BR112019007565A2 - derivados hidroxicinâmicos, métodos e usos dos mesmos. - Google Patents
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Abstract
derivados hidroxicinâmicos, métodos e usos dos mesmos. a presente revelação se refere ao projeto e desenvolvimento de novos derivados hidroxicinâmicos que operam como antioxidantes mitocondriotrópicos. ademais, esta revelação também é relacionada aos métodos e usos dos derivados hidroxicinâmicos, por exemplo, no campo de doenças humanas e animais, por exemplo, para tratar a disfunção mitocondrial ou deficiências mitocondriais, e da cosmética, por exemplo, para impedir ou atrasar envelhecimento da pele.
Description
DERIVADOS HIDROXICINÂMICOS, MÉTODOS E USOS DOS MESMOS CAMPO TÉCNICO [0001] A presente revelação se refere ao projeto de síntese e desenvolvimento de novos derivados dos ácidos hidroxicinâmicos que operam como antioxidantes mitocondriotrópicos. Ademais, esta revelação está também relacionada com os métodos e usos dos derivados hidroxicinâmicos, por exemplo, no campo de doenças humanas e animais, nomeadamente, para tratar a disfunção mitocondrial ou deficiências mitocondriais, e da cosmética, por exemplo, para impedir ou atrasar o envelhecimento da pele.
ANTECEDENTES DA TÉCNICA [0002] O estresse oxidativo é um processo muito complexo, que impacta sistemas biológicos em diferentes aspectos. Seu impacto sobre sistemas biológicos depende do tipo de agente oxidante envolvido, do sítio e intensidade de sua produção, da composição e atividades de antioxidantes endógenos e da atividade de sistemas de reparo. O estresse oxidativo pode alterar a sinalização redox das células perturbando a homeostase normal que, em alguns casos, pode levar a danos celulares maiores, sendo assim, conectado a inúmeras doenças, nomeadamente àquelas associadas ao envelhecimento.12 [0003] Em um evento patológico, as defesas antioxidantes endógenas podem não ser suficientes para lidar com a produção aumentada de agentes oxidantes, de modo que tenha sido sugerido que a administração de antioxidantes exógenos possa ser benéfica para diminuir a lesão celular, visto que estes não só compensam a insuficiência dos sistemas de defesa antioxidantes endógenos, mas também, aprimoram a resposta antioxidante global. Os antioxidantes exógenos, em teoria, podem bloquear as complexas vias de danos oxidativos em diferentes níveis, obtendo um efeito terapêutico. Consequentemente, os antioxidantes que são exogenamente adquiridos a partir de dieta podem ter funções importantes na homeostase redox celular e podem ser importantes para a função celular e prevenção de doenças.
[0004] Os antioxidantes são definidos como qualquer substância que, quando presente em baixas concentrações, em comparação com um substrato oxidável,
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2/58 retarda significativamente ou previne a oxidação de biomoléculas. Os antioxidantes podem exercer seus efeitos através de diferentes mecanismos, como neutralização de espécies reativas circulantes (atividade de anulação), sequestro de ions metálicos de transição (atividade de quelação) e inibição de enzimas envolvidas na produção de espécies reativas.1·2 Ademais, os antioxidantes também podem aumentar a expressão ou atividade de sistemas antioxidantes endógenos.
[0005] O uso de antioxidantes, por si só ou em combinação com outros fármacos, é considerado benéfico para a prevenção/minimização de eventos nocivos relacionados com o estresse oxidativo, nomeadamente, em doenças ou processos associados 1[0006] Os compostos fenólicos são uma das classes mais importantes de antioxidantes naturais presentes na dieta humana. Os estudos epidemiológicos e metaanálises associadas sugeriram que o consumo a longo prazo de dietas com alimentos ou bebidas enriquecidos em compostos fenólicos tem um resultado positivo na incidência de doenças relacionadas ao estresse oxidativo2.
[0007] Os ácidos hidroxicinâmicos (HCAs) consistem em uma das principais classes de compostos fenólicos encontradas na natureza e na dieta. Dentre os HCAs, o ácido cafeico e o ácido cumárico são os mais abundantes em frutas, responsáveis por entre 75 e 100% do teor total de HCAs. O consumo dietético de HCAs foi estimado em um total de 211 mg/dia. Em outro estudo, e como exemplo, o consumo de ácido cafeico sozinho foi relatado em 206 mg/dia, sendo café, frutas e seus sucos as fontes dietéticas principais2.
[0008] Os ácidos hidroxicinâmicos (HCAs) exibem uma ampla faixa de atividades biológicas. Estes são bem conhecidos por suas propriedades antioxidantes que estão relacionadas com mecanismos de ação diversa, nomeadamente, atividade de anulação direta de radicais livres e/ou outras ações indiretas, incluindo a quelação de metais de transição pró-oxidante (a saber, cobre e ferro), modulação de expressão de gene (por exemplo, via de ARE/Nrf2) e inibição de sistemas enzimáticos envolvidos na geração de radicais2.
[0009] Os antioxidantes fenólicos naturais, como ácidos hidroxicinâmicos, obtiveram sucesso geral em estudos pré-clínicos, mas ainda apresentampouco benefício em
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3/58 estudos de intervenção humana ou testes clínicos. Nos testes clínicos ao longo dos últimos anos, nenhum resultado positivo/relevante foi obtido até o momento. A maioria dos estudos mostrou que alguns dos mesmos são desprovidos de qualquer vantagem terapêutica. De fato, existe uma incompatibilidade significativa entre os resultados obtidos em estudos pré-clínicos e o resultado de testes clínicos. Essa incompatibilidade pode ser relacionada, não apenas com o protocolo usado em testes clínicos, mas também, por restrições farmacocinéticas dos antioxidantes em avaliação. De modo similar a outros antioxidantes naturais ou dietéticos, os mesmos têm desvantagens de biodisponibilidade, visto que são incapazes de cruzar barreiras biológicas e alcançar sítios-alvo intracelulares2. Por outro lado, alguns autores propuseram que esse tipo de antioxidante natural pode alterar o equilíbrio de redox normal, em particular, nos compartimentos celulares, sendo no final mais prejudiciais do que benéficos. Outra possibilidade é que alguns dos antioxidantes não alcançam os locais relevantes de geração de radical livre, a saber, as mitocôndrias que são, na realidade, a fonte primária de espécies reativas de oxigênio (ERO) e danos oxidativos 1·2.
[0010] A função mitocondrial, e especificamente seu impacto no equilíbrio redox/oxidativo celular, é fundamental para controlar a vida e a morte celular. Além de ser a principal fonte de energia química para a célula, as mitocôndrias estão envolvidas na produção e desintoxicação de ERO, na regulação de múltiplas vias de sinalização relacionadas à homeostase celular, incluindo sobrevivência celular, equilíbrio redox e morte celular3·4. Embora a produção de erro seja regulada de modo justo por uma rede de antioxidantes endógenos, sua perturbação pode levar a danos oxidativos e disfunção mitocondrial. As disfunções oxidativas mitocondriais prejudicam múltiplas vias metabólicas e de sinalização que podem causar a morte celular por meio de apoptose ou necrose.
[0011] A evidência crescente sugere que as alterações mitocondriais resultantes do estresse oxidativo aumentado desempenha um papel crucial, por exemplo, em câncer, derrame cerebral, insuficiência cardíaca, obesidade, distúrbios neurodegenerativos e envelhecimento3·4.
[0012] Embora o papel das mitocôndrias na patogênese de doença seja
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4/58 consideravelmente consensual, o alvejamento de tal organela para prevenir a perturbação não é sempre direto. O aprimoramento da função mitocondrial através da prevenção/minimização de danos oxidativos é uma estratégia terapêutica eficaz e promissora. Visto que manter a razão entre ERO/antioxidante e a manutenção do estado redox é crítico para a sinalização celular, o alvejamento de antioxidantes para uma mitocôndria disfuncional é de interesse farmacológico34 [0013] Inúmeros antioxidantes para alvejamento da mitocôndria têm sido desenvolvidos, em particular, aqueles que usam trifenilfosfônio (TPP) como carregador. [0014] Esse tipo de cátion lipofílico pode cruzar a membrana mitocondrial e se acumular dentro da matriz mitocondrial, aproveitando o gradiente de potencial elétrico de membrana interna (ΔΨ)2·4.
[0015] Um dos os antioxidantes para alvejamento da mitocôndria mais estudados é uma mitoquinona (MitoQ, MitoQIO, metanossulfonato de [10-(4,5-dimetoxi-2-metil-3,6dioxo-1,4-ciclo-hexadien-1 -iljdecil] trifenilfosfônio). O MitoQ é constituído por uma porção antioxidante endógena (coenzima Q) covalentemente ligada a um espaçador de cadeia alquílica de 10 carbonos (dTPP) a um cátion de trifenilfosfônio (TPP). O MitoQ está sob testes clínicos para diferentes patologias, a saber, para hepatite C. Contudo, os testes clínicos com o uso de MitoQ como uma solução terapêutica para doenças neurodegenerativas produziram resultados insatisfatórios.
[0016] Outro antioxidante para alvejamento mitocondrial relevante é o SKQ1 [brometo de 10-(4,5-dimetil-3,6-dioxociclo-hexa-1,4-dien-1-il)decil)trifenilfosfônio)], que é baseado na plastoquinona, uma quinona envolvida na cadeia transportadora de elétron de cloroplastos. O SkQ1 mostrou diminuir o estresse oxidativo dentro de mitocôndrias e benefícios de proteção significativos para afecção de olho seco.
[0017] No entanto, ainda há uma necessidade de moduladores mitocondriais eficazes e seguros para serem usados na terapia e em outras aplicações como em cosmética.
[0018] O uso de TPP como carregador também foi rastreado como uma estratégia para direcionar HCAs para mitocôndrias. Nesse contexto, um protótipo de um antioxidante de direcionamento mitocondrial com base no ácido cafeico foi desenvolvido pelo presente grupo5. O composto aqui denominado como AntiOxCINi
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5/58 preservou a atividade antioxidante do composto parental, sendo mais lipofílico. O AntiOxCINI se acumulou nas mitocôndrias e protegeu as células C2C12 de mioblasto de camundongo contra diferentes agentes de estresse oxidativo, a saber, H2O2 e hidroperóxidos de ácido linoleico. Contudo, a eficácia de AntiOxCINI como antioxidante mitocondriotrópico ficou aquém do desejado.
[0019] Esses fatos são revelados para ilustrar 0 problema da técnica abordado pela presente revelação.
DESCRIÇÃO GERAL [0020] As mitocôndrias e 0 controle da produção de espécies reativas de oxigênio (ERO) e do equilíbrio redox celular são um alvo atraentepara descoberta e desenvolvimento de fármacos. O alvejamento de mitocôndrias com agentes moduladores provou ser uma estratégia eficaz. Nesse contexto, 0 desenho racional de antioxidantes mitocondriotrópicos potentes e eficazes (AntiOxCINs) com base em ácidos hidroxicinâmicos foi realizado.
[0021] A presente revelação, em um primeiro aspecto, é relacionada com 0 desenvolvimento de novos derivados hidroxicinâmicos que podem ser identificados pela fórmula geral
ou um sal farmaceuticamente aceitável, solvato, hidrato, tautômero, estereoisômero, em queR1, R2, R3, R4, R5, R6, R7 e R8 são selecionados independentemente um do outro;
R1, R2, R3, R4 e R5 são selecionados a partir de H, halogênio, hidroxila, metila, metoxila, amino, ácido carboxílico ou grupo nitro;
R6, R7, R8 são uma cadeia alquila, uma cadeia alquenila, uma cadeia alquinila, arila
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6/58 substituída ou um anel cíclico;
uma ligação entre R6 e R7 é uma ligação simples, uma ligação dupla ou uma ligação tripla, que pode ser ou não substituída, e desde que, em que a ligação entre R6 e R7 seja uma ligação dupla, R3=R2 são diferentes de OH, e R1=R4 são diferentes de H, e R6=R7 são diferentes de metila, Z’ é um ânion.
[0022] Com base nas definições da União Internacional de Química Pura e Aplicada (IUPAC), um grupo alquila é definido como um grupo univalente derivado de alcanos por remoção de um átomo de hidrogênio de qualquer átomo de carbono -CnH2n+i. Os grupos derivados por remoção de um átomo de hidrogênio a partir de um átomo de carbono terminal de alcanos não ramificados formam uma subclasse de grupos normais alquila (n-alquila) H (CH2)n. Os grupos RCH2, R2CH (R + H) e R3C (R + H) são grupos alquila primária, secundária e terciária, respectivamente. Um grupo arila é derivado de arenos (hidrocarbonetos aromáticos monocíclicos e policíclicos) por remoção de um átomo de hidrogênio de um átomo de carbono em anel.
[0023] “Alquila” inclui “alquila inferior” e se estende para abranger fragmentos de carbono que têm até 30 átomos de carbono. Os exemplos de grupos alquila incluem octila, nonila, norbornila, undecila, dodecila, tridecila, tetradecila, pentadecila, eicosila, 3,7-dietil-2,2-dimetil-4-propilnonila, 2-(ciclododecil)etila, adamantila e similares.
[0024] “Alquila inferior” significa grupos alquila de 1 a 7 átomos de carbono. Os exemplos de grupos de alquila inferior incluem metila, etila, propila, isopropila, butila, sec-butila e terc-butila, pentila, hexila, heptila, ciclopropila, ciclobutila, ciclopentila, ciclohexila, ciclo-heptila, 2-metilciclopropila, ciclopropilmetila e similares.
[0025] O halogênio é um elemento selecionado a partir da lista que consiste em: F, Cl, Br, I, At.
[0026] Em uma modalidade, a ligação entre R6 e R7 pode ser uma ligação única ou uma ligação dupla, em que a ligação entre R6 e R7 seja uma ligação dupla, R3=R2 sejam diferentes de OH e R1=R4 sejam diferentes de H e R6=R7 sejam diferentes de metila.
[0027] Em uma modalidade, a cadeia alquila, a cadeia alquenila ou a cadeia alquinila
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7/58 pode ser uma cadeia de C1-C30, preferencialmente uma cadeia de C1-C18, mais preferencialmente uma cadeia de C2-C14, ainda mais preferencialmente, uma cadeia de C3-C12 ou uma cadeia de C6-C10.
[0028] Em uma modalidade, a cadeia alquila pode ser uma cadeia de Ce alquila, uma cadeia de C7 alquila, uma cadeia de Cs alquila, uma cadeia de C9 alquila ou uma cadeia de C10 alquila.
[0029] Em uma modalidade, a arila substituída pode ser uma alcano-arila substituída, alceno-arila substituída ou alcino-arila substituída, preferencialmente Ce-Cio-arila, preferencialmente fenila; benzila, fenetila, fenpropila, fenbutila ou fen-hexila, que é opcionalmente substituída uma vez ou várias vezes por:
a) Ci-C6-alquila, Cs-Cs-cicloalquila, Ce-Cio-arila, Ce-Cio-aril-Ci-Cs-alquila, C1-C6- alcóxi,
Ce-Cio-arilóxi, Ce-Cio-aril-Ci-Cs-alcóxi, hidroxila, CO2H, Ci-Ce-alcoxicarbonila, Ce-Cioariloxicarbonila, Ce-Cio-aril-Ci-Cs-alcoxicarbonila, Ci-Ce-alquilcarbonila, Ce-Cioarilcarbonila, Ce-Cio-aril-Ci-Cs-alquilcarbonila, Ci-Ce-alquilcarbóxi, Ce-Cio-arilcarbóxi, C-i-Ce-alquilmercaptila, Ce-Cio-arilmercaptila, Ci-Ce-alquilmercaptocarbonila, Cs-Cscicloalquilmercaptocarbonila, Ce-Cio-arilmercaptocarbonila, Ci-Cealquilmercaptocarbóxi, C6-C10- arilmercaptocarbóxi, Ci-Ce-alquilsulfonila, C6-C10arilsulfonila, Ci-Ce-alquilsulfóxi, Ce-Cio-arilsulfoxi;
cada um dos quais é opcionalmente substituído uma ou várias vezes por Ci-Ce-alquila, Ci-Ce-alcóxi, COOH; CONH2, substituído uma vez ou duas vezes por Ci-Ce-alquila; SOsH, amino, tiol, hidroxila, nitro, ciano, flúor, cloro, bromo, iodo, CF3 ou OCF3;
em que vários destes substituintes opcionais podem ser combinados para formar sistemas de homoanel ou heteroanel anelados saturados, insaturados ou aromáticos; ou
b) um heterociclo saturado, insaturado ou aromático, opcionalmente substituído uma vez ou várias vezes por Ci-Ce-alquila, Ci-Ce-alcóxi, COOH; CONH2 opcionalmente substituído uma vez ou duas vezes.
[0030] Em uma modalidade, 0 anel cíclico pode ser um ciclopropano, ciclobutano, ciclopentano ou ciclo-hexano.
[0031] Em uma modalidade, 0 ânion Z_ é selecionado a partir da seguinte lista:
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8/58 sulfonato de alquila, sulfonato de arila, nitrato ou um halogênio, em que o dito halogênio pode ser F, Cl ou Br; o sulfonato de alquila ou sulfonato de arila pode ser selecionado a partir da seguinte lista: metanossulfonato, p-toluenossulfonato, etanossulfonato, benzenossulfonato e 2-naftalenossulfonato.
[0032] Em uma modalidade, R1, R2, R3, R4 e R5 podem compreender um halogênio, em que o dito halogênio é F, Cl ou Br.
[0033] Em uma modalidade, R1 e R5 podem ser H.
[0034] Em uma modalidade, R2 e R3 podem ser OH.
[0035] Em uma modalidade, R4 pode ser H ou OH.
[0036] Em uma modalidade, R6 e R7 podem ser uma cadeia de Ci alquila.
[0037] Em uma modalidade, R8 pode ser uma cadeia de C2 alquila.
[0038] Em uma modalidade, 0 composto pode ser metanossulfonato de (E)-(6-(3-(3,4di-hidroxifenil)prop-2-enamido)hexil)trifenilfosfônio.
[0039] Em uma modalidade, 0 composto pode ser metanossulfonato de (E)-(8-(3-(3,4di-hidroxifenil)acrilamido)octil)trifenilfosfônio.
[0040] Em uma modalidade, 0 composto pode ser metanossulfonato de (E)-(6-(3(3,4,5-tri-hidroxifenil)prop-2-enamido)hexil)trifenilfosfônio.
[0041] Em uma modalidade, 0 composto pode ser metanossulfonato de (E)-(8-(3(3,4,5-tri-hidroxifenil)acrilamido)octil)trifenilfosfônio.
[0042] Em uma modalidade, 0 composto pode ser metanossulfonato de (E)-(10-(3(3,4-di-hidroxifenil)acrilamido)decil)trifenilfosfônio.
[0043] Em uma modalidade, 0 composto pode ser metanossulfonato de (E)-(10-(3(3,4,5-tri-hidroxifenil)acrilamido)decil)trifenilfosfônio.
[0044] A presente divulgação também se refere a qualquer composto, ou compostos relacionados, agora divulgados para uso na medicina ou na veterinária.
[0045] Em uma modalidade, os compostos divulgados ou compostos relacionados, podem ser usados para modular pelo menos um aspecto da morfologia mitocondrial e/ou expressão de enzimas de OXPHOS.
[0046] Em uma modalidade, os compostos divulgados, ou compostos relacionados, podem ser usados para 0 tratamento ou prevenção ou supressão de sintomas
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9/58 associado a um distúrbio mitocondrial ou a uma afecção associada à disfunção mitocondrial em geral, incluindo doenças originadas por defeitos de cadeia respiratória mitocondrial.
[0047] Em uma modalidade, o distúrbio mitocondrial é um distúrbio selecionado a partir do grupo que consiste em: Epilepsia mioclônica; Epilepsia Mioclônica com Fibras Rotas Vermelhas (MERRF); Neuropatia Óptica Hereditária de Leber (LHON); neuropatia ataxia e rinite pigmentosa (NARP); Miopatia Mitocondrial, Encefalopatia, Lactacidose, Derrame (MELAS); síndrome de Leigh; síndrome tipo Leigh; atrofia Óptica Dominante (DOA); Síndrome de Kearns-Sayre (KSS); Diabetes e Surdez de Herança Materna (MIDD); síndrome de Alpers-Huttenlocher; espectro de Neuropatia Ataxia; Oftalmoplegia Externa Progressiva Crônica (CPEO); síndrome de Pearson; Encefalopatia Neurogastrointestinal Mitocondrial (MNGIE); síndrome de Sengers; acidúria 3-metilglutacônica, surdez sensorioneural, encefalopatia e constatações neurorradiológicas de síndrome tipo Leigh (MEGDEL); miopatia; miopatia mitocondrial; cardiomiopatia; e encefalomiopatia, SURF1 (síndrome de Leigh deficiente de COX devido à deficiência de proteína de excesso de complexo IV) e deficiências de OXPHOS isoladas ou combinadas com defeito genético não solucionado até o momento, incluindo oxidação de piruvato perturbada e taxas de produção de ATP mais PCr.
