CN110104790A - 一种耐抗生素型微生态制剂的制备方法 - Google Patents

一种耐抗生素型微生态制剂的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种耐抗生素型微生态制剂的制备方法，属于水处理技术领域。本发明技术方案采用地衣芽孢杆菌、酵母菌和嗜酸乳杆菌接种于固态基质，制备微生态制剂；本发明采用沸石为主体基质，通过沸石的基本结构单元是硅氧四面体和铝氧四面体，四面体通过氧原子相互链接，组成链状或环状结构，进而形成中空的架状结构，沸石的架状结构中有许多晶穴和孔道，可以容纳分子或离子，本发明通过其缓释金属离子，与水体中抗生素进行络合并沉降，磺胺类抗生素N官能团参与配位，环素类抗生素含有的官能团种类和数量最多，与金属离子的络合以—OH和—CO为主，有效降低抗生素材料在水体中的分散性能。

Description

一种耐抗生素型微生态制剂的制备方法
技术领域
本发明涉及一种耐抗生素型微生态制剂的制备方法，属于水处理技术领域。
背景技术
人们对海产品的需求量也随之增加，进而带动了海水养殖业的蓬勃发展。与此同时，海水养殖方式也变得多种多样，主要分为池塘养殖、网箱养殖、筏式养殖、吊笼养殖、底播养殖以及工厂化养殖六类。其中，工厂化养殖作为一种高密度、集约化的新型养殖方式，具有节约水资源、占地面积少和养殖效率高等优点，发展尤为迅速。尽管如此，工厂化海水养殖业仍面临着一系列严重的问题，制约着其进一步发展。尤其是养殖过程中产生的氨氮、亚硝态氮和硫化氢等有害物质不但对水产动物产生毒害作用，导致水产动物发生病害甚至死亡，使产量降低，而且这些有害物质还会随养殖废水排入近海海域，将会引发赤潮，进而导致海洋中生物死亡等严重的环境问题。
工厂化海水养殖蓬勃发展的同时，仍受到养殖水体恶化、病害频发等问题的影响，
严重制约着其进一步发展。在氨氮、亚硝态氮和硫化氢等众多导致养殖水体恶化的因素中，氨氮的危害最大，当氨氮含量超过0.2mg/L时就有可能导致海水养殖动物发生病害。因此，降低水体环境中氨氮含量对工厂化海水养殖至关重要。微生态制剂是一种以活菌为主要成分的制剂，不仅能够有效去除水中的有害物质，抑制病原菌的生长而且具有促进养殖动物生长，提高其免疫力等功能。
微生态制剂的本质是活菌。然而，在微生态制剂的生产、保存到使用的过程中，存在着一系列问题影响其中菌株的活性，导致微生态制剂不能发挥出应有的效果。在微生态制剂的生产过程中，菌株的类型不同，发酵培养所需要的条件存在差异，如果不能准确把握菌株发酵培养所需的温度、pH、曝气量以及转速等条件，就无法生产出足够多数量的活菌以及保证菌株的活性。微生态制剂保存期间，不同类型的微生态制剂保存时间不同。液态微生态制剂体积大、保质期较短，因为在含有营养物质的液体环境中，菌株会继续进行代谢活动，直至死亡；而固态微生态制剂一般呈粉状，通常都经过干燥处理，水分含量少，部分产品还采用真空包装，隔绝了氧气，菌株的代谢活动基本停止，因此能够保存更长时间。
微生态制剂使用过程中受外界因素变化的影响较大，如高温、强酸强碱和抗生素等都会对微生态制剂发挥作用产生不利影响。温度和酸碱度等涉及到微生物生长代谢所必须的条件如果超出了菌株的适应范围，菌株将会死亡。而抗生素影响的主要原因是现在的部分生产者和大多的使用者将抗生素和微生态制剂一起应用，或者是使用者在实际应用过程中将抗生素和微生态制剂交替使用，导致微生态制剂中的菌株被抗生素杀灭，从而失去活性。另外，用于生产微生态制剂的特效微生物菌种少、部分生产工艺成本较高、某些作用机制还未清楚等问题也是目前微生态制剂研究方面需要解决的问题。
