CN110101696B

CN110101696B - 一种氨来呫诺在利尿上的制药用途

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Publication number: CN110101696B
Application number: CN201910262099.5A
Authority: CN
Inventors: 夏旋; 贺茜; 邹秀兰
Original assignee: China Three Gorges University CTGU
Current assignee: China Three Gorges University CTGU
Priority date: 2019-04-02
Filing date: 2019-04-02
Publication date: 2021-03-30
Anticipated expiration: 2039-04-02
Also published as: CN110101696A

Abstract

本发明提供一种氨来呫诺在制备诱导出现多尿、低渗透尿、尿离子浓度降低的药物上的新用途。所述的氨来呫诺在制备诱导肾脏对AVP（抗利尿激素）受体拮抗剂上的应用。所述的在制备诱导肾脏对AQPs（水通道蛋白）受体拮抗剂上的应用。活性成分为，其用量为25‑50mg/kg。采用本发明的技术方案进行氨来呫诺诱导的多尿是对照组（灌服氨来呫诺的溶剂）增加尿量一倍（多至3‑4倍，相当于丢失小鼠的体重20%）。使用不同小鼠种系来验证（C57BL/6、昆明鼠，8周龄），灌胃持续短期1周到3个月，均能诱导多尿，整个过程小鼠未出现死亡；AM诱导的多尿是低渗尿（只有对照组1/2‑1/3，对照组尿渗透压达到1600‑2000mmol/L）、饮水量对应增加2‑4倍。

Description

一种氨来呫诺在利尿上的制药用途

技术领域

本发明涉及氨来呫诺(Amlexanox，简称为AM)的制药用途，被发现其化学成分(口服)具有强大的利尿作用，这有助于扩大其适应证，为心力衰竭治疗提供的选择。

背景技术

水潴留是很多疾病(如高容量性、正常容量性低钠血症、心力衰竭、肝硬化以及抗利尿激素分泌异常综合征(SIADH)的患者)的重要症状之一。由于传统的袢利尿剂(呋塞米)和噻嗪类利尿剂(氢氯噻嗪)往往是通过抑制钠、钾、氯离子的重吸收，从而影响水重吸收，并且排钠、排钾多于排水，因此容易导致患者出现血电解质紊乱(低血钠、低血钾、低渗性脱水)。因此，亟需开发排水多于排钠的药物。目前，国内外临床市场仅有一种AVP(ADH，即：抗利尿激素、血管加压素)受体拮抗剂——托伐普坦(商品名：苏麦卡，Tolvaptan，日本大冢制药，国药准字H20110115，15mg/片，192元/片，每日1-2片)，其功效通过拮抗肾小管基底膜侧的AVP受体(V2R)，从而抑制水重吸收。但是因为价格过于昂贵，多数中国患者无法长期使用来治疗心衰等疾病。因此，有必要研发排水，抑制水重吸收(尤其是抑制AVP作用)的药，将其推向临床，具有非常现实的临床意义。

氨来呫诺(Amlexanox，简称AM，又称为：AA 673、CHX 3673、Elics，2-Amino-7-(1-methylethyl)-5-oxo-5H-[1]benzopyrano[2,3-b]pyridine-3-carboxylic acid(C₁₆H₁₄N₂O₄)。CAS Number：68302-57-8；PubChem identifier：2161)在中国内临床上用于治疗复发性口腔溃疡的口腔贴剂(浓度5％)，共有9家药厂生产成品药或原料(国药准字H20050730、H20041202、H20061175、H20110014、H20110009、H20050663、H20080260、H20120080、20080173)，目前报道极少有副作用。2009年以后，AM被国外发现通过抑制IKKε/TBK-1两个基因(IC₅₀＝1～2μM)，可治疗糖尿病、非酒精性脂肪性肝病、肥胖等代谢综合征。

发明内容

本发明公开了AM可以诱导小鼠出现多尿、低渗透尿、尿离子浓度降低。本发明是在研究AM治疗脂肪肝的过程中发现，AM具有非常强的利尿作用，使得小鼠尿量达到5-6ml/24h，远多于对照组(1.0-1.5ml/24h)。且不引起血电解质紊乱。具体内容如下：

一种氨来呫诺在制备诱导出现多尿、低渗透尿、尿离子浓度降低的药物上的用途。

所述的氨来呫诺在制备诱导肾脏对AVP受体拮抗剂上的应用。

所述的氨来呫诺在制备诱导肾脏对AQPs受体拮抗剂上的应用。

活性成分为氨来呫诺，其用量为25-50mg/kg。

所述的氨来呫诺药物为水溶液制剂。

氨来呫诺药物的水溶液配制方法为，将氨来呫诺溶于NaOH水溶液中，采用Tris碱与浓盐酸滴定到pH 7.2-7.5，再加双重水，最后调混合溶液pH为7.2-7.5，即可制备得到氨来呫诺药物的水溶液。

