻干粉末是打算胃肠外使用重建的无菌冷冻干燥制备物，其制备的方式允许掺入脂质体，如具有用于将活性药物物质包封于脂质双层或水性空间内的磷脂的脂双层囊泡，该制剂可在重建时形成。用于溶液注射的冻干粉末是通过冻干(“冷冻干燥”)制备的打算用于溶液的剂型，包括在极低气压下去除冷冻状态产物中的水分，随后加入液体产生在所有方面均符合注射要求的溶液。用于悬浮注射剂的冻干粉末是打算胃肠外使用的液体制备物，含有悬浮于合适液态介质中的固体，其在所有方面均符合无菌悬浮液的要求，通过冻干制备打算用于悬浮液的药用试剂。
溶液注射剂包括液体制备物，含有一种或多种溶解于适合注射的合适溶剂或相互混溶的溶剂混合物中的药物物质。溶液浓缩注射剂包括用于胃肠外使用的无菌制备物，在加入合适的溶剂后产生在所有方面均符合注射要求的溶液。悬浮液注射剂包括(适合注射的)液体制备物，含有分散于液相的固体粒子，所述粒子是不溶性的，油相分散于水相或反之亦然。悬浮液脂质体注射剂为(适合注射的)液体制备物，具有分散于水相的油相，这种方式能形成脂质体(通常在脂双层或水性空间内包含用于包封活性药物物质的磷脂的脂双层囊泡)。悬浮液超声注射剂是(适合注射的)液体制备物，含有分散于液相中的固体粒子，所述粒子是不溶性的。此外，气体从悬浮液中冒泡时，可对该产物进行超声处理，导致通过固体粒子形成微球。
胃肠外运载体系统包括一种或多种药学上合适的赋形剂，如溶剂和助溶剂、增溶剂、湿润剂、悬浮剂、增稠剂、乳化剂、螯合剂、缓冲液、pH调节剂、抗氧化剂、还原剂、抗微生物防腐剂、膨胀剂、保护剂、张力调节剂和特殊的添加剂。
本文所用的吸入剂型包括但不限于：气溶胶，其是在压力下包装并含有治疗活性成分的产品，合适的阀门系统激活后，所述治疗活性成分释放以供局部应用于皮肤以及均应用于鼻部(鼻气溶胶)、口(舌和舌下气溶胶)、或肺(吸入气溶胶)。吸入剂型还包括泡沫气溶胶，其是含有一种或多种活性成分、表面活性剂、水性或非水性液体和推进剂的剂型，如果推进剂在内(不连续的)相中(即，水包油类型)，放出稳定的泡沫，如果推进剂在外(连续的)相中(即，油包水类型)，放出喷雾或快速破碎的泡沫。吸入剂型还包括计量气溶胶，其是计量剂量阀门组成的加压剂型，各阀门能在各自激活后递送均匀量的喷雾；阀门气溶胶，其是加压包装的产品，含有粉末形式的治疗活性成分，在合适的阀门系统激活后释放治疗活性成分；和气溶胶喷雾，其是一种气溶胶产品，利用加压气体作为推进剂以提供排出湿喷雾状产物所需的作用力，适用于水性溶剂配制的医药试剂溶液。
“药学上合适的吸入载体系统”包括本领域已知用于各种吸入剂型中的药学上合适的无活性成分，例如(但不限于)气溶胶推进剂(例如，氢氟烷推进剂)、表面活性剂、悬浮剂、溶剂、稳定剂等。
本文所用的透皮剂型包括但不限于：贴剂，其是常含有胶凝剂背衬的药物递送系统，其常应用于身体的外部部位，各成分从该贴剂的一部分被动快速或主动运输，各成分根据不同贴剂递送至身体的外表面或体内；其它各类透皮贴剂，例如基质、储器和其它贴剂是本领域已知的。“药学上合适的透皮载体系统”包括本领域已知的药学上合适的无活性成分以便用于各种透皮剂型，例如(但不限于)溶剂、胶凝剂、稀释剂、添加剂、渗透增强剂、表面活性剂、乳化剂、脂质体等。
本文所述化合物的有效剂量通常是对患者有有益的生理学作用的任何用量。在一个实施方式中，本文所述化合物对于患者的EC50值可以是30μM(±10％)到600μM(±10％)或是生理学相关模型中有效体外值的约4-10倍(±1-2倍)。
实施例
实施例1.合成线粒体-夹竹桃麻素和线粒体-夹竹桃麻素乙酸酯
合成线粒体-夹竹桃麻素和线粒体-夹竹桃麻素乙酸酯包括将乙酰基香草酰氯与三苯基-2-氨基乙基溴化鏻偶联，从而得到水解成线粒体-夹竹桃麻素的线粒体-夹竹桃麻素乙酸酯。线粒体-夹竹桃麻素和线粒体-夹竹桃麻素乙酸酯的合成见图3。
将香草酸(10g)与含2-3滴浓硫酸的10ml乙酸酐在60℃加热1小时。将热混合物倒入100ml冰冷却的水中，用2x5ml醚萃取。干燥醚萃取物，除去溶剂，最后用真空管路(vacuum line)干燥得到定量产率的灰白色固体状乙酰基香草酸。
将以上化合物悬浮在50ml干燥苯中，加入10ml亚硫酰氯。混合物回流1小时。通过旋转蒸发除去溶液中的溶剂，加入20ml苯，再次除去溶剂。最后，用真空管路干燥残留物得到淡棕色半固体。该水份敏感的酰氯用于偶联反应。
氮气气氛下，三苯基膦(13g，0.05摩尔)和2-溴乙胺氢溴酸盐(10.25g，0.05摩尔)在100ml正丙醇中回流搅拌72小时。冷却后过滤形成的白色固体。用干燥的醚反复洗涤残留物，真空管路干燥。将产物溶解于50ml水中，并过滤。向溶液中加入稀氨水直至pH达到9.0。用二氯甲烷(3x50ml)萃取游离胺。收集有机层，无水硫酸镁干燥，除去溶剂，最后用真空管路干燥。通过HPLC和LC/MS测定纯度(质量＝306)。
将2-氨基乙基三苯基溴化鏻(3.86g，0.01摩尔)溶解于50ml干燥的二氯甲烷，向其中加入2g吡啶。该溶液在冰浴中搅拌。在半小时期间，向搅拌的溶液中滴加乙酰基香草酰氯(2.28g，0.01摩尔)的20ml二氯甲烷溶液。然后在室温下搅拌该溶液过夜。将该溶液与碳酸氢钠的饱和溶液振荡以除去任何酸，然后与0.1M盐酸振荡以除去任何碱性化合物。收集有机层，干燥并除去溶剂以获得淡棕色半固体。分离该中间体产物，线粒体-夹竹桃麻素，通过溶解于二氯甲烷和用醚沉淀数次来纯化。通过HPLC和LC/MS证实纯度(质量＝498)。
