CN110093342A - 一种从石蜡包埋组织切片提取核酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种从石蜡包埋组织切片提取核酸的方法，1、包括以下步骤：S1，石蜡包埋切片；S2，裂解：将S1中备用的切片组织取出，向组织切片中加入新型裂解液，组织切片和新型裂解液的体积比为1：50～100，在65～75℃的温度下混合摇匀10～15min后，对其进行离心分层，分层后静置，取静置后的中间层，得到混合液；S3，结合；S4，洗涤；S5，洗脱。本发明使用新型裂解液对切片组织进行核酸的裂解，可以充分、有效地裂解细胞，加快裂解进程，同时，保护核酸免受氧化，避免DNA自身二聚体形成；具有用时短、提取效率高，且提取质量高的特点，适用于推广使用。
Description
技术领域
本发明涉及核酸提取领域，尤其涉及一种从石蜡包埋组织切片提取核酸的方法。
背景技术
核酸包括脱氧核糖核酸(RNA)和核糖核酸(DNA)两类，是一切生物体的遗传物质，在细胞主要存在于细胞核内，在病毒存在于病毒衣壳内。细胞是生物体的结构和功能的基本单位，已知除病毒之外的所有生物均由细胞所组成，但病毒生命活动也必须在细胞中才能体现。以核酸为研究对象的生物技术，包括对核酸的提取、克隆、扩增、检测、测序等一系列技术，对于核酸的提取，相对于传动的二甲苯脱蜡、蛋白酶溶液K孵育的等方法，磁珠法的提取方式具有提取时间短、操作简单，能够实现大批量操作的优点，磁珠法核酸提取一般可以分为四步：裂解—结合—洗涤—洗脱。
利用磁珠法进行核酸的提取时，裂解液大多直接加入石蜡包埋组织切片中，裂解时间较长，费时，裂解液中的核酸量也有限，影响最终提取核酸的纯度和浓度，无法后续研究和试验的要求，而且由于 RNA相对于DNA较难提取，为此我们设计出了一种从石蜡包埋组织切片提取核酸的方法来解决以上问题。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种从石蜡包埋组织切片提取核酸的方法。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
一种从石蜡包埋组织切片提取核酸的方法，包括以下步骤：
S1，石蜡包埋切片：将石蜡包埋组织放在石蜡切片机上进行切片，切片组织的片厚为3～7μm，切片组织漂浮于摊片机内的温水上，将组织展平，并用载玻片将待提取的组织捞起，放入烘箱中烘烤，待水分烘干后取出，作为待测样品常温保存留作备用；
S2，裂解：将S1中备用的切片组织取出，向组织切片中加入新型裂解液，组织切片和新型裂解液的体积比为1：1.0～1.3，在65～ 75℃的温度下混合摇匀10～15min后，对其进行离心分层，分层后静置，取静置后的中间层，得到混合液；
S3，结合：向S2中的混合液中加入磁珠结合液和纳米磁珠，磁珠结合液与裂解液的体积比为1：1.1～1.5，纳米磁珠和裂解液的体积比为10:1，在外部磁场的作用下，得到磁珠-核酸复合物；
S4，洗涤：向S3中的磁珠-核酸复合物中加入洗涤液，洗涤液与裂解液的体积比1：2.2～2.5，为离心转动下去除磁珠-核酸复合物上的杂质；
S5，洗脱：向S4中洗涤后的磁珠-核酸复合物中加入洗脱液，洗脱液与裂解液的体积比1：2.1～2.3，于52～56℃的温度下洗脱3～ 5min,使核酸从磁珠表面解吸附并进入洗脱液中，通过磁力作用使离心管内磁珠紧贴于离心管壁，转移洗脱液至新的离心管内，得到高质量的核酸。
