CN110054617A - 三嗪类化合物、其制备方法及用途 - Google Patents

三嗪类化合物、其制备方法及用途 Download PDF

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Abstract

本发明属于医药化学领域，具体涉及三嗪类化合物、其制备方法及其作为参比对照品用于(S)‑3‑(三氟甲基)‑1‑(4‑(6‑(三氟甲基)吡啶‑2‑基)‑6‑(2‑(三氟甲基)吡啶‑4‑氨基)‑1,3,5‑三嗪‑2‑基)吡咯烷‑3‑醇甲磺酸盐原料药质量研究中相关杂质定性和/或定量分析的用途。

Description

三嗪类化合物、其制备方法及用途
技术领域
本发明属于医药化学领域，具体涉及三嗪类化合物、其制备方法及其作为参比对照品用于(S)-3-(三氟甲基)-1-(4-(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-6-(2-(三氟甲基)吡啶-4-氨基)-1,3,5-三嗪-2-基)吡咯烷-3-醇甲磺酸盐原料药质量研究中相关杂质定性和/或定量分析的用途。
背景技术
异柠檬酸脱氢酶(isocitrate dehydrogenase，IDH)是三羧酸循环的限速酶，其家族包括IDH1、IDH2和IDH3三个成员，借助NAD+(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，辅酶I)或NADP+(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，辅酶II)作为辅助因子，催化异柠檬酸的氧化脱羧反应生成α-酮戊二酸(α-KG)，同时分别生成NADH(还原型辅酶I)或NADPH(还原型辅酶II)。IDH同工酶有以下三种形式：依赖NADP的胞质的IDH1和线粒体的IDH2，依赖NAD的线粒体IDH3。IDH1基因位于染色体2q33.3，定位于细胞质和过氧化物酶体中；IDH2基因位于染色体15q26.1，定位于细胞线粒体。
已经在多种癌症中鉴别出IDH2突变，所述癌症例如神经胶质瘤、多形性成胶质细胞瘤、急性髓性白血病(AML)等。IDH2的突变包括R140和R172等，这些突变发生在活性位点的关键残基处或附近(参见L.Dang等人,Nature,2009,462,739-44)。研究表明存在于癌细胞中的IDH2的突变导致所述酶具有催化α-酮戊二酸NAPH-依赖性还原为R(-)-2-羟基戊二酸(2-HG)的新的能力。已经在包含突变的肿瘤中检测到高水平的2-HG。例如，已经在患有含突变IDH的AML的患者的血浆中检测到高水平的2-HG(参见S.Gross等人,J.Exp.Med.,2010,207(2),339)。认为IDH2突变导致的高水平2-HG的产生促成癌症的形成和发展(参见L.Dang等人,Nature,2009,462,739-44)。因此，对突变型IDH2及其新生活性的抑制作为以突变型IDH2的存在为特征的癌症治疗进入药物研究人员视野。研制一种安全有效的IDH抑制剂成为治疗癌症的重要方式。
发明内容
本发明的发明人发现了一种三嗪类IDH抑制剂，该抑制剂的化合物结构如下式(I)所示，其化学名称为(S)-3-(三氟甲基)-1-(4-(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-6-(2-(三氟甲基)吡啶-4-氨基)-1,3,5-三嗪-2-基)吡咯烷-3-醇(以下简称“式(I)化合物”)：
本发明的发明人研究发现，式(I)化合物或其水合物、溶剂合物或结晶对IDH2具有好的抑制活性，非常有希望成为疗效更高、副作用更小的癌症治疗剂。
众所周知，对于人类用药，出于安全性因素要求，国内和国际管理机构对原料药(API)中未确证或毒性未定杂质的限度规定非常低，通常低于0.1％(重量)。需要对这些重要杂质进行深入研究，以确保制备得到符合药用标准、能够用于制备安全有效的药物制剂的原料药。原料药中的杂质可能是由于自身的降解而产生的，也可能来源于制备方法，例如，包括未反应的起始原料、起始原料中包含的杂质的化学衍生物、合成副产物、以及降解产物等。通过了解杂质的化学结构和合成途径，以及通过鉴别影响终产物中杂质含量的参数，能够大大增强对相关杂质的控制。
式(I)化合物及其衍生物例如式(I)化合物的药学可接受的盐、异构体、晶型或溶剂合物作为原料药可能包含多种来源的杂质，对其成药性、安全性和有效性带来隐患。因此，研究式(I)化合物及其衍生物的副产物或杂质的性质，对这些副产物或杂质进行检测控制具有重大的意义。
本发明的第一个目的是提供式A、式B、式C、式D、式E、式F或式G所示的化合物：
优选地，分离制备的式A、式B、式C、式D、式E、式F或式G化合物各包含小于1％的式A化合物(根据HPLC判断，面积归一化法)，或者分离制备的式A、式B、式C、式D、式E、式F或式G化合物的纯度至少为90％(根据HPLC判断，面积归一化法)。在一些实施方案中，分离制备的式A、式B、式C、式D、式E、式F或式G化合物的纯度至少为95％。在一些实施方案中，分离制备的式A、式B、式C、式D、式E、式F或式G化合物的纯度至少为97％。在另一些实施方案中，分离制备的式A、式B、式C、式D、式E、式F或式G化合物的纯度至少为98％。在另一些实施方案中，分离制备的式A、式B、式C、式D、式E、式F或式G化合物的纯度至少为99％。在另一些实施方案中，分离制备的式A、式B、式C、式D、式E、式F或式G化合物的纯度至少为99.5％。
本发明的第二个目的是提供式A、式B、式C、式D、式E、式F或式G化合物的制备方法：
所述的式A化合物的制备方法包括使4-氯-6-(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-N-(2-(三氟甲基)吡啶-4-基)-1,3,5-三嗪-2-胺在碱性试剂的作用下发生反应的步骤。在一些具体的实施方案中，其中所述的碱性试剂包括但不限于四丁基氟化铵、氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸铯、碳酸钾或氯化铵。根据所述的式B的制备方法，其中反应溶剂选自四氢呋喃、甲苯、二甲基亚砜、N-甲基吡咯烷酮、N,N-二甲基甲酰胺、乙醇和甲醇中的一种或几种。