将产物溶解于25ml甲醇，室温下与1g NaOH的5ml水溶液搅拌1小时以除去保护性乙酰基。用稀盐酸酸化直至pH为3.0并用二氯甲烷萃取以回收脱乙酰基的化合物。除去溶剂产生半固体，将该半固体溶解于10ml二氯甲烷并将该溶液边搅拌边加入100ml干燥醚进行纯化。通过倾析收集沉淀的产物，完全除去醚。该沉淀纯化过程重复两次或更多次，最后用真空管路干燥产物得到灰白色粉末。通过HPLC和LC/MS测定线粒体-夹竹桃麻素的纯度(质量＝456)。最终产率为50％。
实施例2.线粒体靶向的夹竹桃麻素类似物在亚慢性MPTP小鼠模型中的神经保护作用
夹竹桃麻素和夹竹桃麻素类似物显示强效的神经保护特性(55)。给予夹竹桃麻素(300mg/kg)显著延长G93A小鼠的寿命，该小鼠是熟知的ALS啮齿类模型(5和55)。
虽然夹竹桃麻素和相关的类似物(例如，香草醛)抑制NADPH氧化酶活性(藉此终止超氧化物形成)，但这些化合物还表现出抗氧化剂特性(3)。三苯基鏻-偶联的夹竹桃麻素类似物，线粒体-夹竹桃麻素用作强效的线粒体靶向抗氧化剂(MTA)。在初发性PD中，黑质纹状体多巴胺能神经元经历缓慢而渐进性的破坏。为在临床前小鼠模型中模拟该症状，开发了亚慢性MPTP小鼠模型。此处所用的小鼠模型类似于以下实施例3所用的。
用线粒体-夹竹桃麻素(3mg/kg，口服管饲)处理小鼠1天，然后给予亚慢性MPTP(20mg/kg，腹膜内)5天。最后一剂MPTP的7天后处死小鼠(在该7天期间给予线粒体-夹竹桃麻素)。通过HPLC-EC分析纹状体神经递质(多巴胺、二羟基苯乙酸)。用夹竹桃麻素进行类似实验(20mg/kg，口服管饲；还检验了较低剂量，但无效)。如图4A和4B所示，这些实验所用浓度下的线粒体-夹竹桃麻素(但不是夹竹桃麻素)几乎完全保护纹状体多巴胺和二羟基苯乙酸水平免遭亚慢性MPTP-诱导的消耗。
PD发作的特征在于纹状体多巴胺缺乏，现有的治疗涉及给予PD患者L-多巴。然而，L-多巴治疗与毒副作用相关，包括肝毒性和运动障碍。本发明证明利用MTA通过恢复纹状体中的多巴胺水平来减轻线粒体损伤是有益的。本发明的MTA减轻PD动物模型中的多巴胺丧失。此外，利用MTA可减轻L-多巴治疗相关的细胞毒性。
实施例3.在帕金森病的MPTP小鼠模型中评估二夹竹桃麻素的抗神经炎性作用
动物和治疗.在恒定温度(22±1℃)、湿度(相对，30％)和12-小时白天/黑夜周期的标准条件下饲养体重24-28g的6-8周龄C57BL/6小鼠。小鼠可自由进食或饮水。动物的利用和方案受到衣阿华州立大学动物管理委员会(Committee on Animal Care at Iowa State University，埃姆斯，衣阿华州)的批准和监督。对于神经变性研究，小鼠通过口服管饲接受二夹竹桃麻素(300毫克/千克剂量)1天(MPTP给予前的预先治疗)、5天(与MPTP同时的治疗)或7天(MPTP后的治疗)。
为检查炎性和氧化应激标记，小鼠在MPTP处理前1天管饲给予二夹竹桃麻素(300毫克/千克剂量)，并在MPTP处理的同时继续给予4天。在亚急性MPTP方案中，在第2-7天每天腹膜内注射MPTP(25mg/kg)一次。对照小鼠接受相同剂量的盐水。
HPLC分析纹状体多巴胺及其代谢物水平.通过高效液相层析(HPLC)与电化学检测定量测定纹状体多巴胺(DA)、DOPAC和HVA水平。如以前所述(48，56)制备样品并定量测定。简言之，MPTP注射后7天，处死小鼠，收集纹状体并储存于-80℃。分析之日，利用抗氧化剂提取溶液(含有0.05％Na2EDTA和0.1％Na2S2O5的0.1M高氯酸)和异丙基肾上腺素(作为内标)提取纹状体组织的神经递质。将提取物过滤入0.22μm自旋管(spin tube)，加载20μl样品以供分析。用反相柱等度分离DA、DOPAC和HVA，流速为0.6毫升/分钟。利用装配有冷冻温度控制并具有自动进样器的HPLC系统(542型；ESA有限公司.，贝德福德，马萨诸塞州)作HPLC分析。电化学检测系统由具有微量分析室(5014A型，ESA有限公司)和保护室(5020型，ESA有限公司)的Coulochem(5100A型，ESA有限公司)组成。利用EZStart HPLC软件(ESA有限公司)进行数据获取和分析。
免疫组织化学.MPTP处理后4天，给小鼠灌注4％低聚甲醛(PFA)并分别用PFA和30％蔗糖作后固定。随后，将固定的大脑切成30μm切片，-20℃维持在30％蔗糖-乙二醇溶液中。染色之日，用磷酸缓冲盐水(PBS)清洗切片，4℃与不同的一抗温育过夜，所述一抗包括抗-IBA-1(DAKO，卡宾特利牙(Carpinteria)，加利福尼亚州)、抗-GFAP(马萨诸塞州比尔里卡密理博公司(Millipore，Billerica，MA))、抗-iNOS(加利福尼亚州圣克鲁斯圣克鲁斯生物技术公司(Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA))、抗-3NT(密理博公司)、抗-4HNE(明尼苏达州明尼阿波利斯研发公司(R&D Systems，Minneapolis，MN))和抗-gp91phox(圣克鲁斯生物技术公司)。利用合适的二抗(加利福尼亚州卡尔斯巴德英杰公司(Invitrogen，Carlsbad，CA)的AlexaFluor 488、594或555)，然后在室温下与10μg/ml Hoechst 33342温育5分钟以染色核。利用尼康倒置荧光显微镜(TE-2000U型；尼康公司，东京，日本)观察切片。用密歇根州斯特林高地城诊断仪器公司(DiagnosticInstruments，Inc.，Sterling Heights，MI)的SPOT数码照相机捕捉图像。
