CN110079630A - 一种快速筛选产红景天苷重组酵母菌株的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种快速筛选产红景天苷重组酵母菌株的方法：1)提取候选重组菌株基因组DNA作为模板，分别进行三轮PCR扩增，并根据电泳分析结果筛选获得同时含有TyDC、4HPAAS基因片段以及AAS基因片段的重组酵母菌株；2)将经电泳分析筛选所得的重组酵母菌株于YPD液体培养基中发酵培养，对所得发酵液进行HPLC分析，筛选得到产红景天苷重组酵母菌株。本发明简化了产红景天苷重组酵母菌株的筛选过程，具有高效、低成本、适用性强的特点，是一种具有广泛应用前景的高通量筛选方法。

Description

一种快速筛选产红景天苷重组酵母菌株的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于PCR扩增技术快速筛选产红景天苷重组酵母菌株的方法。
背景技术
红景天泛指景天科(Crassulaceae)红景天属(Rhodiola)植物，是珍稀药用植物，主要分布于北半球的亚北极地区。研究表明，红景天属植物具有多种药理活性，其主要药用活性成分为红景天苷(Salidroside)。红景天苷具有抗肿瘤、抗辐射、抗缺氧等功效，在医学和保健食品中具有重要的应用价值。但伴随着红景天的广泛应用，红景天野生资源日益减少，主要原因有:(1)红景天生长环境恶劣，一般成簇生长在海拔2500～5000m的山地冰川、山梁草地或山谷岩石上，近几年由于过度放牧和采挖，使其生存的生态环境遭到破坏；(2)花粉表面光滑，不利于完成授粉等生殖生理过程。同时，人工栽培的红景天有效成分含量低且易发生根腐烂病，而利用化学途径合成红景天苷，因涉及有机溶剂，难以保障其安全性。因此，迫切需要寻求及扩大红景天苷药源途径，以满足对其日益增长的需求。
近几年，低能离子注入技术被广泛应用于植物和微生物的品质改良及种质创新，并取得了丰硕成果。毛培宏等分别通过Ar+和N+注入介导蓝麻黄基因组DNA在汉逊酵母中随机转化，并获得了遗传稳定酵母工程菌，其培养液中麻黄碱和伪麻黄碱的最高产量分别为18.85mg/L和4.11mg/L。
低能离子注入技术虽然在重组工程菌的构建上有一定的方向性和目的性，但其也有较大的随机性，注入后候选重组菌株数量比较大，所以建立一种高通量的快速筛选方法尤为重要。特别是在将红景天基因组转化酵母后，由于缺乏有效的筛选分子标记，产红景天苷重组酵母菌株的筛选效率亟待提高。
发明内容
本发明的目的在于提供一种快速筛选产红景天苷重组酵母菌株的方法。
为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：
1)重组菌株初筛：
将经过低能离子注入介导拟南芥总基因组DNA和红景天总基因组DNA转化处理后的出发酵母菌株涂布于YPD固体培养基上进行培养，得到大量转化子(即生长在YPD固体培养基上的单菌落)，提取转化子基因组DNA，以转化子基因组DNA为模板，针对红景天苷生物合成途径关键酶，即酪氨酸脱羧酶(tyrosine decarboxylase，TyDC)、4-羟基苯乙醛合酶(4-hydroxyphenylacetaldehyde synthase，4HPAAS)，以及乙醛合酶(acetaldehydesynthase，AAS)的基因特异性片段分别进行三轮PCR扩增，并分别对扩增产物进行核酸电泳分析，根据电泳分析结果从转化子中筛选得到同时含有TyDC基因片段、4HPAAS基因片段以及AAS基因片段的重组酵母菌株；
2)重组菌株复筛：
将步骤1)筛选得到的重组酵母菌株于YPD液体培养基中进行发酵培养，通过对发酵培养所得发酵液进行HPLC分析，筛选得到产红景天苷重组酵母菌株。
优选的，采用上游引物F1和下游引物R1对所述TyDC基因的特异性片段进行PCR扩增，上游引物F1的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示，下游引物R1的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。
优选的，采用上游引物F2和下游引物R2对所述4HPAAS基因的特异性片段进行PCR扩增，上游引物F2的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.3所示，下游引物R2的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.4所示。