所述的式B化合物的制备方法包括使2,4-二氯-6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-1,3,5-三嗪与2-三氟甲基-4-氨基吡啶反应的步骤。在一些具体的实施方案中，2,4-二氯-6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-1,3,5-三嗪与2-三氟甲基-4-氨基吡啶的摩尔比为约1:0.5至约1:5，进一步优选为1:2至约1:4，更进一步优选为约1:3。
所述的式C化合物的制备方法包括使4-氯-6-(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-N-(2-(三氟甲基)吡啶-4-基)-1,3,5-三嗪-2-胺与3-吡咯烷酮盐酸盐反应的步骤。在一些具体的实施方案中，4-氯-6-(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-N-(2-(三氟甲基)吡啶-4-基)-1,3,5-三嗪-2-胺与3-吡咯烷酮盐酸盐的摩尔比为约1:0.5至约1:5，进一步优选为1:0.8至约1:3，更进一步优选为约1:1。
所述的式D化合物的制备方法包括使4-氯-6-(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-N-(2-(三氟甲基)吡啶-4-基)-1,3,5-三嗪-2-胺与氟化试剂反应的步骤。在一些优选的实施方案中，本发明的氟化试剂包括但不限于四丁基氟化铵、氟化钾、氟化钠、氟化银、氟化铯、双(2-甲氧基乙基)氨基三氟化硫或氟化氢。在一些具体的实施方案中，4-氯-6-(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-N-(2-(三氟甲基)吡啶-4-基)-1,3,5-三嗪-2-胺与氟化试剂的摩尔比为约1:0.5至约1:10，进一步优选为约1:1至约1:8，更进一步优选为约1:1至约1:5。
所述的式E化合物的制备方法包括使2,4-二氯-6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-1,3,5-三嗪与(S)-3-(三氟甲基)吡咯烷-3-醇反应的步骤。在一些具体的实施方案中，4-氯-6-(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-N-(2-(三氟甲基)吡啶-4-基)-1,3,5-三嗪-2-胺与3-吡咯烷酮盐酸盐的摩尔比为约1:0.5至约1:5，进一步优选为1:1至约1:3，更进一步优选为约1:2。
所述的式F化合物的制备方法包括使2,4-二氯-6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-1,3,5-三嗪与2-三氟甲基-4-氨基吡啶及(S)-3-(三氟甲基)吡咯烷-3-醇反应的步骤。在一些优选的实施例中，本发明提供的式F化合物的制备方法，包括使2,4-二氯-6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-1,3,5-三嗪与2-三氟甲基-4-氨基吡啶反应制得4-氯-N-(4-氯-6-(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-1,3,5-三嗪-2-基)-6-(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-N-(2-(三氟甲基)吡啶-4-基)-1,3,5-三嗪-2-胺的步骤。在一些优选的实施例中，本发明提供的式F化合物的制备方法，包括使4-氯-N-(4-氯-6-(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-1,3,5-三嗪-2-基)-6-(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-N-(2-(三氟甲基)吡啶-4-基)-1,3,5-三嗪-2-胺与(S)-3-(三氟甲基)吡咯烷-3-醇反应的步骤。在一些优选的实施例中，根据本发明提供的式F化合物的制备方法，其中2,4-二氯-6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-1,3,5-三嗪与2-三氟甲基-4-氨基吡啶的摩尔比为约5:0.5至约2:1，进一步优选为3:1至约2:1，更进一步优选为约2:1。在一些优选的实施例中，根据本发明提供的式F化合物的制备方法，其中4-氯-N-(4-氯-6-(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-1,3,5-三嗪-2-基)-6-(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-N-(2-(三氟甲基)吡啶-4-基)-1,3,5-三嗪-2-胺与(S)-3-(三氟甲基)吡咯烷-3-醇的摩尔比为约1:0.5至约1:5，进一步优选为1:1至约1:3，更进一步优选为约1:2。
所述的式G化合物的制备方法包括使4-氯-6-(6-(二氟甲基)吡啶-2-基)-N-(2-(三氟甲基)吡啶-4-基)-1,3,5-三嗪-2-胺与(S)-3-(三氟甲基)吡咯烷-3-醇反应的步骤。在一些具体的实施例中，本发明提供的式G化合物的制备方法，进一步包括使2,4-二氯-6-(6-(二氟甲基)吡啶-2-基)-1,3,5-三嗪与2-三氟甲基-4-氨基吡啶反应制得4-氯-6-(6-(二氟甲基)吡啶-2-基)-N-(2-(三氟甲基)吡啶-4-基)-1,3,5-三嗪-2-胺的步骤。在一些优选的实施例中，本发明提供的式G化合物的制备方法，进一步包括使-(6-(二氟甲基)吡啶-2-基)-1,3,5-三嗪-2,4(1H,3H)-二酮中的羟基被卤代的步骤，其中卤代包括但不限于氯代和溴代。在一些优选的实施例中，本发明提供的式G化合物的制备方法，进一步包括使6-(二氟甲基)吡啶甲酸甲酯与缩二脲反应的步骤。在一些优选的实施例中，本发明提供的式G化合物的制备方法，进一步包括使6-(二氟甲基)吡啶甲酸甲酯与缩二脲反应的步骤。在一些优选的实施例中，本发明提供的式G化合物的制备方法，进一步包括使6-甲酰基-2-吡啶羧酸甲酯与氟化试剂反应的步骤。在一些优选的实施例中，根据本发明提供的式G化合物的制备方法，其中氟化试剂为双(2-甲氧基乙基)氨基三氟化硫。