DAB免疫染色.如以前所述在纹状体和黑质中进行DAB免疫染色(57)。简言之，在最后一次给予MPTP后第1天或7天，处死小鼠，用4％PFA灌注并分别用PFA和30％蔗糖作后固定。随后，将固定的大脑切成30μm切片，-20℃维持在30％蔗糖-乙二醇溶液中。染色之日，用PBS清洗切片，4℃与抗-TH(兔抗-小鼠，1∶1800；Calbiochem，Gibstown，NJ)、抗-IBA-1(山羊抗-小鼠，1∶1000；Dako)、抗-GFAP(小鼠抗-小鼠，1∶1000；密理博公司，比尔里卡，马萨诸塞州)或抗-gp91phox(小鼠抗-小鼠，1∶500；圣克鲁斯生物技术公司)温育过夜。随后，在室温下用生物素化的抗-兔、-山羊或-小鼠二抗温育切片1.5小时。然后在室温下将切片与亲和素过氧化物酶(Vectastatin ABC Elite试剂盒；载体实验室(Vector Labs)，伯林格姆，加利福尼亚州)温育30分钟。利用产生棕色色斑的二氨基联苯胺(DAB)观察免疫标记。
蛋白质印迹.MPTP处理后第4天或7天处死小鼠，切取黑质组织。如以前所述(48)，将含等量蛋白质的大脑裂解物加载入各道，用10-12％SDS聚丙烯酰胺凝胶分离。分离后，将蛋白质转移至硝酸纤维素膜，用Li-CorOdyssey封闭缓冲液(L-C生物科学公司(Li-Cor Biosciences)，林肯，内布拉斯卡州NE)处理来封闭非特异性结合位点。然后温育膜与不同一抗，包括抗-TH(密理博公司)、抗-iNOS(卡尔生物化学公司(Calbiochem))、抗-3NT(密理博公司)和抗-4HNE(研发公司)。然后，将膜与Alexa Fluor 680山羊抗-小鼠或Alexa Fluor 680驴抗-山羊(英杰公司)或IR染料800驴抗-兔二抗(宾夕法尼亚州吉尔波次维尔的罗克兰德免疫化学公司(RocklandImmunochemicals，Gilbertsville，PA))温育。为证实加载了等量蛋白质，用β-肌动蛋白抗体(1∶5000稀释)再次检测印迹。用L-C生物科学公司的Li-CorOdyssey仪器捕捉蛋白质印迹图像。
FLUORO-JADE B
Figure BPA00001491259100261
和酪氨酸羟化酶双重标记.如以前所述(58)，在黑质切片中进行FLUORO-JADE B
Figure BPA00001491259100262
和酪氨酸羟化酶(TH)双重标记。简言之，最后一次注射MPTP后第7天，处死小鼠，用4％PFA灌注并分别用PFA和30％蔗糖作后固定。将固定的大脑切成30μm切片，-20℃维持在30％蔗糖-乙二醇溶液中。染色之日，用PBS清洗切片，依次与抗-TH抗体(密理博公司，小鼠单克隆，稀释度1；1600)和Alexa Fluor 568驴抗-小鼠二抗(英杰公司)温育。通过改进的FLUORO-JADE B
Figure BPA00001491259100263
染色方案对同一切片进行FLUORO-JADE B
Figure BPA00001491259100264
染色，包括0.06％高锰酸钾温育2分钟和0.0002％FLUORO-JADE B
Figure BPA00001491259100265
染色5分钟。利用尼康倒置荧光显微镜(TE-2000U型)观察切片。用诊断仪器公司的SPOT数码照相机捕捉图像。
行为检测.进行两类行为检验，包括检验运动活性的开放场实验(Open Field experiment)和转杆实验以检验MPTP和二夹竹桃麻素处理后小鼠运动的协调性(48，56)。可利用开放场活性监测器(RXYZCM-16型；AS公司(AccuScan)，哥伦布，俄亥俄州)检测小鼠的自发性活动。活动室为40×40×30.5cm，由透明的PLEXIGLAS
Figure BPA00001491259100266
制成，盖有具有通气孔的PLEXIGLAS
Figure BPA00001491259100267
盖子。沿着周边(每侧16个红外束)每2.54cm和在底面以上2.5cm安装红外监测传感器。在对侧，底面以上8.0cm处安装额外的两组16个传感器。通过VersaMax分析仪(CDA-8型，AS公司)收集数据并分析。处理前，将小鼠置于红外监测器中每日10分钟和每日5分钟连续3天以训练它们。最后一次注射MPTP后5天，进行开放场和转杆实验。运动活性体现为水平运动和垂直运动，测试时间10分钟。对于转杆实验，采用20rpm转速。小鼠有5-7分钟休息间隔以消除应激和疲劳。
实施例3.结果
二夹竹桃麻素抑制PD的MPTP-诱导小鼠模型黑质中的胶质细胞激活.最近的研究证明胶质细胞的激活是帕金森病(PD)和其它神经变性疾病的病理性标志(56-57和59-60)。与这些结果一致，在MPTP-处理小鼠的黑质中观察到IBA-1(小胶质细胞的标记物)和GFAP(星形细胞的标记物)的表达增加(图5，A-D图)。较高的放大率(图5，B和D图)显示MPTP处理造成小胶质细胞增生(变形虫样形状和形态学特征增加)和星形细胞增生(表达增加和形态学特征增加)增加。用二夹竹桃麻素治疗MPTP-中毒小鼠导致黑质中IBA-1和GFAP蛋白质表达抑制(图5，A-D图)。这些结果表明二夹竹桃麻素降低MPTP-处理小鼠中胶质细胞激活。
