CN110054615B

CN110054615B - 三嗪类idh抑制剂甲磺酸盐的晶型

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Publication number: CN110054615B
Application number: CN201910047425.0A
Authority: CN
Inventors: 赵立文; 张瑾; 陈程; 许成龙; 王成
Original assignee: Nanjing Sanhome Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Nanjing Sanhome Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2018-01-19
Filing date: 2019-01-18
Publication date: 2021-06-15
Anticipated expiration: 2039-01-18
Also published as: CN110054615A

Abstract

本发明属于医药化学领域，涉及IDH抑制剂的甲磺酸盐的晶型及其制备方法，具体涉及式(I)的(S)‑3‑(三氟甲基)‑1‑(4‑(6‑(三氟甲基)吡啶‑2‑基)‑6‑(2‑(三氟甲基)吡啶‑4‑氨基)‑1,3,5‑三嗪‑2‑基)吡咯烷‑3‑醇的甲磺酸盐的晶型及其制备方法，所述的甲磺酸盐晶型可用于制备治疗癌症的药物，

Description

三嗪类IDH抑制剂甲磺酸盐的晶型

技术领域

本发明属于医药化学领域，具体涉及(S)-3-(三氟甲基)-1-(4-(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-6-(2-(三氟甲基)吡啶-4-氨基)-1,3,5-三嗪-2-基)吡咯烷-3-醇甲磺酸盐的晶型及其制备方法与用途。

背景技术

异柠檬酸脱氢酶(isocitrate dehydrogenase，IDH)是三羧酸循环的限速酶，其家族包括IDH1、IDH2和IDH3三个成员，借助NAD⁺(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，辅酶I)或NADP⁺(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，辅酶II)作为辅助因子，催化异柠檬酸的氧化脱羧反应生成α-酮戊二酸(α-KG)，同时分别生成NADH(还原型辅酶I)或NADPH(还原型辅酶II)。IDH同工酶有以下三种形式：依赖NADP的胞质的IDH1和线粒体的IDH2，依赖NAD的线粒体IDH3。IDH1基因位于染色体2q33.3，定位于细胞质和过氧化物酶体中；IDH2基因位于染色体15q26.1，定位于细胞线粒体。

已经在多种癌症中鉴别出IDH2突变，所述癌症例如神经胶质瘤、多形性成胶质细胞瘤、急性髓性白血病(AML)等。IDH2的突变包括R140和R172等，这些突变发生在活性位点的关键残基处或附近(参见L.Dang等人,Nature,2009,462,739-44)。研究表明存在于癌细胞中的IDH2的突变导致所述酶具有催化α-酮戊二酸NAPH-依赖性还原为R(-)-2-羟基戊二酸(2-HG)的新的能力。已经在包含突变的肿瘤中检测到高水平的2-HG。例如，已经在患有含突变IDH的AML的患者的血浆中检测到高水平的2-HG(参见S.Gross等人,J.Exp.Med.,2010,207(2),339)。认为IDH2突变导致的高水平2-HG的产生促成癌症的形成和发展(参见L.Dang等人,Nature,2009,462,739-44)。因此，对突变型IDH2及其新生活性的抑制作为以突变型IDH2的存在为特征的癌症治疗进入药物研究人员视野。研制一种安全有效的IDH抑制剂成为治疗癌症的重要方式。

发明内容

本发明的发明人发现了一种三嗪类IDH抑制剂，该抑制剂的化合物结构如下式(I)所示，其化学名称为(S)-3-(三氟甲基)-1-(4-(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-6-(2-(三氟甲基)吡啶-4-氨基)-1,3,5-三嗪-2-基)吡咯烷-3-醇(以下简称“式(I)化合物”)：

本发明的发明人研究发现，式(I)化合物或其水合物、溶剂合物或结晶对IDH2具有好的抑制活性，非常有希望成为疗效更高、副作用更小的癌症治疗剂。

本领域技术人员知道，药用活性化合物的晶型结构往往影响其化学稳定性、溶解度等性质，因此需要深入研究寻找适合药用的晶型。

本发明的目的是提供一种水溶性好、生物利用度高、稳定性高的三嗪类IDH抑制剂的甲磺酸盐的晶型。具体地说，本发明提供一种如式(I)所示的(S)-3-(三氟甲基)-1-(4-(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-6-(2-(三氟甲基)吡啶-4-氨基)-1,3,5-三嗪-2-基)吡咯烷-3-醇的甲磺酸盐晶型，