本发明的第三个目的是提供一种定位、定量式(I)化合物甲磺酸盐中作为副产物的式A、式B、式C、式D、式E、式F或式G化合物的HPLC方法。当式(I)化合物甲磺酸盐作为原料药生产时，产品中可能会存在一定量的作为副产物的式A、式B、式C、式D、式E、式F或式G化合物。为满足药品的要求，需要检测和控制作为杂质的式A、式B、式C、式D、式E、式F或式G化合物的含量。因此，式A、式B、式C、式D、式E、式F或式G化合物可以作为参比对照品，应用于HPLC法分析式(I)化合物甲磺酸盐中相关杂质的归属和定位，可以用于式(I)化合物甲磺酸盐中作为副产物的式A、式B、式C、式D、式E、式F或式G化合物的定量分析以及用于式(I)化合物甲磺酸盐的质量分析。本发明的所述利用式A、式B、式C、式D、式E、式F或式G化合物分析式(I)化合物甲磺酸盐的HPLC方法包括以下步骤：
1)制备各含有式A、式B、式C、式D、式E、式F、式G、式(I)化合物甲磺酸盐的定位溶液；
2)制备含有式A、式B、式C、式D、式E、式F、式G和式(I)化合物甲磺酸盐的混合溶液；和
3)使用步骤1)制得的定位溶液和步骤2)制得的混合溶液通过高效液相色谱法分离式A、式B、式C、式D、式E、式F、式G和式(I)化合物甲磺酸盐，并确定式A、式B、式C、式D、式E、式F、式G和式(I)化合物甲磺酸盐的位置和含量。
在一些具体的实施方案中，根据本发明的利用式A、式B、式C、式D、式E、式F、式G和式(I)化合物甲磺酸盐的HPLC方法，其中步骤2)的所述的系统适应性溶液的制备方法包括：
I)精密称定式A、式B、式C、式D、式E、式F或式G化合物，分别用溶剂溶解，各获得相应溶液；和
II)精密称定式(I)化合物甲磺酸盐，用溶剂溶解，再加入步骤I)制得的各溶液，之后再用溶剂稀释，得到混合溶液；
其中所述溶剂为有机溶剂或有机溶剂和水的混合溶剂，优选为极性有机溶剂或有机溶剂和水的混合溶剂，更优选为N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、四氢呋喃、乙腈、乙腈和水的混合溶剂、四氢呋喃和水的混合溶剂、甲醇、乙醇或丙醇。
在本文中，式A、式B、式C、式D、式E、式F、式G和式(I)化合物甲磺酸盐还包括所述化合物的水合物、溶剂合物、结晶或药学上可接受的盐。
术语说明
除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。
在本发明中，“纯度”可以使用传统的分析方法来确认，如可容易地通过本领域所建立的和公知的适当方法(例如高压液相色谱法(HPLC)、气相色谱法(GC))等)将化合物与其它化合物完全分离，通过面积归一化法计算得到。
本发明化合物中的“氢”、“碳”、“氧”包括其所有同位素。同位素应理解为包括具有相同原子数但具有不同质量数的那些原子。举例来说，氢的同位素包括氕、氚和氘，碳的同位素包括13C和14C，氧的同位素包括16O和18O等。
附图说明
图1是式(I)化合物甲磺酸盐及杂质式A、式B、式C、式D、式E、式F和式G化合物混合进样的HPLC图谱，其中式(I)化合物甲磺酸盐为19.191min处，杂质式A化合物为10.351min处，杂质式B化合物为20.571min处，杂质式C化合物为16.598min处，杂质式E化合物为17.911min处，杂质式F化合物为23.624min处，杂质式G化合物为17.424min处。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细阐述，但本发明不限于这些实施例。以下实施例中使用的材料如无特殊说明均为商购获得。
实施例1(S)-3-(三氟甲基)-1-(4-(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-6-(2-(三氟甲基)吡啶-4-氨基)-1,3,5-三嗪-2-基)吡咯烷-3-醇的制备
步骤1 6-(三氟甲基)-吡啶甲酸甲酯的制备
将6-三氟甲基吡啶-2-甲酸(25g,130.8mmol)溶入300mL甲醇中，滴加氯化亚砜(23.3g,196.2mmol)，滴毕加热回流反应12h。反应液浓缩干，加入饱和碳酸氢钠溶液调节pH，乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，浓缩得标题化合物。
步骤2 6-(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-1,3,5-三嗪-2,4-(1H,3H)-二酮的制备
将缩二脲(13g,126.3mmol)溶入300mL乙二醇二甲醚中，分批加入氢化钠(42g,1053mmol)，加热50℃搅拌1h。加入6-(三氟甲基)-吡啶甲酸甲酯(21.6g,105.3mmol)，加热85℃反应16h。反应液倒入水中，用浓盐酸调节pH，过滤，滤饼烘干，得标题化合物。
步骤3 2,4-二氯-6-(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-1,3,5-三嗪的制备
将6-(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-1,3,5-三嗪-2,4-(1H,3H)-二酮(35g,135.6mmol)溶入200mL三氯氧磷中，加入五氯化磷(100g,542.3mmol)，加热105℃反应12h。反应液倒入水中，二氯甲烷萃取，无水硫酸钠干燥，浓缩得标题化合物。
步骤4 4-氯-6-(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-N-(2-(三氟甲基)吡啶-4-基)-1,3,5-三嗪-2-胺的制备
将2,4-二氯-6-(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-1,3,5-三嗪(7g,23.72mmol)溶入50mL四氢呋喃中，加入2-(三氟甲基)-吡啶-4-胺(4.2g,26.1mmol)，碳酸钠(3.8g,35.6mmol)，加热回流72h。反应液过滤，滤液柱层析纯化得标题化合物。
步骤5 4-(3-三氟甲基-3-羟基吡咯-1-基)-6-(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-N-(2-(三氟甲基)吡啶-4-基)-1,3,5-三嗪-2-胺的制备
将4-氯-6-(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-N-(2-(三氟甲基)吡啶-4-基)-1,3,5-三嗪-2-胺(43mg,0.10mmol)溶入5mL四氢呋喃中，加入3-三氟甲基吡咯-3-醇(19mg，0.12mmol)，碳酸钠(16mg，0.15mmol)，加热回流16h。反应液过滤，滤液柱层析纯化得标题化合物。
