CN115920221A - 负载TNF-α-siRNA的冷冻微针及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种负载TNF‑α‑siRNA的冷冻微针及其应用，其特征在于，所述冷冻微针由TNF‑α‑siRNA和水组成。本发明基于冰的特性引入一种包载TNF‑α‑siRNA冷冻微针贴片，通过低温的制作环境siRNA的稳定性会得以保证，可以很容易的在穿透皮肤后随针体融化持续释放药物从而达到透皮给药作用，且冷冻微针具有便捷、无尖锐废弃物残留、不会出现针体断裂等优点。

Description

负载TNF-α-siRNA的冷冻微针及其应用

技术领域

本发明属于医疗器械技术领域，具体涉及一种负载TNF-α-siRNA的冷冻微针及其应用。

背景技术

类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种慢性、对称、以炎性滑膜炎为主的难治性、全身性自身免疫病，主要表现为对称性关节肿胀、晨僵、疼痛及机能障碍。RA分布于世界各地，在各个种族均有发病且在全球的发病率约为0.5％～1.0％，目前针对RA的治疗方法众多但无特效方法来彻底治愈RA，临床上非甾体抗炎药、抗风湿药、糖皮质激素在治疗RA方面被广泛使用，但这类药物往往存在较大副作用，易产生胃肠道刺激，长期使用而导致的中枢系统毒副作用及心血管损伤成为威胁生命的最主要原因。因此RA患者迫切需要一种副作用小且治疗效果好的药物或治疗方法。穴位疗法是中医治疗学理论中的重要组成部分，它以经络学说为核心，通过经络系统将药物应用于特定穴位上，根据其对穴位的刺激作用，可提高患处药物的局部浓度，减少不良反应，更适合长期用药。与西医传统方法相比，在RA的治疗方面更具优势。

肿瘤坏死因子α(tumour necrosis factor-α，TNF-α)是参与级联式炎性反应中最重要的参与者，是广泛分布于RA患者血清和滑膜液中的一种促炎因子。包括TNF-α在内的由众多细胞因子所组成的免疫网络在RA发展进程中发挥着关键作用，TNF-α可抑制炎症信号通路中相关蛋白表达促进炎症发展，且与RA的严重程度密切相关。小分子干扰RNA(smallinterfering RNA，siRNA)是一种对目标基因进行专一性的敲弱以降低其表达、进而有效治疗相关疾病的技术。因此可借此通过特异性抑制TNF-α的表达以减轻RA的炎症进展进而缓解疾病发展。且Elbashir等在2001年首次证实哺乳动物细胞中也存在RNAi机制。目前，由于In vivo siRNA药物导入方式通常是将siRNA溶解后经皮局部注射、系统注射给药，存在因皮肤刺激性大导致顺应性差给患者带来不适、尖锐废弃物残留及不可忽视的感染风险等缺点，同时siRNA具有强亲水性、皮肤角质层会阻止亲水性药物的透皮效果，使其较难穿过皮肤角质层屏障进入血液达到疗效，使其临床应用受到一定限制。因此开发一种针对siRNA安全高效的经皮传递系统颇为重要。

微针技术是继传统经皮给药后的又一种新型经皮给药方式，能够在皮肤形成微米级通道以提高药物的渗透性且通道可自行恢复，几乎在不触及真皮层的情况下将药物精准输送到特定皮肤层面或组织，极大地减轻使用期间的痛苦以简化给药流程，可作为部分药物的载体。由于siRNA通常需先将其用无核酸酶(RNase)溶解后使用，而液体剂型siRNA稳定性远小于冻干粉形式siRNA，故siRNA溶解后应尽量保持低温状态、避免反复冻融。目前现有的微针类型都是在常温或温热干燥条件下制作，无法保证液体剂型siRNA的稳定状态。

冷冻微针本质上隶属于可溶性微针一类，自1998年Henry首次将微针用于透皮给药后，微针技术便得到学者的广泛关注和研究。与其他种类的微针相似，冷冻微针具有注射给药与经皮给药双重优势且并不局限于装载蛋白类大分子药物、核酸类药物、疫苗及小分子药物，目前还可以提供活体治疗，如治疗性细胞、掠食性细菌等。相比于其它类型的微针，冷冻微针生物相容性良好、可极大的保留所包载药物的生物活性，不会出现普通可溶微针在干燥过程由于脱水导致的尺寸误差及其他材料刺入皮肤后出现过敏、红疹等问题。另外同注射给药相比，冷冻微针对皮肤的创伤极其微小，再加上在使用时其能够达到精准定位、高效安全的特点，是一种十分具有前沿性的的药物经皮递送的选择。