本发明的发明人对式(I)化合物的甲磺酸盐晶型进行了核磁共振氢谱(¹H-NMR)、X-射线粉末衍射、差示扫描热分析(DSC)以及热重分析(TGA)检测。

本发明一方面提供式(I)化合物的甲磺酸盐晶型A，¹H-NMR谱显示本发明式(I)化合物的甲磺酸盐晶型A结构中(S)-3-(三氟甲基)-1-(4-(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-6-(2-(三氟甲基)吡啶-4-氨基)-1,3,5-三嗪-2-基)吡咯烷-3-醇与甲磺酸的摩尔比为约1:0.99。

在一些实施方案中，本发明式(I)化合物的甲磺酸盐晶型A的X-射线粉末衍射图谱，参见图1，使用Cu-Ka辐射，以2θ角度表示X-射线粉末衍射图，其中在约7.725±0.2、8.934±0.2、13.193±0.2、17.885±0.2、24.413±0.2处有特征峰。

进一步地，本发明式(I)化合物的甲磺酸盐晶型A的X-射线粉末衍射图谱在约7.725±0.2、8.934±0.2、13.193±0.2、17.885±0.2、24.413±0.2、25.672±0.2处有特征峰。

再进一步地，本发明式(I)化合物的甲磺酸盐晶型A的X-射线粉末衍射图谱在约7.725±0.2、8.934±0.2、13.193±0.2、17.885±0.2、20.015±0.2、21.020±0.2、22.119±0.2、22.898±0.2、24.413±0.2、25.67±0.2处有特征峰。

更进一步地，本发明式(I)化合物的甲磺酸盐晶型A的X-射线粉末衍射图谱在约7.725±0.2、8.934±0.2、13.193±0.2、15.444±0.2、16.836±0.2、17.436±0.2、17.885±0.2、18.633±0.2、20.015±0.2、20.678±0.2、21.020±0.2、21.279±0.2、22.119±0.2、22.898±0.2、24.413±0.2、25.672±0.2、28.288±0.2、31.482±0.2、32.581±0.2、33.871±0.2处有特征峰。

非限制性的，在一个具体的实施方案中，本发明式(I)化合物的甲磺酸盐晶型A具有如图1所示的X-射线粉末衍射图谱。

非限制性的，在一个具体的实施方案中，本发明式(I)化合物的甲磺酸盐晶型A的DSC图谱(参见图2)显示在285.9℃(起点温度)有一尖锐的吸热峰。

非限制性的，在一个具体的实施方案中，本发明式(I)化合物的甲磺酸盐晶型A具有如图2所示的热重分析(TGA)图谱。

本发明提供一种所述的式(I)所示的(S)-3-(三氟甲基)-1-(4-(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-6-(2-(三氟甲基)吡啶-4-氨基)-1,3,5-三嗪-2-基)吡咯烷-3-醇的甲磺酸盐晶型A的制备方法，包括将(S)-3-(三氟甲基)-1-(4-(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-6-(2-(三氟甲基)吡啶-4-氨基)-1,3,5-三嗪-2-基)吡咯烷-3-醇与甲磺酸溶于有机溶剂中反应，析出结晶的步骤。

在一些实施方案中，本发明提供一种所述的式(I)所示的(S)-3-(三氟甲基)-1-(4-(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-6-(2-(三氟甲基)吡啶-4-氨基)-1,3,5-三嗪-2-基)吡咯烷-3-醇的甲磺酸盐晶型A的制备方法，具体包括如下步骤：

(1)将(S)-3-(三氟甲基)-1-(4-(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-6-(2-(三氟甲基)吡啶-4-氨基)-1,3,5-三嗪-2-基)吡咯烷-3-醇与甲磺酸溶于有机溶剂中反应，析出结晶；和

(2)过滤、洗涤、干燥。

上述反应步骤(1)中对原料(S)-3-(三氟甲基)-1-(4-(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-6-(2-(三氟甲基)吡啶-4-氨基)-1,3,5-三嗪-2-基)吡咯烷-3-醇的存在形态没有特别限定，可以使用任意晶体或无定型固体。

在一些优选的实施方案中，上述反应步骤(1)中原料(S)-3-(三氟甲基)-1-(4-(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-6-(2-(三氟甲基)吡啶-4-氨基)-1,3,5-三嗪-2-基)吡咯烷-3-醇与甲磺酸的摩尔比为约1:0.5至约1:5，进一步优选为约1:0.8至约1:3，更进一步优选为约1:0.9至约1:2。