二夹竹桃麻素减弱MPTP-诱导的gp91phox表达.PD的致病原因包括氧化应激和神经炎症。因此，已经证明在人PD大脑和MPTP-诱导小鼠中脑中NADPH氧化酶表达增加(61)。类似地，本发明通过蛋白质印迹分析(图6，A图)和DAB-免疫染色(图6，B图)发现MPTP-处理小鼠的黑质组织中的gp91phox表达增加。然而，二夹竹桃麻素处理减弱黑质中MPTP-诱导的gp91phox表达(图6，A和B图)。DAB免疫染色MPTP-处理细胞中的gp91phox(图6，B图)显示强壮细胞，表达稠密、较短分枝的gp91phox。相反，对照和MPTP-及二夹竹桃麻素处理切片显示温和的免疫反应性。IBA-1和gp91phox的双重标记证明gp91phox与IBA-1阳性细胞共同定位于MPTP处理的小鼠中，而在MPTP和二夹竹桃麻素处理的小鼠中未发现共同定位(图6，C图)。这些结果显示二夹竹桃麻素阻断小胶质细胞中MPTP-诱导的gp91phox激活。
二夹竹桃麻素抑制MPTP-诱导的3-硝基酪氨酸表达.氧化和硝化应激所致的蛋白质硝化与PD的致病原因相关，在PD的MPTP模型中也观察到。在氧化应激条件下，超氧化物与一氧化氮反应形成过氧亚硝酸盐，这是选择性硝化酪氨酸残基并产生3-硝基酪氨酸(3-NT)的强效氧化剂，广泛用作一氧化氮依赖性氧化应激的标记物。本发明发现MPTP-处理小鼠的黑质中3-NT表达增加(图7，A和B图)。此外，二夹竹桃麻素减弱黑质中MPTP-诱导的3-NT表达(图7，A和B图)。
随后，我们推测多巴胺能神经元还表达3-NT。酪氨酸羟化酶(TH，多巴胺能神经元的标记物)和3-NT的双重标记免疫染色显示3-NT主要与TH-阳性神经元共同定位于MPTP-处理小鼠的黑质区域中。然而，几乎没有TH阳性细胞与3-NT共同定位于接受二夹竹桃麻素的MPTP-处理小鼠中(图7，C图)。3-NT形成减少表明二夹竹桃麻素阻止黑质的多巴胺能神经元中MPTP诱导的蛋白质氧化。
二夹竹桃麻素减弱黑质中MPTP-诱导的4-羟基壬烯醇产生.4-羟基壬烯醇(4-HNE)是脂质过氧化期间形成的不饱和醛的主要产物，其广泛用作羟基自由基诱导的膜脂质过氧化的标记物(62)。现已发现4-HNE在氧化应激存在下介导神经元凋亡(63)。以前的报道还显示4-HNE是PD的氧化损伤的良好标记物(64)。本发明通过蛋白质印迹和免疫染色证明MPTP-处理小鼠的黑质中4-HNE表达增加(图8，A和B图)。然而，二夹竹桃麻素减弱MPTP-诱导黑质中4-HNE表达增加(图8，A和B图)。
双重标记免疫染色还证明MPTP-处理小鼠的黑质区域中TH阳性多巴胺能神经元强烈表达4-HNE。相反，MPTP-和二夹竹桃麻素-处理小鼠显示黑质中共同定位的TH和4-HNE细胞几乎没有(图8，C图)。这些结果表明二夹竹桃麻素抑制MPTP-中毒小鼠的黑质中多巴胺能神经元表达4-HNE。
二夹竹桃麻素抑制MPTP-处理小鼠的黑质中诱导型一氧化氮合酶的表达.各种研究人员在动物模型中显示了PD神经变性相关炎症的作用(65-66)。本发明通过蛋白质印迹和免疫染色检测小鼠的黑质中诱导型一氧化氮合酶(iNOS/NOS2)的表达水平以评估MPTP-诱导的炎症。与盐水处理的对照小鼠相比，在MPTP-处理小鼠的黑质中观察到iNOS表达水平增加(图9，A和B图)。此外，在MPTP-处理小鼠中观察到iNOS与IBA-1阳性小胶质细胞和GFAP-阳性星形细胞的共同定位增加(图10，A和B图)。
然而，观察到还接受二夹竹桃麻素的MPTP-处理小鼠中iNOS染色显著降低(图9，A和B图)。此外，我们的图5结果显示二夹竹桃麻素减弱MPTP-诱导的IBA-1和GFAP表达，与之一致的是还接受二夹竹桃麻素的MPTP-处理小鼠的黑质中几乎观察不到共同定位的iNOS和IBA-1或iNOS和GFAP细胞(图10，A和B图)。这些结果证明二夹竹桃麻素作为PD患者中抵御MPTP-诱导炎性反应的抗炎剂的作用及其作为神经保护性抗炎剂的潜能。
二夹竹桃麻素改进MPTP-注射小鼠的运动活性.为评估二夹竹桃麻素抵御MPTP诱导运动缺陷的作用，检测对照、MPTP-处理及MPTP-和二夹竹桃麻素处理小鼠的运动活性。对照、MPTP-处理及MPTP-和二夹竹桃麻素处理小鼠的Versa Plot代表性图见图11，A图。与对照相比，MPTP-处理小鼠中水平运动降低几乎50％，垂直运动降低超过75％(图11，B和C图)。值得注意的是，MPTP-和二夹竹桃麻素处理小鼠显示水平和垂直运动表现显著提高(图11，A、B和C图)。
以20rpm的转速，与对照小鼠相比，MPTP-中毒小鼠显示在转杆所花时间是降低超过75％(图11，D图)。然而，与对照小鼠相比，MPTP-和二夹竹桃麻素处理小鼠显示在转杆上所花时间的降低不到25％(图11，D图)。综合来看，这些结果证明二夹竹桃麻素能抑制神经毒素MPTP导致的行为缺陷，还表明二夹竹桃麻素改善神经变性相关运动缺陷的潜能。
