CN110093332A

CN110093332A - 一种纤维素酶突变体及其高产菌株

Info

Publication number: CN110093332A
Application number: CN201810091774.8A
Authority: CN
Inventors: 刘艳萍; 张青; 许丽红; 吴佳鹏; 黄亦钧; 王华明
Original assignee: Weifang Kdn Biotech Co ltd; Qingdao Vland Biotech Group Co Ltd
Current assignee: Weifang Kdn Biotech Co ltd; Qingdao Vland Biotech Group Co Ltd
Priority date: 2018-01-30
Filing date: 2018-01-30
Publication date: 2019-08-06
Anticipated expiration: 2038-01-30
Also published as: CN113717864A; CN113717864B; CN110093332B

Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，具体提供了一种纤维素酶突变体及其高产菌株。所述纤维素酶突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO：3，其一种编码基因的核酸序列为SEQ ID NO：4。本发明还提供了一种里氏木霉突变菌株，其保藏编号为CCTCC NO:M2017841。本发明提供的纤维素酶突变体的最适作用温度为60℃，最适作用pH为6.0，且在pH 5.5‑7.0范围内均能保持80％以上的酶活水平。与野生型纤维素酶NCE4相比，纤维素酶突变体的耐热性得到显著提高。

Description

一种纤维素酶突变体及其高产菌株

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种纤维素酶突变体及其高产菌株。

背景技术

纤维素酶是将纤维素水解成葡萄糖的一组酶的总称，它不是单种酶，主要包括三个组分：内切葡聚糖酶(Endoglucanase，EG)、纤维二糖水解酶(Cellobiohydrolase，CBH)和β-葡萄糖苷酶(β-glucosidases)。纤维素酶在降解纤维素的过程中，三种酶发挥了协同催化的作用。纤维素酶的应用领域是十分广泛的，涉及纺织、酿造、食品、造纸、饲料等，不同的应用领域对纤维素酶各组分的需求也是不同的。在适当的条件下，它们协同作用，将天然纤维素水解成葡萄糖。

上世纪80年代末，纤维素酶作为一种生物酶制剂开始进入纺织行业，而且得到了迅速的发展。纤维素酶用于纺织工业具有许多的优点：首先，作为一种生物催化剂，它无毒无害；其次，处理需要的条件比较温和，且酶的用量少；最后，处理反应后的废水无污染，可以节约能量。

纤维素酶能作用于天然或再生纤维素纤维，包括棉、麻、竹纤维、构木纤维、粘胶纤维、铜氨纤维和Lyocell纤维等，纤维素酶对织物减量处理后，可去掉织物表面茸毛，使织物光洁、明亮、柔软，打光并减少起球现象。根据处理的目的不同，可进行生物抛光、柔软减量、改善光泽以及石磨水洗等加工。

纤维素酶是多种酶的混合物，酶成分的表征对于了解和控制酶整理的效果是必不可少的。从目前研究结果看，EGⅡ酶在减量处理、生物抛光处理、水洗和石磨处理性能均十分优良，是非常重要的纤维素酶组分。同时，温度、PH值、表面活性剂、无机盐、机械搅拌、超声波协同等因素都会影响纤维素酶处理的效果。因此，对不同的纤维素酶品种，不同的纤维要选择合理的工艺条件，才能使酶处理的效果最佳。

目前在许多相关的研究中，为了得到更佳的酶，除了从自然界中筛选出来之外，就是将现有的酶蛋白加以改造。目前主要有两大改造策略，其一是随机突变或将酶基因随机排列，在特定的作用条件下，筛选出更符合其作用条件的酶蛋白。另一种改造策略则是通过研究酶结构与作用机制找出对于酶活性或特性具有关键性的氨基酸，并针对这些特定氨基酸进行突变并测试，进而得到功能性更强的改造酶蛋白。

本发明通过定点突变的方式获得一种耐温性能得到显著提高的纤维素酶突变体，以满足纤维素酶在纺织工业中的应用需求。

发明内容

本发明的目的是提供一种纤维素酶突变体及其高产菌株。本发明通过对来源于特异腐质霉(Humicola insolens)的纤维素酶NCE4进行蛋白质工程改造，获得了突变体蛋白，其在纺织除毛和水洗中的应用效果得到显著的提升，其热稳定性也得到明显提高，可广泛应用于纺织工业领域。

本发明一方面提供了一种纤维素酶突变体，是氨基酸序列为SEQ ID NO：1的纤维素酶的第219-235位氨基酸发生缺失。

上述纤维素酶突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO：3，其一种编码基因的核酸序列为SEQ ID NO：4。

本发明另一方面提供了携带有上述纤维素酶突变体基因的重组质粒。

本发明还涉及一种里氏木霉(Trichoderma reesei)工程菌株，其携带有上述的重组质粒。

本发明还提供另一种里氏木霉工程菌株，是以上述里氏木霉工程菌为出发菌株，通过过量表达转录正调控因子Hap2得到的；所述转录正调控因子Hap2的基因序列为SEQ IDNO：5。