优选的，采用上游引物F3和下游引物R3对所述AAS基因的特异性片段进行PCR扩增，上游引物F3的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.5所示，下游引物R3的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.6所示。
本发明的有益效果体现在：
与现有筛选方法相比，本发明通过依据目的产物红景天苷生物合成代谢途径中多个生物合成关键酶基因作为分子标记，基于三轮PCR扩增技术，对利用低能离子注入介导拟南芥和红景天总基因组DNA转化酵母技术所构建的重组酵母菌株进行初步筛选，简化了产红景天苷重组酵母菌株的筛选过程。此方法简单、快速、高效、低成本、通用性强，是一种具有广泛运用前景的高通量筛选方法。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细说明。
为了对基于低能离子注入驱动的合成生物学技术构建的重组菌株提供一种快速、高效、通用性强的高通量筛选方法，本发明以利用低能离子注入将红景天苷生物合成途径部分基因或全部相关基因整合至酵母基因组DNA中而构建的重组菌株为筛选对象，通过多次PCR扩增初步筛选出产红景天苷重组酵母菌株，进而利用HPLC对其进一步分析确定。
(1)拟南芥和红景天总基因组DNA的提取
在构建重组菌株时，需要利用低能离子注入分别介导拟南芥和红景天总基因组DNA随机转化酵母菌株。
拟南芥嫩叶由实验室(陕西省西安市)种植、采摘获得。红景天新鲜嫩叶采集于四川省甘孜州石渠县大花红景天种植基地，洗净后置于-20℃下冷冻保存备用。
拟南芥和红景天的总基因组DNA的提取均采用经典的CTAB法，具体如下：红景天或拟南芥嫩叶剪碎，液氮研磨至细粉状，加入2％CTAB缓冲液(2％CTAB、100mmol/L Tris-HCl、20mmol/L EDTA、1.4mol/L NaCl，及0.5％β-巯基乙醇)，充分混匀后，65℃温育1h(期间每隔8min摇匀一下)，6000rpm离心10min，收集上清液，加入等体积氯仿-异戊醇(24:1)，轻轻摇至乳状液，静置10min，6000rpm离心20min，收集上层水相液体至新试管中，加入等体积-20℃预冷的异丙醇，有白色絮状物出现，-20℃静置30min，12 000rpm离心20min，弃去上清液，75％乙醇洗涤三遍，于65℃条件下烘干，TE溶解保存，备用，并取5μL体积进行凝胶电泳检测。检测结果显示，红景天及拟南芥的总基因组DNA电泳条带清晰整齐，表明采用CTAB法分别提取的红景天、拟南芥的总基因组DNA纯度高、质量好。
(2)筛选方法的建立
经红景天苷合成代谢中关键酶的确定及其基因序列的查找，并对其进行引物设计，优化并确定扩增条件，建立重组菌株的初步筛选方法；
引物设计：根据红景天苷生物合成特点，确定红景天苷合成中的关键酶分别为TyDC、4HPAAS、AAS，然后在NCBI基因数据库中分别搜索其基因序列，根据基因序列利用Primer 5.0引物设计软件分别进行特异性引物设计。各个基因的具体特异性引物序列见表1(引物设计完成时间为2018年9月)，由上海生工生物工程股份有限公司合成。
表1.TyDC、4HPAAS和AAS特异性引物序列
反应体系20μL：2×Taq PCR MasterMix 10μL，上、下引物(浓度为10μM)各1μL，模板1.5μL(浓度为1μg/mL)，用ddH2O将终体积调整为20μL。Taq PCR MasterMix为天根生化科技(北京)有限公司生产。
TyDC基因反应程序：94℃5min；循环30次：94℃30s，54.5℃30s，72℃90s；72℃10min。扩增产物使用1％琼脂糖凝胶电泳检测，扩增产物为TyDC基因中1710bp左右的目的片段。
4HPAAS基因反应程序：94℃5min；循环30次：94℃30s，55℃30s，72℃80s；72℃10min。扩增产物使用1％琼脂糖凝胶电泳检测，扩增产物为4HPAAS基因中1470bp左右的目的片段。
AAS基因反应程序：94℃5min；循环30次：94℃30s，53.5℃30s，72℃80s；72℃10min。扩增产物使用1％琼脂糖凝胶电泳检测，扩增产物为AAS基因中1470bp左右的目的片段。