二夹竹桃麻素保护PD的MPTP-诱导动物模型以免神经递质缺陷.由于我们发现二夹竹桃麻素在MPTP-诱导的行为缺陷中的保护作用，我们检测了二夹竹桃麻素能否保护免遭MPTP导致的神经化学缺陷。MPTP中毒导致多巴胺水平降低超过78％，而MPTP-和二夹竹桃麻素-处理的小鼠显示纹状体中多巴胺水平的降低不到40％(图12，A图)。我们还发现MPTP-中毒小鼠的纹状体DOPAC和HVA水平显著降低，而MPTP-和二夹竹桃麻素处理小鼠显示明显维持了纹状体DOPAC和HVA水平(图12，B和C图)。这些结果证明二夹竹桃麻素抵御MPTP毒性相关的多巴胺水平降低的神经保护特征。此外，这些结果强调二夹竹桃麻素抵御炎性疾病，例如PD相关神经化学缺陷的保护作用。
二夹竹桃麻素保护黑质纹状体抵御MPTP毒性.由于二夹竹桃麻素显著防止MPTP毒性导致的多巴胺、DOPAC和HVA水平丧失，我们检查了二夹竹桃麻素是否能保护黑质纹状体轴免遭MPTP毒性。通过蛋白质印迹和免疫组化分析观察到MPTP-处理小鼠的纹状体和黑质中TH表达水平均降低(图13，A-D图)。然而，MPTP-和二夹竹桃麻素-处理小鼠显示TH表达降低(图13，A图)。TH-DAB免疫染色显示纹状体的壳、尾状核和苍白球区域中多巴胺能神经元末稍丧失(图13，B图)，MPTP-处理小鼠的黑质致密部及侧部区域中多巴胺能细胞体的丧失(图13，C和D图)。然而，采用二夹竹桃麻素处理，基本上阻止了纹状体和黑质中TH-阳性神经元和末稍的丧失(图13，C和D图)。因此，二夹竹桃麻素处理看来有实质性的黑质纹状体轴神经保护作用。
通过FLUORO-JADE B
Figure BPA00001491259100301
染色评估二夹竹桃麻素在MPTP-诱导的PD动物模型中的神经保护作用.为进一步确认二夹竹桃麻素能保护MPTP-诱导的多巴胺能神经变性，我们在小鼠黑质切片中进行TH和FLUORO-JADEB
Figure BPA00001491259100302
双重标记。FLUORO-JADE B
Figure BPA00001491259100303
有效染色变性的神经元，其也是神经元破坏的标记(67)。有人提示PD中有凋亡以及坏死细胞死亡(47和68)。与预期的一样，在MPTP-处理切片中检测到TH-阳性神经元数量降低，这与FLUORO-JADE B
Figure BPA00001491259100304
-染色细胞数量增加相关，表明MPTP-处理小鼠中黑质的神经变性(图14)。令人感兴趣的是，MPTP-和二夹竹桃-处理的小鼠显示FLUORO-JADE B
Figure BPA00001491259100305
-阳性细胞较少，表明二夹竹桃麻素减弱神经变性。如预计那样，还在MPTP-和二夹竹桃麻素-处理小鼠中观察到TH-阳性细胞增加。这些数据整体表明二夹竹桃麻素保护黑质中多巴胺能神经元免遭MPTP诱导的死亡。这些数据还暗示二夹竹桃麻素抵御PD-相关多巴胺能神经变性的潜在神经保护作用。
实施例4.在神经炎症的小胶质细胞培养模型中评估二夹竹桃麻素的抗神经炎性作用
化学和生物学试剂.RPMI、胰蛋白酶-EDTA、DMEM-F12、FBS、丙酮酸钠、青霉素/链霉素、NEAA和谷氨酰胺(Q)均购自英杰公司。Griess试剂购自密苏里州圣路易斯的西格玛-阿尔德里奇公司(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)。Bradford蛋白质试验试剂盒购自加利福尼亚州赫拉克勒斯的B-R实验室(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)。蛋白酶和磷酸酶抑制剂购自伊利诺斯州洛克福特的皮尔斯生物技术公司(Pierce Biotechnology，Rockford，IL)。所有一抗购自圣克鲁斯生物技术公司。Li-Cor封闭缓冲液购自L-C生物科学公司。Alexa Fluor 680(驴抗-小鼠)用作二抗，购自英杰公司。IRDye800偶联的抗-兔IgG购自宾夕法尼亚州吉尔波次维尔的罗克兰德免疫化学公司。Luminex封闭/存储缓冲试剂(Sigma P-3688和叠氮钠)购自密苏里州圣路易斯的西格玛-阿尔德里奇公司。链霉亲和素-PE、捕捉抗体和检测抗体购自加利福尼亚州圣迭戈的电子生物科学公司(eBioscience，SanDiego，CA)。96-孔过滤板购自宾夕法尼亚州匹兹堡的费希尔科学公司(Fisher Scientific，Pittsburgh，PA)。
神经炎症的细胞培养模型.利用两种神经炎症的细胞模型评估二夹竹桃麻素的抗-神经炎性特性，包括小鼠BV2小胶质细胞系以及从小鼠大脑分离的原代小胶质细胞。BV2细胞获自美国模式培养物保藏所。37℃和5％CO2下将BV2细胞维持在含有10％FBS和100单位青霉素/链霉素的RPMI中。为作处理，利用含有2％FBS和100单位青霉素/链霉素的RPMI。
原代小胶质细胞.原代小胶质细胞获自1-2日龄的C57/b16幼小鼠。收集后，将完整的大脑维持在含有10％FBS、1x丙酮酸钠、1x NEAA、100单位青霉素/链霉素和Q的冰冷却DMEM-F12培养基。收集后，将大脑置于0.25％胰蛋白酶-EDTA中，37℃温育，每5-10分钟轻柔振荡。30分钟后，除去胰蛋白酶，用温热的培养基洗涤大脑两次。洗涤后，将培养基加入大脑，利用轻柔抽吸匀浆大脑，用25ml移液管开始，随着大脑破碎换用较小的移液管尖。当大脑充分匀浆成单细胞悬液，用70μm尼龙滤膜过滤，从而能收集小胶质细胞和星形细胞。得到的细胞悬液接种在T-75培养瓶中，37℃、5％CO2下生长12-14天。利用Easy Sep磁体(干细胞技术公司(Stemcell Technologies)，温哥华，不列颠哥伦比亚省，加拿大)(68-69)收集小胶质细胞，接种在聚-D-赖氨酸-包被的平板上，使之附着2-4天，然后处理。