本发明还进一步提供了一种里氏木霉突变菌株，是以超量表达转录正调控因子Hap2的里氏木霉工程菌株为出发菌株，通过紫外诱变方法筛选获得的。

所述突变菌，其中一株为里氏木霉H2V-3(Trichoderma reeseiH2V-3)株，已于2017年12月25日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:M2017841。

所述里氏木霉突变菌株在发酵生产纤维素酶中的应用。

本发明提供的纤维素酶突变体的最适作用温度为60℃，最适作用pH为6.0，且在pH5.5-7.0范围内均能保持80％以上的酶活水平。与野生型纤维素酶NCE4相比，纤维素酶突变体的耐热性得到显著提高，在37℃条件下存放3个月后，蛋白结构稳定，未发生降解，有利于长期储存，并在实际应用中保持效力的延续性。所述纤维素酶突变体除毛干净，对织物强力损失小；牛仔水洗，起花小，花点较小的批差稳定，可广泛应用于纺织加工领域。而且在pH5.0-8.0范围内，相同蛋白含量的纤维素酶突变体，其除毛和起花的应用效果为野生型纤维素酶NCE4的1.5倍，能大大减少酶的添加量，节约成本，增加经济效益。

此外，本发明通过紫外诱变筛选获得一株高产上述纤维素酶突变体的突变菌株里氏木霉H2V-3。与出发菌里氏木霉KDNE-DH相比，所述突变菌的发酵上清液酶活提高了35.3％，蛋白含量提高了36.4％，而且该突变菌的菌落形态发生显著变化，菌丝分支和菌丝的蛋白分泌顶端明显增多，有利于胞外蛋白的大量分泌，可广泛应用于纤维素酶的生产，降低生产成本。

附图说明

图1：纤维素酶突变体KDNE-D与野生型纤维素酶NCE4于37℃放置3个月后SDS-PAGE电泳图比较；

图2：突变菌里氏木霉H2V-3与出发菌里氏木霉KDNE-DH的菌落和发酵菌丝体形态比较。

具体实施方式

本发明用到了遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法，例如MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL,3nd Ed.(Sambrook,2001)和CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(Ausubel,2003)中所记载的方法。这些一般性参考文献提供了本领域技术人员已知的定义和方法。但是，这并不意味着将本发明限定于所述的任何具体方法、实验方案和试剂，因为它们可以改变。

下面结合具体实施方式对本发明进行详细描述。

实施例1纤维素酶基因的克隆

为了提高野生型纤维素酶NCE4(氨基酸序列为SEQ ID NO:1，编码核苷酸序列为SEQ ID NO:2)的耐热性，提高蛋白质的结构刚性，申请人对该酶的氨基酸位点进行了大量的点突变、插入和缺失改造筛选。其中有些改造使突变体的耐热性降低了，有些改造使突变体的耐热性未发生明显变化，有些改造虽然使突变体的耐热性提高，但酶学性质变差，不适用于工业生产。最终，申请人筛选到了一种热稳定性得到显著提高，而酶学性质又没有发生明显变化的纤维素酶变体。所述突变体与野生型纤维素酶NCE4相比，第219-235位氨基酸发生缺失。

申请人将该突变体命名为KDNE-D，其氨基酸序列为SEQ ID NO:3，其编码核苷酸序列为SEQ ID NO:4。

以野生型纤维素酶NCE4基因为模板，设计引物NCE4-F(含KpnI酶切位点)及R1，PCR扩增得到上游片段；

NCE4-F：CGGGGTACCATGCGTTCCTCCCCCCTC(KpnI)

R1:TGGACTGGCGGGCTCGAGCTGGTGCTGCTGGAGG

以引物F1及NCE4-R(含MluI酶切位点)，PCR扩增得到下游片段；

F1:CCTCCAGCAGCACCAGCTCGAGCCCGCCAGTCCA

NCE4-R:CGACGCGTCTACAGGCACTGATGATACCAG(MluI)

分别以扩增得到的上游片段和下游片段为模板，以NCE4-F及NCE4-R为引物，进行融合PCR扩增，获得的核酸片段即为纤维素酶突变体KDNE-D的基因序列。

野生型纤维素酶NCE4的核酸序列由上海生工生物工程股份有限公司完成，其核苷酸序列为SEQ ID NO:2。

实施例2纤维素酶突变体的表达

2.1重组载体的构建

将合成后的纤维素酶突变体基因片段和和pSC1G载体分别用限制性内切酶KpnI和MluI(Fermentas)进行酶切，使用凝胶纯化试剂盒将酶切产物纯化，并用T4DNA连接酶(Fermentas)将上述两个酶切产物连接并转化大肠杆菌Trans5α(Transgen)，用氨苄青霉素进行选择，并对克隆进行测序(Invitrogen)验证。测序正确后，即得到含有纤维素酶突变体基因的重组载体pSC1G-KDNE-D。