在一个具体的实施方案中，上述反应步骤(1)中原料(S)-3-(三氟甲基)-1-(4-(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-6-(2-(三氟甲基)吡啶-4-氨基)-1,3,5-三嗪-2-基)吡咯烷-3-醇与甲磺酸的摩尔比为约1:1.5。

上述反应步骤(1)中的有机溶剂为有机溶剂或它们的混合溶液，所述有机溶剂选自碳原子数小于6的醇类、酮类、酯类、醚类、腈类、烃类溶剂和四氢呋喃等，所述有机溶剂优选选自甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、正戊醇、正己醇、丙酮、甲基乙基酮、甲基异丁基酮、乙酸乙酯、乙醚、乙腈、环己烷和四氢呋喃等，更优选选自甲醇、乙醇、异丙醇、正丁醇、乙醚、环己烷、丙酮和四氢呋喃等。

在一些实施方案中，根据本发明的式(I)化合物的甲磺酸盐晶型A的制备方法，其中反应温度为约10℃-约70℃，滴加甲磺酸时内温为约0℃至约40℃，反应时间为约0.5h至约8h。在另一些实施方案中，反应温度为约20℃至约60℃，滴加甲磺酸时内温为约5℃至约30℃，反应时间为约3h至约6h。

本发明提供另一种所述的式(I)所示的(S)-3-(三氟甲基)-1-(4-(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-6-(2-(三氟甲基)吡啶-4-氨基)-1,3,5-三嗪-2-基)吡咯烷-3-醇的甲磺酸盐晶型A的制备方法，为单一溶剂晶浆结晶法。在一些具体的实施方案中，所述方法包括例如将(S)-3-(三氟甲基)-1-(4-(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-6-(2-(三氟甲基)吡啶-4-氨基)-1,3,5-三嗪-2-基)吡咯烷-3-醇甲磺酸盐溶于有机溶剂中得到悬浊液的步骤。在一些优选的实施方案中，所述方法进一步包括搅拌的步骤。优选地，所述有机溶剂为异丙醇、正丁醇、水、丙酮、异丙醚、乙酸乙酯、乙酸异丙酯水饱和的乙酸乙酯、四氢呋喃、1,4-二氧六环、乙腈、氯仿、甲苯或正庚烷。

本发明提供另一种所述的式(I)所示的(S)-3-(三氟甲基)-1-(4-(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-6-(2-(三氟甲基)吡啶-4-氨基)-1,3,5-三嗪-2-基)吡咯烷-3-醇的甲磺酸盐晶型A的制备方法，为单一溶剂挥发结晶法。在一些具体的实施方案中，所述方法包括例如将(S)-3-(三氟甲基)-1-(4-(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-6-(2-(三氟甲基)吡啶-4-氨基)-1,3,5-三嗪-2-基)吡咯烷-3-醇甲磺酸盐溶于有机溶剂中溶液澄清后，过滤，滤液放置在一定温度下挥发干的步骤。优选地，所述有机溶剂为甲醇、乙醇、三氟乙醇、硝基甲烷、丙酮、四氢呋喃、1,4-二氧六环、乙腈、二氯甲烷、正丙醇、氯仿或二甲亚砜。

本发明提供另一种所述的式(I)所示的(S)-3-(三氟甲基)-1-(4-(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-6-(2-(三氟甲基)吡啶-4-氨基)-1,3,5-三嗪-2-基)吡咯烷-3-醇的甲磺酸盐晶型A的制备方法，为混合溶剂晶浆结晶法。在一些具体的实施方案中，所述方法包括例如将(S)-3-(三氟甲基)-1-(4-(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-6-(2-(三氟甲基)吡啶-4-氨基)-1,3,5-三嗪-2-基)吡咯烷-3-醇甲磺酸盐溶于有机溶剂中，搅拌，过滤的步骤。优选地，所述有机溶剂选自异丙醇、丙酮、乙醚、乙酸乙酯、1,4-二氧六环、乙腈、正庚烷和四氢呋喃中的两种或多种溶剂。

