CN110075363A - 一种具有全向通孔结构胶原蛋白支架及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种具有全向通孔结构胶原蛋白支架的制备方法，包括以下步骤：1)将胶原蛋白溶液倒入容器中；2)将盛有胶原蛋白溶液的容器放入冷冻设备中梯度冷冻；3)将步骤2)中已冷冻的胶原蛋白放入真空冷冻干燥机中进行真空冷冻干燥，即得具有全向通孔结构的所述胶原蛋白支架。本发明公开了一种采用微针模具制备具有全向通孔结构胶原蛋白支架的方法。本发明提出的全向通孔结构胶原蛋白支架，不仅利于体内营养物质的传送，而且利于细胞的迁入及生长，更适合作为组织工程支架。

Description

一种具有全向通孔结构胶原蛋白支架及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物支架材料领域，特别是涉及一种具有全向通孔结构胶原蛋白支架及其制备方法。
背景技术
胶原蛋白作为组织工程支架时，其结构对控制支架机械性能和细胞与支架间相互作用起着至关重要的作用。控制胶原蛋白支架孔结构的常用方法是真空冷冻干燥，已有的研究如下：
通过冰冻技术可以使冰晶晶核在胶原蛋白之间形成、生长，冰晶在冻干的过程中消失，但冰晶体结构仍然存在，最终形成胶原蛋白支架的孔结构。因此，胶原蛋白支架结构主要依赖于胶原蛋白浆内冰结晶。冰的结晶过程包括成核和晶体生长，两者都受热经历和液体性质的影响。成核通常被认对冰的结构形成和确定支架是否具有各向同性或各向异性起着至关重要的作用。因此，为了改变支架的结构，大量研究集中在何时和以何种方式改变晶核的形成。通常采用液氮淬火加快冷却速度，在胶原蛋白浆中创造这种大的温差可以改变孔的各向异性。另一方面，缓慢地冷却可以改变孔的各向同性。
而最终的孔结构，是否各向异性和各向同性不只是成核决定，还取决于冰晶随后的生长方式。已有研究可以获得孔径大小不等、孔隙率高低不同的多孔胶原蛋白海绵，但是并未获得具有全向通孔结构的胶原蛋白支架。
因此，寻求使用简单的方法便能够制备具有全向通孔结构的胶原蛋白支架的方法成为本领域技术人员亟待解决的技术问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有全向通孔结构胶原蛋白支架及其制备方法。
本发明的技术方案如下：
根据本发明，提供一种具有全向通孔结构胶原蛋白支架的制备方法，其在真空冷冻干燥时采用不同梯度冷冻控制冰晶成核、改变溶剂以改变凝结点来控制冰晶生长，包括以下步骤：
1)将胶原蛋白溶液倒入容器中；
2)将盛有胶原蛋白溶液的容器放入冷冻设备中梯度冷冻；
3)将步骤2)中已冷冻的胶原蛋白放入真空冷冻干燥机中进行真空冷冻干燥，即得具有全向通孔结构的胶原蛋白支架；
所述梯度冷冻为使用梯度温度冷冻；
所述梯度温度为2～6℃维持3-6小时、-15～-25℃维持3-6小时、-75～-85℃维持12-16小时；或者，在室温至-80℃使用程序降温。
根据本发明的一个实施例，所述容器是孔板或冻存管。
根据本发明的一个实施例，所述冷冻设备选自液氮罐、可调温冰箱、程序降温盒。
根据本发明的一个实施例，所述胶原蛋白溶液的浓度为0.1mg/mL～200mg/mL。
根据本发明的一个实施例，所述胶原蛋白溶液为经过提纯后的胶原蛋白和溶剂混合而成。
根据本发明的一个实施例，所述胶原蛋白可以来自于任何物种，例如选自鱼、牛、猪、细菌或酵母菌等。
根据本发明的一个实施例，所述溶剂可以是纯水、生理盐水、蔗糖水等任一种可以结晶的物质。
根据本发明的一个实施例，所述孔板是金属材质孔板或高分子材料孔板。