[0048] Em uma modalidade, a afecção associada à disfunção mitocondrial pode ser um distúrbio selecionado a partir do grupo que consiste em: Ataxia de Friedreich (FRDA); acidose tubular renal; doença de Parkinson; doença de Alzheimer; esclerose lateral amiotrófica (ALS); doença de Huntington; distúrbios pervasivos desenvolvimentais; perda de audição; surdez; diabetes; envelhecimento; e efeitos de fármaco adversos impeditivos da função mitocondrial.
[0049] Em uma modalidade, os compostos agora divulgados, ou compostos relacionados, podem ser usados no tratamento ou prevenção de uma doença neurodegenerativa, neoplasia, doença do rim, escleroderma, doença de sobrecarga de ferro hepático, doença de sobrecarga de cobre hepático, alopecia, infertilidade humana, pancreatite aguda, fibromialgia, ou outra doença relacionada envolvendo danos
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10/58 oxidativos mitocondriais.
[0050] Em uma modalidade, os compostos agora divulgados, ou compostos relacionados, podem ser usados no tratamento de doenças do fígado gorduroso não alcoólico, a saber, doença do fígado gorduroso não alcoólico (NAFLD), esteato-hepatite não alcoólica (NASH) ou cirrose hepática, dentre outros.
[0051] Em uma modalidade, os compostos agora divulgados, ou compostos relacionados, podem ser usados em neoplasias, em que a doença de neoplasia é um câncer, em particular, carcinoma celular basal, câncer do osso, câncer do intestino, câncer cerebral, câncer de mama, câncer cervical, leucemia, câncer de fígado, câncer de pulmão, linfoma, melanoma, câncer de ovário, câncer pancreático, câncer de próstata, câncer de tiroide ou câncer biliar, entre outros.
[0052] Em uma modalidade, os compostos agora divulgados, ou compostos relacionados, podem ser para uso em doenças relacionadas ao rim, a saber, insuficiência renal entre outros.
[0053] Em uma modalidade, os compostos agora divulgados, ou compostos relacionados, podem ser para uso em esclerose lateral amiotrófica.
[0054] Em uma modalidade, os compostos agora divulgados, ou compostos relacionados, podem ser para uso como agente antimicrobiano, em particular, como um desinfetante.
[0055] Em uma modalidade, os compostos agora divulgados, ou compostos relacionados, podem ser para uso na manutenção de uma cultura de célula pluripotente, como um suplemento para cultura celular, em particular, como componente de meio de cultivo.
[0056] Em uma modalidade, os compostos agora divulgados, ou compostos relacionados, podem ser usados para acelerar a recuperação muscular após o exercício físico.
[0057] Em uma modalidade, os compostos agora divulgados, ou compostos relacionados, podem ser usados como ingredientes ativos em produtos cosméticos, de suplemento ou nutracêuticos, a saber, como um produto ou ingrediente de cuidados com a pele antienvelhecimento ou antirrugas.
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11/58 [0058] Em uma modalidade, os compostos agora divulgados, ou compostos relacionados, podem ser para uso como uma sonda em estudos de imageamento, em particular, para monitorar estudos de imageamento mitocondrial.
[0059] A presente revelação também se refere a um meio de cultura celular para manter células-tronco pluripotentes em um estado não diferenciado que compreende qualquer um dentre os compostos revelados agora ou compostos relacionados.
[0060] A presente revelação também se refere a uma composição farmacêutica que compreende qualquer um dos compostos revelados agora ou compostos relacionados e um ou mais adjuvante, excipiente, diluente, carreador farmaceuticamente aceitável ou misturas dos mesmos, dentre outros.
[0061] Em uma modalidade, o carreador farmaceuticamente aceitável pode ser selecionado a partir da seguinte lista: solução salina, goma acácia, gelatina, pasta de amido, talco, queratina, silica coloidal, ureia ou misturas dos mesmos, dentre outros.
[0062] Em uma modalidade, o adjuvante pode ser selecionado a partir da seguinte lista: adjuvante de emulsão de óleo em água, adjuvante de alumínio, um ligante de TLR-4, uma saponina e misturas dos mesmos, dentre outros.
[0063] Em uma modalidade, o excipiente pode ser selecionado a partir da seguinte lista: glicose, lactose, sacarose, monoestearato de glicerol, cloreto de sódio, glicerol, propileno, glicol, água, etanol ou misturas dos mesmos, dentre outros.
[0064] Em uma modalidade, a composição farmacêutica pode ser administrada de modo tópico, oral, parenteral ou injetável.
[0065] Em uma modalidade, a composição farmacêutica pode ser para uso, por exemplo, em um método para o tratamento ou prevenção de uma doença neurodegenerativa, doença do fígado gorduroso não alcoólico, neoplasia, doença do rim, escleroderma, doença de sobrecarga de ferro hepático, doença de sobrecarga de cobre hepático, alopecia, infertilidade humana, pancreatite aguda ou fibromialgia, em que a composição farmacêutica é administrada em uma dose diária.
[0066] Em uma modalidade, a dose diária da dita composição farmacêutica pode ser 20 mg/dia ou 10 mg/dia, dentre outros.
[0067] A presente revelação também fornece um nanocarreador, por exemplo, um
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12/58 lipossomo, em que o dito nanocarreador ou o dito lipossomo compreende os compostos revelados agora, ou compostos relacionados, ou a composição farmacêutica revelada agora.
[0068] Em algumas modalidades, a composição pode compreender os compostos revelados, ou compostos relacionados, na presente matéria, em uma quantidade eficaz para aprimorar a eficácia de outras terapias, incluindo imunoterapia ou qualquer abordagem farmacológica, por pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 95,7%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% no indivíduo.
[0069] Em algumas modalidades, a composição compreende uma dose de 0,1 a 1.000 mg. Por exemplo, em algumas modalidades, a preparação compreende uma dose de 0,1 mg/kg, 0,2 mg/kg, 0,3 mg/kg, 0,4 mg/kg, 0,5 mg/kg, 0,7 mg/kg, 0,8 mg/kg, 0,9 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg, 3 mg/kg, 4 mg/kg, 5 mg/kg, 6 mg/kg, 7 mg/kg, 8 mg/kg, 9 mg/kg, 10 mg/kg, 11 mg/kg, 12 mg/kg, 13 mg/kg, 14 mg/kg, 15 mg/kg, 16 mg/kg, 17 mg/kg, 18 mg/kg, 19 mg/kg, 20 mg/kg, 25 mg/kg, 30 mg/kg, 40 mg/kg, 50 mg/kg, 60 mg/kg, 70 mg/kg, 80 mg/kg, 90 mg/kg, 100 mg/kg, 200 mg/kg, 250 mg/kg, 300 mg/kg,
400 mg/kg, 500 mg/kg, 600 mg/kg, 700 mg/kg, 750 mg/kg, 800 mg/kg, 900 mg/kg ou 1.000 mg/kg. Em algumas modalidades, a composição compreende uma dose de 0,1 a 10 mg/kg, 0,1 a 100 mg/kg, 1 a 10 mg/kg, 1 a 100 mg/kg, 1 a 1.000 mg/kg, 10 a 100 mg/kg, 10 a 1.000 mg/kg, 100 a 1.000 mg/kg, 10 a 50 mg/kg, 10 a 25 mg/kg, 10 a 20 mg/kg, 50 a 100 mg/kg ou 100 a 250 mg/kg.
[0070] As vias de administração preferenciais incluem, porém, sem limitações, oral, parenteral, intramuscular, intravenosa, injeção in situ, intranasal, sublingual, intratraqueal, inalação ou tópica.
[0071] Em algumas modalidades, a forma de dose ou dosagem pode ser administrada ao indivíduo, por exemplo, uma vez por dia, duas vezes por dia ou três vezes por dia.
[0072] Em outras modalidades, a dose é administrada ao indivíduo uma vez por semana, uma vez por mês, uma vez a cada dois meses, quatro vezes por ano, três
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13/58 vezes por ano, duas vezes por ano ou uma vez por ano.
[0073] Ao longo da descrição e das reivindicações, a palavra “compreende” e variações da palavra, não são destinadas a excluir outros recursos técnicos, aditivos, componentes ou etapas. Os objetivos, vantagens e recursos adicionais da solução agora revelada irão se tornar evidentes àqueles versados na técnica mediante a examinação da descrição ou podem ser aprendidos pela prática da solução.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS [0074] As seguintes figuras fornecem modalidades preferenciais para ilustrar a descrição e não devem ser vistas como limitantes do alcance da revelação.
Figura 1: Estratégia sintética buscada para obter inúmeros AntiOxCINs. Reagentes e condições: i) Cloroformato de etila, aminoálcool, t.a.; ii) Cloreto de metanossulfonila, t.a.; iii) Trifenilfosfina, 150 °C (micro-onda, 1 h e 30 min) ou 130 °C (18 h); ou iv) BBn, de-70 °C (10 min) à t.a. (12 h).
Figura 2: Avaliação das propriedades de quelação de ferro do ácido cafeico, AntiOxCINs e MitoQ. EDTA (agente de quelação) foi usado como referência. Estatisticamente significativo em comparação com o grupo-controle com o uso de ANOVA unidirecional (P < 0,0001, n.s., não significativo).
Figura 3: (A) Acúmulo de AntiOxCINs por mitocôndrias de fígado de rato energizadas medido com o uso de um eletrodo seletivo de TPP. (B) Efeitos da substituição do padrão do anel aromático de AntiOxCINs e cadeia lateral de carbono alquila sobre a lipofilicidade (—) e razão de acúmulo mitocondrial (—). (C) Razão de acúmulo de AntiOxCINs por mitocôndrias de fígado de rato. MIT, mitocôndrias; SUC, succinato; VAL, valinomicina.
Figura 4: Efeito de ácido cafeico, AntiOxCINs e MitoQ sobre peroxidação de lipídio mitocondrial sob diferentes condições oxidativas: (A) Níveis de TBARS e (B) alterações no consumo de oxigênio. As comparações entre o controle versus pré-incubações de AntiOxCINs (5 μΜ) foram realizadas com o uso de ANOVA unidirecional.
Figura 5: O efeito de (A) ácido cafeico, (B) dTPP e MitoQ e AntiOxCINs contendo um (C) núcleo de catecol ou (D) de pirogalol em peroxidação de lipídio de membranas de RLM induzidas por ADP e Fe2+ seguido pelo consumo de oxigênio.
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Figura 6: 0 efeito de MitoQ eAntiOxCINs sobre a respiração de RLM suportada por succinato a 5 mM. (A) Efeitos de MitoQ (branco, controle; padrão horizontal, 2,5 μΜ, padrão vertical, 5 pM); (B-H), Efeitos de AntiOxCINs (branco, controle; padrão horizontal, 2,5 pM, padrão vertical, 5 pM, padrão quadriculado, 10 pM). A significância estatística em relação às diferentes taxas/estados respiratórios foi determinada com o uso do teste t de duas caudas de Student.
Figura 7: O efeito de AntiOxCINs e MitoQ sobre o inchaço mitocondrial mediante a indução do poro de transição de permeabilidade mitocondrial (mPTP). AntiOxCINs e MitoQ em (A) 2,5 pM, (B) 5 pM e (C) 10pM foi pré-incubados com RLM por 5 min antes da adição de cálcio. As comparações foram realizadas com o uso de ANOVA unidirecional entre controle (apenas Ca2+) versus ensaios em que derivados de AntiOxCIN foram pré-incubados antes de Ca2+. CsA-ciclosporina A
Figura 8: (A) O perfil de citotoxicidade de AntiOxCIN4 () e AntiOxCINe (*)em células de carcinoma hepatocelular (HepG2). Estatisticamente significativo em comparação com o grupo-controle com o uso de ANOVA unidirecional (B) Efeito de AntiOxCIN4 e AntiOxCINe sobre danos oxidativos em células HepG2 induzidos por peróxido de hidrogênio e ferro. As comparações foram realizadas com o uso de ANOVA unidirecional entre o controle (FeSO4 ou H2O2) versus a preparação em que os AntiOxCINs foram pré-incubados (C) AntiOxCIN4 e AntiOxCINe (100 pM e 2,5 pM, respectivamente) não perturbaram a morfologia nuclear normal e a polarização mitocondrial.
DESCRIÇÃO DETALHADA [0075] Em uma modalidade, e com um exemplo, a estratégia sintética buscada para 0 desenvolvimento de inúmeros antioxidantes cinâmicos catiônicos lipofílicos (AntiOxCINs) é representada na Figura 1. Nesse exemplo, os ácidos di (1) ou trimetoxicinâmicos (2) usados como materiais de partida foram ligados por uma reação de amidação a espaçadores alquílicos bifuncionalizados adequados com um comprimento variável (derivados cinâmicos 3 a 8)., Inicialmente 0 grupo funcional álcool dos derivados foi,ativado com um grupo de saída (-OSO2CH3) para obter os derivados cinâmicos 9 a 14. Em seguida, 0 grupo terminal foi deslocado por meio de
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15/58 uma reação de substituição nucleofílica com trifenilfosfina (PPhs) para obter os cátions de trifenilfônio 15 a 20 ao longo de reações clássicas ou assistidas por micro-onda. O uso de radiação de micro-onda permite obter precursores de AntiOxCINs em um processo acelerado inofensivo ao ambiente. O tempo de reação foi de 1 hora e 30 minutos, em contraste com 18 h necessárias na reação clássica. Por fim, AntiOxCINs (AntiOxCIN2 a AntiOxCIN?) foram obtidos por uma reação de desmetilação com o uso de solução tribrometo (BBra).
[0076] Em uma modalidade, e como um exemplo, as propriedades antioxidantes, lipofílicas e redox de AntiOxCINs foram relatadas. O ácido cafeico e AntiOxCINi também foram incluídos no estudo. Os resultados foram representados na Tabela 1. Tabela 1. Propriedades antioxidantes, lipofílicas e redox de AntiOxCINs.
| Composto | MW (gmol-1) | ICso (μΜ) | EP (V) | Etr/V | ||
| DPPH | ABTS + | GO | ||||
| Ácido cafeico | 180,16 | 18,1 | 17,9 | 3,4 | 0,168 | - |
| AntiOxCINi | 563,60 | 35,4 | 33,3 | 4,5 | 0,166a) | 0,572 |
| AntiOxCIN2 | 619,71 | 29,5 | 30,5 | 4,1 | 0,164 | 0,396 |
| AntiOxCINs | 632,52 | 28,0 | 27,9 | 2,8 | 0,170 | 0,345 |
| AntiOxCINe | 675,81 | 25,9 | 23,5 | 2,7 | 0,174 | 0,291 |
| AntiOxCINd | 635,71 | 19,0 | 12,2 | 3,1 | 0,034 | 0,498 |
| AntiOxCINs | 663,76 | 14,7 | 8,7 | 2,3 | 0,046 | 0,423 |
| AntiOxCIN? | 691,82 | 13,7 | 7,5 | 2,5 | 0,057 | 0,377 |
[0077] Em uma modalidade, a hierarquia de atividade antioxidante de AntiOxCINsfoi estabelecida por métodos não celulares in vitro. Os ensaios de capacidade antioxidante total (TAC) selecionados (DPPH, ABTS e GO) envolvem a medição espectrofotométrica da diminuição de absorbância de radical como um resultado de uma desativação de radical in situ por um antioxidante. Os compostos com atividade
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16/58 antioxidante superior exibem valores de ICso inferiores. Os dados de atividade antioxidante (Tabela 1) permitem concluir que os AntiOxCINs são antioxidantes eficazes, quando comparados com ácido cafeico e AntiOxCINi, e que os valores de ICso obtidos seguiram a mesma tendência nos três ensaios diferentes. Os dados claramente indicam que as séries que compreendem um sistema de pirogalol (AntiOxCIN4, AntiOxCINs e AntiOxCIN?) exibem uma atividade antioxidante superior às suas contrapartes de catecol (AntiOxCINz, AntiOxCINs e AntiOxCINs). Em geral, a introdução da cadeia lateral alifática de trifenilfosfônio (TPP) levou a uma ligeira diminuição na atividade antioxidante, quando comparado com ácido cafeico. Essa diminuição foi atenuada/melhorada pelo incremento do comprimento de espaçador e/ou a introdução do grupo hidroxila adicional no anel aromático.
[0078] Em uma modalidade, AntiOxCINs AntiOxCINs e AntiOxCIN? tem uma atividade antioxidante similar ou superior ao ácido cafeico e AntiOxCIN-ι. As alterações químicas realizadas no comprimento de espaçador não têm uma influência negativa na capacidade de anulação de radicais. Pelo contrário, uma capacidade antioxidante superior foi observada para compostos que têm um espaçador de alquila comprido.
[0079] Em uma modalidade, e como um exemplo, as propriedades de redox de AntiOxCINs foram avaliadas (Tabela 1). Os potenciais redox são correlacionados com a habilidade de um antioxidante para doar um átomo de hidrogênio e/ou um elétron para um radical livre. Geralmente, os baixos potenciais de oxidação (Ep) são associados a um desempenho antioxidante superior.
[0080] Em uma modalidade, os dados de potencial redox, obtidos em pH fisiológico (7,4) por voltametria de pulso diferencial e cíclica, permitem concluir que o ácido cafeico e seus análogos de catecol (AntiOxCIN-ι, AntiOxCINz, AntiOxCINs e AntiOxCINs) mostraram potenciais de redox (EP) característicos da presença de um grupo catecol (EP = 0,164 a 0,174 V) (Tabela 1). Entretanto, para derivados de pirogalol (AntiOxCIN^ AntiOxCINs e AntiOxCIN?), uma diminuição significativa em potenciais de redox foi observada (Ep = 0,034 a 0,057 V) (Tabela 1).
[0081] Em uma modalidade, os dados de voltametria cíclica permitiram concluir que o ácido cafeico e seus análogos de catecol (AntiOxCIN-ι, AntiOxCINz, AntiOxCINs e
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AntiOxCINe) sofrem uma reação reversível, visto que um único pico anódico e um pico catódico na varredura inversa foram observados. Em todos os sistemas, o mecanismo de oxidação foi comparável àquele proposto para o ácido cafeico visto que envolve dois elétrons por molécula, que provavelmente corresponde à formação de um radical semiquinona e sua oxidação subsequente para orto-quinona.
[0082] Em uma modalidade, sistemas de pirogalol (AntiOxCINe AntiOxCINs e AntiOxCIN?) parecem sofrer uma reação de oxidação irreversível visto que não foi vista qualquer onda de redução na varredura catódica. Para esse tipo de sistemas, apenas um pico anódico foi observado em pH fisiológico com o uso de voltametria de pulso diferencial. Os voltamogramas apresentam um pico de difusão e um pós-pico de adsorção em um potencial mais anódico correspondente à oxidação de formas dissolvidas e adsorvidas dos compostos, respectivamente. As ondas de oxidação podem ser relacionadas ao processo de oxidação da porção química de pirogalol. Os voltamogramas cíclicos também mostram a presença de dois picos anódicos sobrepostos. Os picos anódicos parecem corresponder a processos irreversíveis, visto que não foi vista qualquer onda de redução distinta na varredura catódica. A existência do grupo fenólico adicional nos sistemas de pirogalol, quando comparados com os de catecol, parece influenciar a estabilização do intermediário de semiquinona e, por sua vez, o mecanismo oxidativo.
[0083] Em uma modalidade, os dados obtidos com ensaios de TAC são consistentes com o potencial redox obtido para os AntiOxCINs. Em geral, os resultados reforçam a suposição de que o número de substituintes de hidroxila presentes no anel aromático cinâmico é diretamente relacionado às propriedades antioxidantes e eletroquímicas.
[0084] Em uma modalidade, as propriedades lipofílicas de AntiOxCINs foram avaliadas em pH fisiológico por eletroquímica. A técnica usada é frequentemente usada para simular a transferência de fármacos iônicos através de membranas biológicas à medida que o processo ocorre na interface entre duas soluções de eletrólito imiscíveis (ITIES). O potencial de transferência (Etr) em que o fármaco iônico, inicialmente presente na fase aquosa (C = 0,32 mM), é transferida para a fase de 1,6-diclorohexano (DCH) é medida por voltametria de pulso diferencial (DPV). No modelo de
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ITIES, o potencial de transferência (Etr) se torna menos positivo com o aumento do caráter lipofílico de fármaco.
[0085] Em uma modalidade, e como um exemplo, os potenciais de transferência de AntiOxCINs (Etr) obtidos estão mostrados na Tabela 1. Em geral, um incremento de lipofilicidade de AntiOxCINs foi observado em função do comprimento do espaçador de alquila. Esse comportamento foi observado em ambas as séries de AntiOxCINs, em que AntiOxCINi é o composto menos lipofílico. Como esperado, o ácido cafeico não permeia. Para a série à base de catecol, a lipofilicidade relativa aumenta na seguinte ordem: AntiOxCINi< AntiOxCIN2< AntiOxCINs< AntiOxCINe e para a série à base de pirogalol: AntiOxCINs AntiOxCINs< AntiOxCIN?. Para o mesmo incremento do comprimento de espaçador (por exemplo, AntiOxCINeversus AntiOxCIN?) a introdução de uma função de OH adicional aumentou a hidrofilicidade de AntiOxCINs.