步骤6(S)-3-(三氟甲基)-1-(4-(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-6-(2-(三氟甲基)吡啶-4-氨基)-1,3,5-三嗪-2-基)吡咯烷-3-醇的制备
将步骤5中制得的产物4-(3-三氟甲基-3-羟基吡咯-1-基)-6-(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-N-(2-(三氟甲基)吡啶-4-基)-1,3,5-三嗪-2-胺(260mg)溶解在30mL甲醇中进行制备性分离，制备性分离方法为：仪器：MGⅡpreparative SFC(SFC-1)，制备柱：ChiralCelOD,250×30mm I.D.,5μm.，流动相：A：CO2、B：异丙醇(0.1％NH3H2O)，梯度：B 30％，流速：60mL/min,，压力：100bar，柱温：38℃，检测波长：220nm。经制备性分离后，将后流出物经过40℃水浴真空旋干，得到标题化合物(135.0mg，保留时间为5.09min)，ee＝99.7％，1H NMR(500MHz,DMSO-d6):δ10.81(s,1H),8.55-8.81(m,3H),8.27-8.32(m,1H),8.08-8.11(m,1H),7.81-8.00(m,1H),6.67(s,1H),3.73-4.11(m,4H),2.18-2.38(m,2H),ES:m/z 540.2[M+H]+。
实施例1A：(S)-3-(三氟甲基)-1-(4-(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-6-(2-(三氟甲基)吡啶-4-氨基)-1,3,5-三嗪-2-基)吡咯烷-3-醇甲磺酸盐的合成
在50L立式夹套反应釜中加入丙酮(14.2kg)、(S)-3-(三氟甲基)-1-(4-(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-6-(2-(三氟甲基)吡啶-4-氨基)-1,3,5-三嗪-2-基)吡咯烷-3-醇(2.110kg,3.91mol)，开启搅拌，加入金属清除剂Thiol(0.147kg,0.20mol)，室温搅拌1h。过滤，丙酮(4.74kg)洗涤，将滤液倒入50L反应釜中，补加丙酮(4.74kg)。将0.011kg甲磺酸(总甲磺酸质量的3％)于-20℃下缓慢滴入60mL丙酮中，将以上甲磺酸丙酮溶液缓慢滴入反应釜中，滴完加入(S)-3-(三氟甲基)-1-(4-(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-6-(2-(三氟甲基)吡啶-4-氨基)-1,3,5-三嗪-2-基)吡咯烷-3-醇甲磺酸盐晶种，室温搅拌1h。将剩余甲磺酸(0.365kg)分成4份，于-20℃下缓慢滴入丙酮(0.39kg)中，于低温下滴入反应釜中，滴完室温搅拌3h。抽滤，丙酮洗涤，滤饼60℃真空干燥12h以上，得标题化合物粗品共2.370kg，收率95.4％。
将(S)-3-(三氟甲基)-1-(4-(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-6-(2-(三氟甲基)吡啶-4-氨基)-1,3,5-三嗪-2-基)吡咯烷-3-醇甲磺酸盐粗品(2.360kg)加入20L四口烧瓶中，依次加入乙醇(5.06kg)、水(0.70kg)，剧烈搅拌，升温至回流6h，关闭加热自然冷却析晶，抽滤，乙醇与水混合液洗涤滤饼，滤饼60℃真空干燥50h以上，得标题化合物精制品2.177kg，精制收率92.2％，纯度99.7％，比旋度为+35.3°。ESI-Ms m/z:540.1[M-CH3SO3H+H]+.1H NMR(500MHz,DMSO-d6):δ10.80(s,1H,重水交换后消失),9.24(br,2H,重水交换后消失),8.54-8.72(m,2H),8.46-8.47(d,1H),8.17-8.20(t,1H),7.97-7.99(d,1H),7.66-7.82(dd,1H),3.78-4.08(m,4H),2.56(s,3H),2.18-2.37(m,2H).
实施例2：4-(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-6-((2-(三氟甲基)吡啶-4-基)氨基)-1,3,5-三嗪-2-醇
将4-氯-6-(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-N-(2-(三氟甲基)吡啶-4-基)-1,3,5-三嗪-2-胺(20g)、四氢呋喃(200mL)、四丁基氟化铵(237.4mL)依次加入到反应瓶中，升温至回流反应，反应完全后，浓缩反应液至干，加入乙酸乙酯溶解剩余物，然后加入水搅拌，析出固体，过滤。在室温下，将滤饼(10g)用二氯甲烷(50mL)打浆2-3h，过滤，滤饼40℃真空干燥过夜，得标题化合物5.2g。1H NMR(500MHz,DMSO-d6):δ8.631-8.642(1H,d),8.541-8.557(1H,d),8.475(1H,s),8.405-8.437(1H,t),8.221-8.237(1H,d),8.078-8.088(1H,d),7.686(2H,s).ESI-MS m/z:[M+H]+＝403.1.
实施例3：6-(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-N2,N4-双(2-(三氟甲基)吡啶-4-基)-1,3,5-三嗪-2,4-二胺
将2,4-二氯-6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-1,3,5-三嗪(5g,1eq)、2-甲基-四氢呋喃(50mL)、2-三氟甲基-4-氨基吡啶(8.24g,3eq)、N,N-二异丙基乙胺(3.29g,1.5eq)依次加入到反应瓶中，升温至80℃反应。反应完全后，浓缩反应液，使用硅胶柱层析纯化(石油醚:乙酸乙酯＝8:1～5:1)，得标题化合物1.20g。1H NMR(500MHz,DMSO-d6):δ10.957(2H,s,重水交换后信号消失),8.502-8.543(2H,t),8.491(2H,s),8.187-8.218(3H,s),7.984-8.000(2H,d).ESI-MS m/z:[M+H]+＝547.1.