采用上述同样方法构建得到含有野生型纤维素酶NCE4基因的重组载体pSC1G-NCE4。

2.2重组菌株的构建及筛选

(1)原生质体制备

接种里氏木霉菌丝于PDA平板(马铃薯200-300克，葡萄糖20克，琼脂15-20克，自来水1000毫升，自然pH)上，30℃培养6天；待其产孢丰富后，切取约1cm×1cm的菌落置于含120mL YEG+U(0.5％酵母粉、1％葡萄糖、0.1％尿苷)的液体培养基中，30℃，220rpm振荡培养14～16h；

多层纱布过滤收集菌丝，并用无菌水清洗一次；将菌丝体置于含有20mL10mg/mL裂解酶液(Sigma L1412)的三角瓶中，30℃，90rpm作用1-2h；用显微镜观察检测原生质体转化进展；

将预冷的20mL 1.2M山梨醇(1.2M山梨醇，50mM Tris-Cl，50mM CaCl₂)加入上述三角瓶中，轻轻摇匀，用无菌Miracloth滤布过滤收集滤液，3000rpm，4℃离心10min；弃上清，加入预冷的5mL1.2M山梨醇溶液悬浮菌体，3000rpm，4℃离心10min；弃上清，加入适量预冷的1.2M山梨醇悬浮分装(200μL/管，原生质体浓度为10⁸个/mL)。

(2)PEG介导的原生质体转化与菌株验证

以下操作均在冰上进行，将10μg重组载体加入到200μL上述原生质体溶液中，接着加入50μL25％PEG轻轻混匀，温和混匀后在冰上放置20min，然后加入1mL25％PEG，轻轻混匀，室温静置5min，然后加入2mL25％PEG溶液和4mL1.2M山梨醇溶液，温和混匀各管，把混合物轻轻加到50mL左右且熔化后冷却至45-55℃的转化上层培养基中(0.1％MgSO₄，1％KH₂PO₄，0.6％(NH₄)₂SO₄，1％葡萄糖，18.3％山梨醇，0.35％琼脂糖，0.1％微量元素(微量元素：在250mLdlH₂O中加入1g FeSO₄·7H₂O，8.8g ZnSO₄·₇H₂O，0.4g CuSO₄·5H₂O，0.15gMnSO₄·4H₂O，0.1g Na₂B₄O₇·10H₂O，50mg(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O，0.2mL浓HCl，完全溶解后用dlH₂O定容至1L))，轻轻混匀后倒入转化下层培养基平板(2％葡萄糖，0.5％(NH4)₂SO₄,1.5％KH₂PO₄,0.06％MgSO₄,0.06％CaCl₂，1.5％琼脂，0.1％微量元素)，30℃培养5～7d至转化子长出。

挑取转化子至下层培养基平板，30℃培养2d；取适量菌丝体置于2mL离心管中，加入100mg无菌石英砂和400μL抽提缓冲液(100mM Tris-HCl,100mMEDTA,250mM NaCl,1％SDS)；用珠打仪剧烈振荡2min；65℃水浴20min后，加入200μL 10M NH₄AC，冰浴10min；13000rpm离心10min；取上清，加入2倍体积的无水乙醇，-20℃放置30min；13000rpm离心10min，弃上清；用70％乙醇洗涤2次；晾干，加水溶解，于-20℃保存。

以上述提取转化子基因组DNA为模板，利用引物NCE4D-F1和NCE4D-R1进行PCR扩增目的基因进行验证。

NCE4D-F1：ATGCGTTCCTCCCCCCTC

NCE4D-R1：CTACAGGCACTGATGATACCAG；

PCR扩增条件为94℃4min；94℃40s；58℃40s，72℃1min，30个循环；72℃7min，16℃；利用凝胶回收试剂盒回收PCR扩增产物并进行测序分析，构建得到了含纤维素酶突变体KDNE-D基因的里氏木霉工程菌，将其命名为里氏木霉KDNE-D(Trichoderma reeseiKDNE-D)。

采用上述同样的方法构建得到重组表达野生型纤维素酶NCE4的里氏木霉工程菌，命名为里氏木霉NCE4(Trichoderma reesei NCE4)。

实施例3发酵验证和酶活检测

将上述构建得到的里氏木霉菌KDNE-D(Trichoderma reeseiKDNE-D)与里氏木霉NCE4(Trichoderma reesei NCE4)分别接种于MM发酵培养基(1.5％葡萄糖，1.7％乳糖，2.5％玉米浆，0.44％(NH₄)₂SO₄，0.09％MgSO₄，2％KH₂PO₄，0.04％CaCl₂，0.018％吐温-80，0.018％微量元素，0.018％聚丙二醇-2000)，30℃培养48小时，然后25℃培养72小时，分别取上清样品，测定酶活。