[0086] Em uma modalidade, e como um exemplo, as propriedades de quelação de AntiOxCINs, a saber, sua habilidade de quelar ferro, foram determinadas. O ferro é um metal redox ativo que pode catalisar reações de Fenton e Haber-Weiss gerando radicais de hidroxila (*OH), que é uma forte espécie oxidante que é associada com eventos de danos oxidativos com implicações graves para a saúde e doença humana. Observa-se que a perda de homeostase de ferro mitocondrial e sobrecarga de ferro consequente podem contribuir para a disfunção mitocondrial e, por sua vez, para patologias diferentes. Portanto, o uso de agentes de quelação de metal ou antioxidantes que operam através desse ou mais do que um mecanismo pode funcionar como uma abordagem terapêutica para prevenir a toxicidade induzida por metal.
[0087] Em uma modalidade, as propriedades de quelação de ferro (II) de AntiOxCINs foram avaliadas pelo ensaio de ferrozina com o uso de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) como referência. As propriedades de quelação de ferro de ácido cafeico e MitoQ também foram avaliadas. Foi constatado que EDTA é capaz de quelar todo o ferro na solução, visto que pode inibir completamente a formação do complexo de ferrozina-fe(ll) colorido.
[0088] Em uma modalidade, AntiOxCINs (série de catecol ou pirogalol) e ácido
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19/58 cafeico, em oposição a MitoQ, puderam quelar o ferro ferroso semelhante ao EDTA (Figura 2). Apesar das modificações químicas realizadas em AntiOxCINs, os novos derivados ainda apresentam uma capacidade notória de quelar o ferro, de modo similar ao agente de quelação EDTA e ao ácido cafeico (Figura 2). AntiOxCIN2 e AntiOxCllsk exibem uma atividade de quelação de ferro superior ao ácido cafeico em si.
[0089] Em uma modalidade, é destacado que as propriedades de quelação de AntiOxCINs não foram compartilhadas por MitoQ. Essa propriedade particular de AntiOxCINs pode constituir por si só um recurso importante para o tratamento de distúrbios metabólicos e mitocondriais que envolvem a sobrecarga de ferro.
[0090] Em uma modalidade, e como um exemplo, o acúmulo de AntiOxCINs mitocondrial foi analisado em mitocôndrias de fígado de rato (RLM) isoladas em resposta à potencial de membrana. AntiOxCINs pode se acumular dentro de mitocôndrias conduzido por ΔΨ (Figura 3A). Diferentes capacidades de acúmulo de AntiOxCINs dentro da matriz mitocondrial foram observados. Foi constatado que o processo está relacionado ao incremento do comprimento de espaçador e padrão de substituição aromática, e diretamente relacionado à lipofilicidade de AntiOxCINs (Figura 3B e 3C, Tabela 1). Entretanto, o aumento linear da lipofilicidade de AntiOxCINs não foi diretamente traduzido em um aumento na razão de acúmulo na matriz mitocondrial (Figura 3B). A seguinte ordem de classificação foi obtida: AntiOxCINi< AntiOxCIN2< AntiOxCINe< AntiOxCINs (séries de catecol); AntiOxCINs AntiOxCIN?< AntiOxCINs (séries de pirogalol) (Figura 3C). Embora AntiOxCINs e AntiOxCIN? foram os compostos mais lipofílicos, os mesmos exibem uma razão de acúmulo inferior provavelmente devido ao efeito de corte de membrana. Apesar das diferenças estruturais químicas, AntiOxCIN2, AntiOxCINs e AntiOxCIN4 exibiram aproximadamente a mesma razão de acúmulo. Todos os AntiOxCINs apresentam uma razão de acúmulo comparável àquela do MitoQ e superior ao AntiOxCINi (Figura 3C).
[0091] As membranas mitocondriais têm uma alta concentração de ácidos graxos poliinsaturados que são particularmente propensos à oxidação, visto que são localizados próximos aos sítios de produção de ERO.
[0092] Em uma modalidade, e como um exemplo, o desempenho antioxidante de
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AntiOxCINs, na proteção de peroxidação de lipídio de membranas de RLM foi determinado. Dois agentes estressantes oxidativos diferentes, FeSCWhhCh/ascorbato e ADP/FeSO4 e dois pontos de extremidade, produção de TBARS e consumo de oxigênio, respectivamente, foram usadas. MitoQ foi usado como referência (Figuras 4 e5).
[0093] Em uma modalidade, constatou-se que AntiOxCIN2 (séries de catecol) e AntiOxCIN? (séries de pirogalol), em ensaio de FeSCU/FhCte/ascorbato são os derivados cinâmicos mitocondriotrópicos mais eficazes na prevenção de peroxidação de lipídio de mitocôndrias (Figura 4A). No ensaio de ADP/FeSCh, a eficácia de AntiOxCINs para prevenir a peroxidação de lipídio seguiu a mesma tendência (Figuras 4B e 5A a 5D). A capacidade de AntiOxCINs versus MitoQ para inibir a peroxidação de lipídio em RLM diminuiu na ordem MitoQ > AntiOxCIN?> AntiOxCIN2» AntiOxCIN4 ~ AntiOxCINs> AntiOxCINe ~ AntiOxCIN3> AntiOxCINi> ácido cafeico. Exceto para AntiOxCIN2, AntiOxCINs à base de pirogalol (Figuras 4 e 5D) foram mais eficazes no atraso do processo de peroxidação de lipídio de membrana demonstrando um desempenho superior ao ácido cafeico.
[0094] Visto que o metabolismo celular depende da função mitocondrial adequada, os efeitos dos compostos sobre os parâmetros funcionais das mitocôndrias podem fornecer informações a respeito de seu perfil de toxicidade. Portanto, sua capacidade para induzir a disfunção mitocondrial danificando a membrana mitocondrial interna ou inibindo a cadeia respiratória, a síntese de ATP, processo de poro de transição de permeabilidade mitocondrial (mPTP) ou maquinário de exportação foi avaliado.
[0095] Em uma modalidade, e como um exemplo, os efeitos de toxicidade de AntiOxCINs e MitoQ sobre a bioenergética mitocondrial, a saber, em RLM ΔΨ e parâmetros de respiração mitocondrial, foram medidos. O símbolo ΔΨ representa o componente principal do gradiente eletroquímico gerado por respiração mitocondrial e corresponde a mais de 90% da energia disponível total. Para os ensaios de respiração mitocondrial,glutamato/malato (para o complexo I) e succinato (para o complexo II) foram usados como substratos. Além disso, o índice de acoplamento de fosforilação oxidativa mitocondrial, conhecido como razão de controle respiratório (RCR, respiração
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21/58 de estado 3/estado 4) e o índice de ADP/O (o acoplamento entre a sintese de ATP e consumo de oxigênio) também foram calculados. AntiOxCINs e MitoQ foram testados em concentrações antioxidantesrelevantes, em que 10 pM é a concentração mais alta.
[0096] Em uma modalidade, os dados bioenergéticos mitocondriais obtidos para MitoQ foram mostrados na (Tabela 2). Os resultados obtidos foram usados para análise comparativa.
Tabela 2. Efeito de MitoQ em bioenergética mitocondrial: razão de controle respiratório (RCR) mitocondrial, eficiência do sistema fosforilativo (ADP/O) e potencial transmembranar mitocondrial (ΔΨ). *, **, ***, **** estatisticamente significativo em comparação com o controle com o uso do teste t de duas caudas de Student.
| Bioenergética Mitocondrial | Controle | MitoQ | |||
| 2,5 pM | 5 pM | 10 pM | |||
| Potencial máximo (ΔΨ em - mV) despolarização | 225,8 ± 9,8 | 195,7 ± 10,8 | 188,3 ± 10,6* | 113,9 ± 10,2 | |
| induzida por ADP | 194,2 ±7,9 | 173,0 ±9,3 | 173,5 ±8,9 | ||
| (ΔΨ em - mV) Potencial de Repolarização (ΔΨ em - mV) | 223,0 ± 9,7 | 191,1 ± 11,7 | 185,0 ±9,4* | ||
| 0 * ro ra o | Fase de Latência (s) | 70,7 ± 6,0 | 86,5 ±5,6 | 84,5 ±7,1 | |
| ra E ra 3 0 | RCR ADP/O | 6,4 ±0,6 2,6 ±0,1 | 4.2 ±0,6* 2.2 ±0,1 * | 2,7 ± 0,3 *** 1,9 ±0,1 *** | 1,3 ± 0,1 **** 2,0 ± 0,2 ** |
| 0 M-» | Potencial máximo (ΔΨ em - mV) | 202,1 ±6,7 | 181,6 ±8,3 | 170,2 ±8,1 * | 108,9 ±3,8**** |
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| Despolarização | 173,9 ±5,3 | 162,1 ±6,0 | 157,0 ±6,4 | ||
| induzida | por ADP | ||||
| (ΔΨ em - mV) Potencial de Repolarização (ΔΨ | 195,9 ±5,5 | 182,7 ±9,1 | 170,8 ±8,7* | ||
| em - mV) Fase de (s) RCR | Latência | 106,0 ± 12,4 4,9 ±0,7 | 104,8 ±9,9 2,6 ± 0,2 ** | 92,6 ± 19,4 2,4 ± 0,2 ** | |
| ADP/O | 1,6 ±0,1 | 1,3 ±0,1 * | 1.3 ± 0,1 * |
[0097] Em uma modalidade, foi observado que MitoQ, para todas as concentrações testadas, causou uma diminuição significativa de parâmetros de RCR e ADP/O. (Tabela 2). Ademais, quando RLM foram incubadas com concentrações de MitoQ até 5 μΜ, um aumento no estado 2, estado 4 e respiração inibida por oligomicina e uma diminuição no estado 3 e respiração de FCCP desacoplado, com o uso de glutamato/malato como substrato foram observados (Figura 6A). Ao usar succinato, RLM foram completamente desacopladas na presença de MitoQ na concentração mais alta testada (Figura 6A). A incubação com concentrações crescentes de MitoQ resultou em uma diminuição progressiva de ΔΨ máximo obtido mediante a energização (Tabela 2). MitoQ (5 μΜ) também diminuiu a capacidade das mitocôndrias recuperarA^Ppara a um valor similar ao controle. O colapso de ΔΨ após a adição de ADP foi observado com 10 pM de MitoQ, visto que não ocorreu repolarização após a despolarização induzida por ADP (Tabela 2).
[0098] Em uma modalidade, a concentração mais alta usada em estudos de toxicidade de AntiOxCINs foi aquela na qual MitoQ perturbou completamente os dados bioenergéticos mitocondriais. Os dados de estudos de toxicidade de AntiOxCINs foram
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23/58 mostrados nas Tabelas 3 a 9. AntiOxCINi também foi incluído nos estudos mencionados para análise comparativa (Tabela 3).
Tabela 3. Efeito de AntiOxCINma bioenergética mitocondrial: razão de controle respiratório (RCR) mitocondrial, eficiência do sistema fosforilativo (ADP/O) e potencial transmembranar mitocondrial (ΔΨ). *, **, *** estatisticamente significativo em comparação com o controle com o uso do teste t de duas caudas de Student.
Bioenergética Mitocondrial
Potencial máximo (ΔΨ em - mV)
Despolarização induzida por (ΔΨ em - mV)
ADP
Potencial
Repolarização em - mV) o
ra ra o ra o +4 ra c Ό o 3 (/)
Fase de Latência (s)
RCR
ADP/O
Potencial máximo (ΔΨ em - mV)
Despolarização induzida por ADP (ΔΨ em - mV)
Potencial de (ΔΨ de
| Controle | AntiOxCINi | ||
| 2,5 pM | 5 pM | 10 pM | |
| 225,8 ± 9,8 | 208,7 ± 9,5 | 210,6± 11,4 | 213,9 ± 10,7 |
| 194,2 ±7,9 | 184,2 ±8,2 | 187,1 ± 10,3 | 187,4 ±9,2 |
| 223,0 ± 9,7 | 208,0 ± 9,4 | 209,8 ± 11,1 | 209,1 ±9,7 |
| 70,7 ± 6,0 | 84,7 ± 6,6 | 72,0 ±2,1 | 87,7 ±5,1 |
| 6,4 ±0,6 | 5,4 ±0,6 | 5,1 ±0,7 | 4,4 ±0,2* |
| 2,6 ±0,1 | 2,5 ±0,1 | 2,4 ±0,1 | 2,3 ±0,1 |
| 202,1 ±6,7 | 194,7 ±3,6 | 195,8 ±8,8 | 195,2 ±4,5 |
| 173,9 ±5,3 | 172,2 ±3,9 | 173,3 ±6,4 | 175,2 ±5,7 |
| 195,9 ±5,5 | 195,9 ±4,7 | 194,3± 11,8 | 195,3 ±8,3 |
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| Repolarização (ΔΨ em - mV) Fase de Latência (s) | 106,0 ± 12,4 | 100,6 ± 12,8 | 121,6± 15,0 | 132,6 ±30,4 | |
| RCR | 4,9 + 0,7 | 3,5 ±0,3 | 3,3 ±0,5 | 3,2 ±0,2 | |
| ADP/O | 1,6 ± 0,1 | 1,4 ±0,1 | 1,3 ±0,1 | 1,4 ± 0,1 |
Tabela 4. Efeito de AntiOxCIN2na bioenergética mitocondrial: razão de controle respiratório (RCR) mitocondrial, eficiência do sistema fosforilativo (ADP/O) e potencial transmembranar mitocondrial (ΔΨ). *, **, *** estatisticamente significativo em comparação com o controle com o uso do teste t de duas caudas de Student.
| Bioenergética Mitocondrial | Controle | AntiOxCIN2 | ||
| 2,5 pM | 5 pM | 10 pM | ||
| Potencial máximo | ||||
| 225,8 ±9,8 | 208,4 ± 10,1 | 214,8± 11,7 | 209,8 ± 9,4 | |
| (ΔΨ em - mV) | ||||
| Despolarização | ||||
| induzida por ADP | 194,2 ±7,9 | 186,2 ±8,9 | 199,2 ± 13,3 | 193,3 ±9,1 |
| (ΔΨ em - mV) | ||||
| Potencial de | ||||
| Repolarização (ΔΨ | 223,0 ±9,7 | 205,1 ±9,0 | 214,0 ± 12,5 | 202,0 ± 8,0 |
| 2 em - mV) | ||||
| ra S Fase de Latência (s) | 70,7 ± 6,0 | 81,2 ±7,2 | 79,5 ±7,0 | 88,7 ±25,1 |
| o | ||||
| | RCR | 6,4 ±0,6 | 5,2 ± 1,0 | 3,9 ±0,6* | 3,4 ± 0,3 ** |
| (ü M-» | ||||
| 2 ADP/O | 2,6 ±0,1 | 2,4 ± 0,04 | 2,2 ±0,1 * | 2,2 ±0,1 * |
| 0 | ||||
| ro Potencial máximo | 202,1 ±6,7 | 190,5 ±5,9 | 189,7 ±8,0 | 190,0 ±6,3 |
| c < |
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25/58
| (ΔΨ em - mV) | 173,9 ±5,3 | 169,3 ±4,0 | 174,9 ±5,5 | 178,7 ±6,3 | ||
| Despolarização induzida por | ADP | |||||
| (ΔΨ em - mV) Potencial Repolarização | de (ΔΨ | 195,9 ±5,5 | 191,5 ±7,5 | 189,5 ±9,0 | 186,6 ±7,1 | |
| em - mV) Fase de Latência (s) | 106,0 ± 12,4 | 101,2 ±7,5 | 64,6 ± 19,4 | 46,2 ± 12,4* | ||
| RCR ADP/O | 4,9 ±0,7 1,6 ±0,1 | 3.3 ±0,2 1.4 ±0,1 | 3.3 ±0,2 1.3 ±0,1 | 2.1 ± 0,2 *** 1.1 ±0,1 ** |
Tabela 5. Efeito de AntiOxCINsna bioenergética mitocondrial: razão de controle respiratório (RCR) mitocondrial, eficiência do sistema fosforilativo (ADP/O) e potencial transmembranar mitocondrial (ΔΨ). *, ** estatisticamente significativo em comparação com o controle com o uso do teste t de duas caudas de Student.
| Bioenergética Mitocondrial | Controle | AntiOxCINs | |||
| 2,5 pM | 5 pM | 10 pM | |||
| Potencial máximo (ΔΨ em - mV) Despolarização | 225,8 ± 9,8 | 238,0 ± 9,8 | 238,9 ±8,6 | 238,0 ± 6,7 | |
| 0 4~» ra ra | induzida por ADP (ΔΨ em - mV) Potencial de | 194,2 ±7,9 | 199,4 ±7,4 | 200,7 ±5,5 | 302,5 ± 6,3 |
| o ra E ro 4-» | Repolarização (ΔΨ em - mV) | 223,0 ± 9,7 | 234,8 ± 10,3 | 235,0 ±8,4 | 231,5 ±7,2 |
| □ 0 | Fase de Latência (s) | 70,7 ± 6,0 | 65,8 ±6,6 | 68,2 ± 9,6 | 73,8 ± 12,1 |
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26/58
| RCR ADP/O | 6,4 ±0,6 2,6 ±0,1 | 3,8 ±0,5* 2,4 ± 0,2 | 3,5 ±0,5** 2,7 ±0,2 | 3.3 ± 0,3 ** 2.4 ±0,1 | |
| Potencial máximo (ΔΨ em - mV) Despolarização | 202,1 ±6,7 | 191,2 ± 9,1 | 193,3 ±7,6 | 189,7 ±7,8 | |
| induzida por ADP (ΔΨ em - mV) Potencial de | 173,9 ±5,3 | 171,5 ±7,3 | 174,5 ±7,7 | 172,2 ±7,5 | |
| Repolarização (ΔΨ em - mV) | 195,9 ±5,5 | 186,7 ±9,3 | 190,4 ±8,3 | 184,2 ±7,6 | |
| 0 4-» | Fase de Latência (s) | 106,0 ± 12,4 | 84,6 ± 16,7 | 92,0 ± 10,3 | 79,8 ± 17,6 |
| ra c | RCR | 4,9 ±0,7 | 4,1 ±0,5 | 4,7 ±0,7 | 3,9 ±0,6 |
| o o 3 (/) | ADP/O | 1,6 ±0,1 | 1,6 ±0,1 | 1,8 ±0,3 | 1,6 ±0,1 |
Tabela 6. Efeito de AntiOxCINena bioenergética mitocondrial: razão de controle respiratório (RCR) mitocondrial, eficiência do sistema fosforilativo (ADP/O) e potencial transmembranar mitocondrial (ΔΨ). *, **, *** estatisticamente significativo em comparação com o controle com o uso do teste t de duas caudas de Student.
| Bioenergética Mitocondrial | Controle | AntiOxCINe | |||
| 2,5 pM | 5 pM | 10 pM | |||
| o ra ra | Potencial máximo (ΔΨ em - mV) Despolarização | 225,8 ± 9,8 | 237,9 ± 5,9 | 227,5 ± 6,5 | 200,5 ± 16,80 |
| o | induzida por ADP | 194,2 ±7,9 | 202,5 ± 5,7 | 197,9 ±5,0 | 174,2 ± 16,8 |
| ra E RJ M-» □ O | (ΔΨ em - mV) Potencial de | 223,0 ± 9,7 | 233,3 ± 6,5 | 220,7 ± 6,2 | 185,3 ±20,8 |
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27/58
| Repolarização (ΔΨ em - mV) Fase de Latência (s) | 70,7 ± 6,0 | 73,2 ± 8,8 | 75,2 ± 12,5 | 47,8 ±8,7* | |
| RCR | 6,4 ±0,6 | 3,1 ±0,3*** | 3,3 ± 0,2 ** | 2,6 ±0,1 *** | |
| ADP/O | 2,6 ±0,1 | 2,5 ±0,1 | 2,5 ±0,2 | 2,3 ±0,1 | |
| Potencial máximo (ΔΨ em - mV) Despolarização | 202,1 ± 6,7 | 181,9 ±6,2 | 178,3 ±4,7* | 151,7 ±9,3*** | |
| induzida por ADP (ΔΨ em - mV) Potencial de | 173,9 ±5,3 | 166,8 ±6,1 | 167,1 ±5,7 | 143,6 ± 11,0* | |
| Repolarização (ΔΨ | 195,9 ±5,5 | 177,7 ±4,5 | 178,1 ±5,1 | 149,0 ± 11,2 *** | |
| em - mV) Fase de Latência (s) | 106,0 ± 12,4 | 77,8 ± 11,2 | 83,4 ± 11,5 | 62,2 ± 11,2 | |
| 0 | |||||
| ra c | RCR | 4,9 ±0,7 | 3,7 ±0,6 | 3,2 ±0,3 | 2,6 ±0,3* |
| o | |||||
| o 3 ω | ADP/O | 1,6 ±0,1 | 1,5 ±0,1 | 1,5 ± 0,1 | 1,6 ± 0,11 |
Tabela 7. Efeito de AntiOxCINqna bioenergética mitocondrial: razão de controle respiratório (RCR) mitocondrial, eficiência do sistema fosforilativo (ADP/O) e potencial transmembranar mitocondrial (ΔΨ). *, ** estatisticamente significativo em comparação com o controle com o uso do teste t de duas caudas de Student.
| Bioenergética Mitocondrial | Controle | AntiOxCIN4 | |||
| 2,5 pM | 5 pM | 10 pM | |||
| o í | Potencial máximo | 225,8 ± 9,8 | 214,6 ± 10,9 | 216,4 ± 13,1 | 216,8 ± 15,7 |
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28/58
| (ΔΨ em - mV) Despolarização induzida por ADP | 194,2 ±7,9 | 188,5 ±9,6 | 193,8 ± 11,8 | 192,7 ± 14,4 | |
| (ΔΨ em - mV) Potencial de Repolarização (ΔΨ em - mV) | 223,0 ± 9,7 | 211,8± 10,1 | 216,1 ± 12,7 | 207,7 ± 15,6 | |
| Fase de Latência (s) | 70,7 ± 6,0 | 84,7 ±7,0 | 81,7 ±6,7 | 65,7 ± 15,1 | |
| RCR | 6,4 ±0,6 | 5,3 ±0,8 | 4,3 ±0,7* | 3,5 ± 0,5 ** | |
| ADP/O | 2,6 ±0,1 | 2,4 ±0,1 | 2,2 ±0,1 * | 2,2 ±0,1 ** | |
| Potencial máximo (ΔΨ em - mV) Despolarização | 202,1 ±6,7 | 192,0 ±4,0 | 197,6 ±6,1 | 187,4 ±8,5 | |
| induzida por ADP | 173,9 ±5,3 | 171,2 ±3,7 | 176,2 ±5,0 | 170,3 ±5,2 | |
| (ΔΨ em - mV) Potencial de Repolarização (ΔΨ em - mV) | 195,9 ±5,5 | 192,7 ±5,4 | 195,4 ±8,2 | 183,5 ± 10,5 | |
| Fase de Latência (s) | 106,0 ± 12,4 | 95,6 ±7,5 | 97,8 ± 18,8 | 101,4 ±23,75 | |
| 0 | RCR | 4,9 ±0,7 | 3,4 ±0,3 | 3,0 ±0,34 | 2,7 ±0,4* |
| ra c õ υ | ADP/O | 1,6 ±0,1 | 1,4 ±0,1 | 1,3 ± 0,1 | 1.3 ± 0,02 * |
| 3 ω |
Tabela 8. Efeito de AntiOxCINsna bioenergética mitocondrial: razão de controle respiratório (RCR) mitocondrial, eficiência do sistema fosforilativo (ADP/O) e potencial transmembranar mitocondrial (ΔΨ). *, ** estatisticamente significativo em comparação
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29/58 com o controle com o uso do teste t de duas caudas de Student.