实施例4：1-(4-(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-6-((2-(三氟甲基)吡啶-4-基)氨基)-1,3,5-三嗪-2-基)吡咯烷-3-酮
将4-氯-6-(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-N-(2-(三氟甲基)吡啶-4-基)-1,3,5-三嗪-2-胺(1g,1eq)、二氯甲烷(10mL)、3-吡咯烷酮盐酸盐(291mg,1eq)、N,N-二异丙基乙胺(922mg,3eq)依次加入到反应瓶中，室温搅拌反应。反应完全后，过滤，滤饼40℃真空干燥约4h，得标题化合物0.82g。1H NMR(500MHz,DMSO-d6):δ10.804-10.832(1H,m),8.658-8.672(1H,d),8.644-8.658(1H,d),8.557-8.568(1H,d),8.254-8.313(1H,m),8.083-8.116(1H,t),7.954-7.987(1H,m),4.080-4.113(2H,m),4.013-4.048(2H,m),2.722-2.779(2H,m).ESI-MS m/z:[M+H]+＝470.1.
实施例5：4-氟-6-(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-N-(2-(三氟甲基)吡啶-4-基)-1,3,5-三嗪-2-胺
将4-氯-6-(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-N-(2-(三氟甲基)吡啶-4-基)-1,3,5-三嗪-2-胺(5g，1eq)、四氢呋喃(100mL)、四丁基氟化铵(59.24mL，5eq)依次加入到反应瓶中，升温至回流反应，反应结束后，浓缩反应液，使用硅胶柱层析纯化(石油醚:乙酸乙酯＝4:1～1:1)，得目标化合物1.1g。1H NMR(500MHz,DMSO-d6):δ11.685(1H,s),8.590-8.601(1H,d),8.536-8.552(1H,d),8.289-8.320(1H,d),8.192-8.208(1H,d),8.106-8.121(1H,d),7.823(1H,d).ESI-MS m/z:[M+H]+＝405.1.
实施例6：(3S,3'S)-1,1'-(6-(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-1,3,5-三嗪-2,4-取代基)双(3-(三氟甲基)吡咯烷-3-醇)
将2,4-二氯-6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-1,3,5-三嗪(1g，1eq)、2-甲基四氢呋喃(25mL)、(S)-3-(三氟甲基)吡咯烷-3-醇(1.05g，2eq)依次加入到反应瓶中，室温搅拌1-2h。加入N,N-二异丙基乙胺(1.31mg,3eq)，室温搅拌反应过夜。反应完全后，浓缩反应液，使用硅胶柱层析纯化，得标题化合物560mg。1H NMR(500MHz,DMSO-d6):δ8.563-8.578(1H,m),8.230-8.261(1H,t),8.032-8.047(1H,d),6.515-6.534(2H,m),3.652-4.041(8H,m),2.244-2.306(2H,m),2.103-2.141(2H,m).ESI-MS m/z:[M+H]+＝533.1.
实施例7：(3S,3'S)-1,1'-(6,6'-(2-(三氟甲基)吡啶-4-氨基)双(4-(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-1,3,5-三嗪-6,2-取代基))双(3-(三氟甲基)吡咯烷-3-醇
将2,4-二氯-6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-1,3,5-三嗪(10g，2eq)、2-三氟甲基-4-氨基吡啶(2.75g，1eq)、四氢呋喃(60mL)依次加入到反应瓶中，室温搅拌0.5h，然后加入N,N-二异丙基乙胺(3.29g，1.5eq)。HPLC监控反应完全后，浓缩反应液至干，然后加入乙酸乙酯溶解残留物，依次用0.5M HCl溶液、饱和碳酸氢钠溶液洗涤有机相。无水硫酸钠干燥有机相，过滤，浓缩得4-氯-N-(4-氯-6-(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-1,3,5-三嗪-2-基)-6-(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-N-(2-(三氟甲基)吡啶-4-基)-1,3,5-三嗪-2-胺粗品。
取4-氯-N-(4-氯-6-(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-1,3,5-三嗪-2-基)-6-(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-N-(2-(三氟甲基)吡啶-4-基)-1,3,5-三嗪-2-胺粗品(6g)、(S)-3-(三氟甲基)吡咯烷-3-醇(2.44g)、二氯甲烷(60mL)、N,N-二异丙基乙胺(2.75g)依次加入到反应瓶中，室温搅拌反应。反应完全后，浓缩反应液，使用硅胶柱层析纯化，得2.5g粗品。然后继续纯化，制备得730mg标题化合物。1H NMR(500MHz,DMSO-d6):δ8.703-8.714(1H,d),8.477-8.493(1H,d),8.446-8.468(1H,m),8.275-8.293(1H,d),8.223-8.239(1H,d),8.207-8.223(1H,d),8.080(1H,s),8.065(1H,s),7.692-7.727(1H,m),6.577-6.624(2H,d),3.498-4.093(8H,m),2.088-2.316(4H,m).ESI-MS m/z:[M+H]+＝917.2