iNOS或NOS-2激活评估.采用96-孔形式，利用Griess试剂检测亚硝酸盐水平来评估诱导型一氧化氮合酶(iNOS或NOS2)激活(70-72)。各孔含有40,000个BV2细胞或100,000个原代小胶质细胞。BV2细胞培养在含有10％FBS和青霉素/链霉素的150μl RPMI中，用含有10％FBS、青霉素/链霉素、丙酮酸钠(S/P)、Q和NEAA的DMEM-F12培养原代小胶质细胞。培养一天后，用仅含2％FBS的150μl它们各自的完全培养基替换细胞。用二夹竹桃麻素(10μM)和夹竹桃麻素(100μM)预处理两种细胞类型30分钟，再作LPS刺激(BV2细胞为1μg/ml LPS，原代小胶质细胞为100ng/ml)，37℃温育平板。37℃温育24小时后，取出100μl上清液，置于新的96孔板中，向其中加入100μl Griess试剂。用平板振荡器振荡该平板10分钟，然后用平板读数计在540nm下读数。
通过LUMINEX
Figure BPA00001491259100321
免疫测定检测细胞因子.通过LUMINEX
Figure BPA00001491259100322
多重免疫测定检测二夹竹桃麻素处理的BV2和小胶质细胞的细胞因子水平。制备各孔，其中在含10％FBS和青霉素/链霉素的150ul RPMI中含有40,000个BV2细胞或在含有10％FBS、青霉素/链霉素、S/P、Q和NEAA的DMEM-F12中含有100,000个原代小胶质细胞。处理期间，细胞接受仅含2％FBS的150μl它们各自的完全培养基。LPS处理(BV2细胞为1μg/ml LPS，原代小胶质细胞为500ng/ml LPS)前30分钟加入二夹竹桃麻素(10μM)和夹竹桃麻素(100μM)，但在37℃的整个24小时处理期间维持在上清液中。24小时后，收集上清液，-20℃冷冻以供后续分析。为了分析，解冻上清液，按照生产商的使用说明书，采用LUMINEX
Figure BPA00001491259100323
方案检验40μl的各上清液样品(73-74)。
将细胞因子标准品和对照调整到40μl体积，用LUMINEX200总系统运行LUMINEX
Figure BPA00001491259100325
样品，利用加利福尼亚州卡尔斯巴德英杰公司的多重分析-LUMINEX
Figure BPA00001491259100326
软件作分析。
蛋白质印迹.将含等量蛋白质的BV2细胞裂解物加载入各泳道，利用10％SDS-PAGE凝胶分离。分离后，将蛋白质转移至硝酸纤维素膜。用Licor封闭缓冲液封闭非特异性结合位点45分钟。然后，用针对NOS2的一抗(小鼠单克隆1∶200)和p67phox(家兔多克隆1∶200)处理膜。为证实加载了等量蛋白质，还用β-肌动蛋白抗体检测膜的β-肌动蛋白(稀释度1∶10,000)。室温下，利用1∶10,000稀释度的二抗，驴抗-小鼠(英杰公司)和偶联的抗-家兔IgG(罗克兰德)，1小时。利用Li-COR Odyssey红外成像系统和软件使膜成像并捕捉。
数据分析.利用Prism 4.0软件(GP软件公司(GraphPad Software，Inc.))进行数据分析。首先用单向ANOVA分析原始数据，然后采用Tukey后检验(Tukey′s post-test)比较所有的处理组。P＜0.05的差异认为是显著的。
实施例4.结果
二夹竹桃麻素在BV2小胶质细胞和原代小胶质细胞中比夹竹桃麻素更有效地减弱LPS-诱导的iNOS激活.首先，我们通过产生剂量应答曲线检测了何种浓度的二夹竹桃麻素(图15A和15B)和夹竹桃麻素(图16A和16B)是阻断LOS-诱导的iNOS激活所需。从剂量应答曲线获知各化合物的EC50。二夹竹桃麻素的EC50是7.757μM，而夹竹桃麻素的EC50是61.33μM。根据EC50值，用于其它实验的二夹竹桃麻素浓度为10μM，而夹竹桃麻素的使用浓度是100μM。我们证明即便在低10倍的浓度，二夹竹桃麻素在BV2细胞(图17)和原代小胶质细胞(图18)中减弱LPS-诱导的iNOS激活与夹竹桃麻素一样有效。
二夹竹桃麻素对原代小胶质细胞中LPS-诱导的细胞因子释放的影响.由于二夹竹桃麻素能减弱LPS-诱导的iNOS激活，我们随后检验了其阻断小胶质细胞释放已知炎性细胞因子的能力。我们比较了低10倍的二夹竹桃麻素(10μM)与夹竹桃麻素(100μM)。通过LUMINEX
Figure BPA00001491259100331
试验检测上清液中的细胞因子释放。我们发现二夹竹桃麻素非常有效地阻断LPS诱导IL-1β(图19A)、IL-10(图19B)、IL-12(图19C)和TNF-α(图19D)释放。夹竹桃麻素也有效，但需要浓度高于二夹竹桃浓度10倍。这些结果总体证明二夹竹桃麻素比夹竹桃麻素更有效阻断原代小胶质细胞介导的神经炎性应答。
