CN109843896B - 羟基肉桂酸衍生物、方法及其用途 - Google Patents
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Abstract
本公开涉及作为趋线粒体性抗氧化剂起作用的新的羟基肉桂酸衍生物的设计和开发。此外,本公开还涉及羟基肉桂酸衍生物的方法和用途,例如,在人和动物疾病领域,例如治疗线粒体功能障碍或线粒体缺陷,以及化妆品领域,例如预防或延缓皮肤衰老。
Description
技术领域
本公开涉及作为趋线粒体性(mitochondriotropic,线粒体靶向)抗氧化剂起作用的新型羟基肉桂酸衍生物的设计和开发。此外,本公开还涉及羟基肉桂酸衍生物的方法和用途,例如,在人和动物疾病领域,例如治疗线粒体功能障碍或线粒体缺乏,以及化妆品,例如预防或延缓皮肤衰老。
背景技术
氧化应激是一个非常复杂的过程,它在不同方面影响生物系统。它对生物系统的影响取决于所涉及的氧化剂类型,其生产地点和强度,内源性抗氧化剂的组成和活性,以及修复系统的活性。氧化应激可以改变破坏正常动态平衡的细胞中的氧化还原信号,在某些情况下可导致严重的细胞损伤,因此与许多疾病,即与衰老有关的疾病相关1,2。
在病理事件中,内源性抗氧化剂防御库可能不足以应对氧化剂产生的增加,因此有人提出外源性抗氧化剂的使用可以有利于减少细胞损伤,因为它们不仅可以弥补内源性防御系统的不足,还提高了整体抗氧化反应。理论上,外源性抗氧化剂可阻断不同水平的氧化损伤通路的复杂网络,从而产生治疗效果。因此,从饮食中外源获得的抗氧化剂可能在氧化还原细胞稳态中具有重要功能,并且对于细胞功能和疾病预防可能是重要的。
抗氧化剂已被定义为当以低浓度存在时,与可氧化底物相比,显著延迟或阻止生物分子氧化的任何物质。抗氧化剂可以通过不同的机制发挥其作用,例如中和循环活性物质(清除活性),螯合过渡金属离子(螯合活性)和抑制参与活性物质生产的酶1,2。此外,抗氧化剂还可以增加内源性抗氧化系统的表达或活性。
抗氧化剂本身或与其他药物组合使用被认为有利于预防/减少与氧化应激有关的有害事件,即在相关疾病或过程中1。
酚类化合物是人类饮食中最重要的一类天然抗氧化剂。流行病学研究和相关的元研究表明,长期食用富含酚类食物或饮料的饮食对氧化应激相关疾病的发病有积极作用2。
羟基肉桂酸(HCAs)是天然和饮食中发现的主要酚类化合物之一。在HCAs中,咖啡酸和香豆酸是水果中含量最高的,占总HCAs含量的75%至100%。据估计,HCAs的膳食摄入总量为211毫克/天。在另一项研究中,作为实例,据报道,单独摄入咖啡酸的量为206毫克/天,咖啡、水果及其果汁是主要的膳食来源2。
羟基肉桂酸(HCAs)具有广泛的生物活性。众所周知,它们的抗氧化特性与多种作用机制相关,即直接自由基清除活性和/或其他间接作用,包括促氧化过渡金属(即铜和铁)的螯合,基因表达的调节(例如ARE/Nrf2通路)和自由基产生酶系统的抑制2。
酚类天然抗氧化剂,如羟基肉桂酸,在临床前研究中取得了普遍的成功,但在人类干预研究或临床试验中仍然没有什么好结果。在过去几年的临床试验中,迄今未获得积极/相关的结果。大多数研究表明,其中一些缺乏治疗优势。事实上,临床前研究中获得的结果与临床试验结果之间存在显著的不匹配。该差距不仅与临床试验中使用的方案有关,而且与评价评估中抗氧化剂的药代动力学抑制有关。与其他天然或膳食抗氧化剂类似,它们具有生物利用度缺点,即不能穿过生物屏障并到达细胞内靶位点2。另一方面,一些作者提出这种类型的天然抗氧化剂可能会改变特定细胞区室的正常氧化还原平衡,这将造成更多的伤害。另一种可能性是一些抗氧化剂没有到达自由基生成的相关位置,即线粒体实际上是活性氧(ROS)和氧化损伤的主要来源1,2。
线粒体功能,特别是其对细胞氧化还原/氧化平衡的影响,是控制细胞生命和死亡的基础。除了作为细胞化学能的主要来源外,线粒体还参与ROS的产生和解毒,调节与细胞稳态相关的多种信号通路,包括细胞存活,氧化还原平衡和细胞死亡3,4。尽管ROS产生受到内源性抗氧化网络的严格调节,但其破坏可导致线粒体氧化损伤和功能障碍。线粒体氧化功能障碍损害多种代谢和信号传导通路,并可通过细胞凋亡或坏死引发细胞死亡。
越来越多的证据表明,由增强的氧化应激引起的线粒体改变在例如癌症、中风、心力衰竭、肥胖、神经退行性疾病和衰老中发挥关键作用3,4。
虽然线粒体在疾病发病机制中的作用是相当主动的,但针对该细胞器以防止破坏并不总是直截了当的。通过预防/最小化氧化损伤来改善线粒体功能是有效且有前途的治疗策略。由于维持ROS/抗氧化剂比和氧化还原维持对细胞信号传导至关重要,因此将抗氧化剂靶向功能失调的线粒体具有药理学意义3,4。
正在开发许多靶向线粒体的抗氧化剂,特别是那些使用三苯基鏻(TPP)作为载体的抗氧化剂。这种类型的亲脂性阳离子可以利用内膜电势梯度(ΔΨ)穿过线粒体膜并在线粒体基质内积聚2,4。
最受研究的线粒体靶向抗氧化剂之一是Mitoquinone(MitoQ,MitoQ10,[10-(4,5-二甲氧基-2-甲基-3,6-二氧代-1,4-环己二烯-1-基)癸基]三苯基膦甲磺酸盐)。MitoQ由与10-碳烷基链(dTPP)间隔基和三苯基鏻(TPP)阳离子共价连接的内源性抗氧化剂部分(辅酶Q)构成。MitoQ正在针对不同的病理学进行临床试验,即针对丙型肝炎。然而,使用MitoQ作为神经退行性疾病的治疗解决方案的临床试验产生了令人失望的结果。
另一种相关的线粒体靶向抗氧化剂是SKQ1[10-(4,5-二甲基-3,6-二氧代环己-1,4-二烯-1-基)癸基)三苯基溴化鏻)],它基于质体醌,是一种在叶绿体的电子传递链中的醌。SkQ1显示可降低线粒体内的氧化应激,并显著保护干眼症。
然而,仍然需要有效且安全的线粒体调节剂用于治疗和其他应用,例如化妆品。
TPP用作载体也被示踪为将HCAs靶向线粒体的策略。在本发明中,我们的研究小组开发了一种基于咖啡酸的线粒体定向抗氧化剂的原型5。这里命名为AntiOxCIN1的化合物保留了母体化合物的抗氧化活性,同时更具亲脂性。AntiOxCIN1在线粒体中积聚并保护小鼠成肌细胞C2C12细胞对抗不同的氧化应激应激物,即H2O2和亚油酸-氢过氧化物。然而,AntiOxCIN1作为线粒体抗氧化剂的功效远达不到所期望的。
公开这些事实是为了说明本公开所解决的技术问题。
发明内容
线粒体以及细胞活性氧(ROS)和氧化还原平衡的控制是药物发现和开发的有吸引力的靶点。用调节剂靶向线粒体已被证明是一种有效的策略。在本发明中,进行了基于羟基肉桂酸的有力的和有效的线粒体抗氧化剂(AntiOxCINs)的合理设计。
在第一方面,本发明涉及开发通式所示的新型羟基肉桂酸衍生物:
或药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物、互变异构体、立体异构体,其中
R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7和R8彼此独立地选择;
R1、R2、R3、R4和R5选自H、卤素、羟基、甲基、甲氧基、氨基、羧酸或硝基;
R6、R7、R8为烷基链、烯基链、炔基链、取代的芳基或环状环;
R6和R7之间的键是单键、双键或三键,并且
条件是其中R6和R7之间的键是双键,R3=R2,不是OH,R1=R4,不是H,R6=R7,不是甲基,Z-是阴离子。
基于国际纯粹和应用化学联合会(IUPAC)的定义,烷基定义为通过从烷烃的任何碳原子除去氢原子而得到的单价基团-CnH2n+1。通过从直链烷烃的末端碳原子上除去氢原子得到的基团形成常规烷基(正烷基)亚类H(CH2)n。基团RCH2、R2CH(R≠H)和R3C(R≠H)分别是伯、仲和叔烷基。通过从芳烃(单环和多环芳烃)的环碳原子上除去氢原子得到芳基。
“烷基”包括“低级烷基”并延伸到覆盖具有最多30个碳原子的碳片段。烷基的实例包括辛基、壬基、降冰片基、十一烷基、十二烷基、十三烷基、十四烷基、十五烷基、二十烷基、3,7-二乙基-2,2-二甲基-4-丙基壬基、2-(环十二烷基)乙基、金刚烷基等。
“低级烷基”是指具有1至7个碳原子的烷基。低级烷基的实例包括甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、仲丁基和叔丁基、戊基、己基、庚基、环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、2-甲基环丙基、环丙基甲基等。
卤素是选自由以下组成的列表的元素:F、Cl、Br、I、At。
在一个实施方式中,R6和R7之间的键可以是单键或双键,条件是其中R6和R7之间的键是双键,R3=R2,不是OH,R1=R4,不是H,R6=R7且不是甲基。
在一个实施方式中,烷基链、烯基链或炔基链可以是C1-C30链,优选C1-C18链,更优选C2-C14链,甚至更优选C3-C12链或C6-C10链。
在一个实施方式中,烷基链可以是C6烷基链、C7烷基链、C8烷基链、C9烷基链或C10烷基链。
在一个实施方式中,取代的芳基可以是烷烃取代的芳基(alkane-arylsubstituted,烷烃-芳基取代的)、烯烃取代的芳基(alkene-aryl substituted,烯烃-芳基取代的)、或炔烃取代的芳基(alkyne-aryl substituted,炔烃-芳基取代的),优选C6-C10-芳基,优选苯基;苄基、苯乙基、苯丙基、苯丁基或苯己基,其任选被下列基团取代一次或多次:
a)C1-C6-烷基、C3-C8-环烷基、C6-C10-芳基、C6-C10-芳基-C1-C8-烷基、C1-C6-烷氧基、C6-C10-芳氧基、C6-C10-芳基-C1-C8-烷氧基、羟基、CO2H、C1-C6-烷氧基羰基、C6-C10-芳氧基羰基、C6-C10-芳基-C1-C8-烷氧基羰基、C1-C6-烷基羰基、C6-C10-芳基羰基、C6-C10-芳基-C1-C8-烷基羰基、C1-C6-烷基羧基、C6-C10-芳基羧基、C1-C6-烷基巯基、C6-C10-芳基巯基、C1-C6-烷基巯基羰基、C3-C8-环烷基巯基羰基、C6-C10-芳基巯基羰基、C1-C6-烷基巯基羧基、C6-C10-芳基巯基羧基、C1-C6-烷基磺酰基、C6-C10-芳基磺酰基、C1-C6-烷基亚磺酰氧基、C6-C10-芳基亚磺酰氧基;
其中每一个任选被C1-C6-烷基、C1-C6-烷氧基、COOH;任选被C1-C6-烷基取代一次或两次的CONH2;SO3H、氨基、硫醇、羟基、硝基、氰基、氟、氯、溴、碘、CF3或OCF3取代一次或多次;
其中几个这些任选的取代基可以结合形成稠合的饱和、不饱和或芳香族的非杂环(homo-ring,均环)或杂环体系;
或b)饱和的、不饱和的或芳族的杂环,其任选被C1-C6-烷基、C1-C6-烷氧基、COOH;任选取代一次或两次的CONH2取代一次或多次。
在一个实施方式中,环状环可以是环丙烷、环丁烷、环戊烷或环己烷。
在一个实施方式中,Z-阴离子选自以下列表:烷基磺酸根、芳基磺酸根、硝酸根或卤素,其中所述卤素可以是F、Cl或Br;烷基磺酸根或芳基磺酸根可选自以下列表:甲磺酸根、对甲苯磺酸根、乙磺酸根、苯磺酸根和2-萘磺酸根。
在一个实施方式中,R1、R2、R3、R4和R5可包含卤素,其中所述卤素为F、Cl或Br。
在一个实施方式中,R1和R5可以是H。
在一个实施方式中,R2和R3可以是OH。
在一个实施方式中,R4可以是H或OH。
在一个实施方式中,R6和R7可以是C1烷基链。
在一个实施方式中,R8可以是C2烷基链。
在一个实施方式中,该化合物可以是(E)-(6-(3-(3,4-二羟基苯基)丙-2-烯酰胺基)己基)三苯基鏻甲磺酸盐。
在一个实施方式中,该化合物可以是(E)-(8-(3-(3,4-二羟基苯基)丙烯酰胺基)辛基)三苯基鏻甲磺酸盐。
在一个实施方式中,该化合物可以是(E)-(6-(3-(3,4,5-三羟基苯基)丙-2-烯酰胺基)己基)三苯基鏻甲磺酸盐。
在一个实施方式中,该化合物可以是(E)-(8-(3-(3,4,5-三羟基苯基)丙烯酰胺基)辛基)三苯基鏻甲磺酸盐。
在一个实施方式中,该化合物可以是(E)-(10-(3-(3,4-二羟基苯基)丙烯酰胺基)癸基)三苯基鏻甲磺酸盐。
在一个实施方式中,该化合物可以是(E)-(10-(3-(3,4,5-三羟基苯基)丙烯酰胺基)癸基)三苯基鏻甲磺酸盐。
本公开还涉及现在公开用于医学或兽医学的任何化合物或相关化合物。
在一个实施方式中,所公开的化合物或相关化合物可用于调节线粒体形态和/或OXPHOS酶表达的至少一个方面。
在一个实施方式中,所公开的化合物或相关化合物可用于治疗或预防或抑制与线粒体紊乱或通常与线粒体功能障碍相关的病症相关的症状,包括源自线粒体呼吸链缺陷的疾病。
在一个实施方式中,线粒体紊乱是选自由以下组成的组的紊乱:肌阵挛性癫痫;肌阵挛性癫痫伴破碎红纤维综合症(MERRF);莱伯氏遗传性视神经病变(LHON);神经病变性共济失调和视网膜色素变性(NARP);线粒体肌病、脑病、乳酸中毒、中风(MELAS);Leigh综合征;Leigh样综合征;显性视神经萎缩(DOA);Kearns-Sayre综合征(KSS);母系遗传性糖尿病和耳聋(MIDD);Alpers-Huttenlocher综合征;共济失调神经病谱;慢性进行性眼外肌麻痹(CPEO);皮尔逊综合征;线粒体神经-胃肠道脑病(MNGIE);Sengers综合征;Leigh样综合症的3-甲基戊二酸尿症,感音神经性耳聋,脑病和神经放射学发现(MEGDEL);肌病;线粒体肌病;心肌病;和脑肌病,SURF1(由于复杂的IV过量蛋白质缺乏引起的COX缺乏性Leigh综合征)和分离或组合OXPHOS缺陷与迄今未解决的遗传缺陷,包括扰乱的丙酮酸氧化和ATP加PCr生成率。