(3)利用低能离子注入分别介导拟南芥和红景天总基因组DNA转化多形汉逊酵母菌株
以多形汉逊酵母DL-1(H.polymorpha DL-1，来源为ATCC No.26012)为出发菌株。
菌悬液的制备：以出发菌株为例，将置于-20℃保存的多形汉逊酵母菌株37℃活化3～4h，然后于37℃、YPD液体培养基(1％酵母浸膏、2％蛋白胨，及2％葡萄糖)中进行种子液培养8～10h，得种子液。采用血球计数板计数法确定稀释倍数，用葡萄糖-蔗糖保护液(0.5％葡萄糖水溶液和0.5％蔗糖水溶液，体积比为1:1)对种子液进行稀释，使菌体浓度为1.0×107CFU/mL，制备得到菌悬液。
菌膜制备：将0.1mL菌悬液均匀涂布于直径为90mm的无菌平皿中央，用无菌风吹干，使无菌平皿上形成菌膜。
低能N+离子注入菌膜：离子源为N+，注入能量为15～25KeV，注入剂量为1.5×1016～2.5×1016ions/cm2，将菌膜置于离子注入机真空靶室的无菌靶台上，在1×10-3Pa真空度下以10s脉冲方式，间隔10s注入N+，然后立即将拟南芥或红景天总基因组DNA溶液平铺在菌膜上使其充分接触。
酵母菌温育及洗脱：在37℃温育2h后用无菌玻璃刮铲反复洗脱无菌平皿上的菌膜2min，获得洗脱液。
转化子培养：取洗脱液0.1mL，无菌条件下均匀涂布于YPD固体培养基(1％酵母浸膏、2％蛋白胨、2％葡萄糖，及2％琼脂粉)上37℃培养48h，得到转化子。
(4)利用PCR初筛转化子
1)首先将经拟南芥总基因组DNA转化酵母获得的2238个转化子作为研究对象，分别提取其基因组DNA，以拟南芥总DNA(即拟南芥总基因组DNA)作为阳性对照，出发菌株DNA作为阴性对照，以TyDC(NM_001341927)为目标基因，利用引物F1和R1进行PCR扩增，筛选含拟南芥TyDC基因片段的候选重组菌株。扩增产物的电泳分析结果表明，在2238个转化子中有1091个重组酵母菌株可以扩增出TyDC基因部分片段，显阳性结果，条带大小在1710bp左右，和预期目标条带大小一致；而以出发菌株DNA为模板的PCR扩增则无任何条带出现。进而对含拟南芥TyDC基因片段的重组酵母菌株进行二次注入，利用该次低能离子注入介导红景天总基因组DNA转化含拟南芥TyDC基因片段的重组酵母菌株。
2)以步骤1)中经二次注入介导获得的1091个转化子作为研究对象，分别提取其基因组DNA，以红景天总DNA(即红景天总基因组DNA)作为阳性对照，对应的含拟南芥TyDC基因片段的重组酵母菌株的DNA作为阴性对照，以4HPAAS(MF674522)为目标基因，利用引物F2和R2进行第二轮PCR扩增，筛选同时含4HPAAS基因片段的候选重组酵母菌株。扩增产物的电泳分析结果表明，在1091株重组酵母菌株中有617株重组酵母菌株可以扩增出4HPAAS基因部分片段，显阳性结果，条带大小在1470bp左右，和预期目标条带大小一致；而以所选阴性对照的DNA为模板的PCR扩增则无任何条带出现。
3)以步骤2)中617株重组酵母菌株作为研究对象，分别提取其基因组DNA，以红景天总DNA作为阳性对照，对应的含拟南芥TyDC基因片段的重组酵母菌株的DNA作为阴性对照，以AAS(MF674523)为目标基因，利用引物F3和R3进行第三轮PCR扩增，筛选同时含AAS基因片段的重组酵母菌株。扩增产物的电泳分析结果表明，在617株重组酵母菌株中有84株重组酵母菌株可以扩增出AAS基因部分片段，显阳性结果，条带大小在1470bp左右，和预期目标条带大小一致；而以所选阴性对照的DNA为模板的PCR扩增则无任何条带出现。
由于以上通过PCR扩增的TyDC、4HPAAS和AAS基因片段具有特异性，因此，也可以先利用低能离子注入介导拟南芥及红景天总基因组DNA转化出发菌株，然后对得到的转化子利用表1中的3对引物进行对应的三轮PCR扩增。
(5)利用HPLC(高效液相色谱)进一步分析经初筛获得的转化子
以(4)中筛选出的84株重组酵母菌株为研究对象，进行液体发酵。所述发酵的方法为：将重组酵母菌株接种于YPD液体培养基中，于37℃、150r/min转速条件下培养48～72h。提取发酵液，利用HPLC进行进一步鉴定分析，流动相为甲醇:水＝10:90；流速1.0mL/min；柱温25℃；进样量10μL，检测波长275nm。结果有7株重组酵母菌株显阳性结果，在58.6min处出峰，即这7株重组酵母菌株发酵液中有红景天苷检出，产量平均约为2.35mg/L。