然而，由于TNF-α-siRNA容易受到载体的影响，采用常规的微针载体难以保证其治疗活性，因此，如何针对TNF-α-siRNA，提供一种能够有效保证其治疗活性，又能够确保微针机械强度的冷冻微针，还要避免冷冻微针在常温下快速融化从而难以实现冷冻微针的正常使用，仍然是本领域技术人员亟待解决的技术问题。

发明内容

针对上述不足，本发明提供一种负载TNF-α-siRNA的冷冻微针及其应用。具体而言，为了实现本发明的目的，本发明拟采用如下的技术方案：

本发明一方面涉及负载TNF-α-siRNA的冷冻微针，其特征在于所述冷冻微针由TNF-α-siRNA和水组成。本发明的冷冻微针配方简单，能够有效保证其治疗活性，又能够确保微针机械强度的冷冻微针，还要够避免冷冻微针在常温下快速融化。

在本发明的一个优选实施方式中，所述冷冻微针的针体长度1000-2000μm，底部的长度和宽度都介于400-800μm。

在本发明的一个优选实施方式中，所述冷冻微针中含有TNF-α-siRNA 300-500ng/根。

在本发明的一个优选实施方式中，所述冷冻微针最大负载破裂力为0.12-0.24N/根。

在本发明的一个优选实施方式中，所述TNF-α-siRNA的序列为5'—GCCACACCAAAGCAUUCAATT—3'。

在本发明的一个优选实施方式中，所述水为超纯水，特别优选为DEPC水。

本发明另一方面涉及上述冷冻微针的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

采用PDMS阴模，将TNF-α-siRNA溶液分两次加入到PDMS阴性模具中，第一次加入后将模具真空处理后进行离心，第二次离心前将模具旋转180°后再进行离心，使溶液充分进入针腔；最后将足量且适量的水作为模具基础填充模具底部，将整个模具在0-4℃条件下冷却，然后至于-15至-25℃放置2-4h，于-60℃至-100℃冰箱冻结2-4h，最后将已冻结的微针轻轻从PDMS模具脱离在液氮条件下冻结，然后置于-60℃至-100℃保存。相比于直接于-80℃冻存与梯度冻存，发现-80℃冻存会出现针尖不能完整从模具中剥离的情况，而采用本发明的梯度冻存可以将冷冻微针完整地剥离。

本发明另一方面还涉及上述冷冻微针在制备治疗类风湿性关节炎的微针中的应用。

在本发明的一个优选实施方式中，所述治疗类风湿性关节炎的微针用于足三里穴位。将TNF-α-siRNA冷冻微针经穴位点与非穴位点给药应用于卵蛋白(OAV)诱导的家兔类风湿性关节炎模型，TNF-α-siRNA冷冻微针经穴位给药，相比于非穴位部位透皮给药，能够进一步提高对类风湿性关节炎的疗效。

有益效果

本发明基于冰的特性引入一种包载TNF-α-siRNA冷冻微针贴片，通过低温的制作环境siRNA的稳定性会得以保证，可以很容易的在穿透皮肤后随针体融化持续释放药物从而达到透皮给药作用，且冷冻微针具有便捷、无尖锐废弃物残留、不会出现针体断裂等优点。

附图说明

图1(a)冷冻微针的制备流程；(b)冷冻微针3D效果图；

图2(a)冷冻微针的阵列图片；(b)冷冻微针的针形图片；(c)冷冻微针在室温下的融化情况；(d)冷冻微针在指尖的融化情况；

图3 FAM-TNF-α-siRNA标准曲线；

图4(a)染色前离体大鼠皮肤穿刺结果；(b)染色后离体大鼠皮肤穿刺结果；(c)冷冻微针不同暴露时间下的穿透能力；

图5家兔膝关节处皮肤使用冷冻微针图像；

图6冷冻微针与几种较常用聚合物微针的机械性能考察；

图7(a)RA家兔模型的诱导和药物干预示意图；(b)体质量变化；(c)膝关节直径变化；注：与对照组比较，＊＊P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；下图表同。

图8 TNF-αsiRNA冷冻微针对血清TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10水平的影响；