根据本发明的一个实施例，所述金属材质孔板是不锈钢孔板；所述高分子材料孔板是聚四氟乙烯孔板。
根据本发明的一个实施例，所述孔板的孔径为4毫米～10厘米。
根据本发明的一个实施例，所述梯度冷冻的降温速率为0.5℃/min～2℃/min。
根据本发明，提供一种具有全向通孔结构胶原蛋白支架的制备方法，其使用微针模具进行造孔，包括以下步骤：
1)将胶原蛋白溶液倒入预置微针模具的容器中；
2)将盛有胶原蛋白溶液的容器放入冷冻设备中梯度冷冻；
3)将步骤2)中已冷冻的胶原蛋白放入真空冷冻干燥机中进行真空冷冻干燥，即得具有全向通孔结构的所述胶原蛋白支架；
所述梯度冷冻为使用梯度温度冷冻；
所述梯度温度为2～6℃维持3-6小时、-15～-25℃维持3-6小时、-75～-85℃维持12-16小时；或者，在室温至-80℃使用程序降温。
根据本发明的一个实施例，在步骤3)中，放入容器的微针模具是在放入真空冷冻干燥机前取出，或者在真空冷冻干燥之后取出。
根据本发明的一个实施例，所述微针模具包含基板和贯穿基板的微针，所述微针插入所述容器中；所述微针的直径是5微米～1毫米。
根据本发明的一个实施例，所述胶原蛋白溶液的浓度为0.1mg/mL～200mg/mL。
根据本发明的一个实施例，所述容器是孔板或培养皿。
根据本发明的一个实施例，所述孔板是金属材质孔板或高分子材料孔板。
根据本发明的一个实施例，所述金属材质孔板是不锈钢孔板；所述高分子材料孔板是聚四氟乙烯孔板。
根据本发明的一个实施例，所述冷冻设备选自液氮罐、可调温冰箱、程序降温盒。
根据本发明的一个实施例，所述胶原蛋白溶液为经过提纯后的胶原蛋白和溶剂混合而成。
根据本发明的一个实施例，所述胶原蛋白可以来自于任何物种，例如选自鱼、牛、猪、细菌或酵母菌等。
根据本发明的一个实施例，所述溶剂可以是纯水、生理盐水、蔗糖水等任一种可以结晶的物质。
根据本发明的一个实施例，所述梯度冷冻的降温速率为0.5℃/min～2℃/min。
根据本发明，还提供一种胶原蛋白支架，采用如上所述的方法制备，所述胶原蛋白支架具有全向通孔结构。
本发明的有益效果：
本发明提出胶原蛋白支架的全向孔径的制备技术，以期获得更利于组织再生的胶原蛋白组织工程支架。现有的胶原蛋白支架具有多孔结构，但不具有全向通孔结构。而全向通孔结构的胶原蛋白支架不仅利于体内营养物质的传送，而且利于细胞的迁入及生长，更适合作为组织工程支架。
附图说明
图1为具有全向通孔结构的胶原蛋白支架示意图，其中a为全向通孔为圆柱状孔且对面孔全部相互连通；b为全向通孔为圆柱状孔且对面孔部分相互连通；c为全向通孔为圆锥状孔且对面孔全部相互连通；d为全向通孔为圆锥状孔且对面孔部分相互连通；
图2为现有干燥方法制备的胶原蛋白支架的扫描电镜图；
图3为实施例3制备的胶原蛋白支架的扫描电镜图；
图4为实施例4使用的微针模具的示意图；
图5为实施例4制备的胶原蛋白支架的扫描电镜图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
本实施例提供一种具有全向通孔结构胶原蛋白支架的制备方法，其制备步骤为：
步骤一、将提纯的猪跟腱胶原蛋白溶液浓度(溶剂为蔗糖水)调节至3mg/mL后，测试其pH值为2～3，将胶原蛋白溶液倒入冻存管中；
步骤二、将盛有胶原蛋白溶液的冻存管放入程序降温盒，将程序降温盒放入-80℃冰箱过夜完成胶原蛋白溶液的程序性降温；
步骤三、从-80℃冰箱中取出程序降温盒，放入已预冷至-40℃的真空冷冻干燥机中真空冷冻干燥，待冷冻干燥完成，将冻干的多孔胶原蛋白支架取出。
实施例2
本实施例提供一种具有全向通孔结构胶原蛋白支架的制备方法，其制备步骤为：