经过多个批次实验验证，利用(4)中方法确定的重组酵母菌株经发酵以及HPLC检测确定的阳性结果概率稳定保持在8％～40％。
(6)产红景天苷重组酵母菌株的遗传稳定性
将(5)中确定的7株重组酵母菌株分别进行种子液(同上述(3)中种子液获得方法)培养，取2mL种子液接种于500mL YPD液体培养基中进行摇瓶培养，于37℃、200r/min条件下，传代培养10代后，收集发酵液，对重组酵母菌株发酵性能遗传稳定性进行测定。7株重组酵母菌株均可以稳定遗传，红景天苷产量集中在2.76～2.91mg/L之间。即筛选得到的产红景天苷重组酵母菌株具有较好的遗传稳定性。
上述结果表明，本发明可以高效筛选获得产红景天苷的重组酵母菌株。
(7)产红景天苷重组酵母菌株的摇瓶发酵实验
将遗传稳定的重组酵母菌株种子液(同上述(3)中种子液获得方法)50mL接种于5LYPD液体培养基中进行发酵培养，在37℃、125r/min条件下培养96h后，提取并浓缩发酵液，对发酵液进行进一步HPLC分析，测定其红景天苷含量约为2.83mg/L，结果表明通过本发明方法筛选获得的重组酵母菌株可以用于进一步的发酵培养研究。
<110> 陕西科技大学
<120> 一种快速筛选产红景天苷重组酵母菌株的方法
<160> 6
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213>人工合成
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<213> 人工合成
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Claims (6)

1.一种快速筛选产红景天苷重组酵母菌株的方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)重组菌株初筛：
将经过低能离子注入介导拟南芥和红景天总基因组DNA转化处理后的出发酵母菌株接种于固体培养基上进行培养，得到转化子；提取转化子基因组DNA，以转化子基因组DNA为模板，针对TyDC基因、4HPAAS基因以及AAS基因的特异性片段分别进行三轮PCR扩增，并分别对扩增产物进行核酸电泳分析，根据电泳分析结果从转化子中筛选得到同时含有TyDC基因片段、4HPAAS基因片段以及AAS基因片段的重组酵母菌株；
2)重组菌株复筛：
将步骤1)筛选得到的重组酵母菌株于液体培养基中进行发酵培养，通过对发酵培养所得发酵液进行HPLC分析筛选得到产红景天苷重组酵母菌株。
2.根据权利要求1所述一种快速筛选产红景天苷重组酵母菌株的方法，其特征在于：所述出发酵母菌株选自多形汉逊酵母DL-1。
3.根据权利要求1所述一种快速筛选产红景天苷重组酵母菌株的方法，其特征在于：所述固体培养基及液体培养基选自YPD培养基。
4.根据权利要求1所述一种快速筛选产红景天苷重组酵母菌株的方法，其特征在于：采用上游引物F1和下游引物R1对所述TyDC基因的特异性片段进行PCR扩增，上游引物F1的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示，下游引物R1的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。
5.根据权利要求1所述一种快速筛选产红景天苷重组酵母菌株的方法，其特征在于：采用上游引物F2和下游引物R2对所述4HPAAS基因的特异性片段进行PCR扩增，上游引物F2的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.3所示，下游引物R2的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.4所示。
6.根据权利要求1所述一种快速筛选产红景天苷重组酵母菌株的方法，其特征在于：采用上游引物F3和下游引物R3对所述AAS基因的特异性片段进行PCR扩增，上游引物F3的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.5所示，下游引物R3的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.6所示。
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