本发明提供另一种所述的式(I)所示的(S)-3-(三氟甲基)-1-(4-(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-6-(2-(三氟甲基)吡啶-4-氨基)-1,3,5-三嗪-2-基)吡咯烷-3-醇的甲磺酸盐晶型A的制备方法，为高分子模板结晶法。在一些具体的实施方案中，所述方法包括例如将(S)-3-(三氟甲基)-1-(4-(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-6-(2-(三氟甲基)吡啶-4-氨基)-1,3,5-三嗪-2-基)吡咯烷-3-醇甲磺酸盐溶于有机溶剂中(优选至澄清后)，过滤，滤液中加入高分子材料，挥发的步骤。优选地，所述有机溶剂选自甲醇、乙醇、三氟乙醇、硝基甲烷、二氯甲烷、丙酮、四氢呋喃、1,4-二氧六环、乙腈和正丙醇中的一种或多种，所述的高分子材料选自聚烯丙基胺盐酸盐、聚乙烯醇124、羟丙基纤维素、聚氯乙烯、聚乙二醇4000、聚甲基丙烯酸甲酯、羟甲基纤维素钠、聚维酮K30、聚环氧乙烷和乙基纤维素。

本发明提供另一种所述的式(I)所示的(S)-3-(三氟甲基)-1-(4-(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-6-(2-(三氟甲基)吡啶-4-氨基)-1,3,5-三嗪-2-基)吡咯烷-3-醇的甲磺酸盐晶型A的制备方法，为研磨结晶法。在一些具体的实施方案中，所述方法包括例如将(S)-3-(三氟甲基)-1-(4-(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-6-(2-(三氟甲基)吡啶-4-氨基)-1,3,5-三嗪-2-基)吡咯烷-3-醇甲磺酸盐放入研磨容器中，加入有机溶剂研磨至干的步骤。在一个具体的实施方案中，所述有机溶剂为乙酸乙酯。

按照本发明的方法制备得到的甲磺酸盐晶型A不含有或者含有较低含量的残留溶剂，符合国家药典规定的有关医药产品残留溶剂的限量要求，可以较好的作为医药活性成分使用。

本发明另一方面提供式(I)化合物的甲磺酸盐晶型G。

非限制性的，本发明式(I)化合物的甲磺酸盐晶型G的一个典型实例具有如图3所示的X-射线粉末衍射图谱。

本发明提供所述的式(I)所示的(S)-3-(三氟甲基)-1-(4-(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-6-(2-(三氟甲基)吡啶-4-氨基)-1,3,5-三嗪-2-基)吡咯烷-3-醇的甲磺酸盐晶型G的制备方法，包括将(S)-3-(三氟甲基)-1-(4-(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-6-(2-(三氟甲基)吡啶-4-氨基)-1,3,5-三嗪-2-基)吡咯烷-3-醇的甲磺酸盐晶型A溶于二甲基亚砜和四氢呋喃的混合溶剂，然后挥发的步骤；进一步优选地，所述式(I)所示的(S)-3-(三氟甲基)-1-(4-(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-6-(2-(三氟甲基)吡啶-4-氨基)-1,3,5-三嗪-2-基)吡咯烷-3-醇的甲磺酸盐晶型G的制备方法中，二甲基亚砜和四氢呋喃的体积比为约1:5。

本发明另一方面提供式(I)化合物的甲磺酸盐歧化产物晶型B。

非限制性的，本发明式(I)化合物的甲磺酸盐歧化产物晶型B中甲磺酸与游离碱的摩尔比为0.14。

非限制性的，本发明式(I)化合物的甲磺酸盐歧化产物晶型B的一个典型实例具有如图4所示的X-射线粉末衍射图谱。

本发明提供本发明的式(I)所示的(S)-3-(三氟甲基)-1-(4-(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-6-(2-(三氟甲基)吡啶-4-氨基)-1,3,5-三嗪-2-基)吡咯烷-3-醇的甲磺酸盐歧化产物晶型B的制备方法，包括将(S)-3-(三氟甲基)-1-(4-(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-6-(2-(三氟甲基)吡啶-4-氨基)-1,3,5-三嗪-2-基)吡咯烷-3-醇的甲磺酸盐晶型A溶于二甲基亚砜和四氢呋喃的混合溶剂，然后挥发的步骤；优选地，所述式(I)所示的(S)-3-(三氟甲基)-1-(4-(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-6-(2-(三氟甲基)吡啶-4-氨基)-1,3,5-三嗪-2-基)吡咯烷-3-醇的甲磺酸盐晶型B的制备方法中，二甲基亚砜和四氢呋喃的体积比为1:1。