(1)酶活测定方法

在50℃、pH值为6.0的条件下，每分钟从浓度为5mg/ml的羟甲基纤维素钠溶液中降解释放1μmol还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位U，还原糖以葡萄糖等量。

取三支试管各加入0.5mL CMC底物，与待测酶液一起50℃水浴预热5min。在第一、二试管中各加入0.5mL待测液，并计时，50℃水浴中反应15min。反应完后在三支试管中各加入1.5mL DNS试剂，并在第三支试管总补加0.5mL的待测酶液。取出并摇匀三支试管后，在沸水浴中反应5min。迅速冷却至室温，用水定到5.0mL。以第三支试管试液为对照在540nm波长条件下测第一、二试管试液的吸光度，吸光度在0.25-0.35之间为宜。待测酶液反应液的吸光度与水平控制酶液反应液吸光度之差的绝对值不超过0.015。

酶活X＝(葡萄糖等量值/180/15/0.5)×n

其中:X——酶活力单位，IU/g(mL)；

180——葡萄糖从微克换算成微摩尔；

15——待测液与底物的反应时间；

0.5——加入反应的待测酶液量；

n——稀释倍数；

(2)酶活测定结果

采用上述方法检测上述发酵上清液的酶活，结果显示：宿主菌里氏木霉发酵上清液中几乎检测不出纤维素酶酶活，而里氏木霉NCE4发酵上清液酶活为90U/mL，分子量为43KD；里氏木霉KDNE-D发酵上清液酶活130U/mL，分子量为32KD。酶活检测结果进一步证实，本发明所选用的宿主菌本身不产纤维素酶，从而说明本发明构建的里氏木霉NCE4和里氏木霉KDNE-D能分别高效重组表达野生型纤维素酶NCE4和突变体KDNE-D。

3.1最适反应pH分析

分别用pH值为3.0、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的缓冲液稀释上述发酵上清液，在50℃条件下测定其酶活，以最高酶活为100％，计算相对酶活，做pH-相对酶活曲线。结果显示，纤维素酶突变体KDNE-D和野生型纤维素酶NCE4的最适作用pH均为6.0，且在pH 5.5-7.0范围内均能保持80％以上的酶活水平。

3.2最适反应温度分析

分别在30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃，pH 6.0条件下，进行纤维素酶酶活测定，以最高酶活为100％，计算相对酶活，做温度-相对酶活曲线。结果显示：与野生型纤维素酶NCE4相比，纤维素酶突变体KDNE-D的最适反应温度没有发生改变，最适反应温度均为60℃。

3.3耐热性分析

将上述发酵上清液在37℃条件下存放3个月后，分别进行SDS-PAGE电泳检测分析，同时以在-80℃条件下存放3个月的发酵上清液作为对照组。结果如图1所示，与对照组相比，野生型纤维素酶NCE-+4在37℃条件下存放3个月后，结构不稳定，蛋白质发生降解，由43KD降解为23KD；而纤维素酶突变体KDNE-D在37℃条件下存放3个月后，结构稳定，蛋白质未发生降解。从而说明，本发明提供的纤维素酶突变体KDNE-D具有更好的耐热性，更有利于该酶的长期储存，并在实际应用中保持效力的延续性。

实施例4里氏木霉KDNE-D的基因工程改造

申请人以实施例2构建得到的重组表达纤维素酶突变体KDNE-D的工程菌里氏木霉KDNE-D为出发菌株，通过过量表达转录正调控因子Hap2，提高纤维素酶KDNE-D基因的转录水平，进一步筛选获得产酶水平得到显著提高的里氏木霉工程菌株。

4.1诱变宿主

将出发菌里氏木霉KDNE-D接种于PDA平板上，30℃恒温培养7天，待孢子成熟后，用5ml无菌水洗刷孢子，制备孢子悬液浓度至10⁶个/ml。

取100ul上述孢子悬液均匀涂布于含5-氟乳清酸的PDA平板上(其中5-氟乳清酸浓度为1g/L)，30℃恒温培养4-5天，挑取同一个菌落分别接种于不含尿苷的转化下层平板和含有尿苷的转化下层平板上(其中尿苷浓度为1g/L)，30℃恒温培养2天，挑取在转化下层平板上不生长而在含有尿苷的转化下层平板上生长的菌落，接种于含有尿苷的PDA平板上(其中尿苷浓度为1g/L)，30℃恒温培养6-7天至稳定期，待孢子成熟后，切取1cm×1cm的小块于MM发酵培养基，30℃培养48小时，然后25℃培养72小时，培养结束后，分别离心取上清进行酶活检测(检测方法参考实施例3)。根据检测结果，筛选出纤维素酶酶活最高的菌株，命名为里氏木霉KDNE-DU(Trichoderma reesei KDNE-DU)，作为宿主用于后续基因的转化。