二夹竹桃麻素能减弱LPS-诱导的iNOS和p67phox蛋白质表达增加.证明二夹竹桃麻素能够阻断关键炎性分子释放后，我们检测了二夹竹桃麻素阻断关键炎性蛋白表达的能力。我们选择检测BV2细胞内的NOS2和p67phox表达。NOS2是诱导型一氧化氮合酶蛋白，其负责LPS刺激后细胞的大多亚硝酸盐释放。p67phox蛋白是NADPH氧化酶复合物2(NOX2)的关键激活亚基之一，负责激活的小胶质细胞产生和释放活性氧中间体(ROS)。如图20所示，二夹竹桃麻素极其有效地降低LPS-诱导的NOS2和p67phox蛋白质表达，使其回复至基础水平、甚至低于基础水平。这些结果总体上证明二夹竹桃麻素通过减弱小胶质细胞介导的炎性应答，例如细胞因子释放、NOS2和NOX2激活而具有抗炎作用。
实施例5.在神经炎症的小胶质细胞培养模型中评估二夹竹桃麻素二乙酸酯的抗-神经炎性作用
本实施例总体上遵循以上实施例4的细胞培养、处理和分析步骤。
二夹竹桃麻素二乙酸酯(diapodiacetate或diapo diace)抑制BV2小胶质细胞中LPS-诱导的NOS-2(图21)。将BV-2细胞接种于96孔板，每孔40,000个细胞，用含有2％热灭活FBS和青霉素/链霉素的150μl RPMI处理。二夹竹桃麻素二乙酸酯用于细胞作为30分钟的预处理，然后加入LPS(1μg/ml)。从加入LPS开始，所有处理在37℃温育24小时。将各孔的100微升上清液试样与100μl Griess试剂(西格玛公司(Sigma))混合于96孔板中，振荡10分钟后用平板读数计读数。绘制与对照相比，各处理的亚硝酸盐水平百分数的图。
虽然描述和示例了本发明的某些特性，但本领域技术人员应明白可在描述的特性中作出各种改进，包括改变、添加和删除。应知道，本发明还包括这些改进，而本发明的范围仅受随附权利要求书在法律上的最大解读范围的限制。本文所列的所有参考文献和出版物通过引用纳入本文。
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Claims (53)

1.一种以下结构所示的夹竹桃麻素衍生物或其前药、溶剂化物或水合物：
Figure FPA00001491259000011
式中，R1是C＝O、(CH＝CH)或CH2，
R2是O、NH或COO，
R3是H、COCH3或CO(CH2)mCH3，
X-是Cl-、Br-或I-，
n是2-16，和
m是1-16。
2.一种药物剂型，其包含权利要求1所述的夹竹桃麻素衍生物和药学上合适的载体系统。
3.如权利要求2所述的药物剂型，其特征在于，所述剂型包括口服、注射、输注、吸入、透皮或植入物剂型。
4.一种增加哺乳动物脑中多巴胺含量的方法，包括给予治疗有效量的权利要求1所述的夹竹桃麻素衍生物。
5.一种增加哺乳动物脑细胞的线粒体中二羟基苯乙酸含量的方法，包括给予治疗有效量的权利要求1所述的夹竹桃麻素衍生物。
6.一种以下任一结构所示的夹竹桃麻素衍生物或其前药、溶剂化物或水合物：
Figure FPA00001491259000021
7.一种药物剂型，其包含权利要求6所述的夹竹桃麻素衍生物和药学上合适的载体系统。
8.如权利要求7所述的药物剂型，其特征在于，所述剂型包括口服、注射、输注、吸入、透皮或植入物剂型。
9.一种增加哺乳动物脑中多巴胺含量的方法，包括给予治疗有效量的权利要求6所述的夹竹桃麻素衍生物。
10.一种增加哺乳动物脑细胞的线粒体中二羟基苯乙酸含量的方法，包括给予治疗有效量的权利要求6所述的夹竹桃麻素衍生物。
11.如权利要求4、5、9或10中任一项所述的方法，其特征在于，口服给予所述夹竹桃麻素衍生物。
12.一种以下结构所示的夹竹桃麻素衍生物或其前药、盐、溶剂化物或水合物：
Figure FPA00001491259000032
式中，R1是C＝O、(CH＝CH)或CH2，
R2是O、NH或COO，
R3是H、COCH3或CO(CH2)mCH3，
n是2-16，和
m是1-16。
13.一种药物剂型，其包含权利要求12所述的夹竹桃麻素衍生物和药学上合适的载体系统。
14.如权利要求13所述的药物剂型，其特征在于，所述剂型包括口服、注射、输注、吸入、透皮或植入物剂型。
15.一种增加哺乳动物脑中多巴胺含量的方法，包括给予治疗有效量的权利要求12所述的夹竹桃麻素衍生物。
16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，口服给予所述夹竹桃麻素衍生物。
17.一种增加哺乳动物脑细胞的线粒体中二羟基苯乙酸含量的方法，包括给予治疗有效量的权利要求12所述的夹竹桃麻素衍生物。
18.如权利要求17所述的方法，其特征在于，口服给予所述夹竹桃麻素衍生物。
19.一种以下结构所示的夹竹桃麻素衍生物或其前药、溶剂化物或水合物：
Figure FPA00001491259000041
式中，R1是H、COCH3或CO(CH2)mCH3，
R2是O或NH，
X-是Cl-、Br-或I-，
n是2-16，和
m是1-16。
20.如权利要求19所述的夹竹桃麻素衍生物或其前药、盐、溶剂化物或水合物，其特征在于，R1是H、COCH3或CO(CH2)mCH3，R2是O或NH，X-是Br-，n是2-16，m是1-16。
21.一种药物剂型，其包含权利要求19或20所述的夹竹桃麻素衍生物和药学上合适的载体系统。
22.如权利要求21所述的药物剂型，其特征在于，所述剂型包括口服、注射、输注、吸入、透皮或植入物剂型。