优选的，所述S3中的新型裂解液由二硫苏糖醇溶液、异硫氰酸胍、CTAB、EDTA和氯化钾组成，各个组分混合后，二硫苏糖醇溶液、异硫氰酸胍、CTAB、EDTA、氯化钾在新型裂解液中的最终浓度分别为： 3×10-3～12×10-3mol/L、1～5mol/L、2×10-3～5×10-3mol/L、5×10-3～ 15×10-3mol/L、0.2～1.2mol/L。
优选的，所述S2和S4中离心的速度为11000～12000r/min。
优选的，所述S3中的新型裂解液由二硫苏糖醇溶液、异硫氰酸胍、CTAB、EDTA和氯化钾组成，各个组分混合后，二硫苏糖醇溶液、异硫氰酸胍、CTAB、EDTA、氯化钾在新型裂解液中的最终浓度分别为： 8×10-3mol/L、2mol/L、1.8×10-3mol/L、10×10-3mol/L、0.8mol/L。
优选的，所述S3中的新型裂解液由二硫苏糖醇溶液、异硫氰酸胍、CTAB、EDTA和氯化钾组成，各个组分混合后，二硫苏糖醇溶液、异硫氰酸胍、CTAB、EDTA、氯化钾在新型裂解液中的最终浓度分别为： 6×10-3mol/L、3mol/L、2.6×10-3mol/L、12×10-3mol/L、0.6mol/L。
优选的，所述S3中的新型裂解液pH值为6.0～7.5。
优选的，所述S4中的洗涤液由EDTA、蛋白酶和乙醇组成，各个组分混合后，EDTA、蛋白酶、乙醇在洗涤液中的最终浓度分别为3× 10-3～8×10-3mol/L、5×10-3～9×10-3mol/L、10×10-3～13× 10-3mol/L。
优选的，所述S4中的洗涤液由EDTA、蛋白酶和乙醇组成，各个组分混合后，EDTA、蛋白酶、乙醇在洗涤液中的最终浓度分别为：5 ×10-3mol/L、7×10-3mol/L、12×10-3mol/L。
优选的，所述S4中洗涤液的pH值为6.0～6.5。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、本发明通过离心洗涤去除磁珠-核酸复合物上的杂质，可以减少洗涤次数、缓冲液的使用和核酸的流失，节省能源，提高核酸提取的质量和效率；
2、本发明使用新型裂解液对切片组织进行核酸的裂解，可以充分、有效地裂解细胞，加快裂解进程，同时，保护核酸免受氧化，避免DNA自身二聚体形成；
3、本发明使用的提取方法，具有用时短、提取效率高，且提取质量高的特点，适用于推广使用。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
实施例一
一种从石蜡包埋组织切片提取DNA的方法，包括以下步骤：
S1，石蜡包埋切片：将石蜡包埋组织放在石蜡切片机上进行切片，切片组织的片厚为4μm，切片组织漂浮于摊片机内的温水上，将组织展平，并用载玻片将待提取的组织捞起，放入烘箱中烘烤，待水分烘干后取出，作为待测样品常温保存留作备用；
S2，裂解：将S1中备用的切片组织取出，加入新型裂解液，新型裂解液由二硫苏糖醇溶液、异硫氰酸胍、CTAB、EDTA和氯化钾组成，各个组分混合后，二硫苏糖醇溶液、异硫氰酸胍、CTAB、EDTA、氯化钾在新型裂解液中的最终浓度分别为：4×10-3mol/L、2mol/L、2 ×10-3mol/L、5×10-3mol/L、0.4mol/L氯化钾，新型裂解液pH值为 6.5，裂解液和新型裂解液的体积比为1：1.0，在65℃的温度下混合摇匀15min后，对其进行离心分层，分层后静置，取静置后的中间层，得到混合液；