步骤一、将提纯的猪跟腱胶原蛋白溶液(溶剂为生理盐水)浓度调节至6mg/mL后，倒入冻存管中，调节胶原蛋白溶液的pH值至7.0～7.6之间；
步骤二、将盛有胶原蛋白溶液的冻存管放入程序降温盒，将程序降温盒放入-80℃冰箱过夜完成胶原蛋白溶液的程序性降温；
步骤三、从-80℃冰箱中取出程序降温盒，放入已预冷至-50℃的真空冷冻干燥机中真空冷冻干燥，待冷冻干燥完成，将冻干的多孔胶原蛋白支架取出。
实施例3
本实施例提供一种具有全向通孔结构胶原蛋白支架的制备方法，其制备步骤为：
步骤一、将提纯的猪跟腱胶原蛋白溶液(溶剂为水)浓度调节至5mg/mL后，测试其pH值为2～3，将胶原蛋白溶液倒入聚四氟乙烯孔板中；
步骤二、将盛有胶原蛋白溶液的聚四氟乙烯孔板放入4℃冰箱4小时，再放入-20℃冰箱4小时，最后放入-80℃冰箱过夜(约12小时)；
步骤三、将盛有胶原蛋白溶液的聚四氟乙烯孔板放入已预冷至-50℃的真空冷冻干燥机中真空冷冻干燥，待冷冻干燥完成，将冻干的多孔胶原蛋白支架取出。
实施例4
本实施例提供一种具有全向通孔结构胶原蛋白支架的制备方法，其制备步骤为：
步骤一、将提纯的猪跟腱胶原蛋白溶液(溶剂为水)浓度调节至5mg/mL后，测试其pH值为2～3，将胶原蛋白溶液倒入预置微针模具的聚四氟乙烯孔板中；微针模具如图4所示。
步骤二、将盛有胶原蛋白溶液的聚四氟乙烯孔板放入4℃冰箱4小时，再放入-20℃冰箱4小时，最后放入-80℃冰箱过夜(约12小时)；
步骤三、将盛有胶原蛋白溶液的聚四氟乙烯孔板从-80℃冰箱取出，于室温放置约2小时，待固态的胶原蛋白溶液融化至恰好可以取出微针模具。取出微针模具后，将固态的胶原蛋白溶液放入已预冷至-50℃的真空冷冻干燥机中真空冷冻干燥，待冷冻干燥完成，将冻干的多孔胶原蛋白支架取出。
实施例5
本实施例提供一种具有全向通孔结构胶原蛋白支架的制备方法，其制备步骤为：
步骤一、将提纯的猪跟腱胶原蛋白溶液浓度(溶剂为水)调节至6mg/mL后，测试其pH值为2～3，将胶原蛋白溶液倒入预置微针模具的聚四氟乙烯孔板中；微针模具如图4所示。
步骤二、将盛有胶原蛋白溶液的聚四氟乙烯孔板放入4℃冰箱4小时，再放入-20℃冰箱4小时，最后放入-80℃冰箱过夜(约12小时)；
步骤三、将盛有胶原蛋白溶液的聚四氟乙烯孔板从-80℃冰箱取出，放入已预冷至-50℃的的真空冷冻干燥机中真空冷冻干燥，待完全干燥，取出微针模具，获得多孔胶原蛋白支架。
实施例6
本实施例提供一种具有全向通孔结构胶原蛋白支架的制备方法，其制备步骤为：
步骤一、将提纯的牛跟腱胶原蛋白溶液(溶剂为生理盐水)浓度调节至10mg/mL后，测试其pH值为2～3，将胶原蛋白溶液倒入聚四氟乙烯孔板中；
步骤二、将盛有胶原蛋白溶液的聚四氟乙烯孔板放入2℃冰箱3小时，再放入-15℃冰箱3小时，最后放入-75℃冰箱过夜(约13小时)；
步骤三、将盛有胶原蛋白溶液的聚四氟乙烯孔板放入已预冷至-50℃的真空冷冻干燥机中真空冷冻干燥，待冷冻干燥完成，将冻干的多孔胶原蛋白支架取出。
实施例7
本实施例提供一种具有全向通孔结构胶原蛋白支架的制备方法，其制备步骤为：
步骤一、将提纯的牛跟腱胶原蛋白溶液(溶剂为生理盐水)浓度调节至50mg/mL后，测试其pH值为2～3，将胶原蛋白溶液倒入聚四氟乙烯孔板中；
步骤二、将盛有胶原蛋白溶液的聚四氟乙烯孔板放入6℃冰箱6小时，再放入-25℃冰箱6小时，最后放入-85℃冰箱过夜(约16小时)；
步骤三、将盛有胶原蛋白溶液的聚四氟乙烯孔板放入已预冷至-50℃的真空冷冻干燥机中真空冷冻干燥，待冷冻干燥完成，将冻干的多孔胶原蛋白支架取出。
实施例8
本实施例提供一种具有全向通孔结构胶原蛋白支架的制备方法，其制备步骤为：