图9 TNF-αsiRNA冷冻微针对家兔微血管血流状态的影响；

图10 TNF-αsiRNA冷冻微针对家兔滑膜组织病理学的影响；

图11 RT-PCR检测家兔滑膜组织中TNF-α、MMP-1、MMP-3、TIMP-1mRNA的表达；

图12 Western-blot检测家兔滑膜组织中相关蛋白的表达。

具体实施方式

为了进一步理解本发明，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

如无特殊说明，本发明实施例中所涉及的试剂均为市售产品，均可以通过商业渠道购买获得。

实施例1：

1.实验材料

1.1主要试剂

卵清蛋白(批号C12654052，上海伯奥生物科技有限公司)；弗氏完全佐剂(批号SLCF1289，美国SIGMA)；兔源(Rabbit)肿瘤坏死因子(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-10(IL-10)ELISA检测试剂盒(批号均为20211220，南京建成生物工程研究所)；经2’OMe特殊修饰的TNF-α-siRNA(5'—GCCACACCAAAGCAUUCAATT—3')购自苏州吉玛基因股份有限公司；DEPC水(批号R0021，Beyotime)；4％多聚甲醛固定液(批号AR1068，BOSTER)；RIPA蛋白裂解液(批号20210826，Solarbio)、BCA蛋白浓度测定试剂盒(批号20210903，Solarbio)；Trizol(批号10296028，Invitrogen)；SuperScript III RT逆转录kit(批号11752050，ABI-invitrogen)；Sybr qpcr mix(批号4472920，ABI-invitrogen)；β-actin抗体(批号F20040，Abways)；MMP-1抗体(批号20211010，Bioswamp)、MMP-3抗体(批号20211010，Bioswamp)、TIMP-1抗体(批号20211010，Bioswamp)、荧光二抗(批号F300405，Abways)。

1.2主要仪器

低温高速离心机TG-16M(上海卢湘仪离心机仪器有限公司)；恒温真空干燥箱DZF-6090(上海一恒科技有限公司)；PDMS微针模具(安徽中鼎玉铉新材料科技有限公司)；全自动包埋机ES600(德国Leica)；石蜡病理切片机RM2235(德国Leica)；手持式显微镜10085－1A(鑫湘光学)；质构分析仪CTX(美国Brookfiled)；光学显微镜DM3000(德国Leica)；酶联免疫检测仪SYNERGY H1(美国伯腾仪器有限公司)；涡旋振荡器MS3 Basic(德国IKA)；BI-2000A+微循环检测仪(成都泰盟软件有限公司)；荧光定量PCR仪StepOne Software(美国Applied Biosystems公司)；电泳仪EPS 300(美国Bio-Rad公司)；DYCZ-24DN型双垂直电泳仪(北京六一公司)；ChemiDocTMXRS+凝胶成像系统(美国Bio-Rad公司)。

1.3实验动物

雄性新西兰家兔，体质量2.3-2.5Kg，由黑龙江中医药大学实验动物中心提供，实验动物合格证号：SYXK(黑)2021-004，室温控制在(24.0±2.0)℃，相对湿度保持在50％左右，定期消毒所用器具，黑暗与通光时间均12h平等分配，适应喂养7d。本实验相关动物实验严格遵循黑龙江中医药大学有关实验动物管理和使用的规定。

2.方法和结果

2.1载TNF-α-siRNA冷冻微针的制备

制备过程中，采用针体长度1400μm、底宽600μm的PDMS阴模，将用适量DEPC水配制浓度为20μM的TNF-α-siRNA溶液分两次加入到PDMS阴性模具中，第一次加入后将模具真空处理5min(-0.09-0.1Mpa)后3000r/min的速度离心5min，第二次离心前将模具旋转180°后进行离心，使溶液充分进入针腔；最后将足量且适量的DEPC水作为模具基础填充模具底部，将整个模具在4℃条件下冷却40分钟，-20℃放置3h，于-80℃冰箱冻结3h，最后将已冻结的微针轻轻从PDMS模具脱离在-196℃液氮条件下1h后，即得并置于-80℃下保存以保证其机械强度。具体制备过程及3D效果图如图1a、1b所示。