本发明另一方面提供式(I)化合物的甲磺酸盐歧化产物晶型C。

非限制性的，本发明式(I)化合物的甲磺酸盐歧化产物晶型C中甲磺酸与游离碱的摩尔比为约0.1至约0.9。非限制性的，本发明的甲磺酸盐歧化产物晶型C的一个典型实例具有如图5所示的X-射线粉末衍射图谱。

在一个具体的实施方案中，本发明式(I)化合物的甲磺酸盐歧化产物晶型C中甲磺酸与游离碱的摩尔比为0.13。

在一个具体的实施方案中，本发明式(I)化合物的甲磺酸盐歧化产物晶型C中甲磺酸与游离碱的摩尔比为0.28。

在一个具体的实施方案中，本发明式(I)化合物的甲磺酸盐歧化产物晶型C中甲磺酸与游离碱的摩尔比为0.67。

在一个具体的实施方案中，本发明式(I)化合物的甲磺酸盐歧化产物晶型C中甲磺酸与游离碱的摩尔比为0.44。非限制性的，本发明甲磺酸与游离碱的摩尔比为0.44的式(I)化合物的甲磺酸盐歧化产物晶型C的一个典型实例具有如图6所示的TGA/DSC。升温至120℃前有7.0％的失重，在72.0℃(峰值温度)观察到一较宽的吸热效应，推测为挥发性组分的脱除所致，在151.8℃(峰值温度)有一微弱的吸热信号，继续升温至284.9℃(峰值温度)观察到一较强的吸热效应。

在一个具体的实施方案中，本发明式(I)化合物的甲磺酸盐歧化产物晶型C中甲磺酸与游离碱的摩尔比为0.93。非限制性的，本发明甲磺酸与游离碱的摩尔比为0.93的式(I)化合物的甲磺酸盐歧化产物晶型C的一个典型实例具有如图7所示的TGA/DSC。升温至120℃前观察到13.3％的失重，在76.2℃(峰值温度)有一较强的吸热效应，推测为挥发性组分的脱除所致，继续升温至273.6℃(峰值温度)观察到另一吸热效应。

本发明提供本发明的式(I)所示的(S)-3-(三氟甲基)-1-(4-(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-6-(2-(三氟甲基)吡啶-4-氨基)-1,3,5-三嗪-2-基)吡咯烷-3-醇的甲磺酸盐歧化产物晶型C的制备方法，包括将(S)-3-(三氟甲基)-1-(4-(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-6-(2-(三氟甲基)吡啶-4-氨基)-1,3,5-三嗪-2-基)吡咯烷-3-醇的甲磺酸盐晶型A溶于甲醇，然后在室温的条件下挥发的步骤。

本发明另一方面提供式(I)化合物的甲磺酸盐歧化产物晶型D。

非限制性的，本发明式(I)化合物的甲磺酸盐歧化产物晶型D中甲磺酸、乙酸和游离碱的摩尔比为0.49:0.53:1。

非限制性的，本发明式(I)化合物的甲磺酸盐歧化产物晶型D的一个典型实例具有如图8所示的X-射线粉末衍射图谱。

本发明提供本发明的式(I)所示的(S)-3-(三氟甲基)-1-(4-(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-6-(2-(三氟甲基)吡啶-4-氨基)-1,3,5-三嗪-2-基)吡咯烷-3-醇的甲磺酸盐歧化产物晶型D的制备方法，包括将(S)-3-(三氟甲基)-1-(4-(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-6-(2-(三氟甲基)吡啶-4-氨基)-1,3,5-三嗪-2-基)吡咯烷-3-醇的甲磺酸盐晶型A溶于乙酸，然后挥发的步骤。

本发明另一方面提供式(I)化合物的甲磺酸盐歧化产物晶型E。

非限制性的，本发明式(I)化合物的甲磺酸盐歧化产物晶型E中乙酸和游离碱的摩尔比为0.85:1。

非限制性的，本发明式(I)化合物的甲磺酸盐歧化产物晶型E的一个典型实例具有如图9所示的X-射线粉末衍射图谱。

本发明提供本发明的式(I)所示的(S)-3-(三氟甲基)-1-(4-(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-6-(2-(三氟甲基)吡啶-4-氨基)-1,3,5-三嗪-2-基)吡咯烷-3-醇的甲磺酸盐歧化产物晶型E的制备方法，包括将(S)-3-(三氟甲基)-1-(4-(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-6-(2-(三氟甲基)吡啶-4-氨基)-1,3,5-三嗪-2-基)吡咯烷-3-醇的甲磺酸盐晶型A溶于四氢呋喃、水和乙酸的混合溶剂中，然后挥发的步骤；优选地，所述式(I)所示的(S)-3-(三氟甲基)-1-(4-(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-6-(2-(三氟甲基)吡啶-4-氨基)-1,3,5-三嗪-2-基)吡咯烷-3-醇的甲磺酸盐晶型E的制备方法中，四氢呋喃和水的体积比为9:1。