在一个实施方式中,与线粒体功能障碍相关的病症可以是选自由以下组成的组的病症:弗里德赖希的共济失调(FRDA);肾小管酸中毒;帕金森病;阿尔茨海默氏病;肌萎缩侧索硬化症(ALS);亨廷顿氏病;发育性普遍性疾病;听力损失;耳聋;糖尿病;衰老;和药物不良反应阻碍线粒体功能。
在一个实施方式中,现在公开的化合物或相关化合物可用于治疗或预防神经变性疾病、瘤形成、肾病、硬皮病、肝铁超负荷疾病、肝铜超负荷疾病、脱发、人类不育、急性胰腺炎、纤维肌痛或与线粒体氧化性疾病有关的其他疾病。
在一个实施方式中,本发明公开的化合物或相关化合物可用于治疗非酒精性脂肪肝疾病,即非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)或肝硬化等。
在一个实施方式中,本发明公开的化合物或相关化合物可用于瘤形成,即其中瘤形成疾病是癌症,特别是基底细胞癌、骨癌、肠癌、脑癌、乳腺癌、宫颈癌、白血病、肝癌、肺癌、淋巴瘤、黑素瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、甲状腺癌或胆道癌等。
在一个实施方式中,本发明公开的化合物或相关化合物可用于肾相关疾病,即肾衰竭等。
在一个实施方式中,本发明公开的化合物或相关化合物可用于肌萎缩侧索硬化。
在一个实施方式中,本发明公开的化合物或相关化合物可以用作抗微生物剂,特别是用作消毒剂。
在一个实施方式中,本发明公开的化合物或相关化合物可用于维持多能细胞培养物,作为细胞培养物的补充物,特别是作为生长培养基组分。
在一个实施方式中,本发明公开的化合物或相关化合物可用于在体育锻炼后加速肌肉恢复。
在一个实施方式中,本发明公开的化合物或相关化合物可用作化妆品、补充剂或营养品的活性成分,即作为抗衰老或抗皱护肤成分或产品。
在一个实施方式中,本发明公开的化合物或相关化合物可以用作成像研究中的探针,特别是用于监测线粒体成像研究。
本公开还涉及用于维持未分化状态的多能干细胞的细胞培养基,其包含本发明公开的任何化合物或相关化合物。
本公开还涉及药物组合物,其包含本发明公开的任何化合物或相关化合物和一种或多种药学上可接受的载体、佐剂、赋形剂、稀释剂或其混合物等。
在一个实施方式中,药学上可接受的载体可选自以下列表:盐水、阿拉伯树胶、明胶、淀粉糊、滑石、角蛋白、胶体二氧化硅、尿素或其混合物等。
在一个实施方式中,佐剂可选自以下列表:水包油乳液佐剂、铝佐剂、TLR-4配体、皂苷及其混合物等。
在一个实施方式中,赋形剂可选自以下列表:葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘油单硬脂酸酯、氯化钠、甘油、丙烯、二醇、水、乙醇或其混合物等。
在一个实施方式中,药物组合物可以局部、口服、胃肠外或注射给药。
在一个实施方式中,药物组合物可用于例如治疗或预防神经变性疾病、非酒精性脂肪肝病、瘤形成、肾病、硬皮病、肝铁超负荷疾病、肝铜超负荷疾病、脱发、人类不育、急性胰腺炎或纤维肌痛的方法中,其中药物组合物以日剂量给药。
在一个实施方式中,所述药物组合物的日剂量可以是20mg/天或10mg/天等。
本发明还提供纳米载体,例如脂质体,其中所述纳米载体或所述脂质体包含本发明公开的化合物或相关化合物或药物组合物。
在一些实施方式中,组合物在本受试物质中可以包含公开的化合物或相关化合物,在受试物质中其量能够有效地提高其他疗法(包括免疫疗法或任何药理学方法)的功效至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、至少95.7%、至少98%或至少99%。
在一些实施方式中,组合物包含0.1-1000mg的剂量。例如,在一些实施方式中,制剂包含0.1mg/kg、0.2mg/kg、0.3mg/kg、0.4mg/kg、0.5mg/kg、0.7mg/kg、0.8mg/kg、0.9mg/kg、1mg/kg、2mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、5mg/kg、6mg/kg、7mg/kg、8mg/kg、9mg/kg、10mg/kg、11mg/kg、12mg/kg、13mg/kg、14mg/kg、15mg/kg、16mg/kg、17mg/kg、18mg/kg、19mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、30mg/kg、40mg/kg、50mg/kg、60mg/kg、70mg/kg、80mg/kg、90mg/kg、100mg/kg、200mg/kg、250mg/kg、300mg/kg、400mg/kg、500mg/kg、600mg/kg、700mg/kg、750mg/kg、800mg/kg、900mg/kg或1000mg/kg的剂量。在一些实施方式中,组合物包含0.1-10mg/kg、0.1-100mg/kg、1-10mg/kg、1-100mg/kg、1-1000mg/kg、10-100mg/kg、10-1000mg/kg、100-1000mg/kg、10-50mg/kg、10-25mg/kg、10-20mg/kg、50-100mg/kg或100-250mg/kg的剂量。
优选的给药途径包括但不限于口服、肠胃外、肌肉内、静脉内、原位注射、鼻内、舌下、气管内、吸入或局部给药。
在一些实施方式中,剂量或剂型可以给药于受试者,例如,每天一次、每天两次或每天三次。在其他实施方式中,剂量是每周一次、每月一次、每两个月一次、一年四次、一年三次、一年两次或一年一次给药于受试者。
在整个说明书和权利要求书中,词语“包含”和该词语的变体并不旨在排除其他技术特征、添加剂、组分或步骤。本发明公开的解决方案的其他目的、优点和特征对于本领域技术人员来说在阅读说明书后将变得显而易见,或者可以通过实践该解决方案而获得。
附图说明
以下附图提供了用于说明说明书的优选实施方式,并且不应视为限制本公开的范围。
图1:获得多个AntiOxCINs的合成策略。试剂和条件:i)氯甲酸乙酯,氨基醇,室温;ii)甲磺酰氯,室温;iii)三苯基膦,150℃(微波,1小时30分钟)或130℃(18小时);或iv)BBr3,从-70℃(10分钟)到室温(12小时)。
图2:咖啡酸、AntiOxCINs和MitoQ的铁螯合特性的评价。EDTA(螯合剂)用作参考。使用单向ANOVA与对照组相比具有统计学显著性(P<0.0001,n.s.,不显著)。
图3:(A)使用TPP选择性电极测量的通电的大鼠肝线粒体对AntiOxCINs的摄取。(B)AntiOxCINs芳香环模式取代和烷基碳侧链对亲脂性(---)和线粒体积聚比(—)的影响。(C)大鼠肝线粒体的AntiOxCINs积聚比。MIT,线粒体;SUC,琥珀酸盐;VAL,缬氨霉素。
图4:咖啡酸、AntiOxCINs和MitoQ对不同氧化条件下线粒体脂质过氧化的影响:(A)TBARS水平和(B)氧消耗的变化。使用单向ANOVA进行对照组与AntiOxCINs(5μM)预培养液之间的比较。
图5:(A)咖啡酸、(B)dTPP和MitoQ以及含有(C)儿茶酚或(D)连苯三酚核的AntiOxCINs对ADP和Fe2+以及后续氧消耗诱导的RLM膜脂质过氧化后的影响。
图6:MitoQ和AntiOxCINs对5mM琥珀酸盐支持的RLM呼吸的影响。(A)MitoQ的影响(白色,对照组;水平图案,2.5μM,垂直图案,5μM);(B-H),AntiOxCINs的影响(白色,对照组;水平图案,2.5μM,垂直图案,5μM,方格图案,10μM)。使用学生双尾t检验确定相对于不同呼吸速率/状态的统计学显著性。
图7:在诱导线粒体通透性转换孔(mPTP)后,AntiOxCINs和MitoQ对线粒体肿胀的影响。将(A)2.5μM,(B)5μM和(C)10μM的AntiOxCINs和MitoQ与RLM预培养5分钟,然后加入钙。使用单向ANOVA比较对照组(仅Ca2+)与在Ca2+之前预培养的AntiOxCIN衍生物的测定组。CsA-环孢菌素A。
图8:(A)AntiOxCIN4(■)和AntiOxCIN6(●)对肝细胞癌细胞(HepG2)的细胞毒性特征,使用单向ANOVA与对照组相比具有统计学显著性。(B)AntiOxCIN4和AntiOxCIN6对过氧化铁和过氧化氢诱导的HepG2细胞损伤的影响,使用单向ANOVA比较对照组(FeSO4或H2O2)与预培养的AntiOxCINs制剂。(C)AntiOxCIN4和AntiOxCIN6(分别为100μM和2.5μM)不干扰正常的核形态和线粒体极化。
具体实施方式
在一个实施方式中,作为实例,图1中描绘了用于开发大量肉桂酸亲脂性阳离子抗氧化剂(AntiOxCINs)的合成策略。在该实例中,用作原料的二(1)或三甲氧基肉桂酸(2)通过酰胺化反应与具有可变长度的合适的双官能化烷基间隔基连接(肉桂酸衍生物3-8)。然后,用离去基团(-OSO2CH3)活化衍生物的醇官能团,得到肉桂酸衍生物9-14。然后通过与三苯基膦(PPh3)的亲核取代反应置换末端基团,以在传统或微波辅助反应中获得三苯基鎓阳离子15-20。微波辐射的使用能够在加速的环境友好工艺中获得AntiOxCINs前体。反应时间为1小时30分钟,而传统反应需要18小时。最后,使用三溴化物(BBr3)溶液通过去甲基化反应获得AntiOxCINs(AntiOxCIN2至AntiOxCIN7)。
在一个实施方式中,作为实例,报道了AntiOxCINs的抗氧化、氧化还原和亲脂性质。咖啡酸和AntiOxCIN1也包括在该研究中。结果如表1所示。
表1.AntiOxCINs的抗氧化、氧化还原和亲脂性质
在一个实施方式中,通过体外非细胞方法建立AntiOxCINs抗氧化剂等级活性等级。选择的总抗氧化能力(TAC)测定(DPPH,ABTS和GO)包括通过抗氧化剂原位自由基失活导致的自由基吸光度降低的分光光度测量。具有较高抗氧化活性的化合物显示较低的IC50值。抗氧化剂数据(表1)可以得出结论,与咖啡酸和AntiOxCIN1相比,AntiOxCINs是有效的抗氧化剂,并且获得的IC50值在三种不同的测定中遵循相同的趋势。数据清楚地表明,包含邻苯三酚体系(AntiOxCIN4、AntiOxCIN5和AntiOxCIN7)的系列显示出比它们的儿茶酚(AntiOxCIN2、AntiOxCIN3和AntiOxCIN6)对应物更高的抗氧化活性。通常,引入三苯基鏻(TPP)脂肪族侧链导致与咖啡酸相比,抗氧化活性略有下降。通过增加间隔基长度和/或在芳环中引入另外的羟基来减弱/改善这种降低。
在一个实施方式中,AntiOxCIN4、AntiOxCIN5和AntiOxCIN7具有与咖啡酸和AntiOxCIN1相似或更优的抗氧化活性。在间隔基长度中进行的化学变化对自由基清除能力没有负面影响。相反,对于具有长烷基间隔基的化合物,观察到更高的抗氧化能力。
在一个实施方式中,作为实例,评估了AntiOxCINs的氧化还原性质(表1)。氧化还原电位与抗氧化剂向自由基提供氢原子和/或电子的能力相关。通常,低氧化电位(Ep)与优异的抗氧化性能相关。
在一个实施方式中,通过差示脉冲和循环伏安法在生理pH(7.4)下获得的氧化还原数据得出结论:咖啡酸及其儿茶酚类似物(AntiOxCIN1、AntiOxCIN2、AntiOxCIN3和AntiOxCIN6)显示儿茶酚组存在的氧化还原电位(Ep)特征。(Ep=0.164-0.174V)(表1)。然而,对于连苯三酚衍生物(AntiOxCIN4、AntiOxCIN5和AntiOxCIN7),观察到氧化还原电位的显著降低(Ep=0.034-0.057V)(表1)。
在一个实施方式中,循环伏安法数据得出结论:咖啡酸及其儿茶酚类似物(AntiOxCIN1、AntiOxCIN2、AntiOxCIN3和AntiOxCIN6)经历可逆反应,因为反向扫描中观察到单个阳极峰和一个阴极峰。在所有体系中,氧化机理与咖啡酸提出的机理相当,因为它每分子包含两个电子,这可能对应于半醌基团的形成及其随后氧化成正醌。
在一个实施方式中,邻苯三酚体系(AntiOxCIN4、AntiOxCIN5和AntiOxCIN7)似乎经历不可逆的氧化反应,因为在阴极扫描上看到还原波。对于这种类型的体系,使用差分脉冲伏安法在生理pH下仅观察到一个阳极峰。伏安图表示扩散峰和在峰值附近的吸附峰值,其阳极电位分别对应于化合物的溶解和吸附形式的氧化。氧化波可与邻苯三酚部分的氧化过程有关。循环伏安图还显示存在两个重叠的阳极峰。阳极峰似乎对应于不可逆过程,因为在阴极扫描中没有看到任何明显的还原波。与邻苯二酚相比,邻苯三酚体系中其他酚基团的存在似乎影响了半醌中间体的稳定化,进而影响了氧化机理。
在一个实施方式中,用TAC测定获得的数据与AntiOxCINs氧化还原特征一致。总的来说,结果强化了肉桂芳环上存在的羟基取代基的数量与抗氧化性和电化学性质直接相关的假设。
在一个实施方式中,通过电化学在生理pH下评估AntiOxCINs的亲脂性质。所使用的技术通常用于模拟离子药物通过生物膜的转移,因为该过程发生在两种不混溶的电解质溶液(ITIES)之间的界面处。通过差示脉冲伏安法(DPV)测量最初存在于水相(C=0.32mM)中的离子药物转移至1,6-二氯己烷(DCH)相的转移电位(Etr)。在ITIES模型中,随着药物亲脂性的增加,转移电位(Etr)变得不太正。