实施例8：(S)-1-(4-(6-(二氟甲基)吡啶-2-基)-6-((2-(三氟甲基)吡啶-4-基)氨基)-1,3,5-三嗪-2-基)-3-(三氟甲基)吡咯烷-3-醇
步骤1：6-(二氟甲基)吡啶甲酸甲酯的制备
将6-甲酰基-2-吡啶羧酸甲酯(4g，1eq)、二氯甲烷(60mL)、无水乙醇(0.2mL)依次加入到反应瓶中，降温至-35℃～-40℃，滴加双(2-甲氧基乙基)氨基三氟化硫(21.42g，4eq)，保持温度不变。滴毕，保温反应。TLC监控反应反应完全后，将50mL水缓慢滴加到反应液中淬灭反应，分离有机相，二氯甲烷萃取水相，合并有机相，浓缩，使用硅胶柱层析纯化，得4.02g标题化合物。
步骤2：6-(6-(二氟甲基)吡啶-2-基)-1,3,5-三嗪-2,4(1H,3H)-二酮的制备
将6-(二氟甲基)吡啶甲酸甲酯(4g，1eq)、缩二脲(2.64g，1.2eq)、无水乙醇依次加入到反应瓶中，升温至60℃，然后加入钛酸四乙酯(4mL)，保温反应0.5h。升温至80℃，滴加甲醇钠的甲醇溶液(12mL)，其后保温反应。TLC监控反应完全后，降至室温，加入60mL水淬灭反应，然后用浓HCl调节pH<1，过滤，40℃真空干燥过夜，得3.00g标题化合物。
步骤3：2,4-二氯-6-(6-(二氟甲基)吡啶-2-基)-1,3,5-三嗪的制备
将三氯氧磷(20mL)加入反应釜中，升温至50℃时加入6-(6-(二氟甲基)吡啶-2-基)-1,3,5-三嗪-2,4(1H,3H)-二酮(3g，1eq)。通氮气吹扫10分钟，加入五氯化磷(10.40g，4eq)，升温至110±5℃反应。TLC监控反应完全后，浓缩反应液直至干，向反应瓶中加入乙酸乙酯，然后在10℃下将有机相滴加到碳酸钠水溶液(0.1g/mL)中淬灭三氯氧磷。分离有机相，随后使用乙酸乙酯萃取水相，合并有机相，使用无水硫酸钠干燥，过滤，将浓缩至干得3.25g标题化合物。
步骤4：4-氯-6-(6-(二氟甲基)吡啶-2-基)-N-(2-(三氟甲基)吡啶-4-基)-1,3,5-三嗪-2-胺的制备
将2,4-二氯-6-(6-(二氟甲基)吡啶-2-基)-1,3,5-三嗪(3.25g，1eq)、2-甲基四氢呋喃(70mL)、2-三氟甲基-4-氨基吡啶(2.09g，1.1eq)、N,N-二异丙基乙胺(2.27g，1.5eq)依次加入到反应瓶中，升温至80℃反应。TLC监控反应完全后，冷却至室温，用乙酸乙酯稀释；0.5mol/L稀盐酸洗涤三次，有机相碳酸氢钠洗涤、饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩滤液至干，得4.35g标题化合物。
步骤5：(S)-1-(4-(6-(二氟甲基)吡啶-2-基)-6-((2-(三氟甲基)吡啶-4-基)氨基)-1,3,5-三嗪-2-基)-3-(三氟甲基)吡咯烷-3-醇的制备
将4-氯-6-(6-(二氟甲基)吡啶-2-基)-N-(2-(三氟甲基)吡啶-4-基)-1,3,5-三嗪-2-胺(4.35g，1eq)、二氯甲烷(30mL)、N,N-二异丙基乙胺(2.10g，1.5eq)、(S)-3-(三氟甲基)吡咯烷-3-醇(1.64g，0.98eq)依次加入到反应瓶中，室温搅拌反应。TLC监控反应完全后，浓缩反应液，使用硅胶柱层析(石油醚:乙酸乙酯＝5:1～3:1)纯化，得4.63g标题化合物。1H NMR(500MHz,DMSO-d6):δ10.82(s,1H),8.52-8.78(m,2H),8.49-8.51(d,1H),8.15-8.18(t,1H),7.86-7.88(d,1H),7.74-7.92(dd,1H),6.85-7.07(t,1H),6.63-6.66(d,1H),3.75-4.09(m,4H),2.17-2.37(m,2H).ESI-MS m/z:[M+H]+＝522.1.
实验例1：式A、式B、式C、式D、式E、式F和式G化合物的定位分析
杂质定位溶液的配制：精密称取杂质式A、式B、式C、式D、式E、式F和式G化合物各适量，用乙腈-水(70:30)溶解并稀释制成每1mL中约含0.5mg的各杂质对照品母液，分别作为杂质定位溶液，备用；
式I化合物甲磺酸盐对照品溶液的配制：精密称取式I化合物甲磺酸盐对照品适量，用乙腈-水(70:30)溶解并稀释制成每1mL中约含0.5mg的式I化合物甲磺酸盐，备用；
混合溶液的配制：分别精密量取以上制得的式A、式B、式C、式D、式E、式F和式G化合物定位溶液适量及式I化合物甲磺酸盐对照品溶液适量，用稀释液定容至刻度，摇匀，即得。
分别精密量取各杂质定位溶液、式I化合物甲磺酸盐对照品溶液及混合溶液各10μL，注入液相色谱仪，依据表1梯度洗脱样品，记录色谱图，其中，色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Eclipse Plus C18，4.6×250mm,3.5μm)，以10mmol/L乙酸铵溶液(pH3.0±0.1)为流动相A，以乙腈为流动相B，流速为1.0mL/min，柱温为40℃。
表1
时间(min) 0 20 30 31 36
流动相A(％) 75 30 30 75 75
流动相B(％) 25 70 70 25 25
在265nm波长处检测并确定位置和含量。
实验结果显示，在图1中杂质式A化合物为10.351min处，杂质式B化合物为20.571min处，杂质式C化合物为16.598min处，杂质式E化合物为17.911min处，杂质式F化合物为23.624min处，杂质式G化合物为17.424min处，具体见图1。
实验例2：U87-MG(IDH2-R140Q)突变细胞皮下移植瘤体内药效评价
1.实验材料
1.1受试化合物：以上实施例制备的本发明的式I化合物或其可药用盐或其水合物、溶剂合物或结晶。每个受试化合物用溶媒(2％无水乙醇∶10％∶88％生理盐水(v/v/v))配制为相应浓度溶液。