23.一种增加哺乳动物脑中多巴胺含量的方法，包括给予治疗有效量的权利要求19或20所述的夹竹桃麻素衍生物。
24.如权利要求23所述的方法，其特征在于，口服给予所述夹竹桃麻素衍生物。
25.一种增加哺乳动物脑细胞的线粒体中二羟基苯乙酸含量的方法，包括给予治疗有效量的权利要求19或20所述的夹竹桃麻素衍生物。
26.如权利要求25所述的方法，其特征在于，口服给予所述夹竹桃麻素衍生物。
27.一种以下结构所示的夹竹桃麻素衍生物或其前药、溶剂化物或水合物：
式中，n是1-16。
28.一种药物剂型，其包含权利要求27所述的夹竹桃麻素衍生物和药学上合适的载体系统。
29.如权利要求28所述的药物剂型，其特征在于，所述剂型包括口服、注射、输注、吸入、透皮或植入物剂型。
30.一种增加哺乳动物脑中多巴胺含量的方法，包括给予治疗有效量的权利要求27所述的夹竹桃麻素衍生物。
31.一种增加哺乳动物脑细胞的线粒体中二羟基苯乙酸含量的方法，包括给予治疗有效量的权利要求27所述的夹竹桃麻素衍生物。
32.如权利要求30或31所述的方法，其特征在于，口服给予所述夹竹桃麻素衍生物。
33.一种以下结构所示的夹竹桃麻素衍生物或其前药、盐、溶剂化物或水合物：
Figure FPA00001491259000061
34.一种药物剂型，其包含权利要求33所述的夹竹桃麻素衍生物和药学上合适的载体系统。
35.如权利要求34所述的药物剂型，其特征在于，所述剂型包括口服、注射、输注、吸入、透皮或植入物剂型。
36.一种增加哺乳动物脑中多巴胺含量的方法，包括给予治疗有效量的权利要求33所述的夹竹桃麻素衍生物。
37.一种增加哺乳动物脑细胞的线粒体中二羟基苯乙酸含量的方法，包括给予治疗有效量的权利要求33所述的夹竹桃麻素衍生物。
38.如权利要求36或37所述的方法，其特征在于，口服给予所述夹竹桃麻素衍生物。
39.一种减轻哺乳动物脑炎症或其影响的方法，包括给予该哺乳动物有效量的夹竹桃麻素衍生物，从而相比于具有脑炎症的未治疗动物，减轻脑炎症或其影响。
40.如权利要求39所述的方法，其特征在于，所述夹竹桃麻素衍生物包括夹竹桃麻素、二夹竹桃麻素、二夹竹桃麻素-乙酸酯、二夹竹桃麻素-二乙酸酯、线粒体-夹竹桃麻素、线粒体-二夹竹桃麻素、夹竹桃麻素-乙酸酯、线粒体-夹竹桃麻素-乙酸酯、线粒体-二夹竹桃麻素-乙酸酯和线粒体-二夹竹桃麻素-二乙酸酯中的至少一种。
41.如权利要求40所述的方法，其特征在于，所述夹竹桃麻素衍生物包括二夹竹桃麻素-二乙酸酯。
42.一种防止患者中脑炎症相关的病理生理性神经递质缺陷的方法，包括给予该患者有效量的夹竹桃麻素衍生物以防止病理生理性神经递质缺陷。
43.如权利要求42所述的方法，其特征在于，所述夹竹桃麻素衍生物包括夹竹桃麻素、二夹竹桃麻素、二夹竹桃麻素-乙酸酯、二夹竹桃麻素-二乙酸酯、线粒体-夹竹桃麻素、线粒体-二夹竹桃麻素、夹竹桃麻素-乙酸酯、线粒体-夹竹桃麻素-乙酸酯、线粒体-二夹竹桃麻素-乙酸酯和线粒体-二夹竹桃麻素-二乙酸酯中的至少一种。
44.如权利要求43所述的方法，其特征在于，所述夹竹桃麻素衍生物包括二夹竹桃麻素-二乙酸酯。
45.一种防止帕金森病患者的大脑中多巴胺水平降低的方法，包括给予该患者有效量的夹竹桃麻素衍生物以防止多巴胺水平降低。
46.如权利要求45所述的方法，其特征在于，所述夹竹桃麻素衍生物包括夹竹桃麻素、二夹竹桃麻素、二夹竹桃麻素-乙酸酯、二夹竹桃麻素-二乙酸酯、线粒体-夹竹桃麻素、线粒体-二夹竹桃麻素、夹竹桃麻素-乙酸酯、线粒体-夹竹桃麻素-乙酸酯、线粒体-二夹竹桃麻素-乙酸酯和线粒体-二夹竹桃麻素-二乙酸酯中的至少一种。
47.如权利要求46所述的方法，其特征在于，所述夹竹桃麻素衍生物包括二夹竹桃麻素-二乙酸酯。
48.一种延迟哺乳动物中神经变性的方法，包括给予该哺乳动物有效量的夹竹桃麻素衍生物，
其中所述神经变性由至少一种以下疾病所致：神经炎症、亨廷顿病、帕金森病、肌萎缩性侧索硬化症、多发性硬化症和阿尔茨海默病，和
其中延迟神经变性推迟了与至少一种以下疾病相关的疾病症状的发作或减轻其影响：神经炎症、亨廷顿病、帕金森病、肌萎缩性侧索硬化症、多发性硬化症和阿尔茨海默病。
49.如权利要求48所述的方法，其特征在于，所述夹竹桃麻素衍生物包括夹竹桃麻素、二夹竹桃麻素、二夹竹桃麻素-乙酸酯、二夹竹桃麻素-二乙酸酯、线粒体-夹竹桃麻素、线粒体-二夹竹桃麻素、夹竹桃麻素-乙酸酯、线粒体-夹竹桃麻素-乙酸酯、线粒体-二夹竹桃麻素-乙酸酯和线粒体-二夹竹桃麻素-二乙酸酯中的至少一种。
50.如权利要求49所述的方法，其特征在于，所述夹竹桃麻素衍生物包括二夹竹桃麻素-二乙酸酯。
51.一种延长患有神经变性疾病的哺乳动物的运动功能的方法，包括给予该哺乳动物有效量的夹竹桃麻素衍生物以延长该哺乳动物的运动功能。
52.如权利要求51所述的方法，其特征在于，所述夹竹桃麻素衍生物包括夹竹桃麻素、二夹竹桃麻素、二夹竹桃麻素-乙酸酯、二夹竹桃麻素-二乙酸酯、线粒体-夹竹桃麻素、线粒体-二夹竹桃麻素、夹竹桃麻素-乙酸酯、线粒体-夹竹桃麻素-乙酸酯、线粒体-二夹竹桃麻素-乙酸酯和线粒体-二夹竹桃麻素-二乙酸酯中的至少一种。
53.如权利要求52所述的方法，其特征在于，所述夹竹桃麻素衍生物包括二夹竹桃麻素-二乙酸酯。
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