本发明旨在研制出一种用于工厂化海水养殖的微生态制剂，使其能够有效降低养殖水体中氨氮含量，并兼具一定的益生功效。
发明内容
本发明所要解决的技术问题：针对微生态制剂使用过程中受抗生素干扰，会对微生态制剂发挥作用产生不利影响的问题，提供了一种耐抗生素型微生态制剂的制备方法。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：
（1）分别将地衣芽孢杆菌、酵母菌、嗜酸乳杆菌各自接种至各自的300mL的种子液培养基中，培养40～4h后，得培养液；
（2）再按质量比1:5，将沸石与去离子水搅拌混合并调节pH至7.0，收集混合液并置于研钵中研磨分散，得分散浆液；
（3）按重量份数计，分别称量45～50份分散浆液、3～5份硝酸银、1～2份硝酸铜和1～2份硝酸锌置于烧杯中，搅拌混合并保温反应1～2h，静置后过滤并收集滤饼，洗涤、干燥，得基体颗粒；
（4）分别称量西芹、肉桂、百里香置于研钵中，研磨分散并收集分散颗粒，将分散颗粒置于超临界二氧化碳萃取装置中，静态萃取处理，收集得混合萃取物并过滤，收集滤液得改性精油；
（5）按重量份数计，分别称量45～50份培养液、6～8份改性精油、25～30份基质颗粒、15～20份琼脂液置于搅拌机中，搅拌混合并用磷酸缓冲液调节pH至7.0，真空冷冻干燥并研磨过筛，即可制备得所述的耐抗生素型微生态制剂。
步骤（1）所述的种子液培养基为按重量份数计，分别称量45～50份去离子水、1～3份磷酸氢二钾1～3份磷酸二氢钾、0.5～1.0份NH4Cl、0.5～1.0份MnSO4、0.5～1.0份ZnSO4、0.5～1.0份FeCl3和1～2份钼酸铵、10～15份葡萄糖置于烧杯中，搅拌混合并置于45～50℃下混合25～30min，紫外灭菌并收集制备而成。
步骤（3）所述的保温反应温度为70～80℃。
步骤（2）所述的培养条件为控制培养温度为均为30～32℃，转速为180～200r/min。
步骤（2）所述的调节pH至7.0采用的是质量分数1％硝酸。
步骤（4）所述的西芹、肉桂、百里香混合比例为按重量份数计，分别称量45～50份西芹、10～15份肉桂、6～8份百里香。
步骤（4）所述的静态萃取处理为在萃取压强为20～205Pa，萃取温度为45～50℃，二氧化碳流速为1.7～2.0L/min、分离温度为52℃，静态萃取45～50min。
步骤（4）所述的过滤筛网孔径为0.25～0.28μm。
步骤（5）所述的磷酸缓冲液为pH为7.0磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液。
步骤（5）所述的耐抗生素型微生态制剂粒径为200目。
本发明与其他方法相比，有益技术效果是：
（1）本发明技术方案采用地衣芽孢杆菌、酵母菌和嗜酸乳杆菌接种于固态基质，制备微生态制剂，不仅含有活性菌体，而且含有大量微生物发酵代谢产物，在水体中投入有效降低水体中的氨氮、亚硝酸盐、COD和硫化物的含量，同时，细菌可以将有机物质降解和转化为藻类生长所需要营养盐和生长因子等，并可促进藻类的生长，改善水质使其具有较好的应用价值；