在一个实施方式中,作为实例,获得的AntiOxCINs转移电位(Etr)显示在表1中。通常,观察到AntiOxCINs亲脂性的增量是烷基间隔基长度的函数。在AntiOxCINs系列中观察到这种行为,AntiOxCIN1是亲脂性较低的化合物。正如所料,咖啡酸不会渗透。对于基于儿茶酚的系列,相对亲脂性按以下顺序增加:AntiOxCIN1<AntiOxCIN2<AntiOxCIN3<AntiOxCIN6和基于连苯三酚的系列:AntiOxCIN4<AntiOxCIN5<AntiOxCIN7。对于相同的间隔基长度增量(例如相比AntiOxCIN6和AntiOxCIN7),引入其他OH功能,增加了AntiOxCINs的亲水性。
在一个实施方式中,作为实例,测定了AntiOxCINs的螯合特性,即它们螯合铁的能力。铁是一种氧化还原活性金属,可催化Fenton和Hɑber-Weiss反应产生羟基自由基(●OH),这是一种强氧化物种,与氧化损伤事件有关,对人类健康和疾病具有严重影响。需要注意的是,线粒体铁稳态的丧失和随之而来的铁过载可能导致线粒体功能障碍,进而导致不同的病变。因此,这种或多种机制起作用的金属螯合剂或抗氧化剂能够在预防金属诱导的毒性的治疗方法中发挥作用。
在一个实施方式中,使用乙二胺四乙酸(EDTA)作为参考,通过铁嗪测定评估AntiOxCINs铁(II)螯合性质。还评估了咖啡酸和MitoQ的铁螯合性质。发现EDTA能够螯合溶液中的所有铁,因为它可以完全抑制有色的铁嗪-Fe(II)络合物的形成。
在一个实施方式中,与MitoQ相反的AntiOxCINs(儿茶酚或连苯三酚系列)和咖啡酸能够类似EDTA,螯合亚铁(图2)。尽管对AntiOxCINs进行了化学修饰,但与螯合剂EDTA和咖啡酸类似,新型衍生物仍具有螯合铁的显著能力(图2)。AntiOxCIN2和AntiOxCIN4显示出比咖啡酸本身更高的铁螯合活性。
在一个实施方式中,突出显示MitoQ不具有AntiOxCINs的螯合特性。这种特定的AntiOxCINs特性可以构成治疗涉及铁超负荷的线粒体和代谢紊乱的重要特征。
在一个实施方式中,作为实例,响应于膜电位,在分离的大鼠肝线粒体(RLM)中评估线粒体AntiOxCINs摄取。AntiOxCINs可以在ΔΨ驱动的线粒体内积聚(图3A)。已经注意到线粒体基质内的不同AntiOxCINs积聚特征。发现该过程与间隔基长度的增加和芳族取代模式有关,并且与AntiOxCINs亲脂性直接相关(图3B和3C,表1)。然而,AntiOxCINs亲脂性的线性增加并未直接转化为线粒体基质积聚比率的增加(图3B)。达到以下排序顺序:AntiOxCIN1<AntiOxCIN2<AntiOxCIN6<AntiOxCIN3(儿茶酚系列);AntiOxCIN4<AntiOxCIN7<AntiOxCIN5(连苯三酚系列)(图3C)。虽然AntiOxCIN6和AntiOxCIN7是最亲脂的化合物,但它们表现出较低的积聚比,可能是由于截止膜效应。尽管化学结构差异,AntiOxCIN2、AntiOxCIN6和AntiOxCIN4显示出大致相同的积聚比率。所有AntiOxCINs都具有与MitoQ相当的积聚比,并且高于AntiOxCIN1(图3C)。
线粒体膜具有高浓度的多不饱和脂肪酸,因为它们位于ROS产生位点附近,所以特别容易氧化。
在一个实施方式中,作为实例,测定了AntiOxCINs抗氧化性能,对RLM膜的脂质过氧化作用的保护。分别使用两种不同的氧化应激剂,FeSO4/H2O2/抗坏血酸盐和ADP/FeSO4,以及两个终点,TBARS产生和氧消耗。MitoQ用作参考(图4和5)。
在一个实施方式中,发现在FeSO4/H2O2/抗坏血酸测定中的AntiOxCIN2(儿茶酚系列)和AntiOxCIN7(连苯三酚系列)是预防线粒体脂质过氧化的最有效的线粒体亲和性肉桂酸衍生物(图4A)。在ADP/FeSO4测定中,AntiOxCINs预防脂质过氧化的效率遵循相同的趋势(图4B和5A-D)。AntiOxCINs与MitoQ抑制RLM中脂质过氧化的能力按照以下顺序降低:MitoQ>AntiOxCIN7>AntiOxCIN2>>AntiOxCIN4≈AntiOxCIN5>AntiOxCIN6≈AntiOxCIN3>AntiOxCIN1>咖啡酸。除AntiOxCIN2外,基于邻苯三酚的AntiOxCINs(图4和5D)在延迟脂质过氧化膜过程方面更有效,其具有比咖啡酸更高的性能。
由于细胞代谢依赖于线粒体的适当功能,因此化合物对线粒体功能参数的影响可以提供关于其毒性特征的信息。因此,评估了它们通过破坏线粒体内膜或通过抑制呼吸链、ATP合成、线粒体通透性转换孔(mPTP)过程或输出机制来诱导线粒体功能障碍的能力。
在一个实施方式中,作为实例,测量AntiOxCINs和MitoQ对线粒体生物能学的毒性作用,即对RLMΔΨ和线粒体呼吸参数的影响。ΔΨ代表线粒体呼吸产生的电化学梯度的主要分量,占总可用能量的大于90%。对于线粒体呼吸测定,使用谷氨酸盐/苹果酸盐(复合物I)和琥珀酸盐(复合物II)作为底物。此外,还计算了线粒体氧化磷酸化偶联指数,称为呼吸控制比(RCR,状态3/状态4呼吸)和ADP/O指数(ATP合成与氧消耗之间的耦合)。在抗氧化剂相关浓度下测试AntiOxCINs和MitoQ,其中10μM是最高浓度。
在一个实施方式中,针对MitoQ获得的线粒体生物能学数据显示在(表2)中。获得的结果已用于比较分析。
表2.MitoQ对线粒体生物能量学性质:线粒体呼吸控制比(RCR),磷酸化系统的效率(ADP/O)和线粒体跨膜电位(ΔΨ)的影响。*,**,***,****使用学生双尾t检验与对照组相比具有统计学意义。
在一个实施方式中,观察到所有测试浓度的MitoQ引起RCR和ADP/O参数的显著降低(表2)。此外,当使用谷氨酸盐/苹果酸盐作为底物,RLM与浓度高达5μM的MitoQ一起培养时,观察到状态2,状态4和寡霉素抑制呼吸的增加以及状态3和FCCP-未偶联呼吸的减少(图6A)。当使用琥珀酸盐时,在测试的最高浓度的MitoQ存在下,RLM完全解偶联(图6A)。随着MitoQ浓度增加的培养使得通电时获得的最大ΔΨ的逐渐减小(表2)。MitoQ(5μM)也降低了ΔΨ线粒体恢复到与对照组相似的值的能力。用10μM MitoQ观察到ADP添加后的ΔΨ塌陷,因为在ADP诱导的去极化后没有发生复极化(表2)。
在一个实施方式中,AntiOxCINs毒性研究中使用的最高浓度是MitoQ完全破坏线粒体生物能量学的浓度。AntiOxCINs毒性研究的数据显示在表3至9中。AntiOxCIN1也包括在上述用于比较分析的研究中(表3)。
表3.AntiOxCIN1对线粒体生物能量学性质:线粒体呼吸控制比(RCR),磷酸化系统的效率(ADP/O)和线粒体跨膜电位(ΔΨ)的影响。*,**,***使用学生双尾t检验与对照组相比具有统计学意义。
表4.AntiOxCIN2对线粒体生物能量学性质:线粒体呼吸控制比(RCR),磷酸化系统的效率(ADP/O)和线粒体跨膜电位(ΔΨ)的影响。*,**,***使用学生双尾t检验与对照组相比具有统计学意义。
表5.AntiOxCIN3对线粒体生物能量学性质:线粒体呼吸控制比(RCR),磷酸化系统的效率(ADP/O)和线粒体跨膜电位(ΔΨ)的影响。*,**使用学生双尾t检验与对照组相比具有统计学意义。
表6.AntiOxCIN6对线粒体生物能量学性质:线粒体呼吸控制比(RCR),磷酸化系统的效率(ADP/O)和线粒体跨膜电位(ΔΨ)的影响。*,**,***使用学生双尾t检验与对照组相比具有统计学意义。
表7.AntiOxCIN4对线粒体生物能量学性质:线粒体呼吸控制比(RCR),磷酸化系统的效率(ADP/O)和线粒体跨膜电位(ΔΨ)的影响。*,**使用学生双尾t检验与对照组相比具有统计学意义。
表8.AntiOxCIN5对线粒体生物能量学性质:线粒体呼吸控制比(RCR),磷酸化系统的效率(ADP/O)和线粒体跨膜电位(ΔΨ)的影响。*.**使用学生双尾t检验与对照组相比具有统计学意义。
表9.AntiOxCIN7对线粒体生物能量学性质:线粒体呼吸控制比(RCR),磷酸化系统的效率(ADP/O)和线粒体跨膜电位(ΔΨ)的影响。*,**使用学生双尾t检验与对照组相比具有统计学意义。
在一个实施方式中,作为实例,状态2、状态3、状态4、寡霉素抑制的呼吸和线粒体呼吸测定以及琥珀酸盐(用作底物FCCP刺激的呼吸)的AntiOxCINs和MitoQ速率显示在图6A-H中。
在一个实施方式中,发现AntiOxCINs以剂量依赖性方式诱导呼吸链的改变。通常,AntiOxCINs在浓度高于2.5μM的过程中增加状态2、状态4和寡霉素抑制的呼吸,该过程主要取决于它们的亲脂性并且不依赖于它们的芳香模式(儿茶酚相对邻苯三酚)(图6B-H)。观察到对状态3呼吸的双重剂量依赖性影响,由较少亲脂性化合物(AntiOxCIN2和AntiOxCIN4)引起的减少,以及对于所有测试浓度具有更高亲脂性AntiOxCINs(AntiOxCIN3、AntiOxCIN6、AntiOxCIN5和AntiOxCIN7)的增加(2.5-10μM)(图6B-H)。
在一个实施方式中,显示AntiOxCINs诱导分离的RLM的呼吸谱的剂量依赖性改变。可能一些观察到的效应可能是由膜透化作用或质子穿梭活动引起的。这种效应可能导致非磷酸化呼吸的刺激和小的ΔΨ去极化。因此,对于一些AntiOxCINs,通过ADP/O比评估的线粒体磷酸化系统也受到影响。观察到对状态3呼吸的双重剂量依赖性影响,由较少亲脂性化合物(AntiOxCIN2和AntiOxCIN4)引起的呼吸状态减少,并且用更亲脂的AntiOxCINs(AntiOxCIN3、AntiOxCIN6、AntiOxCIN5和AntiOxCIN7)观察到状态3呼吸的相关增加)(图6)。
在一个实施方式中,作为实例,测量AntiOxCINs对ΔΨ的直接影响(表3-9)。加入AntiOxCINs后,无论使用何种底物,都发现ΔΨ变化相似。一般而言,尽管RLM分别与2.5μMAntiOxCIN3(表5)和AntiOxCIN6(表6)或AntiOxCIN5(表8)和AntiOxCIN7(表9)的培养促进了10或25mV的初始轻微超极化,但AntiOxCINs引起轻微的剂量依赖性ΔΨ去极化。然而,用AntiOxCIN6(浓度高于5μM)(表6)和AntiOxCIN7(10μM)培养导致琥珀酸盐激活的线粒体中ΔΨ的显著降低。
在一个实施方式中,建立了线粒体生物能学装置上的AntiOxCINs排序毒性等级:AntiOxCIN1<AntiOxCIN2<AntiOxCIN3<AntiOxCIN6(儿茶酚系列);AntiOxCIN4<AntiOxCIN5<AntiOxCIN7(连苯三酚系列)。
在一个实施方式中,在较高浓度下观察到的AntiOxCINs线粒体毒性可能与间隔基的亲脂性和/或TPP部分的存在相关,并且与它们(儿茶酚对邻苯三酚)几乎没有关系(如果有的话)。事实上,咖啡酸对线粒体生物能量装置显示出低毒性。尽管如此,TPP阳离子和亲脂性间隔基的存在对于有效且有时广泛的线粒体积聚是必需的。
在一个实施方式中,发现在较高浓度下,线粒体靶向抗氧化剂,AntiOxCINs和MitoQ可通过在线粒体内膜中引起损伤或通过抑制呼吸链,ATP合成或输出机制来破坏线粒体呼吸。
在一个实施方式中,必须强调MitoQ在5μM下有效抑制RLM中的脂质过氧化(图4和5),但在2.5μM下对RLM的线粒体生物能量装置产生毒性(图6A和表2)。
在一个实施方式中,得出结论,必须沿着药物发现优化过程获得合适的亲脂平衡,以规避线粒体抗性抗氧化剂的毒性。
在一个实施方式中,得出结论,对于研究中的AntiOxCINs,RLM毒性的检测浓度高于发挥抗氧化作用所需的浓度,与其机理无关。
在一个实施方式中,得出结论,通常AntiOxCINs显示出比MitoQ更好的安全性。
在一个实施方式中,评估了AntiOxCINs对线粒体通透性转换孔(mPTP)开孔的影响。通常,对于所有测试浓度,亲脂性较低的AntiOxCINs对mPTP开孔没有影响(图7A-C)。
在一个实施方式中,发现更亲脂的AntiOxCINs(AntiOxCIN3、AntiOxCIN5、AntiOxCIN6、AntiOxCIN7)引起钙依赖性mPTP开孔的抑制。对于基于儿茶酚的化合物,其效果类似于环孢菌素A(1μM),一种传统的mPTP脱敏剂。MitoQ对mPTP诱导没有影响(图7A-C)。该性质可具有治疗意义,例如预防和治疗移植物中的移植物抗宿主排斥,其通常涉及移植物中的线粒体破坏。
在一个实施方式中,作为实例,使用来自肝细胞癌(HepG2)的人肝细胞的单层培养物和SRB方法(图8A)评估两种AntiOxCINs(AntiOxCIN4和AntiOxCIN6)的细胞毒性。从数据可以得出结论,在对抗HepG2细胞时,AntiOxCIN6(包含儿茶酚部分)表现出比AntiOxCIN4(含有连苯三酚部分)更高的毒性(图6A)。值得注意的是,在高于2.5μM的浓度时,AntiOxCIN6抑制细胞增殖,而在高于100μM的浓度下,AntiOxCIN4刺激细胞增殖。
在一个实施方式中,得出结论,基于其亲脂性质(表1)和RLM积聚速率(图3),可以通过由儿茶酚氧化还原化学性(这种性质通常与有害作用相关)的存在介导的其他过程介导的AntiOxCIN6毒性。