2.2冷冻微针的形态

2.2.1冷冻微针的阵列形态

冷冻脱模后，使用肉眼(图2A)及手持显微镜观察(图2B)其阵列，所制得的整个冷冻微针为15mm×15mm的正方形，呈无色均匀透明冰状，基底层平整、针体完整且间距相同，形成10×10阵列垂直于背衬规则完整排列。另对冷冻微针在室温及体温下的稳定性进行研究，将微针贴片从-196℃液氮条件下取出分别置于室温及体温下应用数码相机观察其融化行为，置于室温下20s左右，针尖开始出现冰霜，140s左右针尖开始融化；置于指尖37℃、50s左右，针尖开始融化，在连续拍摄过程中指尖无任何痛感及不适。根据针尖长度与停留时间的关系对其稳定性进行评估，结果如图2C、2D所示，RT下冷冻微针的形态保持时间略长。

2.2.2冷冻微针载TNF-α-siRNA情况

将荧光标记的TNF-α-siRNA(FAM-TNF-α-siRNA)溶解在适量的0.1％DEPC水中制备成FAM-siRNA储备溶液。取0.1％DEPC水将储备液分别稀释至0.05μg/μL，0.10μg/μL，0.15μg/μL，0.20μg/μL，0.25μg/μL，0.30μg/μL不同浓度梯度的标准溶液。492nm波长下通过酶标仪测定每组OD值，根据检测结果绘制标准曲线。结果见表1，图3。

表1不同浓度标准溶液吸光度值

得出OD值(Y)对于FAM-TNF-α-siRNA浓度(X)的标准曲线，得到标准曲线方程为：y＝988.58x+124.2(R²＝0.9991)，准确度高、重复性好。根据曲线结果可知，OD值与FAM-TNF-α-siRNA浓度在0.05-0.30μg/μL范围内表现出良好的线性关系。

将制备的冷冻微针贴片，置于1mL DEPC水中溶解待完全溶解后将溶液在492nm条件下测定其吸光度值，根据标准曲线计算出FAM-TNF-α-siRNA的浓度并根据其分子量换算含量。所得每片冷冻微针含TNF-α-siRNA约(39.6±1.29)μg(n＝10)。

2.3冷冻微针的机械强度

机械强度是可溶微针最重要的机械性能之一，冷冻微针能够刺入角质层、达到真皮层成功输送药物的必要条件是其针体具有足够的机械强度。本实验利用质构分析仪检测了冷冻微针的机械强度，将冷冻微针贴片水平放置在事先经预冷处理的不锈钢板上，随后使用4mm直径的柱形探针以0.05mm 2min^-1的恒定速度垂直向下移动至冷冻微针的尖端，柱形探针与针尖相接触瞬间力的记录则开始，记录位移与压缩力的变化以评估其机械强度。通过该方法，横向比较了冷冻微针与其他三种常用可溶微针(透明质酸、聚乳酸和聚乙烯醇)机械强度的异同。如图4所示，在此次试验中，由聚乳酸(PLA)、聚乙烯醇(PVA)为材料制得的可溶微针的压缩力/位移曲线类似，每根微针所能承受的最大压缩力平均可达0.2N；冷冻微针的最大负载破裂力约为0.18N，而微针针尖的压力达0.03N便可成功刺入皮肤，本实验制得的冷冻微针所能承受的压力是其6倍，因此能够保证其具有足够的机械强度穿透皮肤。

2.4冷冻微针穿透离体皮肤的能力

取离体大鼠皮肤，去除绒毛及多余组织。用生理盐水洗涤并用滤纸擦干后，用微针注射器将冷冻微针插入离体大鼠的皮肤中。观察皮肤针孔形态，立即用0.4％台盼蓝溶液染色。1min后，洗涤并观察染色结果(图4A和4B)。图4A显示了未染色的皮肤，具有规则针孔形状；图4B显示添加台盼蓝溶液后的染色皮肤。针孔区域已被染色，针孔区域成功染色表明cryoMNs成功穿透角质层屏障。同时，我们评估了在室温(RT)不同暴露时间下，冷冻微针对离体大鼠皮肤的穿透能力。离体大鼠皮肤脱去绒毛、皮下脂肪及肌肉组织后，将不同RT暴露时间下(0s、15s、30s、45s)的冷冻微针刺入离体大鼠皮肤，采用OCT包埋剂包埋固定皮肤，冷冻切取皮肤切片、染色、显微镜观察穿透情况，如图4C所示。