S3，结合：向S2中的混合液中加入磁珠结合液和纳米磁珠，磁珠结合液与裂解液的体积比为1：1.1，纳米磁珠和裂解液的体积比为10:1，在外部磁场的作用下，得到磁珠-DNA复合物；
S4，洗涤：向S3中的磁珠-DNA复合物中加入洗涤液，洗涤液由 EDTA、蛋白酶和乙醇组成，各个组分混合后，EDTA、蛋白酶、乙醇在洗涤液中的最终浓度分别为：3×10-3mol/L、5×10-3mol/L、10× 10-3mol/L，S4中洗涤液的pH值为6.0，去除磁珠-DNA复合物上的杂质；
S5，洗脱：向S4中洗涤后的磁珠-DNA复合物中加入洗脱液，洗脱液与裂解液的体积比1：2.1，在52℃的温度加热洗脱5min,使DNA 从磁珠表面解吸附并进入洗脱液中，通过磁力作用使离心管内磁珠紧贴于离心管壁，转移洗脱液至新的离心管内，得到高质量的DNA。
实施例二
一种从石蜡包埋组织切片提取DNA的方法，包括以下步骤：
S1，石蜡包埋切片：将石蜡包埋组织放在石蜡切片机上进行切片，切片组织的片厚为5μm，切片组织漂浮于摊片机内的温水上，将组织展平，并用载玻片将待提取的组织捞起，放入烘箱中烘烤，待水分烘干后取出，作为待测样品常温保存留作备用；
S2，裂解：将S1中备用的切片组织取出，加入新型裂解液，新型裂解液由二硫苏糖醇溶液、异硫氰酸胍、CTAB、EDTA和氯化钾组成，各个组分混合后，二硫苏糖醇溶液、异硫氰酸胍、CTAB、EDTA、氯化钾在新型裂解液中的最终浓度分别为：6×10-3mol/L、3mol/L、3 ×10-3mol/L、12×10-3mol/L、0.6mol/L，新型裂解液pH值为6.5，裂解液和新型裂解液的体积比为1：1.2，在68℃的温度下混合摇匀 13min后，对其进行离心分层，分层后静置，取静置后的中间层，得到混合液；
S3，结合：向S2中的混合液中加入磁珠结合液和纳米磁珠，磁珠结合液与裂解液的体积比为1：1.2，纳米磁珠和裂解液的体积比为10:1，在外部磁场的作用下，得到磁珠-DNA复合物；
S4，洗涤：向S3中的磁珠-DNA复合物中加入洗涤液，洗涤液由 EDTA、蛋白酶和乙醇组成，各个组分混合后，EDTA、蛋白酶、乙醇在洗涤液中的最终浓度分别为：4×10-3mol/L、6×10-3mol/L、11× 10-3mol/L，S4中洗涤液的pH值为6.0，去除磁珠-DNA复合物上的杂质；
S5，洗脱：向S4中洗涤后的磁珠-DNA复合物中加入洗脱液，洗脱液与裂解液的体积比1：2.2，在54℃的温度加热洗脱4min,使DNA 从磁珠表面解吸附并进入洗脱液中，通过磁力作用使离心管内磁珠紧贴于离心管壁，转移洗脱液至新的离心管内，得到高质量的DNA。
实施例三
一种从石蜡包埋组织切片提取RNA的方法，包括以下步骤：
S1，石蜡包埋切片：将石蜡包埋组织放在石蜡切片机上进行切片，切片组织的片厚为6μm，切片组织漂浮于摊片机内的温水上，将组织展平，并用载玻片将待提取的组织捞起，放入烘箱中烘烤，待水分烘干后取出，作为待测样品常温保存留作备用；
S2，裂解：将S1中备用的切片组织取出，加入新型裂解液，新型裂解液由二硫苏糖醇溶液、异硫氰酸胍、CTAB、EDTA和氯化钾组成，各个组分混合后，二硫苏糖醇溶液、异硫氰酸胍、CTAB、EDTA、氯化钾在新型裂解液中的最终浓度分别为：8×10-3mol/L、2mol/L、4 ×10-3mol/L、10×10-3mol/L、0.8mol/L，新型裂解液pH值为6.5，裂解液和新型裂解液的体积比为1：1.2，在72℃的温度下混合摇匀 12min后，对其进行离心分层，分层后静置，取静置后的中间层，得到混合液；