在一个实施方式中,作为实例,使用来自肝细胞癌(HepG2)的人肝细胞的单层培养物和两种不同氧化应激物(250μM FeSO4或250μM H2O2)评估AntiOxCIN4和AntiOxCIN6的抗氧化细胞特征(图8B)。两种AntiOxCINs均显著阻止过氧化铁和过氧化氢诱导的HepG2细胞毒性,表达为细胞增殖结果(图6B)。AntiOxCIN4的较高功效与从TAC测定(表1)和RLM测定(图4)获得的数据一致。
在一个实施方式中,作为实例,已经确定了线粒体网络的形态学变化和AntiOxCIN4和AntiOxCIN6的核染色质浓缩。用AntiOxCINs处理HepG2细胞48小时,然后与线粒体ΔΨ依赖性荧光探针TMRM和DNA染料Hoechst 33342一起培养。结果显示,AntiOxCIN4(100μM)和AntiOxCIN6(2.5μM)不诱导HepG2中的线粒体去极化的核形态变化(图8C)。
在一个实施方式中,得出结论,AntiOxCIN1的定制结构修饰导致其线粒体特性的显著改善。一些AntiOxCINs具有增加的抗氧化活性,更高的线粒体积聚和更低的毒性。
在一个实施方式中,来自AntiOxCINs系列的AntiOxCIN4(基于连苯三酚的类似物)被预测为开发具有线粒体氧化相关病症中的治疗应用的第一类药物的潜在候选物。AntiOxCIN4不会干扰线粒体形态和极化,并且显示出MitoQ不具备的显著的铁螯合特性。AntiOxCIN4可用于减轻线粒体铁超负荷和/或减少氧化应激相关疾病和病症中线粒体铁储备的影响。
提供了获得的合成程序的实例和许多中间体和AntiOxCINs。
在一个实施方式中,通过光谱分析方法获得化合物的结构表征。1H和13C NMR光谱在室温下获得,并分别记录在400和100MHz下运行的Bruker Avance III上。化学位移以δ(ppm)值表示,相对于四甲基硅烷(TMS)作为内部参考,偶合常数(J)以Hz给出。分配也来自DEPT(通过极化转移的无失真增强)(带下划线的值)。在Bruker Microtof(ESI)或Varian320-MS(EI)装置上记录质谱(MS),并以重要片段的m/z(%相对)表示。
在一个实施方式中,微波辅助的所有过程均在Biotage Initiator微波合成仪中进行。
在一个实施方式中,通过薄层色谱(TLC)分析在铝硅胶片60F254板(Merck,Darmstadt,Germany)上在二氯甲烷、乙酸乙酯和二氯甲烷/甲醇中以几个比例评估反应进程。使用UV检测(254和366nm)检测斑点。使用硅胶60(0.040-0.063mm)(Cɑrlo ErbaReactifs-SDS,France)进行快速柱色谱。
在一个实施方式中,获得肉桂酸酰胺(化合物3-8,图1)的一般合成方法如下:将(1mmol)3,4-二甲氧基肉桂酸(1),或3,4,5-三甲氧基肉桂酸(2)溶于二氯甲烷(10ml)和三乙胺(2mmol)中。将搅拌的溶液保持在冰浴中,滴加氯甲酸乙酯(2mmol)。在室温下搅拌2小时后,将混合物在冰浴中冷却,并逐滴加入假氨基醇(2mmol)。在室温下搅拌反应10小时。中和后,将溶剂部分蒸发,并将反应混合物用二氯甲烷(3×20mL)萃取。合并有机相,用水(3×20mL),10%碳酸氢钠水溶液(NaHCO3)(2×20mL)洗涤,并用无水硫酸钠(Na2SO4)干燥。过滤后,蒸发溶剂,得到期望的化合物。
在一个实施方式中,(E)-3-(3,4-二甲氧基苯基)-N-(6-羟基己基)丙-2-烯酰胺(3)的产率为81%。该化合物的结构表征如下:1H(400MHz,CDCl3):δ=1.31(4H,m,H3',H4'),1.49(4H,m,H2',H5'),3.30(2H,m,H1'),3.55(2H,t,J=6.5Hz,H6'),3.80(3H,s,OCH3),3.81(3H,s,OCH3),6.03(1H,t,J=5.6Hz,CONH),6.25(1H,d,J=15.5Hz,Hɑ),6.75(1H,d,J=8.3Hz,H5),6.94(1H,d,J=1.9Hz,H2),6.99(1H,dd,J=1.7,8.4Hz,H6),7.48(1H,d,J=15.5Hz,Hβ)。13C(100MHz,CDCl3):δ=25.4(C3'),26.6(C4'),30.0(C2'),32.7(C5'),39.7(C1'),56.0(2×(OCH3),62.7(C6'),109.9(C2),111.2(C5),118.9(Cɑ),121.9(C6),128.0(C1),140.8(Cβ),149.2(C4),150.6(C3),166.5(CONH)。EI/ME m/z(%):307(M+,17),206(62),192(27),191(100),189(29)。
在一个实施方式中,(E)-3-(3,4,5-三甲氧基苯基)-N-(6-羟基己基)丙-2-烯酰胺(4)的产率为88%。该化合物的结构表征如下:1H(400MHz,CDCl3):δ=1.37(4H,m,H3',H4'),1.56(4H,m,H2',H5'),3.36(2H,m,H1'),3.62(2H,t,J=6.6Hz,H6'),3,85(6H,s,2×OCH3),3.86(3H,s,OCH3),6.35(1H,t,J=5.6Hz,CONH),6.40(1H,d,J=15.5Hz,Hɑ),6.72(2H,s,H2,H6),7.52(1H,d,J=15.5Hz,Hβ)。13C(100MHz,CDCl3):δ=25.1(C3'),26.2(C4'),29.8(C2'),32.3(C5'),39.3(C1'),55.9(2×OCH3),60.7(OCH3),62.3(C6'),104.7(C2,C6),120.2(Cɑ),130.3(C1),139.2(C4),140.4(Cβ),153.1(C3,C5),166.0(CONH)。EI/ME m/z(%):337(M+,64),336(41),236(27),222(58),221(100)。
在一个实施方式中,(E)-3-(3,4-二甲氧基苯基)-N-(8-羟基辛基)丙-2-烯酰胺(5)的产率为83%。该化合物的结构表征如下:1H(400MHz,CDCl3):δ=1.26-1.40(6H,m,H3',H4',H5'),1.51-1.62(4H,m,H2',H6'),1.70-1.81(2H,m,H7'),3.37(2H,dd,J=7.0,13.0Hz,H1'),3.63(2H,t,J=6.6Hz,H8'),3.89(3H,s,OCH3),3.89(3H,s,OCH3),5.82(1H,bs,CONH),6.29(1H,d,J=15.5Hz,Hα),6.84(1H,d,J=8.3Hz,H5),7.02(1H,d,J=1.9Hz,H2),7.07(1H,dd,J=8.3,1.9Hz,H6),7.55(1H,d,J=15.5Hz,Hβ)。13C(100MHz,CDCl3):δ=25.6(C6'),26.8(C3'),29.2(C4'),29.3(C5'),29.7(C2'),32.7(C7'),39.7(C1'),55.9(OCH3),56.0(OCH3),62.9(C8'),109.8(C2),111.1(C5),118.8(C6),121.9(Cɑ),127.9(C1),140.6(Cβ),149.1(C4),150.5(C3),166.2(CONH)。EI/ME m/z(%):336(M+1,40),335(M+,71),206(53),192(75),191(100),151(63)。
在一个实施方式中,(E)-3-(3,4,5-三甲氧基苯基)-N-(8-羟基辛基)丙-2-烯酰胺(6)的产率为89%。该化合物的结构表征如下:1H(400MHz,CDCl3):δ=1.28-1.41(6H,m,H3',H4',H5'),1.44-1.70(6H,m,H2',H6',H7'),3.38(2H,dd,J=7.0,13.0Hz,H1'),3.64(2H,t,J=6.6Hz,H8'),3.87(3H,s,OCH3),3.88(6H,s,2×OCH3),5.67(1H,t,J=7.0Hz,CONH),6.30(1H,d,J=15.5Hz,Hα)6.73(2H,s,J=6.7Hz,H2,H6),7.53(1H,d,J=15.5Hz,Hβ)。13C(100MHz,CDCl3):δ=25.6(C6'),26.8(C3'),29.2(C4'),29.3(C5'),29.7(C2'),32.7(C7'),39.8(C1'),56.2(2×OCH3),61.0(OCH3),63.0(C8'),105.0(C2,C6),120.2(Cɑ),130.5(C1),139.6(C4),140.8(Cβ),153.4(C3,C5),165.8(CONH)。EI/ME m/z(%):366(M+1,39),365(M+,98),236(45),221(100),181(37)。
在一个实施方式中,(E)-3-(3,4-二甲氧基苯基)-N-(10-羟基癸基)丙-2-烯酰胺(7)的产率为78%。该化合物的结构表征如下:1H(400MHz,CDCl3):δ=1.21-1.41(10H,m,H3',H4',H5',H6',H7'),1.49-1.62(4H,m,H2',H8'),1.75-2.00(2H,m,H9'),3.32-3.42(2H,m,H1'),3.64(2H,t,J=6.6Hz,H10'),3.90(6H,s,2×OCH3),5.79(1H,bs,CONH),6.29(1H,d,J=15.5Hz,Hɑ),6.84(1H,d,J=8.3Hz,H5),7.02(1H,d,J=1.7Hz,H2),7.08(1H,dd,J=8.3,1.7Hz,H6),7.56(1H,d,J=15.5Hz,Hβ)。13C(100MHz,CDCl3):δ=25.8(C8'),27.0(C3'),29.3(C4'),29.45(C5'),29.49(C6'),29.6(C7'),29.8(C2'),32.9(C9'),39.9(C1'),56.0(OCH3),56.1(OCH3),63.2(C10'),109.9(C2),111.3(C5),118.8(C6),122.0(Cα),128.0(C1),140.9(Cβ),149.3(C4),150.7(C3),166.3(CONH)。EI/ME m/z(%):364(M+1,433),363(M+,89),206(54),192(72),191(100),151(46)。
在一个实施方式中,(E)-3-(3,4,5-三甲氧基苯基)-N-(10-羟基癸基)丙-2-烯酰胺(8)的产率为69%。该化合物的结构表征如下:1H(400MHz,CDCl3):δ=1.23-1.42(10H,m,H3',H4',H5',H6',H7'),1.51-1.61(4H,m,H2',H8'),1.89-2.06(2H,m,H9'),3.33-3.43(2H,m,H1'),3.64(2H,t,J=6.6Hz,H10'),3.87(3H,s,OCH3),3.88(6H,s,2×OCH3)),5.82(1H,bs,CONH),6.33(1H,d,J=15.6Hz,Hα),6.73(2H,s,H2,H6),7.55(1H,d,J=15.5Hz,Hβ)。13C(100MHz,CDCl3):δ=25.8(C8'),27.0(C3'),29.3(C4'),29.45(C5'),29.50(C6'),29.6(C7'),29.8(C2'),32.9(C9'),39.9(C1'),56.0(2×OCH3),61.1(OCH3),63.2(C10'),105.1(C2,C6),120.3(Cɑ),130.6(C1),139.7(C4),141.0(Cβ),153.5(C3,C5),165.9(CONH)。EI/ME m/z(%):394(M+1,40),393(M+,100),236(37)222(86),221(93)。
在一个实施方式中,获得甲磺酸盐衍生物(化合物9-14,图1)的合成方法如下:将肉桂酸酰胺(3-8)(1mmol)溶于四氢呋喃(10ml)和三乙胺(2mmol)的混合物中,并在室温下搅拌10分钟。然后,滴加甲磺酰氯(1.3mmol)的四氢呋喃(5ml)溶液。在室温下搅拌12小时后,中和混合物并部分蒸发溶剂。将得到的反应混合物用二氯甲烷(3×20mL)萃取,并将合并的有机相用水(3×20mL),10%NaHCO3水溶液(2×20mL)洗涤,用无水硫酸钠(Na2SO4)干燥,过滤并蒸发。粗产物无需进一步纯化即可用于下一步骤。纯化每种化合物的样品并进行结构表征。
在一个实施方式中,(E)-(6-(3-(3,4-二甲氧基苯基)丙-2-烯酰胺)己基)甲磺酸酯(9)的产率为87%。该化合物的结构表征如下:1H(400MHz,CDCl3):δ=1.42(4H,m,H3',H4'),1.66(4H,m,H2',H5'),3.00(3H,s,OSO2CH3),3.38(2H,m,H1'),3.88(3H,s,OCH3),3.89(3H,s,OCH3),4.22(2H,t,J=6.4Hz,H6'),5.97(1H,t,J=5.6Hz,CONH),6.33(1H,d,J=15.5Hz,Hɑ),6.84(1H,d,J=8.3Hz,H5),7.03(1H,d,J=1.9Hz,H2),7.07(1H,dd,J=1.9,8.3Hz,H6),7.55(1H,d,J=15.5Hz,Hβ)。13C(100MHz,CDCl3):δ=24.9(C3'),26.0(C4'),28.8(C2'),29.3(C5'),37.2(OSO2CH3),39.2(C1'),55.7(2×OCH3),69.8(C6'),109.5(C2),110.9(C5),118.6(Cɑ),121.7(C6),127.7(C1),140.4(Cβ),148.9(C4),150.3(C3),166.1(CONH)。