对照化合物为WO2013/102431中公开的化合物409(参见说明书第134页)，化学名为2-methyl-l-(4-(6-(trifluoromethyl)pyridin-2-yl)-6-(2-(trifluoromethyl)pyridin-4-ylamino)-1,3,5-triazin-2yla mino)propan-2-ol(AG-221)，参照WO2013/102431中描述的方法制备并通过氢谱和质谱鉴定。
1.2细胞：人胶质母细胞瘤细胞株U87-MG，购于美国典型培养物保藏中心(ATCC)；
过表达突变型IDH2(R140Q)的U87-MG细胞株[U87-MG(IDH2-R140Q)]，由南京金斯瑞生物科技有限公司使用常规的分子生物学技术构建，所述方法包括以下简要步骤：
(1)将野生型IDH2亚克隆入Lenti-Puro载体(购自GenScript’s MGC library，Slot:IRAU-112-d-10；IRAT-17-b-7)，通过点突变获得IDH2(R140Q)突变体，制备转染级携带有IDH2(R140Q)的重组慢病毒载体；
(2)检测病毒的滴度；
(3)使用构建的重组慢病毒载体转导U87-MG宿主细胞，使用嘌呤霉素筛选稳定细胞，并通过qPCR和蛋白印迹确证IDH2(R140Q)的表达；
(4)通过有限稀释获得单克隆，并通过qPCR和蛋白印迹以及使用LC-MS检测2-羟基戊二酸(2-HG)含量来确认。
1.3试剂：MEM培养基，购自于美国Invitrogen公司；
胎牛血清(FBS)，购自于美国Invitrogen公司；
胰蛋白酶，购自于美国Invitrogen公司；
2-羟基戊二酸(D-α-Hydroxyglutaric acid disodium salt,2-HG)标准品，购自于Sigma公司，Cat.No.SLBD 8946V，纯度≥95％；
非那西汀标准品(内标/IS)：购自于Sigma公司，纯度≥98％；
乙腈/甲醇(色谱纯)购自Merck公司；
其余试剂均为市售分析纯。
1.4动物：
BALB/c nude mice，6-7周龄，雌性，18-22g，购自南京金莱畅公司。
1.5仪器：AB SCIEX API4500液质联用仪(LC-MS/MS)，配有日本岛津超高效液相色谱系统(LC-30A)、美国AB质谱系统(API4500)、电喷雾离子源及Analyst 1.6.2工作站；
Milli-Q超纯水机(Millipore Inc)；
TARGIN VX-II振荡器；
HITACHICF16RXII台式高速冷冻离心机；
Thermo电动移液器。
2.实验方法
2.1动物接种：
扩增U87-MG(IDH2-R140Q)和U87-MG细胞(野生型)，将处于对数生长期的肿瘤细胞用于体内肿瘤接种。按2×106细胞量/小鼠(细胞悬液体积与Matrigel体积比为1：0.8)，分别接种至每组3只小鼠身体右侧腰背部皮下。
2.2分组及给药：
无突变对照组使用U87-MG细胞株接种的裸鼠，受试化合物组和溶媒对照组使用U87-MG(IDH2-R140Q)接种的裸鼠。
各组分别灌胃给予相应浓度的化合物溶液，给药体积为100μL/10g体重，对照组均给予相同体积的空白溶媒。
给药10天后，处死小鼠，剥离肿瘤，匀浆，检测肿瘤中2-HG含量。
2.3LC-MS/MS分析条件
2.3.1色谱条件
色谱柱：Shim-pack XR-ODS 30L*2.0；流动相：乙腈-0.2％氨水，5mM乙酸铵水溶液；柱温：30℃；流速：0.4mL/min；梯度洗脱条件如下表2：
表2 色谱洗脱条件
保留时间：tR,2-HG≈0.21min；tR,IS≈1.41min。
2.3.2质谱条件
选用大气压电离离子源(APCI)，设定源参数分别为：喷雾电压(IonSprayVoltage/IS)-4500V，辅助气1(Ion Source Gas 1/GS1，N2)55Arb，辅助气2(Ion SourceGas 2/GS 2，N2)55Arb，辅助气加热温度(Temperature/TEM)500℃，气帘气(Curtain Gas/CUR)25Arb，碰撞气(Collision Gas/CAD，N2)8Pa。
选用负离子模式(Negative)下多重离子反应监测(MRM)。2-HG的MRM参数为：母离子(Q 1 Mass)为146.9Da，子离子(Q 3 Mass)为129.0Da，去簇电压(DeclusteringPotential/DP)为-15.3V，碰撞电压(Collision Energy/CE)为-14.5eV。内标(IS)的MRM参数为：母离子(Q 1 Mass)为178.0Da，子离子(Q 3 Mass)为149.0Da，去簇电压(Declustering Potential/DP)为-51V，碰撞电压(Collision Energy/CE)为-17eV。
2.4数据处理
经LC-MS/MS测得每组中各只动物肿瘤匀浆液2-HG浓度，计算百分比(2-HG％)，计算公式如下，
2-HG％＝(给药组瘤内2-HG浓度-U87-MG对照组瘤内2-HG浓度)/(U87-MG(IDH2-R140Q)对照组瘤内2-HG浓度-U87-MG对照组瘤内2-HG浓度)×100％
本发明的化合物给药后小鼠肿瘤内2-HG的相对百分含量(均值)如表3所示。
表3 给药10天后瘤内2-HG％
组别 剂量(mg/kg) 2-HG％
U87-MG对照组 0
U87-MG(IDH2-R140Q)对照组 100
AG-221 25 -4
AG-221 12.5 9
AG-221 6.25 58
实施例1 6.25 -2
实验结果表明，在U87-MG(IDH2-R140Q)突变型细胞皮下移植瘤模型中，本发明的化合物具有非常好的抑制肿瘤内因IDH2突变导致的高水平2-HG的能力，实施例1的化合物以低剂量6.25mg/kg的剂量给药能够完全抑制2-HG至野生型对照组水平，而阳性化合物AG-221在高剂量25mg/kg才能达到相同的功效，两者剂量相差4倍。预计本发明的化合物具有好的抑制IDH2突变导致的促成肿瘤的生成和进展的作用。