S3，结合：向S2中的混合液中加入磁珠结合液和纳米磁珠，磁珠结合液与裂解液的体积比为1：1.3，纳米磁珠和裂解液的体积比为10:1，在外部磁场的作用下，得到磁珠-RNA复合物；
S4，洗涤：向S3中的磁珠-RNA复合物中加入洗涤液，洗涤液由 EDTA、蛋白酶和乙醇组成，各个组分混合后，EDTA、蛋白酶、乙醇在洗涤液中的最终浓度分别为：5×10-3mol/L、8×10-3mol/L、12× 10-3mol/L，S4中洗涤液的pH值为6.5，去除磁珠-RNA复合物上的杂质；
S5，洗脱：向S4中洗涤后的磁珠-RNA复合物中加入洗脱液，洗脱液与裂解液的体积比1：2.3，在55℃的温度加热洗脱3min,使RNA 从磁珠表面解吸附并进入洗脱液中，通过磁力作用使离心管内磁珠紧贴于离心管壁，转移洗脱液至新的离心管内，得到高质量的RNA。
实施例四
一种从石蜡包埋组织切片提取RNA的方法，包括以下步骤：
S1，石蜡包埋切片：将石蜡包埋组织放在石蜡切片机上进行切片，切片组织的片厚为7μm，切片组织漂浮于摊片机内的温水上，将组织展平，并用载玻片将待提取的组织捞起，放入烘箱中烘烤，待水分烘干后取出，作为待测样品常温保存留作备用；
S2，裂解：将S1中备用的切片组织取出，加入新型裂解液，新型裂解液由二硫苏糖醇溶液、异硫氰酸胍、CTAB、EDTA和氯化钾组成，各个组分混合后，二硫苏糖醇溶液、异硫氰酸胍、CTAB、EDTA、氯化钾在新型裂解液中的最终浓度分别为：12×10-3mol/L、5mol/L、 5.0×10-3mol/L、10×10-3mol/L、1.2mol/L，新型裂解液pH值为6.0，裂解液和新型裂解液的体积比为1：1.3，在75℃的温度下混合摇匀 10min后，对其进行离心分层，分层后静置，取静置后的中间层，得到混合液；
S3，结合：向S2中的混合液中加入磁珠结合液和纳米磁珠，磁珠结合液与裂解液的体积比为1：1.4，纳米磁珠和裂解液的体积比为10:1，在外部磁场的作用下，得到磁珠-RNA复合物；
S4，洗涤：向S3中的磁珠-RNA复合物中加入洗涤液，洗涤液由 EDTA、蛋白酶和乙醇组成，各个组分混合后，EDTA、蛋白酶、乙醇在洗涤液中的最终浓度分别为：8×10-3mol/L、9×10-3mol/L、13× 10-3mol/L，S4中洗涤液的pH值为6.5，去除磁珠-RNA复合物上的杂质；
S5，洗脱：向S4中洗涤后的磁珠-RNA复合物中加入洗脱液，洗脱液与裂解液的体积比1：2.3，在56℃的温度加热洗脱3min,使RNA 从磁珠表面解吸附并进入洗脱液中，通过磁力作用使离心管内磁珠紧贴于离心管壁，转移洗脱液至新的离心管内，得到高质量的RNA。
通过上述方法可制得高质量DNA/RNA，且操作简单，用时短，可推广使用。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种从石蜡包埋组织切片提取核酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1，石蜡包埋切片：将石蜡包埋组织放在石蜡切片机上进行切片，切片组织的片厚为3～7μm，切片组织漂浮于摊片机内的温水上，将组织展平，并用载玻片将待提取的组织捞起，放入烘箱中烘烤，待水分烘干后取出，作为待测样品常温保存留作备用；