在一个实施方式中,(E)-(6-(3-(3,4,5-三甲氧基苯基)丙-2-烯酰胺)己基)甲磺酸酯(10)的产率为95%。该化合物的结构表征如下:1H(400MHz,CDCl3):δ=1.36(4H,m,H3',H4'),1.60(4H,m,H2',H5'),2.95(3H,s,OSO2CH3),3.32(2H,m,H1'),3.80(6H,s,2×OCH3),3.81(3H,s,OCH3),4.16(2H,t,J=6.4Hz,H6'),6.07(1H,t,J=5.7Hz,CONH),6.34(1H,d,J=15.5Hz,Hɑ),6.68(2H,s,H2,H6),7.46(1H,d,J=15.6Hz,Ηβ)。13C(100MHz,CDCl3):δ=25.5(C3'),26.6(C4'),29.4(C2'),29.8(C5'),37.8(OSO2CH3),39.9(C1'),56.5(2×OCH3),61.4(OCH3),70.5(C6'),105.4(C2,C6),120.8(Cɑ),131.0(C1),139.8(C4),141.0(Cβ),154.8(C3,C5),166.4(CONH)。
在一个实施方式中,(E)-(8-(3-(3,4-二甲氧基苯基)丙-2-烯酰基)辛基)甲磺酸盐(11)的产率为95%。该化合物的结构表征如下:1H(400MHz,CDCl3):δ=1.27-1.47(8H,m,H3',H4',H5',H6'),1.48-1.64(2H,m,H2'),1.66-1.79(2H,m,H7'),3.00(3H,s,OSO2CH3),3.37(2H,dd,J=13.1 6.7Hz,HI'),3.88(3H,s,OCH3),3.89(3H,s,OCH3),4.21(2H,t,J=6.5Hz,H8'),5.97(1H,bs,CONH),6.33(1H,d,J=15.5Hz,Hɑ),6.83(1H,d,J=8.3Hz,H5),7.03(1H,s,H2),7.07(1H,d,J=8.1Hz,H6),7.55(1H,d,J=15.5Hz,Hβ)。13C(100MHz,CDCl3):δ=25.3(C6'),26.7(C3'),28.8(C4'),29.00(C5'),29.05(C2'),29.6(C7'),37.4(OSO2CH3),39.7(C1'),55.87(OCH3),55.95(OCH3),70.2(C8'),109.7(C2),111.1(C5),118.9(C6),121.9(Cɑ),128.0(C1),140.5(Cβ),149.1(C4),150.5(C3),166.2(CONH)。
在一个实施方式中,(E)-(8-(3-(3,4,5-三甲氧基苯基)丙-2-烯酰胺)辛基)甲磺酸酯(12)的产率为96%。该化合物的结构表征如下:1H(400MHz,CDCl3):δ=1.29-1.45(6H,m,H3',H4',H5'),1.52-1.63(4H,m,H2',H6'),1.65-1.80(2H,m,H7'),3.00(3H,s,OSO2CH3),3.38(2H,td,J=13.1,7.0Hz,H1'),3.87(3H,s,OCH3),3.88(6H,s,2×OCH3),4.23(2H,t,J=6.5Hz,H8'),5.64(1H,t,J=7.0Hz,NH),6.30(1H,d,J=15.5Hz,Hɑ),6.73(2H,s,H2,H6),7.53(1H,d,J=15.5Hz,Hβ)。13C(100MHz,CDCl3):δ=25.3(C6'),26.7(C3'),28.8(C7'),29.0(C4'),29.1(C5'),29.6(C2'),37.4(OSO2CH3),39.7(C1'),56.2(2×OCH3),61.0(OCH3),70.1(C8'),105.0(C2,C6),120.1(Cɑ),130.5(C1),139.6(C4),140.8(Cβ),153.4(C3,C5),165.8(CONH)。
在一个实施方式中,(E)-(10-(3-(3,4-二甲氧基苯基)丙-2-烯酰胺)癸基)甲磺酸酯(13)的产率为98%。该化合物的结构表征如下:1H(400MHz,CDCl3):δ=1.20-1.45(12H,m,H3',H4',H5',H6',H7',H8'),1.49-1.64(2H,m,H2'),1.67-1.83(2H,m,H9'),3.01(3H,s,OSO2CH3),3.38(2H,dd,J=10.9,6.3Hz,H1'),3.90(6H,s,2×OCH3),4.23(2H,t,J=6.6Hz,H10'),5.82-5.95(1H,m,CONH),6.32(1H,d,J=15.5Hz,Hɑ),6.85(1H,d,J=8.2Hz,H5),7.03(1H,s,H2),7.08(1H,d,J=8.2Hz,H6),7.57(1H,d,J=15.5Hz,Hβ)。13C(100MHz,CDCl3):δ=25.4(C8'),27.0(C3'),29.0(C5'),29.2(C4'),29.28(C6'),29.34(C7'),29.4(C2'),29.8(C9'),37.5(CH3SO3),39.9(C1'),55.97(OCH3),56.05(OCH3),70.3(C10'),109.8(C2),111.2(C5),118.8(C6),122.0(Cɑ),128.0(C1),140.8(Cβ),149.2(C4),150.6(C3),166.3(CONH)。
在一个实施方式中,(E)-(10-(3-(3,4,5-三甲氧基苯基)丙-2-烯酰胺)癸基)甲磺酸酯(14)的产率为96%。化合物的结构表征如下:1H(400MHz,CDCl3):δ=1.18-1.47(12H,m,H3',H4',H5',H6',H7',H8'),1.51-1.64(2H,m,H2'),1.68-1.82(2H,m,H9'),3.00(3H,s,OSO2CH3),3.32-3.45(2H,m,H1'),3.87(3H,s,OCH3)),3.88(6H,s,2×OCH3),4.22(2H,t,J=6.6Hz,H10'),5.84(1H,bs,CONH),6.34(1H,d,J=15.5Hz,Hɑ),6.74(2H,s,H2,H6),7.54(1H,d,J=15.5Hz,Hβ)。13C(100MHz,CDCl3):δ=25.5(C8'),27.0(C3'),29.0(C5'),29.0(C4'),29.2(C6'),29.3(C7'),29.35(C2'),29.40(C9'),37.5(OSO2CH3),40.0(C1'),56.3(2×OCH3),60.1(OCH3),70.3(C10'),105.2(C2,C6),105.2(C6),120.1(Cɑ),130.6(C1),139.8(C4),141.8(Cβ),153.6(C3,C5),166.1(CONH)。
在一个实施方式中,描述了通过微波或传统方法获得基于肉桂酸的三苯基鏻盐(化合物15-20,图1)的合成方法。
在一个实施方式中,三苯基鏻盐15和16的获得如下进行:将化合物9或10(1mmol)与三苯基膦(1mmol)在微波小瓶中充分混合并在氩气下密封。在磁力搅拌下将反应置于150℃的微波辐射下1小时30分钟。完成后,将反应混合物在室温下冷却,并将粗产物通过快速色谱法纯化,使用二氯甲烷/甲醇[9:1比率(v/v)]作为洗脱体系。合并含有目标化合物的馏分,蒸发溶剂。然后将所得残余物用最少量的二氯甲烷溶解并用过量的乙醚研磨。滗析溶剂,最后的固体残余物在真空下干燥,得到甲苯磺酸三苯基鏻盐。
在一个实施方式中,(E)-(6-(3-(3,4-二甲氧基苯基)丙-2-烯酰胺)己基)三苯基鏻甲磺酸盐(15)的产率为73%。该化合物的结构表征如下:1H(400MHz,CDCl3):δ=1.38(4H,m,H3',H4'),1.47(4H,m,H2',H5'),3.17(2H,d,J=5.1Hz,H1'),3.29(2H,m,H6'),3.69(3H,s,OCH3),3.71(3H,s,OCH3),6.62(1H,d,J=8.3Hz,H5),6.82(1H,d,J=15.7Hz,Hɑ),6.85(1H,dd,J=1.9,8.3Hz,H6),7.04(1H,s,H2),7.29(1H,d,J=15.7Hz,Hβ),7.54-7.63(15H,m,PPh3),8.30(1H,t,J=5.3Hz,CONH)。13C(100MHz,CDCl3):δ=21.2(d,JCP=51.8Hz,C6'),25.0(C5'),28.1(C4'),28.9(C3'),38.2(C2'),39.0(C1'),55.4(2×OCH3),109.2(C2),110.3(C5),117.5(d,JCP=85.9Hz,C1”),120.3(Cɑ),121.3(C6),128.1(C1),130.0(d,JCP=12.5Hz,C3”,C5”),132.8(d,JCP=9.9Hz,C2”,C6”),134.5(d,JCP=2.8Hz,C4”),138.0(Cβ),148.4(C4),149.3(C3),166.4(CONH)。EM/IE m/z(%):277(25),195(33),85(85),83(100)。
在一个实施方式中,(E)-(6-(3-(3,4,5-甲氧基苯基)丙-2-烯酰基)己基)三苯基鏻甲磺酸盐(16)的产率为65%。该化合物的结构表征如下:1H(400MHz,DMSO):δ=1.33(4H,m,H3',H4'),1.52(4H,m,H2',H5'),3.15(2H,m,H1'),3.59(2H,m,H6'),3.69(3H,s,OCH3),3.82(6H,s,2×OCH3),6.68(1H,d,J=15.7Hz,Hɑ),6.90(2H,s,H2,H6),7.34(1H,d,J=15.7Hz,Hβ),7.76-7.84(15H,m,PPh3),8.18(1H,t,J=5.6Hz,CONH)。13C(100MHz,DMSO):δ=20.2(d,JCP=49.7Hz,C6'),21.8(C5'),25.6(C4'),28.8(C3'),29.6(C2'),38.5(C1'),55.9(2×OCH3),60.2(OCH3),104.9(C2,C6),118.6(d,JCP=85.7Hz,C1”),121.9(Cɑ),130.3(d,JCP=12.4Hz,C3”,C5”),130.7(C1),133.6(d,JCP=10.1Hz,C2”,C6”),134.9(d,JCP=2.4Hz,C4”),138.5(Cβ),153.1(C3,C5),156.3(C4),165.0(CONH)。EM/IE m/z(%):278(24),277(48),263(34),262(100),261(22),184(22),183(75),108(38)。
在一个实施方式中,如下进行三苯基鏻盐17-20的制备:在氩气氛下在130℃下用甲苯磺酸盐衍生物(11-14)(1mmol)与三苯基膦(1mmol)一起加热18小时。通过快速色谱法纯化粗产物,使用二氯甲烷/甲醇[9:1比率(v/v)]作为洗脱体系。合并含有目标化合物的馏分,蒸发溶剂。然后将所得残余物用最少量的二氯甲烷溶解并用过量的乙醚研磨。滗析溶剂,最后的固体残余物在真空下干燥,得到甲苯磺酸三苯基鏻盐。
在一个实施方式中,(E)-(8-(3-(3,4-二甲氧基苯基)丙烯酰胺基)辛基)三苯基鏻甲磺酸盐(17)的产率为53%。该化合物的结构表征如下:1H(400MHz,MeOD):δ=1.25-1.40(6H,m,H3',H4',H5'),1.49-1.60(4H,m,H2',H6'),1.61-1.73(2H,m,H7'),2.68(3H,s,OSO2CH3),3.26(2H,t,J=7.1Hz,H1'),3.43-3.33(2H,m,H8'),3.85(3H,s,OCH3),3.86(3H,s,OCH3),6.48(1H,d,J=15.7Hz,Hɑ),6.96(1H,d,J=8.3Hz,H5),7.11(1H,dd,J=2.0,8.3Hz,H6),7.15(1H,d,J=2.0Hz,H2),7.44(1H,d,J=15.7Hz,Hβ),7.70-7.94(16H,m,PPh3-,CONH)。13C(100MHz,MeOD):δ=22.6(d,JCP=51.2Hz,C8'),23.5(d,JCP=4.4Hz,C6'),27.7(C3'),29.7(C4'),29.9(C5'),30.4(C2'),31.4(d,JCP=16.0Hz,C7'),39.5(OSO2CH3),40.4(C1'),56.4(OCH3),56.5(OCH3),111.4(C2),112.8(C5),119.6(C6),120.0(d,JCP=85.8Hz,C1”),123.2(Cɑ),129.4(C1),131.5(d,JCP=12.6Hz,C3”,C5”),134.8(d,JCP=9.9Hz,C2”,C6”),136.3(d,JCP=3.0Hz,C4”),141.5(Cβ),150.7(C4),152.2(C3),168.9(CONH)。ME/ESI m/z(%):581(M++H-CH3SO3,45),580(M+-CH3SO3,54),462(100)。