4.2基因工程菌株构建与筛选

转录正调控因子Hap2的核酸序列由上海生工生物工程股份有限公司合成，其核苷酸序列为SEQ ID NO:5。

将合成后的Hap2基因片段和pdc4载体分别用限制性内切酶KpnI和XbaI进行酶切，酶切产物纯化，T4DNA连接酶连接转化大肠杆菌Trans5α，用氨苄青霉素进行选择，并对克隆进行测序验证。测序正确后，即得到含有Hap2基因的过量表达载体pdc4-Hap2。

以里氏木霉KDNE-DU为宿主，转化过量表达载体pdc4-Hap2，筛选并提取转化子基因组DNA，(原生质体转化方法和转化子基因组DNA提取方法参考实施例2)。以上述提取转化子基因组DNA为模板，利用引物pdc4-F和pdc4-R进行PCR扩增目的基因进行验证。

pdc4-F：CCTCAGAGTGTCGTCACCAG

pdc4-R：GGATAGTCAAGTGGAGCAGATTG；

PCR扩增条件为94℃4min；94℃40s；58℃40s，72℃1min，30个循环；72℃7min，16℃；利用凝胶回收试剂盒回收PCR扩增产物并进行测序分析，构建得到了含转录正调控因子Hap2的基因工程菌株，将其命名为里氏木霉KDNE-DH(Trichoderma reesei KDNE-DH)。

将上述构建得到的里氏木霉菌KDNE-DH与里氏木霉KDNE-D分别接种于MM发酵培养基，30℃培养48小时，然后25℃培养72小时，分别取上清样品，测定纤维素酶酶活，里氏木霉KDNE-D发酵上清液酶活为130U/ml，分子量为32KD，里氏木霉KDNE-DH发酵上清液酶活为170U/ml，分子量为32KD，纤维素酶酶活得到显著提升。

实施例5紫外诱变与筛选

申请人以里氏木霉KDNE-DH为出发菌株，通过紫外诱变的方法，进一步筛选产酶水平得到提高的突变菌株。

将出发菌里氏木霉KDNE-DH接种于PDA平板上，28-30℃恒温培养1周至稳定期。待孢子成熟后，往平板上加入5-10ml无菌水洗刷孢子，吸取孢子悬液并计数，依据孢子含量用调整其浓度至10^5-6个/ml，然后进行后续紫外诱变处理。

将上述孢子悬液，加入到空平板中，并进行磁力搅拌(20-550rpm)，然后利用紫外对准平板进行诱变处理，诱变条件为：10-20W紫外灯，照射距离为10-20cm，照射时间为3-5min；然后将诱变后的孢子悬液在暗光或红光条件下涂布于PDA平板；最后将平板至于30℃恒温培养，直至长出菌落，时间约为7-10天。

4.1 96深孔板筛选：

在96深孔板的孔中加入2-3mlMM发酵培养基，将上述诱变后长出的菌落分别接种于各个孔中，置于摇床上，30℃，200rpm，培养2天，25℃，200rpm，培养3天。培养结束后，分别离心取上清进行酶活检测(检测方法参考实施例3)和SDS-PAGE电泳检测。根据检测结果，筛选出纤维素酶酶活和胞外蛋白含量显著高于出发菌的突变菌共三株，分别命名为H2V-1，H2V-2，H2V-3。

4.2摇瓶筛选：

将上述三株突变菌株(H2V-1，H2V-2，H2V-3)分别接种于50ml MM发酵培养基，置于摇床上，30℃，200rpm，培养2天，25℃，200rpm，培养3天。培养结束后，分别离心取上清，进行酶活检测(检测方法参考实施例3)和蛋白含量测定(考马斯亮蓝检测法)，结果如表1所示。

表1酶活与蛋白含量测定

菌株	酶活(U/ml)	蛋白含量(g/L)
			出发菌株KDNE-DH	170	1.18
突变株H2V-1	190	1.27
			突变株H2V-2	221	1.43
突变株H2V-3	230	1.61

从表1的结果可以看出，本发明筛选到的三株突变菌中H2V-3的发酵酶活和胞外蛋白含量最高，比出发菌提高了35.3％和36.4％，取得了显著的技术效果。

申请人将该突变株命名为里氏木霉H2V-3(Trichoderma reesei H2V-3)。

实施例6突变菌里氏木霉H2V-3的纯化与菌落形态观察

将突变菌里氏木霉H2V-3接种于PDA平板上，28-30℃恒温培养1周至稳定期。待孢子成熟后，往平板上加入5-10ml无菌水洗刷孢子；然后再次吸取适量孢子悬液涂布于PDA平板，最后将平板置于30℃恒温培养，直至长出单菌落；挑取单菌落，即纯化的突变菌里氏木霉H2V-3，接种于PDA平板。同时，以出发菌作为对照组，采用上述同样操作进行培养、纯化，挑取单菌落接种于PDA平板，分别在PDA平板上培养1周。