2.5冷冻微针的体内药效学研究

2.5.1家兔RA模型的建立、分组及治疗

造模：卵清蛋白溶液与等体积的弗氏完全佐剂冰浴条件下充分混合乳化，制得最终浓度为10mg/mL的卵蛋白-弗氏完全佐剂(OVA)乳剂。将家兔肩胛骨及背部脱毛区域选择4-6个点累计注射1mL OVA乳剂进行致敏，每隔7d注射一次持续三周，并于第21天经胫骨结节最高点与髌骨下缘连线之中点的髌韧带两侧，垂直于皮肤双膝各注射0.5mL卵原蛋白溶液(含卵清蛋白5mg)再次加强诱导，对照组注射等量生理盐水。

分组：将30只家兔随机分为6组，对照组(Control)，模型组(Model)，TNF-αsiRNA+非穴位组(NAP)，NC-TNF-αsiRNA+非穴位组(NC+NAP)，TNF-αsiRNA+穴位组(AP)，和NC-TNF-αsiRNA+穴位组(NC+AP)。

治疗：为研究TNF-αsiRNA冷冻微针对RA的影响，以家兔双侧膝关节部位足阳明胃经上足三里(位于后肢背外侧，胫骨粗隆下部约0.3cm处)作为给药的穴位，膝盖上方部位作为非穴位给药，考虑到未来实验的可行性，适当扩大范围(±5mm)，见图5。AP组和NAP组分别在双侧膝关节穴位和非穴位部位给予一枚装载TNF-αsiRNA的冷冻微针贴片。NC+AP组和NC+NAP组分别在双侧膝关节穴位和非穴位部位给予一枚装载NC-TNF-αsiRNA的冷冻微针贴片。每组家兔在建模成功后开始相应的治疗，根据体重和给药方式每2天给予一次，共4周。

2.5.2家兔膝关节肿胀及体质量变化

从加强免疫当天起每7天测量一次家兔体重，用千分游标卡尺在兔胫骨结节最高点与髌骨下缘连线中点平面测量家兔膝关节直径。记录了模型建立前后的体重和膝关节直径的变化情况。

2.5.3免疫器官指数变化

各组兔禁食4h，各组兔称重麻醉后，分离脾、胸腺，最后一次给药2h后测定器官质量。计算免疫器官指数：免疫器官指数＝免疫器官重量(mg)/兔体重(g)。

2.5.4血清炎症因子水平检测

实验开始前，所有家兔均禁食4小时。每组家兔在最后一次给药后1h进行麻醉，然后从耳缘静脉采血。室温放置2h，3000rpm离心10min后，将上清液分离，在-20℃下保存。按说明书检测血清中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10水平。

2.5.5微循环指标变化

将微循环仪解剖显微镜放大倍数调整为40×，用显微测微标尺校正度量后，采用微循环检测仪检测治疗前后微循环微动脉管径(arteriole diameter，AD)、微静脉管径(venous diameter，VD)、血管阻力(resistance index，RI)、综合评分(comprehensiveassessment，CA)和微血管血流状态(blood flow，BF)，以评估微循环反应性情况。

2.5.6滑膜组织病理学变化

治疗后，采用耳静脉空气栓塞法对家兔实施安乐死，取膝关节滑膜组织用10％多聚甲醛固定，然后用不同浓度的乙醇脱水。用二甲苯透明处理后，进行石蜡包埋、切片。最后，采用苏木精-伊红(HE)染色法对切片染色。光镜下观察滑膜的组织病理学变化。比较各组滑膜组织的形态学变化。

2.5.7 RT-PCR检测滑膜组织MMP-1、MMP-3、TIMP-1mRNA表达

我们采用RT-PCR方法检测各组家兔滑膜组织中TNF-α、MMP-1、MMP-3、TIMP-1mRNA的表达水平。取各组家兔滑膜组织，采用Trizol试剂提取标本总RNA。然后，以浓度和纯度为指标，检测总RNA的质量。采用逆转录试剂盒合成cDNA。反应结束后，PCR产物经2％琼脂糖凝胶电泳和自动凝胶成像分析系统进行扫描成像。mRNA的相对表达量通过目标基因与内参基因的电泳条带的密度值的比值表示。引物序列见表2。