Bioenergética Mitocondrial
Potencial máximo (ΔΨ em - mV)
Despolarização induzida por (ΔΨ em - mV)
Potencial o * ra rj
Repolarização em - mV)
O rj
E RJ o 4—* RJ C õ o 3 (/)
Fase de Latência (s)
RCR
ADP/O
Potencial máximo (ΔΨ em - mV)
Despolarização induzida por (ΔΨ em - mV)
Potencial
Repolarização em - mV)
Fase de Latência (s)
RCR
ADP/O
ADP de (ΔΨ
ADP de (ΔΨ
| Controle | AntiOxCINs | ||
| 2,5 pM | 5 pM | 10 pM | |
| 225,8 ± 9,8 | 249,8 ± 5,4 | 244,7 ± 7,0 | 215,1 ±22,3 |
| 194,2 ±7,9 | 207,5 ±6,1 | 207,5 ±5,6 | 184,6 ± 18,7 |
| 223,0 ± 9,7 | 244,7 ± 5,9 | 236,5 ±6,8 | 199,9 ±26,0 |
| 70,7 ± 6,0 | 74,4 ± 10,7 | 69,8 ± 13,3 | 53,2 ± 7,6 |
| 6,4 ±0,6 | 3,7 ± 0,4 ** | 3,7 ± 0,4 ** | 3,2 ±0,1 ** |
| 2,6 ±0,1 | 2,4 ±0,1 | 2,5 ±0,1 | 2,5 ±0,1 |
| 202,1 ±6,7 | 196,2 ±8,6 | 190,1 ±6,8 | 180,8 ±4,0 |
| 173,9 ±5,3 | 177,2 ±7,7 | 173,6 ±6,8 | 162,2 ±7,7 |
| 195,9 ±5,5 | 190,6 ±7,8 | 184,0 ±7,1 | 168,4 ±9,3* |
| 106,0 ± 12,4 | 80,2 ± 11,8 | 67,2 ± 13,4 | 58,4 ± 10,2* |
| 4,9 ±0,7 | 4,2 ± 0,4 | 4,4 ±0,8 | 4,0 ±0,8 |
| 1,6 ±0,1 | 1,6 ±0,1 | 1,5 ± 0,1 | 1,6 ±0,1 |
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Tabela 9. Efeito de AntiOxCINyna bioenergética mitocondrial: razão de controle respiratório (RCR) mitocondrial, eficiência do sistema fosforilativo (ADP/O) e potencial transmembranar mitocondrial (ΔΨ). *, ** estatisticamente significativo em comparação com o controle com o uso do teste t de duas caudas de Student.
| Bioenergética Mitocondrial | Controle | AntiOxCIN? | |||
| 2,5 pM | 5 pM | 10 pM | |||
| Potencial máximo (ΔΨ em - mV) Despolarização | 225,8 ± 9,8 | 251,8 ±8,7 | 248,1 ±3,3 | 232,1 ± 9,2 | |
| induzida por ADP (ΔΨ em - mV) Potencial de | 194,2 ±7,9 | 212,2 ±7,9 | 212,6 ±3,2 | 197,1 ±11,8 | |
| Repolarização (ΔΨ | 223,0 ± 9,7 | 248,3 ± 8,3 | 243,5 ± 5,0 | 212,6 ± 18,4 | |
| 0 4-t TO | em - mV) | ||||
| ra o ra E ra 4-» 3 0 | Fase de Latência (s) RCR ADP/O | 70,7 ± 6,0 6,4 ±0,6 2,6 ±0,1 | 73,4 ± 8,4 3,6 ± 0,2 ** 2,8 ±0,3 | 71,0 ± 10,7 3,5 ±0,3** 2,4 ±0,1 | 58.6 ± 5,4 3,3 ±0,3** 2.6 ±0,1 |
| Potencial máximo (ΔΨ em - mV) Despolarização | 202,1 ±6,7 | 205,3 ± 7,3 | 191,1 ±9,0 | 176,9 ±3,1 * | |
| induzida por ADP | 173,9 ±5,3 | 183,8 ±6,0 | 176,2 ±8,7 | 163,6 ±3,2 | |
| Succinato | (ΔΨ em - mV) Potencial de Repolarização (ΔΨ em - mV) | 195,9 ±5,5 | 199,4 ±7,1 | 186,8 ±7,5 | 171,0±5,0* |
| Fase de Latência (s) | 106,0 ± 12,4 | 80,0 ± 14,9 | 76,0 ± 9,6 | 65,0 ±8,7 |
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| RCR | 4,9 ±0,7 | 4,1 ±0,4 | 3,1 ±0,2* | 3,7 ±0,3 | |
| ADP/O | 1,6 ± 0,1 | 1,8 ±0,2 | 1,8 ±0,2 | 1,7 ±0,2 |
[0099] Em uma modalidade, e como exemplo, as taxas de AntiOxCINs e MitoQ em ensaios de respiração mitocondrial para o estado 2, estado 3, estado 4, respiração inibida por oligomicina e respiração estimulada por FCCP( succinato foi usado como substrato,) são mostradas nas Figuras 6A a 6H.
[00100] Em uma modalidade, foi constatado que AntiOxCINs induz alterações na cadeia respiratória de uma maneira dependente de dose. Em geral, AntiOxCINs aumentaram a respiração de estado 2, estado 4 e a respiração inibida por oligomicina em concentrações superiores a 2,5 μΜ em um processo que é principalmente dependente de sua lipofilicidade e não dependente de padrão de substituição do anel aromático (catecol versus pirogalol) (Figuras 6B a 6H). Um efeito oposto dependente de dose na respiração de estado 3 foi observado, com uma diminuição causada pelos compostos menos lipofílicos (AntiOxCINz e AntiOxCIN^, e um aumento nos AntiOxCINs mais lipofílicos (AntiOxCINs, AntiOxCINs, AntiOxCINs e AntiOxCIN?) para todas as concentrações testadas (2,5 a 10 μΜ) (Figuras 6B a 6H).
[00101] Em uma modalidade, foi mostrado que AntiOxCINs induziram alterações dependentes de dose no perfil respiratório de RLM isoladas. Provavelmente alguns dos efeitos observados pode resultar de um efeito de permeabilização de membrana ou uma atividade de transporte de próton. Esse efeito pode levar ao estímulo da respiração não fosforilativa e a uma pequena despolarização de ΔΨ. Consequentemente, para alguns AntiOxCINs, o sistema fosforilativo mitocondrial, como analisado pela razão de ADP/O, também foi afetado. Um efeito oposto dependente de dose na respiração de estado 3 foi observado, com uma diminuição em tal estado respiratório causada pelos compostos menos lipofílicos (AntiOxCIN e AntiOxCIN^, e aumento relevante de respiração de estado 3 observada com os AntiOxCINs mais lipofílicos (AntiOxCINs, AntiOxCINs, AntiOxCINs e AntiOxCIN?) (Figura 6).
[00102] Em uma modalidade, e como um exemplo, os efeitos diretos de AntiOxCINs
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32/58 sobre ΔΨ foram medidos (Tabelas 3 a 9). Após a adição de AntiOxCINs, foi constatado que as alterações de ΔΨ são similares independentemente do substrato usado. Em geral, AntiOxCINs causaram uma ligeira despolarização de ΔΨ dependente de dose embora a incubação de RLM com 2,5 μΜ de AntiOxCINs (Tabela 5) e AntiOxCINs (Tabela 6) ou AntiOxCINs (Tabela 8) e AntiOxCIN? (Tabela 9) tenha promovido uma ligeira hiperpolarização inicial de 10 ou 25 mV, respectivamente. Entretanto, as incubações com AntiOxCINs (concentrações acima de 5 pM) (Tabela 6) e AntiOxCIN? (10 pM) resultaram em uma diminuição significativa de ΔΨ em mitocôndrias energizadas com succinato.
[00103] Em uma modalidade, uma hierarquia de classificação de toxicidade dos AntiOxCINs no aparelho bioenergético mitocondrial foi estabelecida: AntiOxCINi< AntiOxCIN2< AntiOxCINs< AntiOxCINs (séries de catecol); AntiOxCINs AntiOxCINs< AntiOxCIN? (séries de pirogalol).
[00104] Em uma modalidade, a toxicidade mitocondrial de AntiOxCINs observada em concentrações superiores pode ser associada à lipofilicidade do espaçador e/ou a presença de uma porção química de TPP e tem pouca relação, se tiver, com sua molécula antioxidante (catecol versus pirogalol). De fato, o ácido cafeico mostrou baixa toxicidade em relação ao aparelho bioenergético mitocondrial. Contudo, a presença do cátion de TPP e um espaçador lipofílico é essencial para um acúmulo mitocondrial eficaz e, por vezes, extensivo.
[00105] Em uma modalidade, foi constatado que a concentrações superiores, antioxidantes para alvejamento de mitocôndria, AntiOxCINs e MitoQ podem perturbar a respiração mitocondrial causandodanos na membrana mitocondrial interna ou inibindo a cadeia respiratória, a síntese de ATP ou maquinário de exportação.
[00106] Em uma modalidade, deve ser ressaltado que MitoQ inibiu de modo eficaz a peroxidação de lipídio em RLM em 5 μΜ (Figuras 4 e 5), porém, causou toxicidade no aparelho bioenergético mitocondrial de RLM em 2,5 μΜ (Figura 6A e Tabela 2).
[00107] Em uma modalidade, foi concluído que um equilíbrio lipofílico adequado deve ser obtido ao longo do processo de otimização de descoberta do fármaco para contornar a toxicidade dos antioxidantes mitocondriotrópicos.
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33/58 [00108] Em uma modalidade, foi concluído que, para o AntiOxCINs sob estudo, a toxicidade de RLM foi detectada em concentrações superiores àquelas necessárias para exercer o efeito antioxidante, independentemente de seu mecanismo.
[00109] Em uma modalidade, foi concluído que, em geral, AntiOxCINs mostrou um melhor perfil de segurança do que MitoQ.
[00110] Em uma modalidade, os efeitos de AntiOxCINs sobre a abertura de poro de transição de permeabilidade mitocondrial (mPTP) foram avaliados. Em geral, AntiOxCINs menos lipofílicos não apresentaram efeito sobre a abertura de mPTP para todas as concentrações testadas (Figuras 7A a 7C).
[00111] Em uma modalidade, foi constatado que os AntiOxCINs mais lipofílicos (AntiOxCINs, AntiOxCINs, AntiOxCINs, AntiOxCIN?) causaram uma inibição de abertura de mPTP dependente de cálcio. Para os compostos à base de catecol, o efeito foi similar àquele de ciclosporina A (1 pM), um dessensibilizador clássico de mPTP. MitoQ não apresentou efeito na indução de mPTP (Figuras 7A a 7C). Essa propriedade pode ser de interesse terapêutico, por exemplo, para prevenir e tratar rejeição de enxerto versus hospedeiro em transplantes, que normalmente envolvem perturbação mitocondrial no enxerto.
[00112] Em uma modalidade, e como um exemplo, a citotoxicidade de dois AntiOxCINs (AntiOxCIN4 e AntiOxCINs) foi analisada com o uso de culturas de hepatócitos humanos em monocamada a partir de carcinoma hepatocelular (HepG2) usando o método de SRB (Figura 8A). A partir dos dados, foi concluído que AntiOxCINs (envolvendo uma porção química de catecol) exibiu toxicidade superior a AntiOxCIN4 (abrigando uma porção química de pirogalol) em células HepG2 (Figura 6A). De modo notável, em concentrações superiores a 2,5 pM, o AntiOxCINs inibiu a proliferação celular, enquanto, em concentrações superiores a 100 pM, o AntiOxCIN4 estimulou a proliferação celular.
[00113] Em uma modalidade, foi concluído que a toxicidade de AntiOxCINs, com base em suas propriedades lipofílicas (Tabela 1) e taxas de acúmulo de RLM (Figura 3), pode ser mediado por outros processos, a saber, a química redox do grupo catecol, uma propriedade que é frequentemente ligada a efeitos nocivos.
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34/58 [00114] Em uma modalidade, como um exemplo, o perfil antioxidante celular de AntiOxCIN4 e AntiOxCINe foi analisado com o uso de culturas de hepatócitos humanos em monocamada de carcinoma hepatocelular (HepG2) e dois estressantes oxidativos diferentes (250 μΜ de FeSCU ou 250 μΜ de H2O2) (Figura 8B). Ambos os AntiOxCINs preveniram significativamente citotoxicidade induzida por peróxido de hidrogênio e ferroem HepG2, expressada como resultado de proliferação celular (Figura 6B). A eficácia superior de AntiOxCIN está em conformidade com os dados obtidos a partir de ensaios de TAC (Tabela 1) e ensaios de RLM (Figura 4).
[00115] Em uma modalidade, como um exemplo, as alterações morfológicas na rede mitocondrial e condensação de cromatina de núcleos porAntiOxCIN4 e AntiOxCINe foram determinadas. As células de HepG2 foram tratadas com AntiOxCINs por 48 h e, então, incubadas com as sondas fluorescentes dependentes de ΔΨ mitocondrial, TMRM e corante de DNA, Hoechst 33342. Os resultados mostraram que AntiOxCIN (100 pM) e AntiOxCINe (2,5 pM) não induziram alterações morfológicas nucleares nem despolarização mitocondrial em HepG2 (Figura 8C).
[00116] Em uma modalidade, foi concluído que as modificações estruturais adaptadas de AntiOxCINi levaram a um aprimoramento significativo de suas propriedades mitocondriotrópicas. Alguns AntiOxCINs apresentaram a atividade antioxidante aumentada, 0 acúmulo mitocondrial superior e toxicidade inferior.
[00117] Em uma modalidade, a partir das séries de AntiOxCINs, AntiOxCIN, um análogo à base de pirogalol, é um previsto candidato potencial para desenvolvimento de fármacos de uma primeira classe com aplicação terapêutica em distúrbios relacionados à oxidação mitocondrial. AntiOxCIN4não perturbou a morfologia e a polarização mitocondriais e mostrou uma propriedade de quelação de ferro notável não compartilhada por MitoQ. AntiOxCIN pode ser útil para atenuar os efeitos de sobrecarga de ferro mitocondrial e/ou reduzir armazenamentos de ferro mitocondrial em doenças e afecções relacionadas ao estresse oxidativo.
[00118] Os exemplos de procedimentos sintéticos seguidos de modo a obter inúmeros intermediários e AntiOxCINs são fornecidos.
[00119] Em uma modalidade, a caracterização estrutural dos compostos foi obtida
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35/58 através de métodos espectrométricos de análise. Espectros de RMN de 1H e 13C foram adquiridos à temperatura ambiente e registrados em um Bruker Avance III que opera a 400 e 100 MHz, respectivamente. Os deslocamentos químicos são expressos em valores de δ (ppm) relativos ao tetrametilsilano (TMS) como referência interna e acoplamento constantes (J) são fornecidos em Hz. As atribuições também foram feitas a partir de DEPT (intensificação sem distorção por transferência de polarização) (valores sublinhados). Os espectros de massa (MS) foram registrados em um aparelho Bruker Microtof (ESI) ou Varian 320-MS (El) e referido em m/z (% relativa) de fragmentos importantes.
[00120] Em uma modalidade, todos os processos assistidos por micro-onda foram realizados em um Sintetizador de Micro-onda de Iniciador da Biotage.
[00121] Em uma modalidade, o progresso de reação foi analisado por análises de cromatografia de camada fina (TLC) em placas de 60 F254 de folhas de gel de silica de alumínio (Merck, Darmstadt, Alemanha) em diclorometano, acetato de etila e diclorometano/metanol, em várias proporções. As manchas foram detectadas com o uso de detecção de UV (254 e 366 nm). A cromatografia em coluna de Flash foi realizada com o uso de gel de silica 60 (0,040 a 0,063 mm) (Carlo Erba Reactifs SDS, França).
[00122] Em uma modalidade, o procedimento sintético geral para obtenção de amidas de ácido cinâmico(compostos 3 a 8, Figura 1) foi o seguinte: ácido 3,4dimetoxicinâmico (1), ou ácido 3,4,5-trimetoxicinâmico (2), (1 mmol), foi dissolvido em diclorometano (10 ml) e trietilamina (2 mmol). À solução agitada, mantida em um banho de gelo, cloroformato de etila (2 mmol) foi adicionado em gotas. Após a agitação de 2 horas à temperatura ambiente, a mistura foi resfriada em um banho de gelo e o aminoálcool pretendido (2 mmol) foi adicionado em gotas. A reação foi agitada durante 10 horas à temperatura ambiente. Após a neutralização, o solvente foi parcialmente evaporado e a mistura reacional foi extraída com diclorometano (3 x 20 ml). As fases orgânicas foram combinadas, lavadas com água (3 x 20 ml), 10% de bicarbonato de sódio aquoso (NaHCOs) (2 x 20 ml) e secas com sulfato de sódio anidro (Na2SO4). Após a filtração, o solvente foi evaporado e o composto pretendido foi obtido.
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36/58 [00123] Em uma modalidade, o rendimento de (E)-3-(3,4-dimetoxifenil)-N-(6-hidroxihexil)prop-2-enamida (3) foi de 81%. A caracterização estrutural do composto foi da seguinte forma: 1H (400 MHz, CDCIs): δ = 1,31 (4H, m, H3’, H4’), 1,49 (4H, m, H2’, H5’), 3,30 (2H, m, H1 ’), 3,55 (2H, t, J = 6,5 Hz, H6’), 3,80 (3H, s, OCH3), 3,81 (3H, s, OCH3), 6,03 (1H, t, J = 5,6 Hz, CONH), 6,25 (1H, d, J = 15,5 Hz, Ho), 6,75 (1H, d, J = 8,3 Hz, H5), 6,94 (1H, d, J = 1,9 Hz, H2), 6,99 (1H, dd, J = 1,7, 8,4 Hz, H6), 7,48 (1H, d, J =
15,5 Hz, Ηβ). 13C (100 MHz, CDCI3): δ = 25,4 (C3’), 26,6 (C4’), 30,0 (C2’), 32,7 (C5’),
39.7 (C1 ’), 56,0 (2x (OCH3), 62,7 (C6’), 109,9 (C2), 111,2 (C5), 118,9 (Co), 121,9 (C6), 128,0 (C1), 140,8 (Οβ), 149,2 (C4), 150,6 (C3), 166,5 (CONH). EI/ME m/z (%): 307 (M+, 17), 206 (62), 192 (27), 191 (100), 189 (29).