步骤一、将提纯的猪跟腱胶原蛋白溶液浓度(溶剂为水)调节至200mg/mL后，测试其pH值为7.0～7.6，将胶原蛋白溶液倒入预置微针模具的培养皿中；微针模具如图4所示。
步骤二、将盛有胶原蛋白溶液的培养皿放入5℃冰箱5小时，再放入-25℃冰箱5小时，最后放入-80℃冰箱过夜(约14小时)；
步骤三、将盛有胶原蛋白溶液的培养皿从-80℃冰箱取出，放入已预冷至-50℃的的真空冷冻干燥机中真空冷冻干燥，待完全干燥，取出微针模具，获得多孔胶原蛋白支架。
实施例9
如图1所示的本发明的具有全向通孔结构的胶原蛋白支架示意图，胶原蛋白支架中的孔贯穿整个材料，使得更利于体内营养物质的传送，而且利于细胞的迁入及生长。
如图2示出的现有干燥方法制备的胶原蛋白支架的扫描电镜图，可以看出图中的孔多为片层状的孔，且孔与孔之间并不能连通。如图3示出的本发明的采用梯度冷冻法(实施例3)制备的胶原蛋白支架的扫描电镜图，a-d为不同放大倍数下的胶原蛋白支架，可以看出，胶原蛋白的孔分布比较均匀，且孔与孔之间处于连通的状态。如图5所示，本发明采用微针模具法(实施例4)制备的胶原蛋白支架的扫描电镜图，a-d为不同放大倍数下的胶原蛋白支架，可以看出，胶原蛋白的孔分布比较均匀，且孔与孔之间处于连通的状态。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并非用来限定本发明的实施范围；如果不脱离本发明的精神和范围，对本发明进行修改或者等同替换，均应涵盖在本发明权利要求的保护范围当中。

Claims (10)

1.一种具有全向通孔结构胶原蛋白支架的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将胶原蛋白溶液倒入容器中；
2)将盛有胶原蛋白溶液的容器放入冷冻设备中梯度冷冻；
3)将步骤2)中已冷冻的胶原蛋白放入真空冷冻干燥机中进行真空冷冻干燥，即得具有全向通孔结构的所述胶原蛋白支架；
所述梯度冷冻为使用梯度温度冷冻；
所述梯度温度为2～6℃维持3-6小时、-15～-25℃维持3-6小时、-75～-85℃维持12-16小时；或者，在室温至-80℃使用程序降温。
2.根据权利要求1所述的具有全向通孔结构胶原蛋白支架的制备方法，其特征在于，所述容器是孔板或冻存管。
3.根据权利要求1所述的具有全向通孔结构胶原蛋白支架的制备方法，其特征在于，
步骤1)还将胶原蛋白溶液倒入预置微针模具的容器中。
4.根据权利要求3所述的具有全向通孔结构胶原蛋白支架的制备方法，其特征在于，放入容器的微针模具在放入真空冷冻干燥机前取出，或者在真空冷冻干燥之后取出。
5.根据权利要求3所述的具有全向通孔结构胶原蛋白支架的制备方法，其特征在于，所述微针模具包含基板和贯穿基板的微针，所述微针插入所述容器中；所述微针的直径是5微米～1毫米。
6.根据权利要求3所述的具有全向通孔结构胶原蛋白支架的制备方法，其特征在于，所述容器是孔板或培养皿。
7.根据权利要求1或3所述的具有全向通孔结构胶原蛋白支架的制备方法，其特征在于，所述胶原蛋白溶液的浓度为0.1mg/mL～200mg/mL。
8.根据权利要求2或6所述的具有全向通孔结构胶原蛋白支架的制备方法，其特征在于，所述孔板是金属材质孔板或高分子材料孔板。
9.根据权利要求1或3所述的具有全向通孔结构胶原蛋白支架的制备方法，其特征在于，所述冷冻设备选自液氮罐、可调温冰箱、程序降温盒。
10.一种胶原蛋白支架，采用如权利要求1-9任一项所述的方法制备，其特征在于，所述胶原蛋白支架具有全向通孔结构。
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