表2引物序列

2.5.8 Western blot检测滑膜组织MMP-1、MMP-3、TIMP-1相关蛋白的表达

治疗结束后对家兔实施安乐死，取家兔膝关节滑膜组织，液氮条件下速冻后充分研磨，加入RIPA裂解液冰浴条件下震荡裂解组织蛋白，裂解完毕后离心取上清采用BCA法测定各组总蛋白浓度。SDS-PAGE缓冲液分离目标蛋白，沸水浴使蛋白变性，上样，电泳，湿式转膜至PVDF膜，加入封闭液室温封闭1h。加入一抗4℃条件下孵育过夜，二抗孵育1h，于凝胶成像系统中以β-action为内参通过Image J软件计算灰度值检测相关蛋白表达。

2.10统计学处理

所得数据采用GraphPad 8.0.2统计软件进行数据分析处理，计量数据以“平均数±标准差”(x±s)表示，组间对比采用单因素方差分析。以P<0.05表示差异有统计学意义。

3结果

3.1冷冻微针的形态

制备的冷冻微针贴片为15mm×15mm正方形结构，无色、均匀、透明。基底层平坦，针体完整，间距相同，形成一个垂直于背衬的完整的10×10阵列。此外，我们还评估了冷冻微针在室温(25℃)和体温(37℃)下的稳定性。将微针贴片从液氮中取出，放置在室温和体温下，用数码相机观微针的熔化行为。在25℃下放置约20s后，针尖开始出现冰霜，大约140s后针尖开始融化。在37℃下放置约50s后，针尖开始融化，在连续拍摄过程中没有出现任何疼痛或不适。25℃条件下的冷冻微针形态保留时间略长。

3.2冷冻微针的机械强度

如图6所示，在评价cryoMNs的力学稳定性时，由聚乳酸(PLA)、聚乙烯醇(PVA)为材料制得的可溶微针的压缩力/位移曲线类似，每根微针所能承受的最大压缩力平均可达0.2N；冷冻微针的最大负载破裂力约为0.18N，而微针针尖的压力达0.03N便可成功刺入皮肤，本实验制得的冷冻微针所能承受的压力是其6倍，因此能够保证其具有足够的机械强度穿透皮肤。

3.4冷冻微针穿透离体皮肤的能力

根据图4C所示的结果，当冷冻微针保持在24±2.0C下30s时，它们可以穿透真皮，但在45s时开始失去这种能力。在24±2.0℃温度下的<15s内，冷冻微针可以穿透真皮(523±63μm)。结果表明，冷冻微针穿透皮肤的能力随着暴露时间的延长而降低。因此，冷冻微针应在从存储条件中取出后的30s内使用，以确保其具有足够的穿透能力。

3.5家兔膝关节肿胀及体质量变化

RA家兔模型的诱导、体重及膝关节直径的变化如图7所示。在加强诱导后，与对照组相比，模型组的膝关节直径显著增加，体重显著减少(P<0.01)。与模型组相比，穴位组(AP)和非穴位组(NAP)膝关节肿胀明显减轻，体重明显增加(P<0.01)。此外，AP组在缓解膝关节肿胀和体重增加方面的变化比NAP组更明显(P<0.01)。与模型组相比，NC-TNF-αsiRNA+穴位组(NC+AP)和NC-TNF-αsiRNA+非穴位组(NC+NAP)几乎没有变化。

3.6免疫器官指数变化

脾、胸腺重量及免疫器官指标变化见表3。模型组家兔的脾脏、胸腺重量和免疫器官指数均显著高于对照组(P<0.01)。与模型组相比，穴位组和非穴位组的脾脏、胸腺重量和免疫器官指数均显著低于模型组(P<0.05，P<0.01)，而NC+AP和NC+NAP几乎没有变化。

表3免疫器官指数变化

3.7血清炎症因子水平变化

图8为各组血清炎症因子水平。模型组家兔血清中TNF-α、IL-1β、IL-6水平显著高于对照组，而IL-10水平显著低于对照组(P<0.01)。与模型组相比，穴位组和非穴位组家兔血清中TNF-α，IL-1β，IL-6水平显著降低(P<0.01)，IL-10显著升高(P<0.05，P<0.01)。且穴位组指标的改善比非穴位组更明显。，而NAP和NC+NAP与模型组比较几乎没有变化。