[00124] Em uma modalidade, 0 rendimento de (E)-3-(3,4,5-trimetoxifenil)-N-(6-hidroxihexil)prop-2-enamida (4) foi de 88%. A caracterização estrutural do composto foi da seguinte forma: 1H (400 MHz, CDCI3): δ = 1,37 (4H, m, H3’, H4’), 1,56 (4H, m, H2’, H5’),
3,36 (2H, m, HT), 3,62 (2H, t, J = 6,6 Hz, H6’), 3,85 (6H, s, 2xOCH3), 3,86 (3H, s, OCH3), 6,35 (1H, t, J = 5,6 Hz, CONH), 6,40 (1H, d, J = 15,5 Hz, Ho), 6,72 (2H, s, H2, H6), 7,52 (1H, d, J = 15,5 Hz, Ηβ). 13C (100 MHz, CDCI3): δ = 25,1 (C3’), 26,2 (C4’)
29.8 (C2’)> 32,3 (C5’), 39,3 (C1 ’), 55,9 (2xOCH3), 60,7 (OCH3), 62,3 (C6’), 104,7 (C2, C6), 120,2 (Ca), 130,3 (C1), 139,2 (C4), 140,4 (Οβ), 153,1 (C3, C5), 166,0 (CONH). EI/ME m/z (%): 337 (M+, 64), 336 (41), 236 (27), 222 (58), 221 (100).
[00125] Em uma modalidade, 0 rendimento de (E)-3-(3,4-dimetoxifenil)-N-(8hidroxioctil)prop-2-enamida (5) foi de 83 %. A caracterização estrutural do composto foi da seguinte forma: 1H (400 MHz, CDCI3): δ = 1,26 - 1,40 (6H, m, H3’, H4’, H5 ), 1,51 -
1.62 (4H, m, H2’, H6’), 1,70 - 1,81 (2H, m, H7’), 3,37 (2H, dd, J = 7,0, 13,0 Hz, H1 ’),
3.63 (2H, t, J = 6,6 Hz, H8’), 3,89 (3H, s, OCH3), 3,89 (3H, s, OCH3), 5,82 (1H, bs, CONH), 6,29 (1H, d, J = 15,5 Hz, Ha), 6,84 (1H, d, J = 8,3 Hz, H5), 7,02 (1H, d, J = 1,9 Hz, H2), 7,07 (1H, dd, J = 8,3, 1,9 Hz, H6), 7,55 (1H, d, J = 15,5 Hz, Ηβ). 13C (100 MHz, CDCb): δ = 25,6 (C6’)> 26,8 (C3’), 29,2 (C4’), 29,3 (C5’), 29,7 (C2’), 32,7 (C7’), 392 (C1 ’), 55,9 (OCH3), 56,0 (OCH3), 62,9 (C8’), 109,8 (C2), 111,1 (C5), 118,8 (C6), 121,9 (Ca), 127,9 (C1), 140,6 (Οβ), 149,1 (C4), 150,5 (C3), 166,2 (CONH). EI/ME m/z (%): 336 (M+1,40), 335 (M+, 71), 206 (53), 192 (75), 191 (100), 151 (63).
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37/58 [00126] Em uma modalidade, a (E)-3-(3,4,5-trimetoxifenil)-N-(8-hidroxioctil)prop-2enamida (6) rendeu: 89%. A caracterização estrutural do composto foi da seguinte forma: 1H (400 MHz, CDCh): δ = 1,28-1,41 (6H, m, H3’, H4’, H5’) 1,44- 1,70 (6H, m, H2’, H6’, H7’), 3,38 (2H, dd, J = 7,0, 13,0 Hz, H1 ’), 3,64 (2H, t, J = 6,6 Hz, H8’), 3,87 (3H, s, OCH3), 3,88 (6H, s, 2xOCH3), 5,67 (1H, t, J = 7,0 Hz, CONH), 6,30 (1H, d, J =
15,5 Hz, Ho) 6,73 (2H, s, J = 6,7 Hz, H2, H6), 7,53 (1H, d, J = 15,5 Hz, Ηβ). 13C (100 MHz, CDCh): δ = 25,6 (C6’)> 26,8 (C3’), 29,2 (C4’), 29,3 (C5’), 29,7 (C2’), 32,7 (C7’),
39.8 (C1 ’), 56,2 (2xOCH3), 61,0 (OCH3), 63,0 (C8’), 105,0 (C2, C6),120,2 (Co), 130,5 (C1), 139,6 (C4), 140,8 (Οβ), 153,4 (C3, C5), 165,8 (CONH). EI/ME m/z (%): 366 (M+1, 39), 365 (M+, 98), 236. (45), 221 (100) 181 (37).
[00127] Em uma modalidade, 0 rendimento de (E)-3-(3,4-dimetoxifenil)-N-(10hidroxidecil)prop-2-enamida (7) foi de 78%. A caracterização estrutural do composto foi da seguinte forma: 1H (400 MHz, CDCh): δ = 1,21 - 1,41 (10H, m, H3’, H4’, H5’,H6’, H7’), 1,49 - 1,62 (4H, m, H2’, H8’), 1,75 - 2,00 (2H, m, H9’), 3,32 - 3,42 (2H, m, H1 ’),
3,64 (2H, t, J = 6,6 Hz, H10’), 3,90 (6H, s, 2xOCH3), 5,79 (1H, bs, CONH), 6,29 (1H, d, J = 15,5 Hz, Ho), 6,84 (1H, d, J = 8,3 Hz, H5), 7,02 (1H, d, J = 1,7 Hz, H2), 7,08 (1H, dd, J = 8,3, 1,7 Hz, H6), 7,56 (1H, d, J = 15,5 Hz, Ηβ). 13C (100 MHz, CDCh): δ = 25,8 (C8’), 27,0 (C3’), 29,3 (C4’), 29,45 (C5’), 29,49 (C6’), 29,6 (C7’), 29,8 (C2’), 32,9 (C9’),
39.9 (C1 ’), 56,0 (OCH3), 56,1 (OCH3), 63,2 (C10’), 109,9 (C2), 111,3 (C5), 118,8 (C6), 122,0 (Ca), 128,0 (C1), 140,9 (Οβ), 149,3 (C4), 150,7 (C3), 166,3 (CONH). EI/ME m/z (%): 364 (M+1,433), 363 (M+, 89), 206 (54), 192 (72), 191 (100), 151 (46).
[00128] Em uma modalidade, 0 rendimento de (E)-3-(3,4,5-trimetoxifenil)-N-(10hidroxidecil)prop-2-enamida (8) foi de 69%. A caracterização estrutural do composto foi da seguinte forma: 1H (400 MHz, CDCh): δ = 1,23 - 1,42 (10H, m, H3’, H4’, H5’,H6’, H7’), 1,51-1,61 (4H, m, H2’, H8’), 1,89 - 2,06 (2H, m, H9’), 3,33 - 3,43 (2H, m, H1 ’),
3,64 (2H, t, J = 6,6 Hz, H10’), 3,87 (3H, s, OCH3), 3,88 (6H, s, 2xOCH3)), 5,82 (1H, bs, CONH), 6,33 (1H, d, J = 15,6 Hz, Ha), 6,73 (2H, s, H2, H6), 7,55 (1H, d, J = 15,5 Hz, Ηβ). 13C (100 MHz, CDCh): δ = 25,8 (C8’), 27,0 (C3’), 29,3 (C4’), 29,45 (C5’), 29,50 (C6’), 29,6 (C7’), 29,8 (C2’), 32,9 (C9’), 39,9 (C1 ’), 56,0 (2xOCH3), 61,1 (OCH3), 632 (C10’), 105,1 (C2, C6), 120,3 (Ca), 130,6 (C1), 139,7 (C4), 141,0 (Οβ), 153,5 (C3, C5),
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165,9 (CONH). EI/ME m/z (%): 394 (M+1, 40), 393 (M+, 100), 236 (37) 222 (86), 221 (93).
[00129] Em uma modalidade, o procedimento sintético para obtenção de derivados de metanossulfonatos (compostos 9 a 14, Figura 1) foi da seguinte forma: a amida de ácido cinâmico (3 a 8) (1 mmol) foi dissolvida em uma mistura de tetraidrofurano (10 ml) e trietilamina (2 mmol) e agitada à temperatura ambiente ao longo de um período de 10 minutos. Então, uma solução de cloreto de metanossulfonila (1,3 mmol) em tetraidrofurano (5 ml) foi adicionada em gotas. Após a agitação à temperatura ambiente por 12 horas, a mistura foi neutralizada e o solvente parcialmente evaporado. A mistura de reação resultante foi extraída com diclorometano (3 x 20 ml) e as fases orgânicas combinadas foram lavadas com água (3 x 20 ml), 10% de NaHCOs aquoso (2 x 20 ml), secas com sulfato de sódio anidro (Na2SO4), filtradas e evaporadas. O produto bruto foi usado sem purificação adicional na próxima etapa. Uma amostra de cada composto foi purificada e a caracterização estrutural foi realizada.
[00130] Em uma modalidade, o rendimento de metanossulfonato de (E)-(6-(3-(3,4dimetoxifenil)prop-2-enamida)hexila) (9) foi de 87%. A caracterização estrutural do composto foi da seguinte forma: A caracterização estrutural do composto foi da seguinte forma: 1H (400 MHz, CDCIs): δ = 1,42 (4H, m, H3’, H4’), 1,66 (4H, m, H2’, H5’), 3,00 (3H, s, OSO2CH3), 3,38 (2H, m, H1 ’), 3,88 (3H, s, OCH3), 3,89 (3H, s, OCH3),4,22 (2H, t, J = 6,4 Hz, H6’), 5,97 (1H, t, J = 5,6 Hz, CONH), 6,33 (1H, d, J = 15,5 Hz, Ha),
6,84 (1H, d, J = 8,3 Hz, H5), 7,03 (1H, d, J = 1,9 Hz, H2), 7,07 (1H, dd, J = 1,9, 8,3 Hz, H6), 7,55 (1H, d, J = 15,5 Hz, Ηβ). 13C (100 MHz, CDCI3): δ = 24,9 (C3’), 26,0 (C4’),
28,8 (C2’)> 29,3 (C5’), 37,2 (OSO2CH3), 39,2 (C1’), 55,7 (2xOCH3), 69,8 (C6’), 109,5 (C2), 110,9 (C5), 118,6 (Ca), 121,7 (C6), 127,7 (C1), 140,4 (Οβ), 148,9 (C4), 150,3 (C3), 166,1 (CONH).
[00131] Em uma modalidade, 0 rendimento de metanossulfonato de (E)-(6-(3-(3,4, 5trimetoxifenil)prop-2-enamida)hexila) (10) foi de 95%. A caracterização estrutural do composto foi da seguinte forma: 1H (400 MHz, CDCI3): δ = 1,36 (4H, m, H3’, H4’), 1,60 (4H, m, H2’, H5 ), 2,95 (3H, s, OSO2CH3), 3,32 (2H, m, H1 ’), 3,80 (6H, s, 2xOCH3), 3,81 (3H, s, OCH3), 4,16 (2H, t, J = 6,4 Hz, H6’), 6,07 (1H, t, J = 5,7 Hz, CONH), 6,34 (1H, d,
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J = 15,5 Hz, Ha), 6,68 (2H, s, H2, H6), 7,46 (1H, d, J = 15,6 Hz, Ηβ). 13C (100 MHz, CDCb): δ = 25,5 (C3’), 26,6 (C4’), 29,4 (C2’), 29,8 (C5’), 37,8 (OSO2CH3), 39,9 (C1 ’),
56.5 (2xOCH3), 61,4 (OCH3), 70,5 (C6’), 105,4 (C2, C6), 120,8 (Ca), 131,0 (C1), 139,8 (C4), 141,0 (Οβ), 154,8 (C3, C5), 166,4 (CONH).
[00132] Em uma modalidade, 0 rendimento de metanossulfonato de (E)-(8-(3-(3,4dimetoxifenil)prop-2-enamida)octila)(11) foi de 95%. A caracterização estrutural do composto foi da seguinte forma: 1H (400 MHz, CDCb): δ = 1,27 - 1,47 (8H, m, H3’, H4’, H5’, H6’). 1,48 - 1,64 (2H, m, H2’), 1,66 - 1,79 (2H, m, H7’), 3,00 (3H, s, OSO2CH3),
3.37 (2H, dd, J = 13,1 6,7 Hz, H1 ’), 3,88 (3H, s, OCH3), 3,89 (3H, s, OCH3), 4,21 (2H, t, J = 6,5 Hz, H8’), 5,97 (1H, bs, CONH), 6,33 (1H, d, J = 15,5 Hz, Ha), 6,83 (1H, d, J =
8,3 Hz, H5), 7,03 (1H, s, H2), 7,07 (1H, d, J = 8,1 Hz, H6), 7,55 (1H, d, J = 15,5 Hz, Ηβ). 13C (100 MHz, CDCb): δ = 25,3 (C6’), 26,7 (C3’), 28,8 (C4’), 29,00 (C5’), 29,05 (C2’), 29,6 (C7’), 37,4 (OSO2CH3), 39,7 (C1 ’), 55,87 (OCH3), 55,95 (OCH3), 70,2 (C8’),
109.7 (C2), 111,1 (C5), 118,9 (C6), 121,9 (Ca), 128,0 (C1), 140,5 (Οβ), 149,1 (C4),
150.5 (C3), 166,2 (CONH).
[00133] Em uma modalidade, 0 rendimento de metanossulfonato de (E)-(8-(3-(3,4,5trimetoxifenil)prop-2-enamida)octila) (12) foi de 96%. A caracterização estrutural do composto foi da seguinte forma: 1H (400 MHz, CDCb): δ = 1,29 - 1,45 (6H, m, H3’, H4’, H5’), 1,52 - 1,63 (4H, m, H2’, H6’), 1,65 - 1,80 (2H, m, H7’), 3,00 (3H, s, OSO2CH3),
3.38 (2H, td, J = 13,1, 7,0 Hz, H1 ’), 3,87 (3H, s, OCH3), 3,88 (6H, s, 2 x OCH3), 4,23 (2H, t, J = 6,5 Hz, H8’), 5,64 (1H, t, J = 7,0 Hz, NH), 6,30 (1H, d, J = 15,5 Hz, Ha), 6,73 (2H, s, H2, H6), 7,53 (1H, d, J = 15,5 Hz, Ηβ). 13C (100 MHz, CDCb): δ = 25,3 (C6’),
26.7 (C3’)> 28,8 (C7’), 29,0 (C4’), 29,1 (C5’), 29,6 (C2’), 37,4 (OSO2CH3), 39,7 (C1 ’),
56,2 (2xOCH3), 61,0 (OCH3), 70,1 (C8’), 105,0 (C2, C6), 120,1 (Ca), 130,5 (C1), 139,6 (C4), 140,8 (ΰβ), 153,4 (C3, C5), 165,8 (CONH).
[00134] Em uma modalidade, 0 rendimento de metanossulfonato de (E)-(10-(3-(3,4dimetoxifenil)prop-2-enamida)decila) (13) foi de 98%. A caracterização estrutural do composto foi da seguinte forma: 1H (400 MHz, CDCb): δ = 1,20 - 1,45 (12H, m, H3’, H4’, H5’,H6’, H7’, H8’), 1,49 - 1,64 (2H, m, H2’), 1,67 - 1,83 (2H, m, H9’), 3,01 (3H, s, OSO2CH3), 3,38 (2H, dd, J = 10,9, 6,3 Hz, H1 ’), 3,90 (6H, s, 2 x OCH3), 4,23 (2H, t, J =
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6,6 Hz, H10’), 5,82-5,95 (1H, m, CONH), 6,32 (1H, d, J = 15,5 Hz, Ha), 6,85 (1H, d, J = 8,2 Hz, H5), 7,03 (1H, s, H2), 7,08 (1H, d, J = 8,2 Hz, H6), 7,57 (1H, d, J = 15,5 Hz, Ηβ). 13C (100 MHz, CDCh): δ = 25,4 (C8’), 27,0 (C3’), 29,0 (C5’), 29,2 (C4’), 29,28 (C6’), 29,34 (C7’), 29,4 (C2’), 29,8 (C9 ), 37,5 (ÇH3SO3), 39,9 (CT), 55,97 (OCH3), 56,05 (OCH3), 70,3 (C10’), 109,8 (C2), 111,2 (C5), 118,8 (C6), 122,0 (Ca), 128,0 (C1),
140.8 (Οβ), 149,2 (C4), 150,6 (C3), 166,3 (CONH).
[00135] Em uma modalidade, 0 rendimento de metanossulfonato de (E)-(10-(3-(3,4,5trimetoxifenil)prop-2-enamida)decila) (14) foi de 96%. A caracterização estrutural foi da seguinte forma: A caracterização estrutural do composto foi da seguinte forma: 1H (400 MHz, CDCI3): δ =1,18 - 1,47 (12H, m, H3’, H4’, H5’,H6’, H7’, H8’), 1,51 - 1,64 (2H, m, H2’), 1,68 - 1,82 (2H, m, H9’), 3,00 (3H, s, OSO2CH3), 3,32 - 3,45 (2H, m, HT), 3,87 (3H, s, OCH3)), 3,88 (6H, s, 2xOCH3), 4,22 (2H, t, J = 6,6 Hz, H10’), 5,84 (1H, bs, CONH), 6,34 (1H, d, J = 15,5 Hz, Ha), 6,74 (2H, s, H2, H6), 7,54 (1H, d, J = 15,5 Hz, Ηβ). 13C (100 MHz, CDCI3): δ = 25,5 (C8’), 27,0 (C3’), 29,0 (C5’), 29,0(C4’), 29,2 (C6’),
29,3 (C7’), 29,35 (C2’), 29,40 (C9’), 37,5 (OSO2CH3), 40,0 (CT), 56,3 (2xOCH3), 60,1 (OCH3),7Q,3 (C10’), 105,2(C2, C6), 105,2 (C6), 120,1 (Ca), 130,6 (C1), 139,8 (C4),
141.8 (Οβ), 153,6 (C3, C5), 166,1 (CONH).
[00136] Em uma modalidade, os procedimentos sintéticos para obtenção de sais de trifenilfosfônioà base de cinâmico (compostos 15 a 20, Figura 1) por micro-onda ou abordagens clássicas são descritos.
[00137] Em uma modalidade, a obtenção de sais de trifenilfosfôniol 5 e 16 foi realizado da seguinte forma: O composto 9 ou 10 (1 mmol) foi minuciosamente misturado com trifenilfosfina (1 mmol) em um recipiente de micro-onda e vedado sob árgon. A reação foi colocada sob irradiação de micro-onda a 150 °C por 1 hora e 30 minutos com agitação magnética. Após conclusão, a mistura de reação foi resfriada à temperatura ambiente e 0 produto bruto foi purificado por cromatografia de flash, com 0 uso de diclorometano/metanol [9:1 razão (v/v)] como sistema de eluição. As frações contendo 0 composto pretendido foram combinadas e 0 solvente foi evaporado. O resíduo resultante foi, então, dissolvido com uma quantidade mínima de diclorometano e triturado com éter etílico em excesso. O solvente foi decantado e 0 resíduo sólido final
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41/58 foi seco sob vácuo para fornecer o sal de metanossulfonato de trifenilfosfônio.
[00138] Em uma modalidade, o rendimento de metanossulfonato de (E)-(6-(3-(3,4dimetoxifenil)prop-2-enamida)hexil)trifenilfosfônio (15) foi de 73%. A caracterização estrutural do composto foi da seguinte forma: 1H (400 MHz, CDCh): δ = 1,38 (4H, m, H3’, H4’), 1,47 (4H, m, H2’, H5’), 3,17 (2H, d, J= 5,1 Hz, H1 ’), 3,29 (2H, m, H6’), 3,69 (3H, s, OCH3), 3.71 (3H, s, OCH3), 6,62 (1H, d, J = 8,3 Hz, H5), 6,82 (1H, d, J = 15,7 Hz, Ha), 6,85 (1H, dd, J = 1,9, 8,3 Hz, H6), 7,04 (1H, s, H2), 7,29 (1H, d, J = 15,7 Hz, Ηβ), 7,54-7,63 (15H, m, PPh3), 8,30 (1H, t, J = 5,3 Hz, CONH). 13C (100 MHz, CDCI3): δ = 21,2 (d, Jcp = 51,8 Hz, C6’), 25,0 (C5’) 28,1 (C4’), 28,9 (C3’), 38,2 (C2’), 39,0 (C1 ’),
55,4 (2xOCH3), 109,2 (C2), 110,3 (C5), 117,5 (d, Jcp = 85,9 Hz, C1 ”), 120,3 (Ca), 121,3 (C6), 128,1 (C1), 130,0 (d, Jcp = 12,5 Hz, C3”, C5”), 132,8 (d, Jcp = 9,9 Hz, C2”, C6”),
134,5 (d, Jcp = 2,8 Hz, C4”), 138,0 (C3), 148,4 (C4), 149,3 (C3), 166,4 (CONH). EM/IE m/z (%): 277 (25), 195 (33), 85 (85), 83 (100).