（2）本发明技术方案采用沸石为主体基质，通过沸石的基本结构单元是硅氧四面体和铝氧四面体，四面体通过氧原子相互链接，组成链状或环状结构，进而形成中空的架状结构，沸石的架状结构中有许多晶穴和孔道，可以容纳分子或离子，硅氧四面体呈电中性，但铝氧四面体由于其中铝离子是正三价，从而带负一价电荷，成为吸引阳离子的中心，沸石中吸附的阳离子可以被其他金属阳离子所交换，所以本发明技术方案通过其缓释金属离子，与水体中抗生素进行有效络合并沉降，磺胺类抗生素N官能团参与配位，环素类抗生素含有的官能团种类和数量最多，与金属离子的络合以—OH和—CO为主，所以本发明技术方案缓释金属离子，有效降低抗生素材料在水体中的分散性能；
（3）本发明技术方案采用复合材料提取的精油进行改性，由于将其添加至养殖水体后，进入至养殖生物体内，通过提高生物肠道绒毛高度和十二指肠绒毛高度/隐窝深度（V/C）的比值，由于肠道是动物机体养分消化及吸收的重要场所，小肠绒毛越高，隐窝越浅，机体对养分消化吸收能力则强，反之，消化吸收效率则低，使其有利于肠道绒毛的快速发育，提高养殖产物的快速发育，同时复合植物精油可以通过杀死有害菌，促进有益菌增殖，优化肠道微生物菌群环境，维持肠黏膜完整，提高肠绒毛的高度及增加隐窝深度，从而增强营养物质的吸收，提高抗氧化能力，降低尿素氮的形成，促进机体总蛋白质的生成及促进激素的产生，有效降低抗生素不使用后微生物繁殖能力，有效抑菌并促进繁殖，提高养殖产量。
具体实施方式
按重量份数计，分别称量45～50份去离子水、1～3份磷酸氢二钾、1～3份磷酸二氢钾、0.5～1.0份NH4Cl、0.5～1.0份MnSO4、0.5～1.0份ZnSO4、0.5～1.0份FeCl3和1～2份钼酸铵、10～15份葡萄糖置于烧杯中，搅拌混合并置于45～50℃下混合25～30min，紫外灭菌并收集得种子培养液；分别将地衣芽孢杆菌、酵母菌、嗜酸乳杆菌各自接种至各自的300mL的种子液培养基中，控制培养温度为均为30～32℃，转速为180～200r/min，培养40～48h后，得培养液；再按质量比1:5，将沸石与去离子水搅拌混合并用质量分数1％硝酸调节pH至7.0，收集混合液并置于研钵中研磨分散，得分散浆液并按重量份数计，分别称量45～50份分散浆液、3～5份硝酸银、1～2份硝酸铜和1～2份硝酸锌置于烧杯中，搅拌混合并置于70～80℃下保温反应1～2h，静置6～8h后过滤并收集滤饼，用去离子水洗涤滤饼至洗涤液呈中性，将滤饼置于100～110℃下干燥至恒重，得基体颗粒；按重量份数计，分别称量45～50份西芹、10～15份肉桂、6～8份百里香置于研钵中，研磨分散并收集分散颗粒，将分散颗粒置于超临界二氧化碳萃取装置中，在萃取压强为20～25Pa，萃取温度为45～50℃，二氧化碳流速为1.7～2.0L/min、分离温度为52℃，静态萃取45～50min后，收集得混合萃取物并用0.25～0.28μm筛网过滤，收集滤液得改性精油；按重量份数计，分别称量45～50份培养液、6～8份改性精油、25～30份基质颗粒、15～20份琼脂液置于搅拌机中，搅拌混合并用pH为7.0磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液调节pH至7.0，真空冷冻干燥并研磨过200目筛，即可制备得所述的耐抗生素型微生态制剂。