3.8微循环指标变化

图9和表4显示了各组家兔微循环指标和微血管血流状态的变化。与正常组相比，模型组家兔微动、静脉血管管径显著降低，综合评分、血管阻力显著提高(P<0.01)；与模型组比较，穴位组与非穴位组家兔微动、静脉血管管径显著提高，综合评分、血管阻力显著降低(P<0.05，P<0.01)且穴位组各项微循环指标变化较非穴位组明显。而NAP和NC+NAP几乎没有变化。另一方面，对照组家兔管袢形态、血流速度及袢周状态均正常；模型组家兔出现微血管明显变细、血流呈粒摆流、缓慢淤滞，红细胞聚集等微循环障碍；与模型组相比，穴位组和非穴组家兔微循环指标明显改善。然而NC+AP和NC+NAP几乎没有变化。

表4微循环指标变化

3.9滑膜组织病理学变化

对照组家兔膝关节滑膜细胞有序、完整，无增殖、炎症细胞浸润等病理特征(图10)。模型组可观察到明显病理特征，如滑膜组织大量增生、炎症细胞浸润、组织血管扩张引起的组织充血、血管翳形成；与模型组相比，虽然穴位组与非穴位组滑膜组织病变状态均在一定程度上得到改善，但非穴位组效果不理想，而穴位组组织细胞排列整齐、少量滑膜细胞增生、炎性细胞浸润减少、无血管翳形成。NC+AP和NC+NAP与模型组相比几乎没有变化。

3.10滑膜组织MMP-1、MMP-3、TIMP-1mRNA表达变化

各组兔滑膜组织TNF-αmRNA、MMP-1mRNA、MMP-3mRNA、TIMP-1mRNA的表达见图11。与对照组比较，模型组TNF-αmRNA、MMP-1mRNA、MMP-3mRNA表达量明显升高(P<0.01)，TIMP-1mRNA表达量明显降低(P<0.01)；与模型组比较，穴位组与非穴位组滑膜组织中TNF-αmRNA、MMP-1mRNA、MMP-3mRNA表达均明显降低(P<0.05，P<0.01)，TIMP-1mRNA表达明显升高(P<0.01)；NC+AP和NC+NAP几乎无变化。

3.11滑膜组织MMP-1、MMP-3、TIMP-1蛋白表达变化

各组家兔滑膜组织相关蛋白的表达情况如图12所示。与对照组比较，模型组家兔滑膜组织MMP-1、MMP-3蛋白表达显著升高(P<0.01)、TIMP-1蛋白表达显著降低(P<0.01)；与模型组比较，穴位组与非穴位组滑膜组织中TNF-α、MMP-1、MMP-3蛋白表达均明显降低(P<0.05，P<0.01)，TIMP-1蛋白表达明显升高(P<0.01)；NC+AP和NC+NAP几乎无变化。

以上描述了本发明优选实施方式，然其并非用以限定本发明。本领域技术人员对在此公开的实施方案可进行并不偏离本发明范畴和精神的改进和变化。

Claims (10)

1.负载TNF-α-siRNA的冷冻微针，其特征在于，所述冷冻微针由TNF-α-siRNA和水组成。

2.根据权利要求1所述的冷冻微针，所述冷冻微针的针体长度1000-2000μm，底部的长度和宽度都介于400-800μm。

3.根据权利要求2所述的冷冻微针，所述冷冻微针中含有TNF-α-siRNA 300-500ng/根。

4.根据权利要求2所述的冷冻微针，所述冷冻微针最大负载破裂力为0.12-0.24N/根。

5.根据权利要求1-4任意一项所述的冷冻微针，所述TNF-α-siRNA的序列为5'—GCCACACCAAAGCAUUCAATT—3'。

6.根据权利要求1-4任意一项所述的冷冻微针，所述水为超纯水。

7.根据权利要求6所述的冷冻微针，所述超纯水为DEPC水。

8.权利要求1-7任意一项所述的冷冻微针的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

采用PDMS阴模，将TNF-α-siRNA溶液分两次加入到PDMS阴性模具中，第一次加入后将模具真空处理后进行离心，第二次离心前将模具旋转180°后再进行离心，使溶液充分进入针腔；最后将足量且适量的水作为模具基础填充模具底部，将整个模具在0-4℃条件下冷却，然后至于-15至-25℃放置2-4h，于-60℃至-100℃冰箱冻结2-4h，最后将已冻结的微针轻轻从PDMS模具脱离在液氮条件下冻结，然后置于-60℃至-100℃保存。

9.权利要求1-7任意一项所述的冷冻微针在制备治疗类风湿性关节炎的微针中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，所述治疗类风湿性关节炎的微针用于足三里穴位。

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