实验例3：人急性髓性白血病NOD/SCID动物模型
1.实验材料
1.1受试化合物：以上实施例制备的本发明的式I化合物其可药用盐或其水合物、溶剂合物或结晶及对照化合物AG-221。每个受试化合物用溶媒(2％无水乙醇∶10％∶88％生理盐水(v/v/v))配制为相应浓度溶液。
1.2细胞：人急性髓性白血病细胞AM7577，由中美冠科生物技术(北京)有限公司提供；
1.3试剂：FITC anti-human CD45，货号304038，克隆号HI30，购自Biolegend；
1.4动物：
NOD/SCID小鼠，3-4周龄，雌性，购自北京华阜康生物科技股份有限公司；
1.5仪器：流式细胞仪FACSCalibur，BD；
2.实验方法
2.1动物接种：
每只小鼠按照100uL PBS中重悬2×106个细胞的量通过尾静脉接种。
2.2分组及给药：
每周取动物眼眶血，标记人CD45，检测阳性百分比，当外周血CD45+细胞比例达到5％后分组。在接种后第40天外周血CD45+细胞比例达到5％。分组后，每日一次灌胃给药，给药时间为14天。分组及给药情况如表4所示。
表4
组别 动物数量 给药组 剂量(mg/kg)*
1 8 vehicle -
2 4 AG-221 45
3 8 AG-221 15
4 8 实施例1 45
5 8 实施例1 15
*注：动物的给药体积按照10μL/g体重进行调整。
2.3存活率和生存期的观察：
观察给药后动物的死亡率以及存活动物的生存期。给药14天后各组动物存活数量如表5所示。
表5
组别 给药组 剂量(mg/kg) 动物数量 存活动物数
1 vehicle - 8 1
2 AG-221 45 4 3
3 AG-221 15 8 6
4 实施例1 45 8 7
5 实施例1 15 8 7
实验结果表明，给药14天后，对照组动物仅有1只存活，阳性化合物AG-221高剂量(45mg/kg)组4只动物中有3只存活，阳性化合物AG-221低剂量(15mg/kg)组8只动物中有6只存活，而本发明化合物的低高剂量组均有7只动物存活。与溶媒对照组相比，使用本发明的化合物治疗的小鼠生存率明显增加，实施例1的化合物45mg/kg以及15mg/kg剂量组动物存活率均略高与AG-221。本发明化合物可显著提高荷瘤小鼠的生存率。
实验例4：化合物口服暴露量评价
受试化合物：以上实施例制备的本发明的式(I)化合物及式(I)化合物的甲磺酸盐，每个化合物用0.5％的CMCNa配制为混悬溶液，口服给药剂量以游离碱计为15mg/kg。
雄性SD大鼠，SPF级，购自上海西普尔必凯实验动物有限公司；体重190-220g。
口服给药后于15,30min,1,2,6,10,24h自眼眶静脉丛采血于肝素化EP管中，暂置于碎冰上，离心取血浆处理后，使用LC-MS/MS进行检测，将测得的各时间点的血药浓度绘制成药物浓度-时间曲线，并计算药代动力学参数。实验结果见表6。
表6
受试化合物 T<sub>1/2</sub>(h) Cmax(ng/ml) AUC(h*ng/ml)
实施例1 13.3 683.3 11873.1
实施例1A 23.1 1376.7 25816.8
结果以平均值表示(n＝3)
以上实验结果表明式(I)化合物的甲磺酸盐的Cmax及AUC均明显优于式(I)化合物。
尽管以上已经对本发明作了详细描述，但是本领域技术人员理解，在不偏离本发明的精神和范围的前提下可以对本发明进行各种修改和改变。本发明的权利范围并不限于上文所作的详细描述，而应归属于权利要求书。

Claims (10)

1.式A、式B、式C、式D、式E、式F或式G所示的化合物：
2.根据权利要求1所述的式A、式B、式C、式D、式E、式F或式G所示的化合物，其中式A、式B、式C、式D、式E、式F或式G化合物的纯度至少为90％，优选至少为95％，更优选至少为98％。
3.制备式A所示的化合物的方法，
包括使4-氯-6-(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-N-(2-(三氟甲基)吡啶-4-基)-1,3,5-三嗪-2-胺在碱性试剂的作用下发生反应的步骤。
4.制备式B所示的化合物的方法，
包括使2,4-二氯-6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-1,3,5-三嗪与2-三氟甲基-4-氨基吡啶反应的步骤。
5.制备式C所示的化合物的方法，
包括使4-氯-6-(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-N-(2-(三氟甲基)吡啶-4-基)-1,3,5-三嗪-2-胺与3-吡咯烷酮盐酸盐反应的步骤。
6.制备式D所示的化合物的方法，
包括使4-氯-6-(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-N-(2-(三氟甲基)吡啶-4-基)-1,3,5-三嗪-2-胺与氟化试剂反应的步骤。
7.制备式E所示的化合物的方法，
包括使2,4-二氯-6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-1,3,5-三嗪与(S)-3-(三氟甲基)吡咯烷-3-醇反应的步骤。
8.制备式F所示的化合物的方法，
包括使2,4-二氯-6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-1,3,5-三嗪与2-三氟甲基-4-氨基吡啶及(S)-3-(三氟甲基)吡咯烷-3-醇反应的步骤。
9.制备式G所示的化合物的方法，
包括使4-氯-6-(6-(二氟甲基)吡啶-2-基)-N-(2-(三氟甲基)吡啶-4-基)-1,3,5-三嗪-2-胺与(S)-3-(三氟甲基)吡咯烷-3-醇反应的步骤。
10.根据权利要求1的式A、式B、式C、式D、式E、式F或式G所示的化合物作为参比对照品的用途。
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