按重量份数计，分别称量45份去离子水、1份磷酸氢二钾、1份磷酸二氢钾、0.5份NH4Cl、0.5份MnSO4、0.5份ZnSO4、0.5份FeCl3和1份钼酸铵、10份葡萄糖置于烧杯中，搅拌混合并置于45℃下混合25min，紫外灭菌并收集得种子培养液；分别将地衣芽孢杆菌、酵母菌、嗜酸乳杆菌各自接种至各自的300mL的种子液培养基中，控制培养温度为均为30℃，转速为180r/min，培养40h后，得培养液；再按质量比1:5，将沸石与去离子水搅拌混合并用质量分数1％硝酸调节pH至7.0，收集混合液并置于研钵中研磨分散，得分散浆液并按重量份数计，分别称量45份分散浆液、3份硝酸银、1份硝酸铜和1份硝酸锌置于烧杯中，搅拌混合并置于70℃下保温反应1h，静置6h后过滤并收集滤饼，用去离子水洗涤滤饼至洗涤液呈中性，将滤饼置于100℃下干燥至恒重，得基体颗粒；按重量份数计，分别称量45份西芹、10份肉桂、6份百里香置于研钵中，研磨分散并收集分散颗粒，将分散颗粒置于超临界二氧化碳萃取装置中，在萃取压强为20Pa，萃取温度为45℃，二氧化碳流速为1.7L/min、分离温度为52℃，静态萃取45min后，收集得混合萃取物并用0.25μm筛网过滤，收集滤液得改性精油；按重量份数计，分别称量45份培养液、6份改性精油、25份基质颗粒、15份琼脂液置于搅拌机中，搅拌混合并用pH为7.0磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液调节pH至7.0，真空冷冻干燥并研磨过200目筛，即可制备得所述的耐抗生素型微生态制剂。
按重量份数计，分别称量460份去离子水、1.6份磷酸氢二钾、1.6份磷酸二氢钾、0.6份NH4Cl、0.6份MnSO4、0.6份ZnSO4、0.6份FeCl3和1.3份钼酸铵、12份葡萄糖置于烧杯中，搅拌混合并置于46℃下混合26min，紫外灭菌并收集得种子培养液；分别将地衣芽孢杆菌、酵母菌、嗜酸乳杆菌各自接种至各自的300mL的种子液培养基中，控制培养温度为均为30.5℃，转速为187r/min，培养43h后，得培养液；再按质量比1:5，将沸石与去离子水搅拌混合并用质量分数1％硝酸调节pH至7.0，收集混合液并置于研钵中研磨分散，得分散浆液并按重量份数计，分别称量46份分散浆液、3.7份硝酸银、1.3份硝酸铜和1.3份硝酸锌置于烧杯中，搅拌混合并置于73℃下保温反应1.3h，静置6.7h后过滤并收集滤饼，用去离子水洗涤滤饼至洗涤液呈中性，将滤饼置于103℃下干燥至恒重，得基体颗粒；按重量份数计，分别称量46份西芹、12份肉桂、6.7份百里香置于研钵中，研磨分散并收集分散颗粒，将分散颗粒置于超临界二氧化碳萃取装置中，在萃取压强为22Pa，萃取温度为46℃，二氧化碳流速为1.8L/min、分离温度为52℃，静态萃取46min后，收集得混合萃取物并用0.26μm筛网过滤，收集滤液得改性精油；按重量份数计，分别称量46份培养液、6.7份改性精油、26份基质颗粒、16份琼脂液置于搅拌机中，搅拌混合并用pH为7.0磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液调节pH至7.0，真空冷冻干燥并研磨过200目筛，即可制备得所述的耐抗生素型微生态制剂。
按重量份数计，分别称量48份去离子水、2份磷酸氢二钾、2份磷酸二氢钾、0.8份NH4Cl、0.8份MnSO4、0.8份ZnSO4、0.8份FeCl3和1.6份钼酸铵、14份葡萄糖置于烧杯中，搅拌混合并置于48℃下混合28min，紫外灭菌并收集得种子培养液；分别将地衣芽孢杆菌、酵母菌、嗜酸乳杆菌各自接种至各自的300mL的种子液培养基中，控制培养温度为均为31℃，转速为195r/min，培养46h后，得培养液；再按质量比1:5，将沸石与去离子水搅拌混合并用质量分数1％硝酸调节pH至7.0，收集混合液并置于研钵中研磨分散，得分散浆液并按重量份数计，分别称量48份分散浆液、