在一个实施方式中,(E)-(8-(3-(3,4,5-三甲氧基苯基)丙烯酰胺基)辛基)三苯基鏻甲磺酸盐(18)的产率为:96%。该化合物的结构表征如下:1H(400MHz,CDCl3):δ=1.18-1.46(6H,m,H3',H4',H5'),1.51-1.66(6H,m,H2',H6',H7'),2.68(3H,s,OSO2CH3),3.33(2H,dd,J=12.3 6.3Hz,H1'),3.58-3.43(2H,m,H8'),3.83(3H,s,OCH3),3.85(6H,s,2×OCH3),6.85(2H,s,H2,H6),6.92(1H,d,J=15.7Hz,Hɑ),7.46(1H,d,J=15.6Hz,Hβ),7.62-7.85(15H,m,PPh3),7.99(1H,t,J=5.2Hz,CONH)。13C(100MHz,CDCl3):δ=21.9(d,JCP=50.2Hz,C8'),22.3(d,JCP=4.5Hz,C6'),25.9(C4'),27.8(C3'),28.0(C5'),28.8(C2'),29.5(d,JCP=16.1Hz,C7'),39.3(OSO2CH3),39.7(C1'),56.3(2×OCH3),60.9(OCH3),105.1(C2,C6),118.5(d,JCP=85.8Hz,C1”),122.4(Cɑ),130.5(d,JCP=12.5Hz,C3”,C5”),131.5(C1),133.5(d,JCP=9.9Hz,C2”,C6”),135.1(d,JCP=2.9Hz,C4”),138.8(C4),139.0(Cβ),153.2(C3,C5),166.7(CONH)。ME/ESI m/z(%):611(M++H-CH3SO4,46)610(M+-CH3SO3,100)。
在一个实施方式中,(E)-(10-(3-(3,4-二甲氧基苯基)丙烯酰胺基)癸基)三苯基鏻甲磺酸盐(19)的产率为61%。该化合物的结构表征如下:1H(400MHz,MeOD):δ=1.18-1.41(10H,m,H3',H4',H5',H6',H7'),1.46-1.59(4H,m,H2',H8'),1.60-1.72(2H,m,H9'),2.68(3H,s,OSO2CH3),3.27(2H,t,J=7.1Hz,H1'),3.32-3.42(2H,m,H10'),3.85(3H,s,OCH3),3.86(3H,s,OCH3),6.48(1H,d,J=15.7Hz,Hɑ),6.95(1H,d,J=8.2Hz,H5),7.11(1H,dd,J=8.2,1.9Hz,H6),7.14(1H,d,J=1.9Hz,H2),7.44(1H,d,J=15.7Hz,Hβ),7.95-7.68(16H,m,PPh3,CONH)。13C(100MHz,MeOD):δ=22.6(d,JCP=51.1Hz,C10'),23.5(d,JCP=4.5Hz,C8'),27.9(C3'),29.8(C4'),30.2(C5',C6'),30.35(C7'),30.42(C2'),31.5(d,JCP=16.1Hz,C9'),39.5(OSO2CH3),40.5(C1'),56.4(OCH3),56.5(OCH3),111.4(C2),112.8(C5),119.8(C6),120.0(d,JCP=85.8Hz,C1”),123.2(Cɑ),129.4(C1),131.5(d,JCP=12.5Hz,C3”,C5”),134.8(d,JCP=9.9Hz,C2”,C6”),136.3(d,JCP=3.0Hz,C4”),141.5(Cβ),150.7(C4),152.2(C3),168.9(CONH)。ME/ESI m/z(%):610(M++H-CH3SO3,73),609(M+-CH3SO3,100),491(33),490(67)。
在一个实施方式中,产率(E)-(10-(3-(3,4,5-三甲氧基苯基)丙烯酰胺基)癸基)三苯基鏻甲磺酸盐(20)为69%。该化合物的结构表征如下:1H(400MHz,MeOD):δ=1.20-1.41(10H,m,H3',H4',H5',H6',H7'),1.48-1.59(4H,m,H2',H8'),1.60-1.72(2H,m,H9'),2.68(3H,s,OSO2CH3),3.28(2H,t,J=7.1Hz,H1'),3.35-3.45(2H,m,H10'),3.78(3H,s,OCH3),3.86(6H,s,2×OCH3),6.55(1H,d,J=15.7Hz,Hɑ),6.86(2H,s,H2,H6),7.43(1H,d,J=15.7Hz,Hβ),7.70-7.96(16H,m,PPh3,CONH)。13C(100MHz,MeOD):δ=22.6(d,JCP=51.0Hz,C10'),23.5(d,JCP=4.4Hz,C8'),27.9(C3'),29.8(C4'),30.2(C5',C6'),30.37(C7'),30.42(C2'),31.5(d,JCP=16.0Hz,C9'),39.5(OSO2CH3),40.5(C1'),56.7(2×OCH3),61.2(OCH3),106.3(C2,C6),120.0(d,JCP=86.3Hz,C1”),121.5(Cɑ),132.2(C1),131.5(d,JCP=12.5Hz,C3”,C5”),134.8(d,JCP=10.0Hz,C2”,C6”),136.3(d,JCP=3.0Hz,C4”),140.7(C4),141.5(Cβ),154.8(C3,C5),168.6(CONH)。ME/ESI m/z(%):640(M++2-CH3SO3,100),639(M++H-CH3SO3,100),418(33)。
在一个实施方式中,获得线粒体抗氧化剂(AntiOxCIN2-AntiOxCIN7,图1)的一般合成方法如下进行:将三苯基鏻化合物(15-20)(1mmol)溶于无水二氯甲烷(15ml)中。将反应混合物在氩气下搅拌并在低于-70℃的温度下冷却。向该溶液中加入三溴化硼(3mmol,1M二氯甲烷溶液)。一旦添加完成,将反应在-70℃保持10分钟,然后在连续搅拌下温热至室温12小时。用水破乳BBr3后,直接进行纯化。除去水后,将所得产物溶于甲醇,用无水Na2SO4干燥,过滤,蒸发溶剂。
在一个实施方式中,(E)-(6-(3-(3,4-二羟基苯基)丙-2-烯酰基)己基)三苯基鏻甲磺酸盐(AntiOxCIN2)的产率为30%。该化合物的结构表征如下:1H(400MHz,DMSO):δ=1.35(4H,m,H3',H4'),1.50(4H,m,H2',H5'),3.17(2H,d,J=2.8Hz,H1'),3.58(2H,m,H6'),6.34(1H,d,J=15.7Hz,Hɑ),6.75(1H,d,J=8.0Hz,H5),6.82(1H,dd,J=1.9,8.0Hz,H6),6.94(1H,d,J=1.9Hz,H2),7.20(1H,d,J=15,7Hz,Hβ),7.74-7.92(15H,m,PPh3),7.99(1H,t,J=5.6Hz,CONH),9.14(1H,s,OH),9.39(1H,s,OH)。13C(100MHz,DMSO):δ=20.2(d,JCP=50,2Hz,C6'),21.8(C5'),25.6(C4'),28.9(C3'),29.6(C2'),38.4(C1'),113.8(C2),115.8(C5),118.4(d,JCP=85,6Hz,C1”),119.0(Cɑ),120.3(C6),126.4(C1),130.3(d,JCP=12.4Hz,C3”,C5”),133.6(d,JCP=10.1Hz,C2”,C6”),134.9(d,JCP=2.4Hz,C4”),138.8(Cβ),145.5(C4),147.2(C3),165.3(CONH)。EM/IE m/z(%):277(25),263(33),262(100),183(74),108(34)。
在一个实施方式中,(E)-(8-(3-(3,4-二羟基苯基)丙烯酰胺基)辛基)三苯基鏻甲磺酸盐(AntiOxCIN3)的产率为55%。该化合物的结构表征如下:1H(400MHz,MeOD):δ=1.23-1.41(6H,m,H3',H4',H5'),1.47-1.59(4H,m,H2',H6'),1.60-1.73(2H,m,H7'),3.25(2H,t,J=7.0Hz,H1'),3.33-3.44(2H,m,H8'),6.36(1H,d,J=15.7Hz,Hɑ),6.75(1H,d,J=8.2Hz,H5),6.87(1H,dd,J=8.2,2.0Hz,H6),6.99(1H,d,J=2.0Hz,H2),7.36(1H,d,J=15.7Hz,Hβ),7.68-7.94(16H,m,PPh3,CONH)。13C(100MHz,MeOD):δ=22.7(d,JCP=51.0Hz,C8'),22.5(d,JCP=4.4Hz,C6'),27.7(C3'),29.7(C4'),29.9(C5'),30.4(C2'),31.4(d,JCP=16.0Hz,C7'),40.4(C1'),115.1(C2),116.5(C5),118.6(C6),120.0(d,JCP=86.3Hz,C1”),122.1(Cɑ),128.3(C1),131.6(d,JCP=12.6Hz,C3”,C5”),134.8(d,JCP=9.9Hz,C2”,C6”),136.3(d,JCP=3.0Hz,C4”),142.1(Cβ),146.8(C4),148.8(C3),169.2(CONH)。ESI/ME m/z(%):553(M++H-CH3SO3,73),552(M-CH3SO3,100),462(10)。
在一个实施方式中,(E)-(10-(3-(3,4-二羟基苯基)丙烯酰胺基)癸基)苯基鏻甲磺酸盐(AntiOxCIN6)的产率为80%。该化合物的结构表征如下:1H(400MHz,MeOD):δ=1.20-1.40(10H,m,H3',H4',H5',H6',H7'),1.47-1.57(4H,m,H2',H8'),1.59-1.71(2H,m,H9'),3.26(2H,t,J=7.1Hz,H1'),3.33-3.41(2H,m,H10'),6.36(1H,d,J=15.7Hz,Hɑ),6.75(1H,d,J=8.2Hz,H5),6.88(1H,dd,J=8.4,2.1Hz,H6),6.99(1H,d,J=2.1Hz,H2),7.36(1H,d,J=15.7Hz,Hβ),7.68-7.98(16H,m,PPh3,CONH)。13C(100MHz,MeOD):δ=22.7(d,JCP=51.0Hz,C10'),23.5(d,JCP=4.4Hz,C8'),27.9(C3'),29.8(C4'),30.2(C5',C6'),30.3(C7'),30.4(C2'),31.5(d,JCP=16.1Hz,C9'),40.5(C1'),115.0(C2),116.5(C5),119.8(C6),120.0(d,JCP=86.3Hz,C1”),122.0(Cɑ),128.3(C1),131.5(d,JCP=12.6Hz,C3”,C5”),134.8(d,JCP=10.0Hz,C2”,C6”),136.3(d,JCP=3.0Hz,C4”),142.0(Cβ),146.8(C4),148.7(C3),169.2(CONH)。ESI/ME m/z(%):581(M++H-CH3SO3,85),580(M+-CH3SO3,100),490(20)。
在一个实施方式中,(E)-(6-(3-(3,4,5-三羟基苯基)丙-2-烯酰基)己基)三苯基鏻甲磺酸盐(AntiOxCIN4)的产率为50%。该化合物的结构表征如下:1H(400MHz,DMSO):δ=1.35(4H,m,H3',H4'),1.50(4H,m,H2',H5),2.72(2H,m,H1'),3.58(2H,m,H6'),6.28(1H,d,J=15,6Hz,Hɑ),6.47(2H,s,H2,H6),7.10(1H,d,J=15.6Hz,Hβ),7.75-7.79(15H,m,PPh3),8.00(1H,t,J=5.6Hz,CONH)。13C(100MHz,DMSO):δ=19.8(d,JCP=49.5Hz,C6'),21.3(C5'),25.2(C4'),26.2(C3'),28.5(C2'),38.2(C1'),106.3(C2,C6),118.2(d,JCP=85.1Hz,C1”),118.6(Cɑ),124.9(C1),129.8(d,JCP=12.4Hz,C3”,C5”),133.2(d,JCP=10.1Hz,C2”,C6”),134.5(d,JCP=2.8Hz,C4”),134.7(C4),138.8(Cβ),145.7(C3,C5),164.9(CONH)。EM/IE m/z(%):277(40),263(26),262(100),184(20),183(78),108(36),82(76),81(33),80(78),79(35),58(22)。