从图2所示的菌落与菌丝形态比较可以看出，与出发菌里氏木霉KDNE-DH相比，本发明筛选获得的突变菌里氏木霉H2V-3的菌落形态发生显著变化，且突变菌株的菌丝分支和菌丝的蛋白分泌顶端明显增多，有利于胞外蛋白的大量分泌。

实施例7发酵放大培养

将出发菌里氏木霉KDNE-DH和突变菌里氏木霉H2V-3分别接种于摇瓶种子培养基(葡萄糖10-30g/L，土豆100-200g/L)，30℃，200rpm摇床培养48h之后，将发酵液转入7.5L发酵罐(培养基为：葡萄糖30-50g/L，乳糖2.0-10g/L，玉米浆20-50g/L，硫酸铵10-30g/L，硫酸镁5-10g/L，磷酸二氢钾15-30g/L)，温度控制在25±1℃，pH值控制在5.0±0.2，在发酵罐培养10h到15h之后，开始补加乳糖诱导菌体产酶，发酵时间约为160h到170h，获得发酵菌液。

将上述发酵菌液离心，取上清，进行酶活检测(检测方法参考实施例3)和蛋白含量检测(考马斯亮蓝检测法)。

结果显示，出发菌里氏木霉KDNE-DH的发酵上清液酶活为709U/mL，蛋白含量为7.91g/L，而突变菌里氏木霉H2V-3的发酵上清液酶活为1100U/mL，蛋白含量为10.65g/L，比出发菌提高了55％和35％。

申请人已于2017年12月25日将所述突变菌株里氏木霉H2V-3(TrichodermareeseiH2V-3)保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:M2017841。

实施例7纤维素酶突变体在纺织中的应用

7.1针织面料、梭织面料的除毛工艺

应用温度为35-60℃；处理时间为30-150分钟；pH范围为4.0-8.5；

适用的浴比范围为1:5-1:30，使用的设备类型为溢流染色机，卷染机，水洗机等。

本发明提供的纤维素酶突变体除毛干净，对织物强力损失小，达到相同的除毛效果，纤维素酶突变体KDNE-D的添加量为8g/L，而野生型纤维素酶NCE4的添加量高达12g/L，是突变体的1.5倍。

7.2牛仔面料的起花应用

应用温度为35-60℃；处理时间为10-60分钟；pH范围为4.0-8.5；

上述工艺条件可应用于退浆及单独石磨洗条件下的除毛、起花工艺；适用的浴比范围为1:5-1:30，使用的设备类型为工业水洗机等。

本发明提供的纤维素酶突变体除毛干净，起花均匀，花点较小，达到相同的起花效果，纤维素酶突变体KDNE-D的添加量为8g/L，而野生型纤维素酶NCE4的添加量高达12g/L，是突变体的1.5倍。

上述实验结果表明，本发明的纤维素酶突变体可广泛应用于纺织加工领域，在pH4.0-8.5范围内应用，效果良好；除毛干净，对织物强力损失小；牛仔水洗，起花小，花点较小，批差稳定；且相同蛋白含量的应用效果为野生型的1.5倍，能大大减少酶的添加量，节约成本，提高经济效益。

序列表

<110> 青岛蔚蓝生物集团有限公司

潍坊康地恩生物科技有限公司

<120> 一种纤维素酶突变体及其高产菌株

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 284

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Ala Asp Gly Lys Ser Thr Arg Tyr Trp Asp Cys Cys Lys Pro Ser Cys