4份硝酸银、1.6份硝酸铜和1.6份硝酸锌置于烧杯中，搅拌混合并置于76℃下保温反应1.6h，静置7.5h后过滤并收集滤饼，用去离子水洗涤滤饼至洗涤液呈中性，将滤饼置于106℃下干燥至恒重，得基体颗粒；按重量份数计，分别称量46份西芹、14份肉桂、7份百里香置于研钵中，研磨分散并收集分散颗粒，将分散颗粒置于超临界二氧化碳萃取装置中，在萃取压强为24Pa，萃取温度为48℃，二氧化碳流速为1.9L/min、分离温度为52℃，静态萃取48min后，收集得混合萃取物并用0.27μm筛网过滤，收集滤液得改性精油；按重量份数计，分别称量48份培养液、7.5份改性精油、28份基质颗粒、18份琼脂液置于搅拌机中，搅拌混合并用pH为7.0磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液调节pH至7.0，真空冷冻干燥并研磨过200目筛，即可制备得所述的耐抗生素型微生态制剂。
按重量份数计，分别称量50份去离子水、3份磷酸氢二钾、3份磷酸二氢钾、1.0份NH4Cl、1.0份MnSO4、1.0份ZnSO4、1.0份FeCl3和2份钼酸铵、15份葡萄糖置于烧杯中，搅拌混合并置于50℃下混合30min，紫外灭菌并收集得种子培养液；分别将地衣芽孢杆菌、酵母菌、嗜酸乳杆菌各自接种至各自的300mL的种子液培养基中，控制培养温度为均为32℃，转速为200r/min，培养48h后，得培养液；再按质量比1:5，将沸石与去离子水搅拌混合并用质量分数1％硝酸调节pH至7.0，收集混合液并置于研钵中研磨分散，得分散浆液并按重量份数计，分别称量50份分散浆液、5份硝酸银、2份硝酸铜和2份硝酸锌置于烧杯中，搅拌混合并置于80℃下保温反应2h，静置8h后过滤并收集滤饼，用去离子水洗涤滤饼至洗涤液呈中性，将滤饼置于110℃下干燥至恒重，得基体颗粒；按重量份数计，分别称量50份西芹、15份肉桂、8份百里香置于研钵中，研磨分散并收集分散颗粒，将分散颗粒置于超临界二氧化碳萃取装置中，在萃取压强为25Pa，萃取温度为50℃，二氧化碳流速为2.0L/min、分离温度为52℃，静态萃取50min后，收集得混合萃取物并用0.28μm筛网过滤，收集滤液得改性精油；按重量份数计，分别称量50份培养液、8份改性精油、30份基质颗粒、20份琼脂液置于搅拌机中，搅拌混合并用pH为7.0磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液调节pH至7.0，真空冷冻干燥并研磨过200目筛，即可制备得所述的耐抗生素型微生态制剂。
将本发明制备的耐抗生素型微生态制剂进行检测，具体检测结果如下表表1：
测试方法：
常州市某鱼池塘海水为试验样本，对研制的耐抗生素型微生态制剂在养殖水质净化中的实际使用效果进行验证，并对菌剂使用时投放量进行了试验。
用本发明实施例4的微生态制剂分别取3mg/L、5mg/L、10mg/L的投放量投放到总体积为15L的供试水中，不加者作为空白对照，搅拌均勻匀后置于光照常温下，5天时取样，测定废水中COD、总氮、总磷的指标。
生长性能生长试验42天，试验鱼日喂2次(09:00～10:00、16:30～17:00)，饲养1天、42天称重，统计各重复组草鱼的饲料消耗、增重，并以此计算增重率、特定生长率SGR、公式如下：
增重率％＝(平均末质量-平均初质量)/平均初质量
特定生长率SGR＝(Ln平均末质量-Ln平均初质量)/投食天数×100％
表1耐抗生素型微生态制剂性能表征