在一个实施方式中,(E)-(8-(3-(3,4,5-三羟基苯基)丙烯酰胺基)辛基)三苯基鏻甲磺酸盐(AntiOxCIN5)的产率为88%。该化合物的结构表征如下:1H(400MHz,MeOD):δ=1.25-1.42(6H,m,H3',H4',H5'),1.46-1.61(4H,m,H2',H6'),1.59-1.74(2H,m,H7'),3.24(2H,t,J=7.0Hz,H1'),3.35(3H,s,OSO2CH3),3.43-3.32(2H,m,H10'),6.33(1H,d,J=15.6Hz,Hɑ),6.56(2H,s H2,H6),7.28(1H,d,J=15.6Hz,Hβ),7.70-7.92(16H,m,PPh3,CONH)。13C(100MHz,MeOD):δ=22.7(d,JCP=51.1Hz,C8'),23.5(d,JCP=4.4Hz,C6'),27.7(C3'),29.7(C4'),29.9(C5'),30.3(C2'),31.4(d,JCP=16.1Hz,C7'),40.4(C1',CH3SO3),108.3(C2,C6),118.7(Cɑ),120.0(d,JCP=86.3Hz,C1”),127.4(C1),131.6(d,JCP=12.5Hz,C3”,C5”),134.8(d,JCP=9.9Hz,C2”,C6”),136.3(d,JCP=3.0Hz,C4”),126.8(C4),142.4(Cβ),147.2(C3,C5),169.2(CONH)。ESI/ME m/z(%):569(M++H-CH3SO3,43),568(M+-CH3SO3,100)。
在一个实施方式中,(E)-(10-(3-(3,4,5-三羟基苯基)丙烯酰胺基)癸基)三苯基鏻甲磺酸盐(AntiOxCIN7)的产率为53%。该化合物的结构表征如下:1H(400MHz,MeOD):δ=1.19-1.43(10H,m,H3',H4',H5',H6',H7'),1.49-1.60(4H,m,H2',H8'),1.60-1.73(2H,m,H9'),3.28(2H,t,J=7.0Hz,H1'),3.34-3.43(2H,m,H10'),6.34(1H,d,J=15.6Hz,Hɑ),6.58(2H,s,H2,H6),7.31(1H,d,J=15.6Hz,Hβ),7.71-7.95(16H,m,PPh3,CONH)。13C(100MHz,MeOD):δ=22.7(d,JCP=51.0Hz,C10'),23.5(d,JCP=4.3Hz,C8'),27.9(C3'),29.8(C4'),30.2(C5',C6'),30.3(C7'),30.4(C2'),31.5(d,JCP=15.9Hz,C9'),40.5(C1'),108.2(C2,C6),118.7(Cɑ),120.0(d,JCP=86.3Hz,C1”),127.3(C1),131.5(d,JCP=12.5Hz,C3”,C5”),134.8(d,JCP=9.9Hz,C2”,C6”),136.3(d,JCP=3.0Hz,C4”),136.7(C4),142.4(Cβ),147.1(C3,C5),169.2(CONH)。ESI/ME m/z(%):597(M++H-CH3SO3,67),596(M+-CH3SO3,100),418(14)。
通过基于DPPH●,ABTS●+和GO●基团的总抗氧化能力测定来评估AntiOxCINs的自由基清除活性。所有这些方法都涉及分光光度法测量由抗氧化剂(DPPH●,ABTS●+或GO●)失活引起的吸光度降低。结果以IC50表示,IC50定义为将自由基量减少50%所需的最小抗氧化剂浓度。在Bio-Tech仪器的多板读数器(Powerwave XS多板读数器)中进行抗氧化测定。
在一个实施方式中,DPPH●自由基清除活性如下进行:在乙醇中制备浓度增加(范围在0μM和500μM之间)的测试化合物的溶液。还制备DPPH●乙醇溶液(6.85mM),然后稀释至在515nm处达到0.72±0.02的吸光度。将每种化合物溶液(20μL)一式三份加入到180μL的DPPH●溶液中,并在45分钟内精确记录515nm处的吸光度。自由基的抑制百分比基于与空白组(20μL乙醇和180μL DPPH●溶液)的比较,其对应于100%的自由基和测试化合物溶液。建立剂量-反应曲线以确定IC50值。数据是三次独立实验的平均值±SEM。
在一个实施方式中,按照以下方式评估ABTS●+清除活性:制备浓度增加(范围在10μM和500μM之间)的测试化合物的乙醇溶液。通过将150mM过硫酸钾水溶液(163μL)加入到10mL的7mM ABTS水溶液中,然后在室温下在黑暗中储存16小时(2.45mM终浓度),获得ABTS●+自由基阳离子溶液。然后将溶液在乙醇中稀释至达到吸光度0.72±0.02。在将化合物(20μL)一式三份加入ABTS●+溶液(180μL)后,每分钟在15分钟内进行分光光度测量。自由基的抑制百分比基于与空白组(20μL乙醇和180μL ABTS●+溶液)的比较,其对应于100%的自由基和测试化合物溶液。建立剂量-反应曲线以确定IC50值。数据是三次独立实验的平均值±SEM。
在一个实施方式中,如下评估GO●清除活性:在乙醇中制备浓度为5μM至75μM的测试化合物的溶液。制备5mM GO●的乙醇溶液并稀释至428nm处达到1.00±0.02的吸光度。向GO●溶液(180μL)中一式三份地加入化合物(20μL),然后在室温下在黑暗中在30分钟内在428nm处测量吸光度。自由基的抑制百分比基于与空白组(20μL乙醇和180μL GO●溶液)的比较,其对应于100%的自由基和测试化合物溶液。建立剂量-反应曲线以确定IC50值。数据是三次独立实验的平均值±SEM。
在一个实施方式中,通过电化学技术评估AntiOxCINs的氧化还原和亲脂性质。
在一个实施方式中,使用计算机控制的恒电位仪Autolab PGSTAT302N(MetrohmAutolab,Utrecht,Netherlands)获得电化学分析数据。通常,以50mVs-1的扫描速率获得循环伏安法(CV)数据。在4mV的步进电位,50mV的脉冲幅度和8mVs-1的扫描速率下获得差分脉冲伏安法(DPV)结果。通过通用电化学系统(GPES)4.9版软件包监测电化学信号。所有电化学实验均在室温下在放置在法拉第笼中的电化学池中进行,以使背景噪声对分析信号的贡献最小化。
在一个实施方式中,评估AntiOxCINs氧化还原性质的过程如下进行:通过将适量化合物溶解在乙醇中制备每种化合物(10mM)的储备溶液。在电化学池中制备伏安工作溶液,终浓度为0.1mM。通过将6.2mL的0.2M磷酸氢二钾和43.8mL的0.2M磷酸二氢钾稀释至100mL来制备pH 7.4的支持电解质。在由作为工作电极的玻璃碳电极(GCE,d=2mm),铂丝的对电极和饱和Ag/AgCl参比电极组成的三电极系统中获得伏安数据。在一个实施方式中,如下进行AntiOxCINs亲脂性的评价:电化学池是具有两个Ag/AgCl参比电极和两个Pt反电极(每一相各一个)的微液-液界面(μITIES)的阵列的四电极系统。将微孔膜用氟硅氧烷密封剂(Dow Corning 730)密封到玻璃圆筒上,该玻璃圆筒填充有4.0mL水相,其中加入等分试样的AntiOxCINs溶液。然后将膜浸入包含在电池中的有机相中。机械稳定有机相参比溶液(2mM BTPPACI+2mM NaCl水溶液)。支持电解质水溶液是10mM pH7.0的Tris-HCl缓冲液。
在一个实施方式中,通过在Bio-Tech仪器的多板读数器(Powerwave XS多板读数器)中进行的分光光度法菲洛嗪方法评估AntiOxCINs的铁螯合性质。
在一个实施方式中,如下评估AntiOxCINs铁螯合特性:在每个孔中,加入测试化合物(100μM)和硫酸铵铁(II)的乙酸铵溶液(20μM),培养10分钟并且在562nm处读取吸光度。然后,向每个孔中加入新型制备的菲洛嗪(5mM)溶液(96μM终浓度)。在37℃下进行新培养10分钟后,在562nm处测量[Fe(菲洛嗪)3]2+复合物的吸光度。使用DMSO代替测试化合物运行空白孔。EDTA用作参考。所有化合物的测试终浓度为100μM。将第一读数的吸光度减去最终值以消除由于测试化合物引起的任何吸光度。数据是三次独立实验的平均值±SEM,并表示为Fe(II)螯合的%(EDTA=100%)。
在一个实施方式中,在大鼠肝线粒体(RLM)中进行AntiOxCINs功能性线粒体毒性谱的评估。通过组织匀浆然后在含有250mM蔗糖,10mM HEPES(pH 7.4),1mM EGTA和0.1%无脂肪牛血清白蛋白的冰冷缓冲液中差速离心来制备RLM。获得粗制线粒体制剂后,将沉淀洗涤两次并重悬于洗涤缓冲液(250mM蔗糖和10mM HEPES,pH 7.4)中。使用BSA作为标准,通过缩二脲测定法测定蛋白质浓度。
在一个实施方式中,评估线粒体AntiOxCINs摄取。
在一个实施方式中,按照以下方式评估通电的RLM对AntiOxCINs线粒体的摄取:将RLM(0.5mg蛋白质/mL)与AntiOxCINs在37℃下在持续搅拌下在1mL KCl培养基(120mM KCl,10mM HEPES,pH 7.2和1mM EGTA)中培养。连续5次添加1μM的各AntiOxCINs以在鱼藤酮(1.5μM)存在下校准电极响应。然后,加入琥珀酸盐(10mM)以产生ΔΨ。在测定结束时加入缬氨酸(0.2μg/mL)以消散ΔΨ。用离子选择性电极和Ag/AgCl2电极作为参考电极进行测量,其测量四苯基鏻阳离子(TPP+)的分布。线粒体积聚率通过AntiOxCINs从线粒体外介质到线粒体内介质的消失以及TPP化合物对线粒体摄取的结合校正而计算,假设线粒体内体积为~0.5μL/mg蛋白质,。
评估了AntiOxCINs对RLM脂质过氧化的结果。已经使用了两种不同的方法。
在一个实施方式中,通过硫代巴比妥酸反应性物质(TBARS)按照以下方式测量AntiOxCINs对RLM脂质过氧化的影响:将RLM(2mg蛋白质/ml)在37℃下在0.8mL pH7.6的培养基中培养,该培养基含有100mM KCl和10mM Tris-HCl,且补充有5mM谷氨酸盐/2.5mM苹果酸盐作为底物。将RLM与每种AntiOxCINs(5μM)培养5分钟,然后通过在37℃下加入100μMFeSO4/500μM H2O2/5mM抗坏血酸盐将线粒体暴露于氧化应激条件15分钟。在暴露于氧化应激后,加入60μL 2%(v/v)丁基化羟基甲苯DMSO溶液,然后加入200μL 35%(v/v)高氯酸和200μL 1%(w/v)硫代巴比妥酸。然后将样品在100℃下培养15分钟,使其冷却并将上清液转移到玻璃管中。加入2mL MiliQ水和2mL丁-1-醇后,将样品剧烈涡旋几秒钟。分离两相。在平板读数器(λEx=515nm;λEm=553nm)中分析有机层中TBARS的等分试样(250μL)的荧光。发现谷氨酸盐/苹果酸盐激活的RLM中的TBARS背景产生可以忽略不计。数据是三次独立实验的平均值±SEM,并表示为对照组的%(对照组=100%)。
在一个实施方式中,通过如下的第二种方法测量AntiOxCINs对RLM脂质过氧化的影响:在37℃下用Clark氧电极监测在总体积为1mL的反应介质中2mg RLM的氧消耗,该反应介质由100mM KCl和10mM Tris-HCl组成,pH 7.6,使用谷氨酸/苹果酸盐(5mM/2.5mM)作为呼吸底物。将RLM与每种AntiOxCINs(5μM)培养5分钟,然后通过添加10mM ADP和0.1mMFeSO4(最终浓度)开始脂质过氧化过程。假设在37℃下,培养基中O2的饱和浓度为217μM。记录由促氧化剂对(1mM ADP/0.1mM FeSO4)对RLM膜的过氧化引起的氧消耗的时间依赖性变化。数据是来自六个独立实验的平均值±SEM。与添加ADP/Fe2+后较慢的氧消耗相关的时滞阶段用于测量AntiOxCINs预防脂质过氧化的有效性。数据是来自六个独立实验的平均值±SEM,并表示为对照组的%(对照组=100%)。
在一个实施方式中,评估了AntiOxCINs对线粒体呼吸的影响。
在一个实施方式中,AntiOxCINs对线粒体呼吸的影响的评估如下进行:用Clark型氧电极极谱评估分离的RLM的呼吸,该电极连接到1mL37℃具有磁力搅拌的恒温水夹套室中的合适记录器1。标准呼吸介质由130mM蔗糖,50mM KCl,5mM KH2PO4,5mM HEPES(pH 7.3)和10μM EGTA组成。在测定前,将增加浓度的AntiOxCINs(2.5-10μM)加入含有呼吸底物谷氨酸盐/苹果酸盐(分别为10mM和5mM)或琥珀酸盐(5mM)和RLM(1mg)的反应介质中并培养5分钟。状态2被认为是在使用AntiOxCINs的5分钟培养时间期间的呼吸。为了诱导状态3呼吸,加入125nmol ADP(使用谷氨酸盐/苹果酸盐)或75nmol ADP(使用琥珀酸盐)。在ADP磷酸化完成后测定状态4。随后寡霉素(2μg/ml)的添加抑制ATP-合酶并引起寡霉素抑制呼吸状态。最后,加入1μM FCCP以诱导未偶联的呼吸。对照实验的RCR分别为6.42±0.57和4.90±0.66,谷氨酸盐-苹果酸盐或琥珀酸盐分别作为呼吸底物。对于相同的呼吸底物,ADP/O指数分别为2.64±0.10和1.58±0.09。数据均为7次独立实验的平均值±SEM。
在一个实施方式中,评估了AntiOxCINs对跨膜电位(ΔΨ)的影响。