1 5 10 15

Gly Trp Ala Lys Lys Ala Pro Val Asn Gln Pro Val Phe Ser Cys Asn

20 25 30

Ala Asn Phe Gln Arg Leu Thr Asp Phe Asp Ala Lys Ser Gly Cys Glu

35 40 45

Pro Gly Gly Val Ala Tyr Ser Cys Ala Asp Gln Thr Pro Trp Ala Val

50 55 60

Asn Asp Asp Phe Ala Phe Gly Phe Ala Ala Thr Ser Ile Ala Gly Ser

65 70 75 80

Asn Glu Ala Gly Trp Cys Cys Ala Cys Tyr Glu Leu Thr Phe Thr Ser

85 90 95

Gly Pro Val Ala Gly Lys Lys Met Val Val Gln Ser Thr Ser Thr Gly

100 105 110

Gly Asp Leu Gly Ser Asn His Phe Asp Leu Asn Ile Pro Gly Gly Gly

115 120 125

Val Gly Ile Phe Asp Gly Cys Thr Pro Gln Phe Gly Gly Leu Pro Gly

130 135 140

Gln Arg Tyr Gly Gly Ile Ser Ser Arg Asn Glu Cys Asp Arg Phe Pro

145 150 155 160

Asp Ala Leu Lys Pro Gly Cys Tyr Trp Arg Phe Asp Trp Phe Lys Asn

165 170 175

Ala Asp Asn Pro Ser Phe Ser Phe Arg Gln Val Gln Cys Pro Ala Glu

180 185 190

Leu Val Ala Arg Thr Gly Cys Arg Arg Asn Asp Asp Gly Asn Phe Pro

195 200 205

Ala Val Gln Ile Pro Ser Ser Ser Thr Ser Ser Pro Val Gly Gln Pro

210 215 220

Thr Ser Thr Ser Thr Thr Ser Thr Ser Thr Thr Ser Ser Pro Pro Val

225 230 235 240

Gln Pro Thr Thr Pro Ser Gly Cys Thr Ala Glu Arg Trp Ala Gln Cys

245 250 255

Gly Gly Asn Gly Trp Ser Gly Cys Thr Thr Cys Val Ala Gly Ser Thr

260 265 270

Cys Thr Lys Ile Asn Asp Trp Tyr His Gln Cys Leu

275 280

<210> 2

<211> 855

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gctgatggca agtccacccg ctactgggac tgctgcaagc cttcgtgcgg ctgggccaag 60

aaggctcccg tgaaccagcc tgtcttctcc tgcaacgcca acttccagcg tctcactgac 120

ttcgacgcca agtccggctg cgagccgggc ggtgtcgcct actcgtgcgc cgaccagacc 180

ccatgggctg tgaacgacga cttcgcgttc ggttttgctg ccacctctat tgccggcagc 240

aatgaggcgg gctggtgctg cgcctgctac gagctcacct tcacatccgg tcctgttgct 300

ggcaagaaga tggtcgtcca gtccaccagc actggcggtg atcttggcag caaccacttc 360

gatctcaaca tccccggcgg cggcgtcggc atcttcgacg gatgcactcc ccagttcggc 420

ggtctgcccg gccagcgcta cggcggcatc tcgtcccgca acgagtgcga tcggttcccc 480

gacgccctca agcccggctg ctactggcgc ttcgactggt tcaagaacgc cgacaacccg 540

agcttcagct tccgtcaggt ccaatgccca gccgagctcg tcgctcgcac cggatgccgc 600

cgcaacgacg acggcaactt ccctgccgtc cagatcccct ccagcagcac cagctctccg 660

gtcggccagc ctaccagtac cagcaccacc tccacctcca ccacctcgag cccgcccgtc 720

cagcctacga ctcccagcgg ctgcactgct gagaggtggg ctcagtgcgg cggcaatggc 780

tggagcggct gcaccacctg cgtcgctggc agcacctgca cgaagattaa tgactggtac 840

catcagtgcc tgtag 855

<210> 3

<211> 267

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Ala Asp Gly Lys Ser Thr Arg Tyr Trp Asp Cys Cys Lys Pro Ser Cys

1 5 10 15

Gly Trp Ala Lys Lys Ala Pro Val Asn Gln Pro Val Phe Ser Cys Asn

20 25 30

Ala Asn Phe Gln Arg Leu Thr Asp Phe Asp Ala Lys Ser Gly Cys Glu

35 40 45

Pro Gly Gly Val Ala Tyr Ser Cys Ala Asp Gln Thr Pro Trp Ala Val

50 55 60

Asn Asp Asp Phe Ala Phe Gly Phe Ala Ala Thr Ser Ile Ala Gly Ser

65 70 75 80

Asn Glu Ala Gly Trp Cys Cys Ala Cys Tyr Glu Leu Thr Phe Thr Ser

85 90 95

Gly Pro Val Ala Gly Lys Lys Met Val Val Gln Ser Thr Ser Thr Gly

100 105 110

Gly Asp Leu Gly Ser Asn His Phe Asp Leu Asn Ile Pro Gly Gly Gly

115 120 125

Val Gly Ile Phe Asp Gly Cys Thr Pro Gln Phe Gly Gly Leu Pro Gly

130 135 140

Gln Arg Tyr Gly Gly Ile Ser Ser Arg Asn Glu Cys Asp Arg Phe Pro

145 150 155 160

Asp Ala Leu Lys Pro Gly Cys Tyr Trp Arg Phe Asp Trp Phe Lys Asn

165 170 175

Ala Asp Asn Pro Ser Phe Ser Phe Arg Gln Val Gln Cys Pro Ala Glu

180 185 190

Leu Val Ala Arg Thr Gly Cys Arg Arg Asn Asp Asp Gly Asn Phe Pro

195 200 205

Ala Val Gln Ile Pro Ser Ser Ser Thr Ser Ser Ser Pro Pro Val Gln

210 215 220

Pro Thr Thr Pro Ser Gly Cys Thr Ala Glu Arg Trp Ala Gln Cys Gly

225 230 235 240

Gly Asn Gly Trp Ser Gly Cys Thr Thr Cys Val Ala Gly Ser Thr Cys

245 250 255

Thr Lys Ile Asn Asp Trp Tyr His Gln Cys Leu

260 265

<210> 4

<211> 804

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gctgatggca agtccacccg ctactgggac tgctgcaagc cttcgtgcgg ctgggccaag 60