[00139] Em uma modalidade, 0 rendimento de metanossulfonato de (E)-(6-(3-(3,4,5trimetoxifenil)prop-2-enamido)hexil)trifenilfosfônio (16) foi de 65%. A caracterização estrutural do composto foi da seguinte forma: 1H (400 MHz, DMSO): δ = 1,33 (4H, m, H3’, H4’), 1,52 (4H, m, H2’, H5’), 3,15 (2H, m, HT), 3,59 (2H, m, H6’), 3,69 (3H, s, OCH3), 3,82 (6H, s, 2xOCH3), 6,68 (1H, d, J = 15,7 Hz, Ha), 6,90 (2H, s, H2, H6),7,34 (1H, d, J = 15,7 Hz, Ηβ), 7,76-7,84 (15H, m, PPh3), 8,18 (1H, t, J = 5,6 Hz, CONH). 13C (100 MHz, DMSO): δ = 20,2 (d, Jcp = 49,7 Hz C6’), 21,8 (C5’), 25,6 (C4’), 28,8 (C3’), 29,6 (C2’)> 38,5 (C1 ’), 55,9 (2xOCH3), 60,2 (OCH3), 104,9 (C2, C6), 118,6 (d, Jcp = 85,7 Hz, C1 ”), 121,9 (Ca), 130,3 (d, Jcp = 12,4 Hz, C3”, C5”), 130,7 (C1), 133,6 (d, Jcp = 10,1 Hz, C2”, C6”), 134,9 (d, Jcp = 2,4 Hz, C4”), 138,5 (Οβ), 153,1 (C3, C5), 156,3 (C4), 165,0 (CONH). EM/IE m/z (%): 278 (24), 277 (48), 263 (34), 262 (100), 261 (22), 184 (22), 183 (75), 108 (38).
[00140] Em uma modalidade, a produção de sais de trifenilfosfônio 17 a 20 foi realizada da seguinte forma: O derivado de metanossulfonato (11 a 14) (1 mmol) foi aquecido com trifenilfosfina (1 mmol) sob atmosfera de árgon a 130 °C por 18 horas. O produto bruto foi purificado por cromatografia de flash, com 0 uso de diclorometano/metanol [9:1 razão (v/v)] como sistema de eluição. As frações contendo 0 composto pretendido
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42/58 foram combinadas e o solvente foi evaporado. O resíduo resultante foi, então, dissolvido com uma quantidade mínima de diclorometano e triturado com éter etílico em excesso. O solvente foi decantado e o resíduo sólido final foi seco sob vácuo para fornecer o sal de metanossulfonato de trifenilfosfônio.
[00141] Em uma modalidade, o rendimento de metanossulfonato de (E)-(8-(3-(3,4dimetoxifenil)acrilamido)octil)trifenilfosfônio (17) foi de 53%. A caracterização estrutural do composto foi da seguinte forma: 1H (400 MHz, MeOD): δ = 1,25 - 1,40 (6H, m, H3’, H4’, H5’), 1,49 - 1,60 (4H, m, H2’, H6’), 1,61 - 1,73 (2H, m, H7’), 2,68 (3H, s, OSO2CH3), 3,26 (2H, t, J = 7,1 Hz, H1 ’), 3,43 - 3,33 (2H, m, H8’), 3,85 (3H, s, OCH3), 3,86 (3H, s, OCH3), 6,48 (1H, d, J = 15,7 Hz, Ha), 6,96 (1H, d, J = 8,3 Hz, H5), 7,11 (1H, dd, J = 2,0, 8,3 Hz, H6), 7,15 (1H, d, J = 2,0 Hz, H2), 7,44 (1H, d, J = 15,7 Hz, Ηβ), 7,70 - 7,94 (16H, m, PPh37 CONH). 13C (100 MHz, MeOD): δ = 22,6 (d, Jcp = 51,2 Hz, C8’), 23,5 (d, Jcp = 4,4 Hz, C6’), 27,7 (C3’), 29,7 (C4’), 29,9 (C5’), 30,4 (C2’), 31,4 (d, Jcp = 16,0 Hz, C7’), 39,5 (OSO2CH3), 40,4 (CT), 56,4 (OCH3), 56,5 (OCH3), 111,4 (C2),
112.8 (C5), 119,6 (C6), 120,0 (d, Jcp = 85,8 Hz, C1”), 123,2 (Ca), 129,4 (C1), 131,5 (d, Jcp = 12,6 Hz, C3”, C5”), 134,8 (d, Jcp = 9,9 Hz, C2”, C6”), 136,3 (d, Jcp = 3,0 Hz, C4”), 141,5 (CB), 150,7 (C4), 152,2 (C3), 168,9 (CONH). ME/ESI m/z (%): 581 (M++HCH3SO3, 45), 580 (M+-CH3SO3, 54), 462 (100).
[00142] Em uma modalidade, 0 rendimento de metanossulfonato de (E)-(8-(3-(3,4,5trimetoxifenil)acrilamido)octil)trifenilfosfônio (18) foi: 96 %. A caracterização estrutural do composto foi da seguinte forma: 1H (400 MHz, CDCI3): δ = 1,18 - 1,46 (6H, m, H3’, H4’, H5’), 1,51 - 1,66 (6H, m, H2’, H6’, H7’), 2,68 (3H, s, OSO2CH3), 3,33 (2H, dd, J =
12,3 6,3 Hz, HT), 3,58 - 3,43 (2H, m, H8’), 3,83 (3H, s, OCH3), 3,85 (6H, s, 2 x OCH3),
6.85 (2H, s, H2, H6), 6,92 (1H, d, J = 15,7 Hz, Ha), 7,46 (1H, d, J = 15,6 Hz, Ηβ), 7,62 -
7.85 (15H, m, PPh3), 7,99 (1H, t, J = 5,2 Hz, CONH). 13C (100 MHz, CDCI3): δ = 21,9 (d, Jcp = 50,2 Hz, C8’), 22,3 (d, Jcp = 4,5 Hz, C6’), 25,9 (C4’), 27,8 (C3’), 28,0 (C5’),
28.8 (C2’)> 29,5 (d, Jcp = 16,1 Hz, C7’), 39,3 (OSO2CH3), 39,7 (C1 ’), 56,3 (2xOCH3),
60.9 (OCH3), 105,1 (C2, C6), 118,5 (d, Jcp = 85,8 Hz, C1”), 122,4 (Ca), 130,5 (d, Jcp =
12,5 Hz, C3”, C5”), 131,5 (C1), 133,5 (d, Jcp = 9,9 Hz, C2”, C6”) , 135,1 (d, Jcp = 2,9 Hz, C4”), 138,8 (C4), 139,0 (Οβ), 153,2 (C3, C5), 166,7 (CONH). ME/ESI m/z (%): 611
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43/58 (IW+H-CH3SO3, 46) 610 (M+- CH3SO3, 100).
[00143] Em uma modalidade, o rendimento de metanossulfonato de (E)-(10-(3-(3,4dimetoxifenil)acrilamido)decil)trifenilfosfônio (19) foi de 61%. A caracterização estrutural do composto foi da seguinte forma: 1H (400 MHz, MeOD): δ = 1,18- 1,41 (10H, m, H3’, H4’, H5’,H6’, H7’), 1,46 - 1,59 (4H, m, H2’, H8’), 1,60 - 1,72 (2H, m, H9’), 2,68 (3H, s, OSO2CH3), 3,27 (2H, t, J = 7,1 Hz, H1 ’), 3,32 - 3,42 (2H, m, H10’), 3,85 (3H, s, OCH3),
3,86 (3H, s, OCHs), 6,48 (1H, d, J = 15,7 Hz, Ha), 6,95 (1H, d, J = 8,2 Hz, H5), 7,11 (1H, dd, J = 8,2, 1,9 Hz, H6), 7,14 (1H, d, J = 1,9 Hz, H2), 7,44 (1H, d, J = 15,7 Hz, Ηβ), 7,95 - 7,68 (16H, m,PPh3, CONH). 13C (100 MHz, MeOD): δ = 22,6 (d, Jcp = 51,1 Hz, C1 O’), 23,5 (d, Jcp = 4,5 Hz, C8’), 27,9 (C3’), 29,8 (C4’), 30,2 (C5’, C6’), 30,35 (C7’), 30,42 (C2’), 31,5 (d, Jcp = 16,1 Hz, C9’), 39,5 (OSO2CH3), 40,5 (C1 ’), 56,4 (OCH3), 56,5 (OCH3), 111,4 (C2), 112,8 (C5), 119,8 (C6), 120,0 (d, Jcp = 85,8 Hz, C1”), 123,2 (Ca),
129,4 (C1), 131,5 (d, Jcp = 12,5 Hz, C3”, C5”), 134,8 (d, Jcp = 9,9 Hz, C2”, C6”), 136,3 (d, Jcp = 3,0 Hz, C4”), 141,5 (Οβ), 150,7 (C4), 152,2 (C3), 168,9 (CONH). ME/ESI m/z (%): 610 (M++H- CH3SO3, 73) 609 (M+- CH3SO3, 100), 491 (33), 490 (67).
[00144] Em uma modalidade, 0 rendimento de metanossulfonato de (E)-(10-(3-(3,4,5trimetoxifenil)acrilamido)decil)trifenilfosfônio (20) foi de 69%. A caracterização estrutural do composto foi da seguinte forma:1Η (400 MHz, MeOD): δ = 1,20 - 1,41 (1 OH, m, H3’, H4’, H5’, H6’, H7’), 1,48 - 1,59 (4H, m, H2’, H8’), 1,60 - 1,72 (2H, m, H9’), 2,68 (3H, s, OSO2CH3), 3,28 (2H, t, J = 7,1 Hz, H1 ’), 3,35 - 3,45 (2H, m, H10’), 3,78 (3H, s, OCH3),
3,86 (6H, s, 2xOCH3), 6,55 (1H, d, J = 15,7 Hz, Ha), 6,86 (2H, s, H2, H6), 7,43 (1H, d, J = 15,7 Hz, Ηβ), 7,70 - 7,96 (16H, m, PPh3, CONH). 13C (100 MHz, MeOD): δ = 22,6 (d. Jcp = 51,0 Hz, C1 O’), 23,5 (d, Jcp = 4,4 Hz, C8’), 27,9 (C3’), 29,8 (C4’), 30,2 (C5’, C6’), 30,37 (C7’), 30,42 (C2’), 31,5 (d, Jcp = 16,0 Hz, C9’), 39,5 (OSO2CH3), 40,5 (C1 ’), 56,7 (2xOCH3), 61,2 (OCHs), 106,3 (C2, C6), 120,0 (d, Jcp = 86,3 Hz, C1”), 121,5 (Ca),
132.2 (C1), 131,5 (d, Jcp = 12,5 Hz, C3”, C5”), 134,8 (d, Jcp = 10,0 Hz, C2”, C6”),
136.3 (d, Jcp = 3,0 Hz, C4”), 140,7 (C4), 141,5 (Οβ), 154,8 (C3, C5), 168,6 (CONH). ME/ESI m/z (%): 640 (M++2- CH3SO3, 100), 639 (M++H- CH3SO3, 100), 418 (33).
[00145] Em uma modalidade, 0 procedimento sintético geral para a obtenção de antioxidantes mitocondriotrópicos (AntiOxCIN2- AntiOxCIN?, Figura 1) foi realizada da
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44/58 seguinte forma: O composto de trifenilfosfônio (15 a 20) (1 mmol) foi dissolvido em diclorometano anidro (15 ml). A mistura de reação foi agitada sob árgon e resfriada a uma temperatura abaixo de - 70 °C. A essa solução, tribrometo de boro (3 mmol, 1 M de solução em diclorometano) foi adicionada. Uma vez concluída a adição, a reação foi mantida a - 70 °C por 10 minutos e, então, foi deixada aquecer à temperatura ambiente com agitação contínua por 12 horas. Após a destruição de BBr3 com água, o processo de purificação foi executado diretamente. Após a remoção de água, o produto resultante foi dissolvido em metanol e seco sobre Na2SO4 anidro, filtrado e o solvente evaporado.
[00146] Em uma modalidade, o rendimento de metanossulfonato de (E)-(6-(3-(3,4-dihidroxifenil)prop-2-enamido)hexil)trifenilfosfônio (AntiOxCIISb) foi de 30%. A caracterização estrutural do composto foi da seguinte forma: 1H (400 MHz, DMSO): δ = 1,35 (4H, m, H3’, H4’), 1,50 (4H, m, H2’, H5’), 3,17 (2H, d, J= 2,8 Hz, H1 ’), 3,58 (2H, m, H6’), 6,34 (1H, d, J = 15,7 Hz, Ha), 6,75 (1H, d, J = 8,0 Hz, H5), 6,82 (1H, dd, J = 1,9, 8,0 Hz, H6), 6,94 (1H, d, J =1,9 Hz, H2), 7,20 (1H, d, J = 15,7 Hz, Ηβ), 7,74 - 7,92 (15H, m, PPh3), 7,99 (1H, t, J = 5,6 Hz, CONH), 9,14 (1H, s, OH), 9,39 (1H, s, OH). 13C (100 MHz, DMSO): δ = 20,2 (d, Jcp = 50,2 Hz, C6’), 21,8 (C5’) 25,6 (C4’), 28,9 (C3’),
29.6 (C2 ), 38,4 (C1 ’), 113,8 (C2), 115,8 (C5), 118,4 (d, Jcp = 85,6 Hz, C1 ”), 119,0 (Ca),
120,3 (C6), 126,4 (C1), 130,3 (d, Jcp = 12,4 Hz, C3”, C5”), 133,6 (d, Jcp = 10,1 Hz, C2”, C6”), 134,9 (d, Jcp = 2,4 Hz, C4”), 138,8 (Cp), 145,5 (C4), 147,2 (C3), 165,3 (CONH). EM/IE m/z (%): 277 (25), 263 (33), 262 (100), 183 (74), 108 (34).
[00147] Em uma modalidade, o rendimento de metanossulfonato de (E)-(8-(3-(3,4-dihidroxifenil)acrilamido)octil)trifenilfosfônio (AntiOxCINs) foi de 55%. A caracterização estrutural do composto foi da seguinte forma: 1H (400 MHz, MeOD): δ = 1,23 - 1,41 (6H, m, H3’, H4’, H5’), 1,47 - 1,59 (4H, m, H2’, H6’), 1,60 - 1,73 (2H, m, H7’), 3,25 (2H, t, J = 7,0 Hz, H1 ’), 3,33 - 3,44 (2H, m, H8’), 6,36 (1H, d, J = 15,7 Hz, Ha), 6,75 (1H, d, J = 8,2 Hz, H5), 6,87 (1H, dd, J = 8,2, 2,0 Hz, H6), 6,99 (1H, d, J = 2,0 Hz, H2), 7,36 (1H, d, J = 15,7 Hz, Ηβ), 7,68 - 7,94 (16H, m, PPh3, CONH). 13C (100 MHz, MeOD): δ =
22.7 (d, Jcp = 51,0 Hz, C8’), 22,5 (d, Jcp = 4,4 Hz, C6’), 27,7 (C3’), 29,7 (C4’), 29,9 (C5’), 30,4 (C2’), 31,4 (d, Jcp = 16,0 Hz, C7’), 40,4 (C1 ’), 115,1 (C2), 116,5 (C5), 118,6
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45/58 (C6), 120,0 (d, Jcp = 86,3 Hz, C1”), 122,1 (Co), 128,3 (C1), 131,6 (d, Jcp = 12,6 Hz, C3”, C5”), 134,8 (d, Jcp = 9,9 Hz, C2”, C6”), 136,3 (d, Jcp = 3,0 Hz, C4”), 142,1 (CB),
146,8 (C4), 148,8 (C3), 169,2 (CONH). ESI /ME m/z (%): 553 (M++H - CH3SO3, 73), 552 (M-CH3SO3, 100), 462 (10).
[00148] Em uma modalidade, 0 rendimento de metanossulfonato de (E)-(10-(3-(3,4-dihidroxifenil)acrilamido)decil)trifenilfosfônio (AntiOxCINs) foi de 80 %. A caracterização estrutural do composto foi da seguinte forma: 1H (400 MHz, MeOD): δ = 1,20 - 1,40 (10H, m, H3’, H4’, H5’,H6’, H7’), 1,47- 1,57 (4H,m, H2’, H8’), 1,59 - 1,71 (2H, m, H9’), 3,26 (2H, t, J = 7,1 Hz, H1 ’), 3,33 - 3,41 (2H, m, H10’), 6,36 (1H, d, J = 15,7 Hz, Ho), 6,75 (1H, d, J = 8,2 Hz, H5), 6,88 (1H, dd, J = 8,4, 2,1 Hz, H6), 6,99 (1H, d, J = 2,1 Hz, H2), 7,36 (1H, d, J = 15,7 Hz, Ηβ), 7,68 - 7,98 (16H, m, PPh3, CONH). 13C (100 MHz, MeOD): δ = 22,7 (d, Jcp = 51,0 Hz, C10’), 23,5 (d, Jcp = 4,4 Hz, C8’), 27,9 (C3’), 29£ (C4’), 30,2 (C5’> C6’), 30,3 (C7’), 30,4 (C2’), 31,5 (d, Jcp = 16,1 Hz, C9’), 40,5 (C1 ’), 115,0 (C2), 116,5 (C5), 119,8 (C6), 120,0 (d, Jcp = 86,3 Hz, C1 ”), 122,0 (Ca), 128,3 (C1), 131,5 (d, Jcp = 12,6 Hz, C3”, C5”), 134,8 (d, Jcp = 10,0 Hz, C2”, C6”), 136,3 (d, Jcp = 3,0 Hz, C4”), 142,0 (CB), 146,8 (C4), 148,7 (C3), 169,2 (CONH). ESI /ME m/z (%): 581 (M++H-CH3SO3, 85) 580 (M+-CH3SO3, 100), 490 (20).
[00149] Em uma modalidade, 0 rendimento de metanossulfonato de (E)-(6-(3-(3,4,5-trihidroxifenil)prop-2-enamido)hexil)trifenilfosfônio (AntiOxCIN^ foi de 50%. A caracterização estrutural do composto foi da seguinte forma: 1H (400 MHz, DMSO): δ = 1,35 (4H, m, H3’, H4’), 1,50 (4H, m, H2’, H5), 2,72 (2H, m, H1 ’), 3,58 (2H, m, H6’) 6,28 (1H, d, J = 15,6 Hz, Ha), 6,47 (2H, s, H2, H6), 7,10 (1H, d, J = 15,6 Hz, Ηβ), 7,75-7,79 (15H, m, PPh3), 8,00 (1H, t, J = 5,6 Hz, CONH). 13C (100 MHz, DMSO): δ = 19,8 (d, Jcp = 49,5 Hz, C6’), 21,3 (C5’), 25,2 (C4’), 26,2 (C3’), 28,5 (C2’), 38,2 (C1 ’), 106,3 (C2, C6), 118,2 (d, Jcp = 85,1 Hz, C1”), 118,6 (Ca), 124,9 (C1), 129,8 (d, Jcp = 12,4 Hz, C3”, C5”), 133,2 (d, Jcp = 10,1 Hz, C2”, C6”), 134,5 (d, Jcp = 2,8 Hz, C4”), 134,7 (C4), 138,8 (Οβ), 145,7 (C3, C5), 164,9 (CONH). EM/IE m/z (%): 277 (40), 263 (26), 262 (100), 184 (20), 183 (78), 108 (36), 82 (76), 81 (33), 80 (78), 79 (35), 58 (22).
[00150] Em uma modalidade, 0 rendimento de metanossulfonato de (E)-(8-(3-(3,4,5-trihidroxifenil)acrilamido)octil)trifenilfosfônio (AntiOxCINs) foi de 88 %. A caracterização
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46/58 estrutural do composto foi da seguinte forma: 1H (400 MHz, MeOD): δ = 1,25 - 1,42 (6H, m, H3’, H4’, H5’), 1,46 - 1,61 (4H, m, H2’, H6’), 1,59 - 1,74 (2H, m, H7’), 3,24 (2H, t, J = 7,0 Hz, H1 ’), 3,35 (3H, s, OSO2CH3), 3,43 - 3,32 (2H, m, H10’), 6,33 (1H, d, J = 15,6 Hz, Ha), 6,56 (2H, s H2, H6), 7,28 (1H, d, J = 15,6 Hz, Ηβ), 7,70 - 7,92 (16H, m, PPh3, CONH). 13C (100 MHz, MeOD): δ = 22,7 (d, Jcp = 51,1 Hz, C8’), 23,5 (d, Jcp =
4,4 Hz, C6’), 27,7 (C3’), 29,7 (C4’), 29,9 (C5’), 30,3 (C2’), 31,4 (d, Jcp = 16,1 Hz, C7’), 40,4(C1’· CH3SO3), 108,3 (C2, C6), 118,7 (Ca), 120,0 (d, Jcp = 86,3 Hz, C1”), 127,4 (C1), 131,6 (d, Jcp = 12,5 Hz, C3”, C5”), 134,8 (d, Jcp = 9,9 Hz, C2”, C6”), 136,3 (d, Jcp = 3,0 Hz, C4”), 126,8 (C4), 142,4 (Οβ), 147,2 (C3, C5), 169,2(CONH). ESI/ME m/z (%): 569 (M++H-CH3SO3, 43), 568 (M+-CH3SO3, 100).