在一个实施方式中,按照以下方式进行AntiOxCINs对线粒体跨膜电位(ΔΨ)的影响的评估:通过评估番红花碱(5μM)的荧光变化来估计线粒体跨膜电位(ΔΨ)并且在荧光分光光度计上记录,该荧光分光光度计在495和586nm的激发和发射波长下工作,狭缝宽度为5nm。在开始测定之前,将增加浓度的AntiOxCINs(2.5-10μM)加入到含有呼吸底物谷氨酸盐/苹果酸盐(分别为5mM和2.5mM)或琥珀酸盐(5mM)和RLM(0.5mg,在2mL终体积中)的反应介质(200mM蔗糖,1mM KH2PO4,10mM Tris(pH7.4)和10μM EGTA)中,并在25℃下培养5分钟。在该测定中,分别使用番红花碱(5μM)和ADP(25nmol)来开始测定并诱导去极化。然后,在所有实验结束时加入1μM FCCP以使线粒体去极化。使用当RLM在含有200mM蔗糖,1mM NaH2PO4,10mM Tris(pH 7.4)和10μM AEGTA(补充有0.4μg缬氨酸)的无K+的反应介质中培养时获得的校准曲线计算ΔΨ。发现由ΔΨ诱导的番红花的荧光变化的延伸在标准和无K+的培养基中是相似的。“再极化”对应于加入的ADP完全磷酸化后膜电位的恢复。滞后期反映了磷酸化加入的ADP所需的时间。当分别使用谷氨酸盐/苹果酸盐或琥珀酸盐时,分离的RLM产生ΔΨ≈226mV和ΔΨ≈202mV(内部阴性)。数据是五次独立实验的平均值±SEM。
在一个实施方式中,评估了AntiOxCINs对线粒体通透性转换孔开孔的影响。
在一个实施方式中,按照如下方式测量AntiOxCINs对线粒体通透性转换孔开孔的影响:通过测量从线粒体悬浮液散射的光的改变来估计线粒体肿胀,如在540nm处通过分光光度法监测的。在测定前,在RLM(1mg)存在下,将增加浓度的AntiOxCINs(2.5-10μM)加入到反应介质(200mM蔗糖,1mM KH2PO4,10mM Tris(pH 7.4),5mM琥珀酸盐和10μM EGTA,补充有1.5μM鱼藤酮)中,并培养5分钟。通过每天滴定添加适当浓度的Ca2+(15-50μM)开始实验。加入环孢菌素A(CsA),一种PTP去敏剂,以证明mPTP开孔。连续搅拌进行反应,温度保持在37℃。数据是三次独立实验的平均值±SEM,表示为540nm处的吸光度。
在一个实施方式中,在人肝细胞癌HepG2细胞中评估AntiOxCIN4和AntiOxCIN6的细胞毒性特征。人肝细胞癌HepG2细胞在由Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM;D5648)组成的高葡萄糖培养基中培养,该培养基补充有丙酮酸钠(0.11g/L),碳酸氢钠(1.8g/L),10%胎牛血清(FBS)和1%的抗生素青霉素-链霉素100×溶液。将细胞在37℃下在具有5%CO2的潮湿培养箱中培养。将HepG2细胞以4×104个细胞/mL的密度接种,并在处理前生长24小时。
在一个实施方式中,按照如下方式进行细胞毒性筛选:将细胞置于48孔板(2×104个细胞/500μL)上,然后在48小时内与浓度范围分别为25μM至500μM或0.5μM至25μM的AntiOxCIN4和AntiOxCIN6培养。培养后,基于细胞蛋白质含量的测量,使用磺酰罗丹明B(SRB)测定法进行细胞密度测定。简而言之,在培养后,除去培养基并用PBS(1X)冲洗孔。通过在-20℃下在100%甲醇中加入1%乙酸来固定细胞至少2小时。然后,弃去固定溶液,将板在37℃的烘箱中干燥。加入250μl在1%乙酸溶液中的0.5%SRB,并在37℃下培养1小时。然后将孔用1%乙酸水溶液洗涤并干燥。然后,加入500μl Tris(pH10)并将板搅拌15分钟。最后,将200μl各上清液转移到96孔板中,并在540nm处测量光密度。数据是四次独立实验的平均值±SEM,结果表示为对照组的百分比(对照组=100%),其代表在各个时间点没有任何处理的细胞密度。
在一个实施方式中,在人肝细胞癌HepG2细胞中评估AntiOxCIN4和AntiOxCIN6的细胞抗氧化剂特征。
在一个实施方式中,按照以下方式进行细胞抗氧化剂筛选:将细胞置于48孔板(2×104个细胞/500μL)上,并与无毒浓度的AntiOxCIN4(100μM)或AntiOxCIN6(2.5μM)一起培养1小时。培养时间后,通过加入250μM FeSO4或250μM H2O2将细胞暴露于氧化应激条件48小时。在培养时间结束时,如前所述,SRB测定用于细胞密度测定。数据是四次独立实验的平均值±SEM。结果表示为对照组的百分比(对照组=100%),其代表在各个时间点没有任何处理的细胞密度。与对照相比,氧化应激物分别导致细胞增殖的显著抑制,分别为30%和42%。
在一个实施方式中,使用重要的落射荧光显微镜评估AntiOxCIN4和AntiOxCIN6在人肝细胞癌HepG2细胞中诱导的细胞形态学改变。
在一个实施方式中,按照以下方式通过重要落射荧光显微术进行形态学改变的检测,包括染色质浓缩和线粒体极化以及分布:将细胞置于6孔板中,每孔具有玻璃盖玻片(8×104个细胞/2mL),然后用无毒浓度的AntiOxCIN4或AntiOxCIN6处理48小时。在培养时间结束前30分钟,线粒体网络用TMRM(100nM)染色,而细胞核用Hoechst 33342(1μg/mL)染色,以在37℃,黑暗条件下检测HBSS(NaCl 137mM,KCl 5.4mM,NaHCO3 4.2mM,Na2HPO4 0.3mM,KH2PO4 0.4mM,CaCl2 1.3mM,MgCl2 0.5mM,MgSO4 0.6mM,和D-葡萄糖5.6mM,pH 7.4)中的凋亡染色质浓缩。从孔中取出玻璃盖玻片,并用一滴封固剂置于载玻片上。使用ZeissLSM510Meta显微镜获取细胞图像,并用ImageJ软件1.49v分析。在成像过程期间用细胞维持探针,并从每个孔中随机收集四个图像区域。图像代表三个独立实验。
在一个实施方式中,按照如下方式分析所有生物学数据:在GraphPad Prism 5.0软件(GraphPad Software,Inc.)中,所有结果表示为所示实验数的平均值±SEM。通过用于比较两种方法的学生检验和Dunnet多重比较后检验的单向ANOVA分析数据。最后一次测试用于比较具有一个独立变量的两个以上组。接受的显著性为*P<0.05,**P<0.01,***P<0.0005,****P<0.0001。
本领域技术人员将认识到或能够使用不超过常规的实验确定本文所述的本发明具体实施方式的许多等同物。本发明的范围不限于以上说明,而是如所附权利要求中所述。
在权利要求的说明中使用单数形式的元件或特征的情况下,还包括复数形式,反之亦然,如果没有特别排除的话。例如,术语“一个细胞”或“该细胞”还包括复数形式“细胞”,反之亦然。在权利要求中,诸如“一”,“一个”和“该”的用语可以表示一个或多于一个,除非相反地指出或从上下文中显而易见。如果一个,多于一个或所有组成员在给定产品或过程中存在,使用或以其他方式相关,则认为在组中的一个或多个成员之间包括“或”的声明或描述是满足的,除非另有说明相反或从上下文中显而易见。本发明包括这样的实施方式,其中该组的恰好一个成员在给定产品或过程中存在,使用或以其他方式相关。本发明还包括其中一种以上或所有组成员在给定产品或过程中存在,使用或以其他方式相关。
此外,应理解,本公开涵盖所有变型,组合和置换,其中来自一个或多个权利要求或来自说明书的相关部分的一个或多个限制,要素,条款,描述性术语等引入到另一个权利要求。例如,可以修改依赖于另一个权利要求的任何权利要求以包括在依赖于相同基本权利要求的任何其他权利要求中的一个或多个限制。此外,在权利要求叙述组合物的情况下,应理解包括将组合物用于本文公开的任何目的的方法,以及根据本文公开的任何制备方法或已知的其他方法制备组合物的方法。除非另有说明或者除非本领域普通技术人员明白会出现矛盾或不一致。
在给出范围的情况下,包括端点。此外,应理解,除非另有说明或从本领域普通技术人员的理解和其他方面明显看出,否则表示为范围的值可以假定在本发明不同实施方式中所述范围内的任何具体值为该范围下限单位的十分之一,除非上下文另有明确规定,。还应理解,除非另有说明或从本领域普通技术人员的理解和其他方面明显看出,否则表示为范围的值可以假定为给定范围内的任何子范围,其中子范围的端点表达为精确度与该范围下限单位的十分之一相同。
另外,应该理解,本发明的任何特定实例可以明确地从任何一个或多个权利要求中排除。在给出范围的情况下,该范围内的任何值可以明确地从任何一个或多个权利要求中排除。本发明的组合物和/或方法的任何实施方式,要素,特征,应用或方面可以从任何一个或多个权利要求中排除。出于简洁的目的,本文未明确阐述排除一个或多个元件,特征,目的或方面的所有实例。
上述实施方式是可组合的。
以下权利要求进一步阐述了本公开的特定实施方式。
本文件中引用的所有参考文献通过引用整体并入本文,如同每个参考文献已通过引用单独并入。
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Claims (25)
1.一种化合物,所述化合物为(E)-(8-(3-(3,4-二羟基苯基)丙烯酰胺基)辛基)三苯基鏻甲磺酸盐、(E)-(10-(3-(3,4-二羟基苯基)丙烯酰胺基)癸基)三苯基鏻甲磺酸盐、(E)-(6-(3-(3,4-二羟基苯基)丙-2-烯酰胺基)己基)三苯基鏻甲磺酸盐、(E)-(6-(3-(3,4,5-三羟基苯基)丙-2-烯酰胺基)己基)三苯基鏻甲磺酸盐、(E)-(8-(3-(3,4,5-三羟基苯基)丙烯酰胺基)辛基)三苯基鏻甲磺酸盐或(E)-(10-(3-(3,4,5-三羟基苯基)丙烯酰胺基)癸基)三苯基鏻甲磺酸盐。
2.根据权利要求1所述的化合物在制备用于预防或抑制与线粒体紊乱或与线粒体功能障碍或线粒体疾病相关的病症相关的症状的药物中的用途。
3.根据权利要求2所述的用途,其中,所述线粒体紊乱是选自由以下组成的组的紊乱:肌阵挛性癫痫;肌阵挛性癫痫伴破碎红纤维综合症;莱伯氏遗传性视神经病变;神经病变性共济失调和视网膜色素变性;MELAS综合征;Leigh综合征;显性视神经萎缩;Kearns-Sayre综合征;母系遗传性糖尿病和耳聋;Alpers-Huttenlocher综合征;共济失调神经病谱;慢性进行性眼外肌麻痹;皮尔逊综合征;线粒体神经-胃肠道脑病;Sengers综合征;MEGDEL综合征;由于复合物IV surfeit蛋白缺陷导致的缺陷型Leigh综合征、脑肌病;以及扰乱的丙酮酸氧化和ATP加PCr产生速率。
4.根据权利要求2所述的用途,其中,与线粒体功能障碍相关的病症是选自由以下组成的组的病症:弗里德赖希的共济失调、肾小管酸中毒、帕金森病、阿尔茨海默氏病、肌萎缩侧索硬化症、亨廷顿氏病、广泛性发育障碍、听力损失、糖尿病、衰老、和阻碍线粒体功能的药物不良反应。
5.根据权利要求2所述的用途,其中,所述线粒体紊乱是Leigh样综合征。
6.根据权利要求2所述的用途,其中,所述线粒体紊乱是肌病。
7.根据权利要求2所述的用途,其中,所述线粒体紊乱是线粒体肌病或心肌病。
8.根据权利要求2所述的用途,其中,与线粒体功能障碍相关的病症是耳聋。
9.根据权利要求1所述的化合物在制备用于治疗、预防或抑制神经变性疾病、瘤形成、肾病、硬皮病、肝铁超负荷疾病、肝铜超负荷疾病、脱发、人类不育、急性胰腺炎、纤维肌痛或线粒体疾病的药物中的用途。
10.根据权利要求9所述的用途,其中,所述瘤形成是癌症。
11.根据权利要求10所述的用途,其中,所述癌症是基底细胞癌、骨癌、肠癌、脑癌、乳腺癌、宫颈癌、白血病、肝癌、肺癌、淋巴瘤、黑素瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、甲状腺癌或胆道癌。
12.根据权利要求1所述的化合物在制备用于治疗非酒精性脂肪肝疾病、非酒精性脂肪性肝炎或肝硬化的药物中的用途。
13.根据权利要求1所述的化合物在制备作为抗微生物剂的试剂中的用途。
14.根据权利要求1所述的化合物在制备作为消毒剂的试剂中的用途。
15.根据权利要求1所述的化合物作为细胞培养物的补充物在制备用于维持多能细胞培养物的试剂中的用途。
16.根据权利要求1所述的化合物在制备用于体育锻炼后的肌肉恢复的药物中的用途。
17.用作化妆品、或补充剂或营养品的活性成分的根据权利要求1所述的化合物在制备抗衰老或抗皱护肤产品中的用途。
18.根据权利要求1所述的化合物作为成像研究中的探针在制备用于监测线粒体成像研究的试剂中的用途。
19.药物组合物,包含权利要求1所述的化合物中的任一种和药学上可接受的载体、佐剂、赋形剂、稀释剂或它们的混合物。
20.根据权利要求19所述的药物组合物,其中,所述药学上可接受的载体选自以下列表:盐水、阿拉伯树胶、明胶、淀粉糊、滑石、角蛋白、胶体二氧化硅、尿素或它们的混合物。
21.根据权利要求19所述的药物组合物,其中,所述佐剂选自以下列表:水包油乳液佐剂、铝佐剂、TLR-4配体、皂苷以及它们的混合物。
22.根据权利要求19所述的药物组合物,其中,所述赋形剂选自以下列表:葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘油单硬脂酸酯、氯化钠、甘油、丙烯、二醇、水、乙醇或它们的混合物。
23.根据权利要求19所述的药物组合物在制备用于治疗或预防神经变性疾病、非酒精性脂肪肝病、瘤形成、肾病、硬皮病、肝铁超负荷疾病、肝铜超负荷疾病、脱发、人类不育、急性胰腺炎或纤维肌痛的药物中的用途,其中,所述药物组合物以日剂量给予。
24.根据权利要求23所述的用途,其中,所述日剂量为20 mg/天或10 mg/天。
25.包含权利要求1所述的化合物或权利要求19所述的药物组合物的纳米载体或脂质体。
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