所述的氨来呫诺药物的水溶液在0℃-4℃保存一周，-15℃～-20℃保存至少1月。

Tris.HCl缓冲液的质量浓度为2-4g/L、Tris.HCL与双重水的质量比为1-1.5:4；氨来呫诺药物水溶液的质量浓度为3-8g/L。

氨来呫诺药物的水溶液使用时再次析出，采用Tris碱与浓盐酸调pH至7.2-7.5。

氨来呫诺采用直接灌胃或口服方式进行诱导。

采用本发明的技术方案具有如下有意效果：

(1)AM诱导的多尿是对照组(灌服AM的溶剂)增加尿量一倍(多至3-4倍，相当于丢失小鼠的体重20％)。使用不同小鼠种系来验证(C57BL/6，昆明鼠，8周龄)，灌胃持续短期1周到3个月，均能诱导多尿，整个过程小鼠未出现死亡；AM诱导的多尿是低渗尿(只有对照组1/2-1/3，对照组尿渗透压达到1600-2000mmol/L)、饮水量对应增加2-4倍；尿比重接近1.05g/ml(远低于对照组的1.030g/ml)；尿离子浓度(钾、钠、氯、钙、镁、磷)均全面下降，但是24h的总离子排泄量与对照组无差异；肾脏病理学检测发现有肾小管中度扩张，提示原尿形成增多；见实施例2的相关步骤。

(2)AM诱导的多尿呈现剂量依耐性、时间依耐性、可逆性，对抗利尿激素抵抗。AM诱导小鼠的多尿从25mg/kg开始，小剂量(5mg/kg)不出现多尿，当达到50mg/kg后不再出现进一步尿量增多(100mg/kg与50mg/kg无差别)；尿渗透压检测发现5mg/kg剂量不影响尿渗透压，其余剂量均降低尿渗透压(25、50、100mg/kg)。AM单次给药诱导多尿在第一天尤为明显，第二天逐步恢复，第四天完全恢复正常的尿量和渗透压。通过外源性注射ddAVP(去氨加压素)发现，其没有完全拮抗AM诱导的多尿、多饮，尿渗透压没有变化；垂体AVP表达升高6倍(qPCR法)，说明AM诱导肾脏对AVP抵抗，垂体可能反馈性分泌AVP增多，这属于药物诱导的肾性尿崩症；见实施例4的相关步骤。

(3)AM诱导的多尿与AQPs、AVP受体有关，IKKε基因无关。通过qPCR检测，AM诱导肾脏AQPs明显减少(AQP1、AQP2、AQP3、AQP4)和AVP受体2(V2R)，IKKε和TBK1表达降低。见实施例4的相关步骤。

(4)研发出的AM口服溶剂。由于氨来呫诺(Amlexanox，MW：298.30。本研究采用了2个公司提供的产品，多次重复实验。Abcam公司，货号：ab142825；或者Cayman公司：货号：14181)不溶于水，但溶于DMSO(二甲基亚砜，100mM)和DMF(14mg/dl，二甲基甲酰胺)，既往溶解方法多是：先用AM溶于纯的有机溶剂二甲基甲酰胺(DMF)，然后加入水溶液(总浓度0.5mg/ml，1:1体积比DMF：PBS，pH 7.2)。考虑到DMSO、DMF对人、小鼠灌胃有低毒性。因此，经过多次配方，配置水溶剂(具体配方见表1)，通过3个月的小鼠灌胃，未观察到不良反应(处死小鼠后解剖，包括心脏、肝脏、肾脏外形、测器官重量/体重比、器官病理切片镜检，只有肾脏有镜下改变，其余未见异常，见实施例5的相关步骤)。

附图说明

图1为实施例2中不同时间AM灌胃诱导小鼠多尿情况，其中，A为一周的时间，B为4周时间。

图2为实施例2中AM诱导多尿的不同因素。

图3为实施例2中AM诱导尿离子浓度。

图4为实施例2中AM诱导血离子浓度变化。

图5为实施例2中AM不同剂量灌胃小鼠的尿量影响。

图6为实施例4中基因检测下丘脑AVP和肾脏组织AQPs的变化。

图7为实施例4中注射外源性AVP(去氨加压素ddAVP)对AM诱导的多尿和尿渗透压的影响。

图8为实施例4中对小鼠禁水对AM诱导渗透压的影响。

图9为实施例5中HE染色显示AM对肾脏组织的影响。

图10为实施例5中AM和Veh(Vehicle，对照组)灌胃12周后对器官的大体观影响。

图11为实施例5中AM和Veh(对照组)灌胃12周后对器官的重量的影响。

图12为实施例5中AM对普通饮食小鼠肝脏的镜下结构的影响。

图13为实施例5中AM和Veh的生存率影响。

具体实施方式

实施例1

氨来呫诺水溶剂的配制

表1为氨来呫诺水溶剂的配方成分

备注：溶剂4℃保存一周，如长期保存可放置-20℃；

取上述水溶剂2ml+氨来呫诺10mg(白色固体粉末)，颠倒振荡，即可快速溶解配成氨来呫诺灌胃液(5g/L)，短期使用(1周)可放置4℃，-20℃可长期保存1个月。如果溶剂pH<7.5，氨来呫诺会再次析出，可再调pH(用NaOH)至完全溶解。