[00151] Em uma modalidade, 0 rendimento de metanossulfonato de (E)-(10-(3-(3,4,5tri-hidroxifenil)acrilamido)decil)trifenilfosfônio (AntiOxCIN?) foi de 53 %. A caracterização estrutural do composto foi da seguinte forma: 1H (400 MHz, MeOD): δ = 1,19-1,43 (10H, m, H3’, H4’, H5’,H6’, H7’), 1,49- 1,60 (4H, m, H2’, H8’), 1,60-1,73 (2H, m, H9’), 3,28 (2H, t, J = 7,0 Hz, H1 ’), 3,34 - 3,43 (2H, m, H10’), 6,34 (1H, d, J = 15,6 Hz, Ha), 6,58 (2H, s, H2, H6), 7,31 (1H, d, J = 15,6 Hz, Ηβ), 7,71 - 7,95 (16H, m, PPh3, CONH). 13C (100 MHz, MeOD): δ = 22,7 (d, Jcp = 51,0 Hz, C10’), 23,5 (d, Jcp =
4.3 Hz, C8’), 27,9 (C3’), 29,8 (C4’), 30,2 (C5’, C6’), 30,3 (C7’), 30,4 (C2’), 31,5 (d, Jcp =
15,9 Hz, C9’), 40,5 (CT), 108,2 (C2, C6), 118,7 (Ca), 120,0 (d, Jcp = 86,3 Hz, C1 ”),
127.3 (C1), 131,5 (d, Jcp = 12,5 Hz, C3”, C5”), 134,8 (d, Jcp = 9,9 Hz, C2”, C6”), 136,3 (d, Jcp = 3,0 Hz, C4”), 136,7 (C4), 142,4 (CB), 147,1 (C3, C5), 169,2 (CONH). ESI /ME m/z (%): 597 (M++H-CH3SO3, 67), 596 (M+ -CH3SO3, 100) 418 (14).
[00152] A atividade de neutralização de radicais de AntiOxCINsfoi avaliada por meio de ensaios de capacidade antioxidante total, com base em radicais de DPPH*, ABTS*+ e GO'. Todos esses métodos envolveram a medição espectrofotométrica da diminuição da absorbância resultante da desativação de radical (DPPH', ABTS,+ ou GO’) com um antioxidante. Os resultados foram expressos em ICso, que é definido como a concentração de antioxidante mínima necessária para reduzir a quantidade de radical por 50%. Os ensaios de antioxidante foram realizados em um leitor de múltiplas placas (Powerwave XS Microplate Reader) da Bio-Tech instruments.
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47/58 [00153] Em uma modalidade, a atividade de neutralização de radical de DPPH foi realizada da seguinte forma: soluções dos compostos de teste com concentrações crescentes (entre 0 pM e 500 pM) foram preparadas em etanol. Uma solução etanólica de DPPH· (6,85 mM) também foi preparada e, então, diluída para alcançar a absorbância de 0.72 ± 0.02 a 515 nm. Cada solução de composto (20 pl) foi adicionada a 180 pl de solução de· DPPH triplicada, e a absorbância a 515 nm foi registrada a cada minuto, ao longo de 45 minutos. A inibição percentual do radical foi baseada na comparação entre o produto em branco (20 pl de etanol e 180 pl de solução· de DPPH), que correspondeu a 100% de soluções de compostos de teste e radical. As curvas de resposta à dose foram estabelecidas pela determinação de valores de ICso. Os dados são médias± SEM de três experimentos independentes.
[00154] Em uma modalidade, atividade de neutralização do ABTS-+ foi avaliada da seguinte forma: soluções etanólicas dos compostos de teste com concentrações crescentes (entre 10 pM e 500 pM) foram preparadas. A solução do cátion de radical ABTS + foi obtida através da adição de 150 mM de solução aquosa de persulfato de potássio (163 pl) a 10 ml de 7 mM de solução aquosa de ABTS seguido pelo armazenamento no escuro, à temperatura ambiente por 16 h (2,45 mM de concentração final). A solução, então, foi diluída em etanol para alcançar a absorbância de 0.72 ± 0.02. Após a adição do composto (20 pl), triplicada, à ABTS-+ solução (180 pl) a medição espectrofotométrica foi executada a cada minuto, ao longo de 15 minutos. A inibição percentual de radical foi baseada na comparação entre o produto em branco (20 pl de etanol e 180 pl de ABTS-+ solução), que corresponde a 100% de soluções de compostos de teste e radical. As curvas de resposta à dose foram estabelecidas pela determinação de valores de ICso. Os dados são médiasi SEM de três experimentos independentes.
[00155] Em uma modalidade, a atividade de neutralização de GO foi avaliada da seguinte forma: soluções de compostos de teste com concentrações de 5 pM a 75 pM foram preparadas em etanol. Uma solução etanólica de 5 mM de GO foi preparada e diluída para alcançar a absorbância de 1.00 ±0.02 a 428 nm. A adição (20 pl) em tríplice da solução de composto à solução GO (180 pl) foi seguida pela medição de
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48/58 absorbância a 428 nm ao longo de 30 minutos, no escuro, à temperatura ambiente. A inibição percentual de radical foi baseada na comparação entre o produto em branco (20 pl de etanol e 180 μΙ de GO' solução), que corresponde a 100% de soluções de compostos de teste e radical. As curvas de resposta à dose foram estabelecidas pela determinação de valores de ICso. Os dados são médias± SEM de três experimentos independentes.
[00156] Em uma modalidade, as propriedades lipofílicas e redox de AntiOxCINs foram avaliadas por técnicas eletroquímicas.
[00157] Em uma modalidade, os dados analíticos eletroquímicos foram obtidos com o uso de um potentiostat Autolab PGSTAT302N controlado por computador (Metrohm Autolab, Utrecht, Holanda). Geralmente, os dados de voltametria cíclica (CV) são adquiridos a uma taxa de varredura de 50 mVs-1. Os resultados de voltametria de pulso diferencial (DPV) foram adquiridos em uma etapa potencial de 4 mV, amplitude de pulso de 50 mV e taxa de varredura de 8 mVs-1. Os sinais eletroquímicos foram monitorados pelo software, versão 4.9 do Sistema Eletroquímico de Propósito Geral (GPES). Todos os experimentos eletroquímico foram realizados à temperatura ambiente em uma célula eletroquímico que foi colocada em uma gaiola de Faraday para minimizar a contribuição de ruído de fundo no sinal analítico.
[00158] Em uma modalidade, o processo de avalição de propriedades de redox de AntiOxCINs foi conduzido da seguinte forma: soluções de estoque de cada composto (10 mM) foram preparadas dissolvendo-se a quantidade adequada em etanol. As soluções de trabalho voltamétrico foram preparadas na célula eletroquímica, a uma concentração final de 0,1 mM. O eletrólito de suporte de pH 7,4 foi preparado diluindose 6,2 ml de 0,2 M de fosfato de hidrogênio dipotássico e 43,8 ml de 0,2 M de fosfato de hi-hidrogênio de potássio a 100 ml. Os dados voltamétricos foram adquiridos em um sistema de três eletrodos consistindo em um eletrodo de carbono vítreo (GCE, d = 2 mm) como eletrodo de trabalho, um eletrodo de contador de fio de platina e um eletrodo de referência de Ag/AgCI saturado. Em uma modalidade, a avaliação de propriedades lipofílicas de AntiOxCINs foi realizada da seguinte forma: a célula eletroquímica foi um sistema de quatro eletrodos com arranjos de microinterfaces de
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49/58 líquido-líquido (pITIES) contendo dois eletrodos de referência de Ag/AgCI e dois eletrodos de contador de Pt, um em cada fase. A membrana microporosa foi vedada com um vedante de fluorossilicone (Dow Corning 730) em um cilindro de vidro que foi preenchido com 4,0 ml da fase aquosa, em que as alíquotas de soluções de AntiOxCINs foram adicionadas. A membrana foi, então, submersa na fase orgânica contida na célula. A solução de referência de fase orgânica (uma solução aquosa de 2 mM de BTPPACI + 2 mM de NaCI) foi mecanicamente estabilizada. A solução aquosa de eletrólito de suporte foi um tampão de Tris-HCI a 10 mM, pH 7,0.
[00159] Em uma modalidade, as propriedades de quelação de ferro pelos AntiOxCINs foram avaliadas espectrofotométricamentepelo método de ferrozina realizado em um leitor de múltiplas placas (Powerwave XS Microplate Reader) da Bio-Tech instruments.
[00160] Em uma modalidade, as propriedades de quelação de ferro dos AntiOxCINs foram avaliadas da seguinte forma: em cada cavidade, uma solução do composto de teste (100 μΜ) e sulfato de ferro (II) amônio em acetato de amônio (20 μΜ) foram adicionados, incubados por 10 min e a absorbância foi lida a 562 nm. Então, uma solução recém-preparada de ferrozina (5 mM) foi adicionada a cada cavidade (96 μΜ de concentração final). Após uma nova incubação a 37 °C por um período de 10 min, a absorbância de complexo de [Fe(ferrozina)s]2+ foi medida a 562 nm. As cavidades de produto em branco foram processadas com o uso de DMSO em vez dos compostos de teste. EDTA foi usado como uma referência. Todos os compostos foram testados a uma concentração final de 100 μΜ. A absorbância da primeira leitura foi subtraída dos valores finais para abolir qualquer absorbância devido aos compostos de teste. Os dados são médias± SEM de três experimentos independentes e são expressos como % de quelação de Fe(ll) (EDTA = 100%).
[00161] Em uma modalidade, a avaliação do perfil de toxicidade da função mitocondrial de AntiOxCINs foi realizada em mitocôndrias de fígado de rato (RLM). As RLM foram preparadas por homogeneização de tecido seguida por centrifugações diferenciais em tampão gelado contendo 250 mM de sacarose, 10 mM de HEPES (pH 7,4), 1 mM de EGTA e 0,1% de albumina do soro bovino livre de gordura. Após obter uma preparação mitocondrial bruta, os péletes foram lavados duas vezes e ressuspensos em tampão de
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50/58 lavagem (250 mM de sacarose e 10 mM de HEPES, pH 7,4). A concentração de proteína foi determinada pelo ensaio de biureto com o uso de BSA como um padrão. [00162] Em uma modalidade, o acúmulo de AntiOxCINs mitocondrial foi avaliada.
[00163] Em uma modalidade, o acúmulo mitocondrial de AntiOxCINs por RLM energizadas foi avaliada da seguinte forma: RLM (0,5 mg de proteína/ml) foram incubadas com AntiOxCINs a 37 °C sob agitação constante em 1 ml de meio de KCI (120 mM de KCI, 10 mM de HEPES, pH 7,2 e 1 mM de EGTA). Cinco adições sequenciais de 1 μΜ de cada AntiOxCINs foram realizadas para calibrar a resposta de eletrodo na presença de rotenona (1,5 pM). Então, o succinato (10 mM) foi adicionado para gerar ΔΨ. Valinomicina (0,2 pg/ml) foi adicionada no final do ensaio para dissipar ΔΨ. As medições foram realizadas com um eletrodo seletivo de íon, que mede a distribuição de cátion tetrafenilfosfônio (TPP+) e eletrodo de Ag/AgCL como referência.
[00164] A razão de acúmulo mitocondrial foi calculada pelo desaparecimento de AntiOxCINs do meio extramitocondrial para intramitocondrial, presumindo-se um volume intramitocondrial de —0,5 pl/mg de proteína e uma correção de ligação para a absorção mitocondrial de compostos de TPP.
[00165] O resultado de AntiOxCINs na peroxidação de lipídio de RLM foi avaliado. Dois métodos diferentes foram usados.
[00166] Em uma modalidade, o efeito de AntiOxCINs sobre a peroxidação de lipídio de RLM foi medido por ensaio de espécies reativas de ácido tiobarbitúrico (TBARS) da seguinte forma: RLM (2 mg de proteína/ml) foram incubadas em 0,8 ml de meio contendo 100 mM de KCI, 10 mM de Tris-HCI e pH 7,6, a 37 °C, suplementadas com 5 mM de glutamato/2,5 mM de malato como substrato. RLM foram incubadas por um período de 5 min com cada AntiOxCINs (5 pM) e, então, as mitocôndrias foram expostas à condição de estresse oxidativo pela adição de 100 pM de FeS04/500 pM de H2O2/5 mM de ascorbato por 15 min a 37 °C. Após a exposição ao estresse oxidativo, 60 pl de 2% (v/v) hidroxitolueno butilado em DMSO foram adicionados, seguido de 200 pl de 35% (v/v) de ácido perclórico e 200 pl de 1% (p/v) de ácido tiobarbitúrico. As amostras foram, então, incubadas por 15 min a 100 °C, deixadas para resfriar e 0 sobrenadante transferido para um tubo de vidro. Após a adição de 2 ml de água de
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MiliQ e 2 ml de butan-1-ol, as amostras foram vigorosamente submetidas a vórtice por alguns segundos. As duas fases puderam se separar. A fluorescência de alíquotas (250 pl) da camada orgânica foi analisada, em um leitor de placa (λεχ = 515 nm; ÀEm = 553 nm), quanto a TBARS. Foi constatado que a produção de segundo plano de TBARS em RLM energizadas com glutamato/malato é negligenciável. Os dados são médias ± SEM de três experimentos independentes e são expressos como % de controle (controle = 100%).
[00167] Em uma modalidade, o efeito de AntiOxCINs na peroxidação de lipídio de RLM foi medido por uma segunda metodologia da seguinte forma: o consumo de oxigênio de 2 mg de RLM, em um volume total de 1 ml de um meio de reação consistindo em 100 mM de KCI, 10 mM de Tris-HCI e pH 7,6, com o uso de glutamato/malato (5 mM /2,5 mM), como o substrato respiratório, foi monitorado a 37 °C com um eletrodo de oxigênio de Clark. As RLM foram incubadas por um período de 5 min com cada AntiOxCINs (5 μΜ) e, então, o processo de peroxidação de lipídio foi iniciado adicionando-se 10 mM de ADP e 0,1 mM de FeSO4 (final concentrações). A concentração saturada de O2 no meio de incubação foi presumido como 217 μΜ em 37 °C. As alterações dependentes de tempo no consumo de oxigênio resultante da peroxidação de membranas de RLM por um par de pró-oxidantes (1 mM de ADP/0,1 mM de FeSO4) foram registradas. Os traços são um registro de médiasi SEM de seis experimentos independentes. A fase de latência de tempo associada ao consumo de oxigênio mais lento que seguiu a adição de ADP/Fe2+ foi usado para medir a eficácia de AntiOxCINs para prevenir a peroxidação de lipídio. Os dados são médias± SEM de seis experimentos independentes e são expressos como % de controle (controle = 100%).
[00168] Em uma modalidade, 0 efeito de AntiOxCINs sobre a respiração mitocondrial foi avaliado.
[00169] Em uma modalidade, a avaliação do efeito de AntiOxCINs sobre a respiração mitocondrial foi realizada da seguinte forma: a respiração de RLM isoladas foi avaliada por polarografia com um eletrodo de oxigênio tipo Clark conectado a um gravador adequado em uma câmara de água termostatizada de 1 ml com agitação magnética, a
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52/58 °C 1. 0 meio respiratório-padrão consiste em 130 mM de sacarose, 50 mM de KCI, 5 mM de KH2PO4, 5 mM de HEPES (pH 7,3) e 10 pM de EGTA. As concentrações crescentes de AntiOxCINs (2,5 a 10 pM) foram adicionadas ao meio de reação contendo substratos respiratórios, glutamato/malato (10 mM e 5 mM, respectivamente) ou succinato (5 mM) e RLM (1 mg) e foi incubado por um período de 5 min antes do ensaio. O estado 2 foi considerado como a respiração durante 0 tempo de incubação de 5 min com AntiOxCINs. Para induzir a respiração de estado 3, 125 nmol de ADP (com uso de glutamato/malato) ou 75 nmol de ADP (com uso de succinato) foram adicionados. O estado 4 foi determinado após a fosforilação de ADP foi finalizada. A adição subsequente de oligomicina (2 pg/ml) inibiu a síntese de ATP e originou 0 estado de respiração de inibição de oligomicina. Por fim, 1 pM de FCCP foi adicionado para induzir a respiração não acoplada. A RCR foi de 6,42 ± 0,57 e 4,90 ± 0,66 para os experimentos de controle, com glutamato-malato ou succinato como substratos respiratórios, respectivamente. O índice de ADP/O foi de 2,64 ± 0,10 e 1,58 ± 0,09, com os mesmos substratos respiratórios, respectivamente.Os dados são médias± SEM de sete experimentos independentes.
[00170] Em uma modalidade, 0 efeito de AntiOxCINs sobre 0 potencial elétrico transmembrana (ΔΨ) foi avaliado.
[00171] Em uma modalidade, a avaliação do efeito de AntiOxCINs sobre 0 potencial elétrico transmembrana mitocondrial (ΔΨ) foi realizada da seguinte forma: 0 potencial elétrico transmembrana mitocondrial (ΔΨ) foi estimado através da avaliação de alterações de fluorescência de safranina (5 pM) e foi registrado em um espectrofluorômetro que opera em comprimentos de onda de excitação de 495 e 586 nm, com uma largura de fenda de 5 nm. As concentrações crescentes de AntiOxCINs (2,5 a 10 pM) foram adicionadas ao meio de reação (200 mM de sacarose, 1 mM de KH2PO4, 10 mM de Tris (pH 7,4) e 10 pM de EGTA) contendo substratos respiratórios, glutamato/malato (5 mM e 2,5 mM, respectivamente) ou succinato (5 mM) e RLM (0,5 mg em 2 ml de volume final) e foram incubadas por um período de 5 min antes de iniciar 0 ensaio, a 25 °C. Nesse ensaio, a safranina (5 pM) e ADP (25 nmol) foram usadas para iniciar 0 ensaio e para induzir a despolarização, respectivamente. Então, 1
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53/58 μΜ de FCCP foi adicionado no final de todos os experimentos para despolarizar mitocôndrias. ΔΨ foi calculada com o uso de uma curva de calibração obtida, em que RLM foram incubadas em um meio de reação livre de K+ contendo 200 mM de sacarose, 1 mM de NaFbPCX 10 mM de Tris (pH 7,4) e 10 μΜ de EGTA, suplementada com 0,4 pg de valinomicina. Constatou-se que a extensão de alterações de fluorescência de safranina induzida por ΔΨ é similar nos meios padrão e livre de K+. “Repolarização” corresponde à recuperação de potencial de membrana após a fosforilação completa de ADP adicionado. A fase de latência refletiu o tempo necessário para fosforilar a ADP adicionada. As RLM isoladas desenvolveram um ΔΨ® 226 mV e ΔΨ« 202 mV (interior negativo) quando glutamato/malato ou succinato foram usados, respectivamente. Os dados são médias ± SEM de cinco experimentos independentes.
[00172] Em uma modalidade, o efeito de AntiOxCINs sobre a abertura de poro de transição de permeabilidade mitocondrial foi avaliado.
[00173] Em uma modalidade, o efeito de AntiOxCINs sobre a abertura de poro de transição de permeabilidade mitocondrial foi medido da seguinte forma: o inchaço mitocondrial foi estimado medindo-se as alterações de luz difundida a partir de uma suspensão mitocondrial, como monitorado por espectrofotometria a 540 nm. As concentrações crescentes de AntiOxCINs (2,5 a 10 μΜ) foram adicionadas ao meio de reação (200 mM de sacarose, 1 mM de KH2PO4, 10 mM de Tris (pH 7,4), 5 mM de succinato e 10 μΜ de EGTA suplementado com 1,5 μΜ de rotenona), na presença de RLM (1 mg), e foram incubadas por um período de 5 min antes do ensaio. Os experimentos foram iniciados pela adição de uma concentração adequada de Ca2+ (15 a 50 μΜ), titulada todos os dias. A ciclosporina A (CsA), um dessensibilizador de PTP, foi adicionada para demonstrar a abertura de mPTP. A reação foi agitada continuamente e a temperatura mantida a 37 °C. Os dados são médias ± SEM de três experimentos independentes e são expressos como Aabsorbância a 540 nm.
[00174] Em uma modalidade, 0 perfil de citotoxicidade de AntiOxCIN e AntiOxCINe foi avaliado em células HepG2 de carcinoma hepatocelular humano. As células HepG2 de carcinoma hepatocelular humano foram cultivadas em meio de alto teor de glicose
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54/58 composto por meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM; D5648) suplementado com piruvato de sódio (0,11 g/l), bicarbonato de sódio (1,8 g/l) e 10% de soro bovino fetal (FBS) e 1% de penicilina-estreptomicina antibiótica 100* de solução. As células foram mantidas a 37 °C em um incubador umidificado com 5% de CO2. As células de HepG2 foram semeadas à densidade de 4 x 104 de células/ml e cultivadas por 24 horas antes do tratamento.
[00175] Em uma modalidade, a examinação de citotoxicidade foi realizada da seguinte forma: as células foram colocadas em uma placa de 48 cavidades (2 x 104 de células/500 pl) e, então, foram incubadas durante 48 horas com concentrações de AntiOxCIN4 e AntiOxCINe na faixa de 25 pM a 500 pM ou 0,5 pM a 25 pM, respectivamente. Após a incubação, 0 ensaio de sulforrodamina B (SRB) foi usado para a determinação de densidade de célula com base na medição de teor de proteína celular. Brevemente, após a incubação, 0 meio foi removido e as cavidades enxaguadas com PBS (1X). As células foram fixadas adicionando-se 1% de ácido acético em 100% de metanol por pelo menos 2 horas a - 20 °C. Posteriormente, a solução de fixação foi descartada e as placas foram secas em um forno a 37 °C.