由表1可知本发明制备的耐抗生素型微生态制剂，投放不同剂量微生态制剂的试验组中COD、氨氮的含量要明显低于空白对照组，且随着投放量的逐渐加大，处理效果也越好，且水体较澄清，且对鱼类有益生作用，可广泛应用于水产养殖具有广阔的市场价值和应用前景。

Claims (10)

1.一种耐抗生素型微生态制剂的制备方法，其特征在于具体制备步骤：
（1）分别将地衣芽孢杆菌、酵母菌、嗜酸乳杆菌各自接种至各自的300mL的种子液培养基中，培养40～4h后，得培养液；
（2）再按质量比1:5，将沸石与去离子水搅拌混合并调节pH至7.0，收集混合液并置于研钵中研磨分散，得分散浆液；
（3）按重量份数计，分别称量45～50份分散浆液、3～5份硝酸银、1～2份硝酸铜和1～2份硝酸锌置于烧杯中，搅拌混合并保温反应1～2h，静置后过滤并收集滤饼，洗涤、干燥，得基体颗粒；
（4）分别称量西芹、肉桂、百里香置于研钵中，研磨分散并收集分散颗粒，将分散颗粒置于超临界二氧化碳萃取装置中，静态萃取处理，收集得混合萃取物并过滤，收集滤液得改性精油；
（5）按重量份数计，分别称量45～50份培养液、6～8份改性精油、25～30份基质颗粒、15～20份琼脂液置于搅拌机中，搅拌混合并用磷酸缓冲液调节pH至7.0，真空冷冻干燥并研磨过筛，即可制备得所述的耐抗生素型微生态制剂。
2.根据权利要求1所述的一种耐抗生素型微生态制剂的制备方法，其特征在于：步骤（1）所述的种子液培养基为按重量份数计，分别称量45～50份去离子水、1～3份磷酸氢二钾1～3份磷酸二氢钾、0.5～1.0份NH4Cl、0.5～1.0份MnSO4、0.5～1.0份ZnSO4、0.5～1.0份FeCl3和1～2份钼酸铵、10～15份葡萄糖置于烧杯中，搅拌混合并置于45～50℃下混合25～30min，紫外灭菌并收集制备而成。
3.根据权利要求1所述的一种耐抗生素型微生态制剂的制备方法，其特征在于：步骤（3）所述的保温反应温度为70～80℃。
4.根据权利要求1所述的一种耐抗生素型微生态制剂的制备方法，其特征在于：步骤（2）所述的培养条件为控制培养温度为均为30～32℃，转速为180～200r/min。
5.根据权利要求1所述的一种耐抗生素型微生态制剂的制备方法，其特征在于：步骤（2）所述的调节pH至7.0采用的是质量分数1％硝酸。
6.根据权利要求1所述的一种耐抗生素型微生态制剂的制备方法，其特征在于：步骤（4）所述的西芹、肉桂、百里香混合比例为按重量份数计，分别称量45～50份西芹、10～15份肉桂、6～8份百里香。
7.根据权利要求1所述的一种耐抗生素型微生态制剂的制备方法，其特征在于：步骤（4）所述的静态萃取处理为在萃取压强为20～205Pa，萃取温度为45～50℃，二氧化碳流速为1.7～2.0L/min、分离温度为52℃，静态萃取45～50min。
8.根据权利要求1所述的一种耐抗生素型微生态制剂的制备方法，其特征在于：步骤（4）所述的过滤筛网孔径为0.25～0.28μm。
9.根据权利要求1所述的一种耐抗生素型微生态制剂的制备方法，其特征在于：步骤（5）所述的磷酸缓冲液为pH为7.0磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液。
10.根据权利要求1所述的一种耐抗生素型微生态制剂的制备方法，其特征在于：步骤（5）所述的耐抗生素型微生态制剂粒径为200目。
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