实施例2

AM诱导多尿的生化指标检测

小鼠将采用8周龄(20g左右，雌雄不限)的小鼠代谢笼(三峡大学实验动物中心，苏州新区枫桥净化设备有限公司生产)，将动物放入代谢笼自由进食、饮水，适应三天后，给予灌胃(灌胃AM(5、25、50、100mg/kg)，灌胃体积控制在0.1-0.4ml/只，对照组灌服AM的溶剂。每日一次。固定时间在09:00)，连续三天测量其每日的进食量、尿量、进水量、体重；处死当天仍然灌胃一次。

收集尿液，测尿量(24h)、尿比重、尿pH、尿电解质浓度、尿渗透压(冰点法)(送检)；

实验结束后，乙醚麻醉处死小鼠，采集眼球血，测定血电解质、测定血离子浓度(送检)。

图1中，A和B：通过短期(1周，左图)和长期(4周，右图)的AM灌胃，发现AM能诱导多尿；图2中C和D：AM诱导的多尿是尿渗透压降低，尿比重降低，且和饮食无关(普通饮食Chowdiet和高脂饮食HFD均有相同结果)；图3中E和F：AM诱导尿离子浓度降低、但24小时尿离子排泄总量没有变化；图4中G血离子浓度没有变化，图中*，与对照组(Vehicle)比较，P<0.05。

图5中A：AM通过不同剂量(dosage，0-100mg/kg)灌胃小鼠，发现尿量(urinevolume)从2ml/24h逐步升高到接近6ml/24h。小剂量AM(5mg/kg)不引起多尿；但是从25mg/kg开始至50mg/kg均有增加，而100mg/kg与50mg/kg无差异，说明进入药物作用达到最大、不随剂量增加而药效增加。B：AM单次给药可引起多尿，尤其是第一天，并逐步恢复到正常(NC：正常对照)。

实施例3

AM诱导多尿的鉴别与分析：

AM诱导多尿，是指24h尿体积增多。要分析尿中水份增多的因素，也要查有无成分(离子)变化。尿的形成主要是肾小球过滤形成原尿(180L/24h)，肾小管重吸收99％；只有1％，约1.0-2.0L/24的终尿；因此尿量增多，首先得从水重吸收分析，水重吸收重点是AVP(来源于垂体)介导肾小管上皮细胞管腔侧AQP2(水通道蛋白)来重吸收水分。必须采用排除法，排出以下情况：

1.垂体性尿崩症(腺垂体少分泌或不分泌AVP)：本发明采用注射外源性的AVP没有阻断AM多尿的作用，基因检测垂体AVP合成增加，说明不是垂体分泌AVP减少引起的；可排除；

2.甲状腺功能亢进症：必须有明显消瘦、多食、多汗、烦躁、突眼、甲状腺肿大，此动物灌胃后没有出现此表型，且甲亢很少多饮、多尿增加4倍；可排除；

3.原发性醛固酮增多症：原发醛固酮性增多症应有高血钠、低血钾，高血压，经研究没有发现上述表型(血压结果未列出)；可排除；

4.肾小管浓缩功能不全：包括各种肾小管酸中毒，失盐性肾炎；但这些疾病均是肾小管上皮细胞对离子(Na⁺、HCO₃ ^-)转运、重吸收异常引起，多伴有严重的酸碱平衡紊乱、血电解质紊乱、24h尿电解质大量丢失；数据无上述异常，可排除；

5.糖尿病：有消瘦、多饮、多尿症状；AM已有文献证实不会引起血糖升高；相反，AM可以降低血糖、血脂、减少体重，治疗肥胖、脂肪肝等代谢综合征；可排除；

6.急性肾衰多尿期：急性肾衰(含药物引起)早期多伴有短期1-2周的多尿、然后发展为少尿、尿毒症(血肌酐、尿素氮增加)、死亡；AM长期灌胃是持续性多尿，血肌酐、尿素氮未见异常(结果未列出)，未见大量死亡；可排除；

7.精神性烦渴：多有精神性因素(焦虑)引起多饮，从而引起水利尿、多尿；治疗上完全可以通过禁水，使得尿量减少和尿渗透压升高；本研究没有发现小鼠好争斗、喜动等表型；禁水后依然可见AM引起的多尿、低渗尿；故可排除；