[00176] Duzentos e cinquenta microlitros de 0,5% de SRB em 1% de solução de ácido acético foram adicionados e incubados a 37 °C por 1 h. As cavidades foram, então, lavadas com 1% de ácido acético em água e secas. Então, 500 pl de Tris (pH 10) foram adicionados e as placas foram agitadas por 15 min. Por fim, 200 pl de cada sobrenadante foi transferido para placas de 96 cavidades e a densidade óptica foi medida a 540 nm. Os dados são médias ± SEM de quatro experimentos independentes e os resultados são expressos como porcentagem de controle (controle = 100%), que representa a densidade de célula sem qualquer tratamento no respectivo ponto no tempo.
[00177] Em uma modalidade, 0 perfil de antioxidante celular de AntiOxCIN4 e AntiOxCINe foi avaliado em células HepG2 de carcinoma hepatocelular humano.
[00178] Em uma modalidade, 0 exame da atividade antioxidante celular foi realizada da seguinte forma: células foram colocadas na placa de 48 cavidades (2 x 104 de células/500 pl) e pré-incubadas com concentrações não tóxicas de AntiOxCIN4 (100
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55/58 μΜ) ou AntiOxCINe (2,5 μΜ) por 1 hora. Após o tempo de incubação, as células foram expostas a condições de estresse oxidativo pela adição de 250 μΜ de FeSO4 ou 250 pM de H2O2 por 48 horas. Ao final do tempo de incubação, 0 ensaio de SRB foi usado para a determinação de densidade de célula como descrito anteriormente. Os dados são médias± SEM de quatro experimentos independentes. Os resultados são expressos como porcentagem de controle (controle = 100%), que representa a densidade de célula sem qualquer tratamento no respectivo ponto no tempo. Os estressantes oxidantes resultaram em uma inibição significativa de proliferação celular,30% e 42%, respectivamente, quando comparado com 0 controle.
[00179] Em uma modalidade, as alterações morfológicas celulares induzidas por AntiOxCIN4 e AntiOxCINe em células HepG2 de carcinoma hepatocelular humano foram avaliadas com 0 uso de microscopia de epifluorescência vital.
[00180] Em uma modalidade, a detecção de alterações morfológicas, incluindo condensação de cromatina e polarização e distribuição mitocondrial por microscopia de epifluorescência vital foi realizada da seguinte forma: células foram colocadas em placas de 6 cavidades com uma lamela de vidro por cavidade (8 x 104 de células/2 ml) e, então, tratadas com concentrações não tóxicas de AntiOxCIN4 ou AntiOxCINe por 48 horas. Trinta minutos antes do final do tempo de incubação, a rede mitocondrial foi manchada com TMRM (100 nM) enquanto os núcleos foram manchados com Hoechst 33342 (1 pg/ml), para detectar a condensação de cromatina apoptótica, em HBSS (NaCI a 137 mM, KCI a 5,4 mM, NaHCOs a 4,2 mM, Na2HPO4 A 0,3 mM, KH2PO4 a 0,4 mM, CaCl2 a 1,3 mM, MgCL a 0,5 mM, MgSO4 a 0,6 mM e D-glicose a 5,6 mM, pH 7,4) em 37 °C sob condições escuras. As lamelas de vidro foram removidas das cavidades e colocadas em lâminas de vidro com uma gota de meio de montagem. As imagens celulares foram adquiridas com 0 uso de um microscópio Zeiss LSM 510Meta e analisadas com 0 software ImageJ, versão 1.49. As sondas foram mantidas com células durante 0 procedimento de imageamento e quatro campos de imagem foram aleatoriamente coletados de cada cavidade. As imagens são representativas de três experimentos independentes.
[00181] Em uma modalidade, todos os dados biológicos foram analisados da seguinte
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56/58 forma: no software de GraphPad Prism 5,0 (GraphPad Software, Inc.), em que todos os resultados são expressos como médias ± SEM para o número de experimentos indicados. Os dados foram analisados pelo teste t de Student para comparação de duas médias, e ANOVA unidirecional com comparação múltipla de Dunnet pós-teste. O último teste foi usado para comparar mais de dois grupos com uma variável independente. A significância foi aceita com *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,0005, ****P < 0,0001.
[00182] Aqueles versados na técnica irão reconhecer, ou poderão averiguar com o uso de não mais do que a experimentação de rotina, muito equivalentes das modalidades específicas da invenção descrita no presente documento. O alcance da presente invenção não se destina a ser limitado à descrição acima, mas, em vez disso, é apresentado nas reivindicações anexas.
[00183] Onde as formas singulares de elementos ou recursos são usadas no relatório descritivo das reivindicações, a forma no plural também é incluída, e vice-versa, se não for especificamente excluída. Por exemplo, o termo “uma célula” ou “a célula” também inclui as formas no plural “células” ou “as células” e vice-versa. Nas reivindicações, os artigos das reivindicações como “um”, “uma” e “o/a” podem significar um ou mais de um, exceto se indicado o contrário ou se evidente de outro modo a partir do contexto.
[00184] As reivindicações ou descrições que incluem “ou” entre um ou mais membros de um grupo são consideradas satisfeitas se um, mais de um, ou todos os membros do grupo estiverem presentes, empregados ou, de outro modo, forem relevantes a um dado produto ou processo, exceto se indicado o contrário ou evidente de outro modo a partir do contexto. A invenção inclui modalidades nas quais exatamente um membro do grupo está presente, empregado ou for relevante de outro modo a um dado produto ou processo. A invenção também inclui as modalidades nas quais mais de um, ou todos os membros do grupo estão presentes, empregados ou são relevantes de outro modo a um dado produto ou processo.
[00185] Ademais, deve ser entendido que a revelação engloba todas as variações, combinações e permutações nas quais uma ou mais limitações, elementos, cláusulas, termos descritivos, etc., de uma ou mais dentre as reivindicações ou de porções
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57/58 relevantes da descrição são introduzidos em outra reivindicação. Por exemplo, qualquer reivindicação que é dependente de outra reivindicação pode ser modificada para incluir uma ou mais limitações encontradas em qualquer outra reivindicação que é dependente da mesma reivindicação-base. Ademais, onde as reivindicações recitam uma composição, deve ser entendido que os métodos para usar a composição de qualquer um dos propósitos revelados no presente documento são incluídos, e os métodos para produzir a composição de acordo com qualquer um dos métodos de produção revelados no presente documento ou outros métodos conhecidos na técnica são incluídos, exceto quando indicado de outro modo ou exceto se for evidente a um elemento de habilidade comum na técnica que uma contradição ou inconsistência surgiría.
[00186] Onde são fornecidas faixas, os pontos de extremidade são incluídos. Ademais, deve ser entendido que, exceto se indicado de outro modo ou evidente de outro modo a partir do contexto e/ou o entendimento de um elemento de habilidade comum na técnica, os valores que são expressos como faixas podem assumir qualquer valor específico dentro das faixas mencionadas em diferentes modalidades da invenção, ao décimo da unidade do limite inferior da faixa, exceto se o contexto ditar claramente o contrário. Também deve ser entendido que, exceto se indicado de outro modo ou se evidente de outro modo a partir do contexto e/ou o entendimento de um elemento de habilidade comum na técnica, os valores expressados como faixas podem assumir qualquer subfaixa dentro da dada faixa, em que os pontos de extremidade da subfaixa são expressos ao mesmo grau de precisão que o décimo da unidade do limite inferior da faixa.
[00187] Além disso, deve ser entendido que qualquer modalidade particular da presente invenção pode ser explicitamente excluída de qualquer uma ou mais dentre as reivindicações. Onde são dadas faixas, qualquer valor dentro da faixa pode ser explicitamente excluído de qualquer uma ou mais dentre as reivindicações. Qualquer modalidade, elemento, recurso, aplicação ou aspecto das composições e/ou métodos da invenção pode ser excluído de qualquer uma ou mais reivindicações. Para propósitos de brevidade, todas as modalidades nas quais um ou mais elementos,
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58/58 recursos, propósitos ou aspectos são excluídos não são apresentadas explicitamente no presente documento.
[00188] As modalidades descritas acima são combináveis.
[00189] As seguintes reivindicações definem adicionalmente modalidades particulares da revelação.
[00190] Todas as referências mencionadas no presente documento são incorporadas no presente documento em sua totalidade a título de referência, como se toda e cada referência fosse incorporada a título de referência individualmente.
REFERÊNCIAS
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Claims (47)
- REIVINDICAÇÕES1. Compostos com a formula geral I
ou sal farmaceuticamente aceitável, solvato, hidrato, tautômero, estereoisômero, caracterizado pelo fato de queR1, R2, R3, R4, R5, R6, R7 e R8 são selecionados independentemente um do outro;R1, R2, R3, R4 e R5 são selecionados a partir de H, halogênio, hidroxila, metila, metoxila, amino, ácido carboxílico ou grupo nitro;R6, R7, R8 são uma cadeia alquila, uma cadeia alquenila, uma cadeia alquinila, uma arila substituída ou um anel cíclico;uma ligação entre R6 e R7 é uma ligação única, uma ligação dupla ou uma ligação tripla eZ’ é um ânion. - 2. Composto, de acordo com a reivindicação anterior, caracterizado pelo fato de que a ligação entre R6 e R7 é uma ligação única ou uma ligação dupla.
- 3. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a cadeia alquila, a cadeia alquenila ou a cadeia alquinila é uma cadeia de C1-C30, preferencialmente uma cadeia de C1-C18.
- 4. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a cadeia alquila, a cadeia alquenila ou a cadeia alquinila é uma cadeia de C2-C14, preferencialmente uma cadeia de C3-C12, mais preferencialmente uma cadeia de C6-C10.
- 5. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores,Petição 870190067804, de 17/07/2019, pág. 63/872/7 caracterizado pelo fato de que a cadeia alquila é uma cadeia de Ce alquila, uma cadeia de C7 alquila, uma cadeia de Cs alquila, uma cadeia de C9 alquila ou uma cadeia de C10 alquila.
- 6. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a arila substituída é uma alcano-arila substituída, alceno-arila substituída ou alcino-arila substituída.
- 7. Composto, de acordo com a reivindicação anterior, caracterizado pelo fato deque a alcano-arila substituída, alceno-arila substituída ou alcino-arila substituída é Ci-Ce-alquila, Cs-Cs-cicloalquila, Ce-Cio-arila, Ce-Cio-aril-Ci-Cs-alquila, C1-C6- alcóxi, Ce-Cio-arilóxi, Ce-Cio-aril-Ci-Cs-alcóxi, hidroxila, CO2H, Ci-Ce-alcoxicarbonila, C6-C10ariloxicarbonila, Ce-Cio-aril-Ci-Cs-alcoxicarbonila, Ci-Ce-alquilcarbonila, C6-C10arilcarbonila, Ce-Cio-aril-Ci-Cs-alquilcarbonila, Ci-Ce-alquilcarbóxi, Ce-Cio-arilcarbóxi, Ci-C6-alquilmercaptila, Ce-Cio-arilmercaptila, Ci-Ce-alquilmercaptocarbonila, Cs-Cscicloalquilmercaptocarbonila, Ce-C-io-arilmercaptocarbonila, C1-C6alquilmercaptocarbóxi, C6-C10- arilmercaptocarbóxi, Ci-Ce-alquilsulfonila, C6-C10arilsulfonila, Ci-Ce-alquilsuIfóxi, C6-C10- arilsulfoxi;cada um dos quais é substituído uma vez ou várias vezes por Ci-Ce-alquila, C1-C6alcóxi, COCH; CONH2, substituído uma vez ou duas vezes por Ci-Ce-alquila; SO3H, amino, tiol, hidroxila, nitro, ciano, flúor, cloro, bromo, iodo, CF3 ou OCF3;em que vários dentre esses substituintes opcionais são combinados para formar sistemas de homoanel ou heteroanel anelados saturados, insaturados ou aromáticos; ou um heterociclo saturado, insaturado ou aromático substituído uma vez ou várias vezes por C-i-Ce-alquila, C-i-Ce-alcóxi, COOH; CONH2, substituído uma vez ou duas vezes.
- 8. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que 0 anel cíclico é um ciclopropano, ciclobutano, ciclopentano, ou ciclo-hexano.
- 9. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que Z- é selecionado a partir da seguinte lista: sulfonato de alquila, sulfonato de arila, nitrato ou um halogênio, em que 0 dito halogênio é F, Cl ouPetição 870190067804, de 17/07/2019, pág. 64/873/7Br.
- 10. Composto, de acordo com a reivindicação anterior, caracterizado pelo fato de que o sulfonato de alquila ou sulfonato de arila é selecionado a partir da seguinte lista: metanossulfonato, p-toluenossulfonato, etanossulfonato, naftalenossulfonato.benzenossulfonato e 2reivindicações anteriores, das das das das reivindicações reivindicações reivindicações reivindicações anteriores, anteriores, anteriores, anteriores, anteriores, anteriores,
- 11. Composto, de acordo com qualquer uma das caracterizado pelo fato de que o halogênio é F, Cl ou Br.
- 12. Composto, de acordo com qualquer uma caracterizado pelo fato de que R1 e R5 são H.
- 13. Composto, de acordo com qualquer uma caracterizado pelo fato de que R2 e R3 são OH.
- 14. Composto, de acordo com qualquer uma caracterizado pelo fato de que R4 é H ou OH.
- 15. Composto, de acordo com qualquer uma caracterizado pelo fato de que R6 e R7 são uma cadeia de Ci alquila.
- 16. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações caracterizado pelo fato de que R8 é uma cadeia de C2 alquila.
- 17. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações caracterizado pelo fato de que 0 composto é metanossulfonato de (E)-(6-(3-(3,4-dihidroxifenil)prop-2-enamido)hexil)trifenilfosfônio.
- 18. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que 0 composto é metanossulfonato de (E)-(8-(3-(3,4-dihidroxifenil)acrilamido)octil)trifenilfosfônio.
- 19. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que 0 composto é metanossulfonato de (E)-(6-(3-(3,4,5-trihidroxifenil)prop-2-enamido)hexil)trifenilfosfônio.
- 20. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que 0 composto é metanossulfonato de (E)-(8-(3-(3,4,5-trihidroxifenil)acrilamido)octil)trifenilfosfônio.
- 21. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores,Petição 870190067804, de 17/07/2019, pág. 65/874/7 caracterizado pelo fato de que o composto é metanossulfonato de (E)-(10-(3-(3,4-dihidroxifenil)acrilamido)decil)trifenilfosfônio.
- 22. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o composto é metanossulfonato de (E)-(10-(3-(3,4,5-trihidroxifenil)acrilamido)decil)trifenilfosfônio.
- 23. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que é para uso na medicina ou na veterinária.
- 24. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que é para uso na modulação de pelo menos uma dentre morfologia mitocondrial e expressão de enzimas de OXPHOS.
- 25. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que é para uso no tratamento ou na prevenção ou supressão de sintomas associados a um distúrbio mitocondrial ou com uma afecção associada à disfunção mitocondrial ou doenças mitocondriais.
- 26. Composto, de acordo com a reivindicação anterior, caracterizado pelo fato de que o distúrbio mitocondrial é um distúrbio selecionado a partir do grupo que consiste em: epilepsia mioclônica; Epilepsia Mioclônica com Fibras Rotas Vermelhas; Neuropatia Óptica Hereditária de Leber; neuropatia ataxia e rinite pigmentosa; Miopatia Mitocondrial, Encefalopatia, Lactacidose, Derrame; síndrome de Leigh; síndrome tipo Leigh; atrofia Óptica Dominante; Síndrome de Kearns-Sayre; Diabetes e Surdez de Herança Materna; síndrome de Alpers-Huttenlocher; espectro de Neuropatia Ataxia; Oftalmoplegia Externa Progressiva Crônica; síndrome de Pearson; Encefalopatia Neurogastrointestinal Mitocondrial; síndrome de Sengers; acidúria 3-metilglutacônica, surdez sensorioneural, encefalopatia e constatações neurorradiológicas da síndrome tipo Leigh; miopatia; miopatia mitocondrial; cardiomiopatia; e encefalomiopatia, síndrome de Leigh devido à deficiência de proteína de excesso de complexo IV; deficiências de OXPHOS isoladas ou combinadas com defeito genético não solucionado até o momento incluindo oxidação de piruvato perturbada e taxas de produção de ATP mais PCr.
- 27. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores,Petição 870190067804, de 17/07/2019, pág. 66/875/7 caracterizado pelo fato de que a afecção associada à disfunção mitocondrial é uma afecção selecionada a partir do grupo que consiste em: Ataxia de Friedreich; acidose tubular renal; doença de Parkinson; doença de Alzheimer; esclerose lateral amiotrófica; doença de Huntington; distúrbios pervasivos desenvolvimentais; perda de audição; surdez; diabetes; envelhecimento; e efeitos de fármaco adversos impeditivos da função mitocondrial.
- 28. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que é para uso no tratamento, na prevenção ou supressão de uma doença neurodegenerativa, neoplasia, doença do rim, escleroderma, doença de sobrecarga de ferro hepático, doença de sobrecarga de cobre hepático, alopecia, infertilidade humana, pancreatite aguda, fibromialgia ou uma doença mitocondrial.
- 29. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que é para uso no tratamento de doenças do fígado gorduroso não alcoólicas, a saber, doença do fígado gorduroso não alcoólica, esteatohepatite não alcoólica ou cirrose hepática.
- 30. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a doença de neoplasia é câncer, em particular, carcinoma celular basal, câncer do osso, câncer do intestino, câncer cerebral, câncer de mama, câncer cervical, leucemia, câncer de fígado, câncer de pulmão, linfoma, melanoma, câncer de ovário, câncer pancreático, câncer de próstata, câncer de tiroide ou câncer biliar.
- 31. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que é para uso em doença do rim, a saber, insuficiência renal.
- 32. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que é para uso em esclerose lateral amiotrófica.
- 33. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que é para uso como agente antimicrobiano, em particular, como um desinfetante.
- 34. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores,Petição 870190067804, de 17/07/2019, pág. 67/876/7 caracterizado pelo fato de que é para utilização numa manutenção de uma cultura de células pluripotentes, como um suplemento para cultura celular, em particular, como composto de meio de cultivo.
- 35. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que é para uso para na recuperação muscular após exercício físico.
- 36. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que é para uso como um ingrediente ativo para cosmética, ou um suplemento, ou um nutracêutico, a saber, em um produto de cuidados como envelhecimento da pele ou antirrugas.
- 37. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que é para uso como uma sonda em estudos de imageamento, em particular, para monitorar estudos de imageamento mitocondrial.
- 38. Meio de cultura celular para manter células estaminais pluripotentes num estado indiferenciado caracterizado pelo fato de que compreende um composto de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores 1-22.
- 39. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que compreende qualquer um dos compostos, de acordo com as reivindicações 1 a 37 e um carregador farmaceuticamente aceitável, adjuvante, excipiente, diluente, ou misturas dos mesmos.
- 40. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação anterior, caracterizada pelo fato de que o carregador farmaceuticamente aceitável é selecionado a partir da seguinte lista: solução salina, goma acácia, gelatina, pasta de amido, talco, queratina, silica coloidal, ureia ou misturas dos mesmos.
- 41. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores 39 a 40, caracterizada pelo fato de que o adjuvante é selecionado a partir da seguinte lista: adjuvante de emulsão de óleo em água, adjuvante de alumínio, um ligante de TLR-4, uma saponina e misturas dos mesmos.
- 42. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores 39 a 41, caracterizada pelo fato de que o excipiente é selecionado a partir da seguinte lista: glicose, lactose, sacarose, monoestearato de glicerol, cloreto dePetição 870190067804, de 17/07/2019, pág. 68/877/7 sódio, glicerol, propileno, glicol, água, etanol ou misturas dos mesmos.
- 43. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores 39 a 42, caracterizada pelo fato de que a dita composição farmacêutica é administrada por via tópica, oral, parental ou injetável.
- 44. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores 39 a 43, caracterizada pelo fato de que é para uso em um método para o tratamento ou prevenção de uma doença neurodegenerativa, doença do fígado gorduroso não alcoólico, neoplasia, doença do rim, escleroderma, doença de sobrecarga de ferro hepático, doença de sobrecarga de cobre hepático, alopecia, infertilidade humana, pancreatite aguda ou fibromialgia, em que a composição farmacêutica é administrada em uma dose diária.
- 45. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação anterior, caracterizada pelo fato de que a dose diária é de 20 mg/dia ou 10 mg/dia.
- 46. Nanocarreador caracterizado pelo fato de que compreende o composto, de acordo com as reivindicações 1 a 37, ou a composição farmacêutica, de acordo com as reivindicações 39 a 45.
- 47. Lipossomo caracterizado pelo fato de que compreende o composto, de acordo com as reivindicações 1 a 37, ou a composição farmacêutica, de acordo com as reivindicações 39 a 45.
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