aaggctcccg tgaaccagcc tgtcttctcc tgcaacgcca acttccagcg tctcactgac 120

ttcgacgcca agtccggctg cgagccgggc ggtgtcgcct actcgtgcgc cgaccagacc 180

ccatgggctg tgaacgacga cttcgcgttc ggttttgctg ccacctctat tgccggcagc 240

aatgaggcgg gctggtgctg cgcctgctac gagctcacct tcacatccgg tcctgttgct 300

ggcaagaaga tggtcgtcca gtccaccagc actggcggtg atcttggcag caaccacttc 360

gatctcaaca tccccggcgg cggcgtcggc atcttcgacg gatgcactcc ccagttcggc 420

ggtctgcccg gccagcgcta cggcggcatc tcgtcccgca acgagtgcga tcggttcccc 480

gacgccctca agcccggctg ctactggcgc ttcgactggt tcaagaacgc cgacaacccg 540

agcttcagct tccgtcaggt ccaatgccca gccgagctcg tcgctcgcac cggatgccgc 600

cgcaacgacg acggcaactt ccctgccgtc cagatcccct ccagcagcac cagctcgagc 660

ccgccagtcc agcctacgac tcccagcggc tgcactgctg agaggtgggc tcagtgcggc 720

ggcaatggct ggagcggctg caccacctgc gtcgctggca gcacctgcac gaagattaat 780

gactggtatc atcagtgcct gtag 804

<210> 5

<211> 1038

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atgatggaat acgcgcaata tccacagcag caacacaatt cccacgcagg ttacgcgagc 60

tctgccgccg gtgcaagtat cacgtcgccc accagccacg gcatcaacca gcacgccgtg 120

caatcgtcgc ccgtcaacgc atcgcagcag cagcagcaac aacaacagca acagcaacaa 180

caacaacaac aacagcaaca acagcagcag cagcaacaac aacagcagca gcagcagcag 240

cagcagcagt ctcagcagca acaccagcct gctcaggccc cagctcacgg catgtatcaa 300

ccacagtacg gcgtgcccca gcccagcatg cagcaggtgc cgtatggcat ccctggcatc 360

caggctgccg caatggccgc cacagccgcc gcctcaggct ccggctaccc ttacatgcac 420

tcggatccga gcatgcctca cacgtcgccg cgcatgccca gcgctaagaa ggatggccgg 480

ccgtctcctc gcatgaacag catttcccag atccccggcc gccgcatgag ccaagtcacc 540

agcccgggcg tgccgagtgc ccccggcatg atgaaccacg gcggaccccg gcccccgccc 600

atgcctcccg cccctgccat gcagcaccca cagtcgccag agatgcccgc cggcgccgtc 660

gaagagtcgc cattgtacgt caatgcgaaa cagttccacc gaatcctcaa gcggcgcgtc 720

gcccgccagc gtctcgaaga gcagttgcgg ttgacttcca aaggacgaaa gccctacctg 780

cacgagtcca gacacaacca tgcgatgcgc aggcctcgtg gacccggtgg tcgattcttg 840

acagcagagg aggtggccgc catggaatcc aagggagggc tagacggcaa gggtgagggt 900

tcggacgatg tctcacctgg caagtcctca gatgccccga gcgggaagcg caagtcggaa 960

tctggcccct cgacgtccag caagaagccc aaaacacaaa gcgacaacgg cgaaggaaat 1020

gcagaagacg ccagttaa 1038

Claims

1.一种纤维素酶突变体，其特征在于，所述的纤维素酶突变体是氨基酸序列为SEQ IDNO：1的纤维素酶的第219-235位氨基酸发生缺失后获得的。

2.如权利要求1所述的纤维素酶突变体，其特征在于，所述的纤维素酶突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO：3。

3.一种编码基因，所述的基因编码权利要求1所述的纤维素酶突变体。

4.如权利要求3所述编码基因，其特征在于，所述的基因的核酸序列为SEQ ID NO：4。

5.一种重组质粒，其特征在于，所述的重组质粒携带有权利要求3所述的编码基因。

6.一种里氏木霉工程菌株，其特征在于，所述的里氏木霉工程菌株携带有权利要求5所述的重组质粒。

7.一种里氏木霉工程菌株，其特征在于，所述的里氏木霉工程菌株是以权利要求6所述的里氏木霉工程菌为出发菌株，通过过量表达转录正调控因子Hap2得到的；其中转录正调控因子Hap2的一种基因序列为SEQ ID NO：5。

8.一种里氏木霉突变菌株，其特征在于，所述的里氏木霉突变菌株是以权利要求7所述的里氏木霉工程菌株为出发菌株，通过紫外诱变方法筛选获得的。

9.如权利要求8所述的里氏木霉突变菌株，其特征在于，所述的里氏木霉突变菌株的保藏编号为CCTCC NO:M2017841。

10.权利要求8或9所述的里氏木霉突变菌株在发酵生产纤维素酶中的应用。