8.肾性尿崩症：主要遗传或药物因素拮抗AVP作用于肾小管和集合管上皮细胞，引起AQPs对水重吸收减少，多伴有下丘脑AVP代偿性分泌增多。这是本专利重点发现AM利尿作用的机制。

实施例4

AM诱导多尿的内在机制探讨：

1.图6A和B：持续AM灌胃(25mg/kg)12周后(每天灌胃一次)处理小鼠，取下丘脑和肾脏髓质部，提取RNA，用qPCR检测mRNA表达；基因检测(qPCR法)发现，AM可以明显增加下丘脑的AVP(抗利尿激素)mRNA表达(增加6倍)，提示下丘脑可能有代偿性的AVP合成增加(如图6A)；而IKKε、TBK1的mRNA不仅没有下降，反而上升(AM可能无法通过血脑屏障，图中IKKε/TBK1的变化为继发性改变)；图6B：肾脏的AQPs(水通道蛋白家族，包括AQP1、AQP2、AQP3、AQP4)和AVP受体2(V2R)均有明显下降，说明肾脏的水重吸收明显减少。

2.图7A和B：持续AM灌胃(25mg/kg)1周后(每天灌胃一次)处理小鼠，同时注射外源性AVP(去氨加压素ddAVP，1.0μg/kg腹腔注射，Sigma公司)无法逆转AM诱导的多尿和尿渗透压下降，AM灌胃+AVP注射的小鼠依然多尿(图7A)、低比重尿(图7B)。说明AM可以拮抗外源性AVP的作用。

3.图8：禁水实验(给AM灌胃25mg/kg一次性，然后后禁水12h)发现，对照组禁水后尿渗透压明显上升，AM组尿渗透压没有变化。由于禁水后，小鼠内源性的AVP(下丘脑分泌)会大量分泌，导致水重吸收增加，尿量减少，尿比重增加。但是AM灌胃后尿比重依然很低，说明AM可以拮抗内源性AVP的作用。

总之，AM诱导多尿的内在机制在于抑制肾脏AQPs和水的重吸收，且对AVP抵抗。

实施例5

AM诱导多尿的安全性(器官、组织形态学、生存率)证据：

1.图9.对比Veh(对照溶剂)，AM组(持续灌胃12周，25mg/kg，每天灌胃一次)的小鼠肾脏组织病理图(镜下观察苏木精-伊红染色(HE染色)，放大倍数从左到右依次为40倍、100倍、200倍、400倍)，可肾小管、集合管均有明显扩张，说明肾小管中原尿的流速增加；肾小球无变化。

2.图10.对比Veh(对照溶剂)，AM组(持续灌胃12周，25mg/kg，每天灌胃一次)对器官的大体观图片，发现心脏、肝脏、肾脏大体观没有变化。提示AM及其配方溶剂是低毒的。

3.图11.对比Veh(对照溶剂)，AM组(持续灌胃12周，25mg/kg，每天灌胃一次)的器官(心脏、肝脏、肾脏)称重，发现组间的器官重/体重比没有差异。提示AM及其配方溶剂是低毒的。

4.图12，对比Veh(对照溶剂)与AM组(持续灌胃12周，25mg/kg，每天灌胃一次)(均为12只鼠)的实验过程中分别统计死亡只数，做生存曲线，发现两种处理方法的生存率没有统计学差异。提示AM及其配方溶剂是低毒的。

Claims

1.一种氨来呫诺在制备诱导出现多尿、低渗透尿、尿离子浓度降低的药物上的用途。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的氨来呫诺在制备诱导肾脏对AVP受体拮抗剂的药物上的应用。

3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的氨来呫诺在制备诱导肾脏对AQPs受体拮抗剂的药物上的应用。

4.根据权利要求1或2或3所述的用途，其特征在于，活性成分为氨来呫诺，其用量为25-50mg/kg。

5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述的药物为水溶液制剂。

6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，药物的水溶液配制方法为，将氨来呫诺溶于Tris.HCl缓冲液中，采用Tris碱与浓盐酸滴定到pH 7.2-7.5，再加双重水，最后调混合溶液pH为7.2-7.5，即可制备得到药物的水溶液。

7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述的药物的水溶液在0℃-4℃保存一周，-15℃~-20℃保存至少1个月。

8.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，Tris.HCl缓冲液的质量浓度为2-4g/L、Tris.HCL与双重水的质量比为1-1.5:4；药物水溶液的质量浓度为3-8g/L。

9.根据权利要求6所述的用途，其特征在于：药物的水溶液使用时再次析出，采用Tris碱与浓盐酸调pH至7.2-7.5。

10.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，氨来呫诺采用直接灌胃或口服方式进行诱导。