S2，裂解：将S1中备用的切片组织取出，向组织切片中加入新型裂解液，组织切片和新型裂解液的体积比为1：50～100，在65～75℃的温度下混合摇匀10～15min后，对其进行离心分层，分层后静置，取静置后的中间层，得到混合液；
S3，结合：向S2中的混合液中加入磁珠结合液和纳米磁珠，磁珠结合液与裂解液的体积比为1：1.1～1.5，纳米磁珠和裂解液的体积比为10:1，在外部磁场的作用下，得到磁珠-核酸复合物；
S4，洗涤：向S3中的磁珠-核酸复合物中加入洗涤液，洗涤液与裂解液的体积比1：2.2～2.5，为离心转动下去除磁珠-核酸复合物上的杂质；
S5，洗脱：向S4中洗涤后的磁珠-核酸复合物中加入洗脱液，洗脱液与裂解液的体积比1：2.1～2.3，于52～56℃的温度下洗脱3～5min,使核酸从磁珠表面解吸附并进入洗脱液中，通过磁力作用使离心管内磁珠紧贴于离心管壁，转移洗脱液至新的离心管内，得到高质量的核酸。
2.根据权利要求1所述的一种从石蜡包埋组织切片提取核酸的方法，其特征在于，所述S3中的新型裂解液由二硫苏糖醇溶液、异硫氰酸胍、CTAB、EDTA和氯化钾组成，各个组分混合后，二硫苏糖醇溶液、异硫氰酸胍、CTAB、EDTA、氯化钾在新型裂解液中的最终浓度分别为：3×10-3～12×10-3mol/L、1～5mol/L、2×10-3～5×10-3mol/L、5×10-3～15×10-3mol/L、0.2～1.2mol/L。
3.根据权利要求1所述的一种从石蜡包埋组织切片提取核酸的方法，其特征在于，所述S2和S4中离心的速度为11000～12000r/min。
4.根据权利要求1所述的一种从石蜡包埋组织切片提取核酸的方法，其特征在于，所述S3中的新型裂解液由二硫苏糖醇溶液、异硫氰酸胍、CTAB、EDTA和氯化钾组成，各个组分混合后，二硫苏糖醇溶液、异硫氰酸胍、CTAB、EDTA、氯化钾在新型裂解液中的最终浓度分别为：8×10-3mol/L、2mol/L、1.8×10-3mol/L、10×10-3mol/L、0.8mol/L。
5.根据权利要求1所述的一种从石蜡包埋组织切片提取核酸的方法，其特征在于，所述S3中的新型裂解液由二硫苏糖醇溶液、异硫氰酸胍、CTAB、EDTA和氯化钾组成，各个组分混合后，二硫苏糖醇溶液、异硫氰酸胍、CTAB、EDTA、氯化钾在新型裂解液中的最终浓度分别为：6×10-3mol/L、3mol/L、2.6×10-3mol/L、12×10-3mol/L、0.6mol/L。
6.根据权利要求1所述的一种从石蜡包埋组织切片提取核酸的方法，其特征在于，所述S3中的新型裂解液pH值为6.0～7.5。
7.根据权利要求1所述的一种从石蜡包埋组织切片提取核酸的方法，其特征在于，所述S4中的洗涤液由EDTA、蛋白酶和乙醇组成，各个组分混合后，EDTA、蛋白酶、乙醇在洗涤液中的最终浓度分别为3×10-3～8×10-3mol/L、5×10-3～9×10-3mol/L、10×10-3～13×10- 3mol/L。
8.根据权利要求1所述的一种从石蜡包埋组织切片提取核酸的方法，其特征在于，所述S4中的洗涤液由EDTA、蛋白酶和乙醇组成，各个组分混合后，EDTA、蛋白酶、乙醇在洗涤液中的最终浓度分别为：5×10-3mol/L、7×10-3mol/L、12×10-3mol/L。
9.根据权利要求1所述的一种从石蜡包埋组织切片提取核酸的方法，其特征在于，所述S4中洗涤液的pH值为6.0～6.5。
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