本发明另一方面提供式(I)化合物的甲磺酸盐歧化产物晶型F。

非限制性的，本发明式(I)化合物的甲磺酸盐歧化产物晶型F中乙酸和游离碱的摩尔比为0.15:1。

非限制性的，本发明式(I)化合物的甲磺酸盐歧化产物晶型F的一个典型实例具有如图10所示的X-射线粉末衍射图谱。

非限制性的，本发明式(I)化合物的甲磺酸盐歧化产物晶型F的一个典型实例具有如图11所示的TGA和DSC图谱。样品加热至140℃前可观察到6.3％的台阶式失重，在119.2℃和196.6℃(峰值温度)有吸热峰，在175.4℃(峰值温度)观察到微弱的放热峰。

本发明提供本发明的式(I)所示的(S)-3-(三氟甲基)-1-(4-(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-6-(2-(三氟甲基)吡啶-4-氨基)-1,3,5-三嗪-2-基)吡咯烷-3-醇的甲磺酸盐歧化产物晶型F的制备方法，包括将(S)-3-(三氟甲基)-1-(4-(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-6-(2-(三氟甲基)吡啶-4-氨基)-1,3,5-三嗪-2-基)吡咯烷-3-醇的甲磺酸盐晶型A溶于甲醇、水和乙酸的混合溶剂中，然后挥发的步骤；优选地，所述式(I)所示的(S)-3-(三氟甲基)-1-(4-(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-6-(2-(三氟甲基)吡啶-4-氨基)-1,3,5-三嗪-2-基)吡咯烷-3-醇的甲磺酸盐晶型F的制备方法中，四氢呋喃和水的体积比为69:31。

本发明的另一个方面提供一种药物组合物，其含有(S)-3-(三氟甲基)-1-(4-(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-6-(2-(三氟甲基)吡啶-4-氨基)-1,3,5-三嗪-2-基)吡咯烷-3-醇甲磺酸盐晶型及药学上可接受的载体，优选为含有(S)-3-(三氟甲基)-1-(4-(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-6-(2-(三氟甲基)吡啶-4-氨基)-1,3,5-三嗪-2-基)吡咯烷-3-醇甲磺酸盐晶型A及药学上可接受的载体。

本发明的另一个方面提供(S)-3-(三氟甲基)-1-(4-(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-6-(2-(三氟甲基)吡啶-4-氨基)-1,3,5-三嗪-2-基)吡咯烷-3-醇甲磺酸盐晶型或包含上述甲磺酸盐晶型的药物组合物，尤其是(S)-3-(三氟甲基)-1-(4-(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-6-(2-(三氟甲基)吡啶-4-氨基)-1,3,5-三嗪-2-基)吡咯烷-3-醇甲磺酸盐晶型A或包含上述甲磺酸盐晶型A的药物组合物在制备治疗癌症的药物中的用途，优选地，所述癌症为以突变型异柠檬酸脱氢酶2的存在为特征的癌症，例如用作具有2-HG新变体活性的突变IDH2存在为特征的癌症。本发明还提供(S)-3-(三氟甲基)-1-(4-(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-6-(2-(三氟甲基)吡啶-4-氨基)-1,3,5-三嗪-2-基)吡咯烷-3-醇甲磺酸盐晶型或包含它们的药物组合物用作在残基140或172处具有突变，例如R140Q、R140G、R172K、R172M、R172S、R172G和R172W的IDH2的抑制剂的用途。在一些实施方案中，所述治疗是与具有2-HG新变体活性的突变IDH2相关的癌症。在另一些实施方案中，癌症与具有在残基R140或172处具有突变，例如R140Q、R140G、R172K、R172M、R172S、R172G和R172W的2-HG新变体活性的突变IDH2相关。本发明提供本发明的可药用盐或其水合物、溶剂合物、结晶或包含它们的药物组合物在制备治疗以突变型IDH2的存在为特征的癌症的药物中的用途，其中所述的癌症选自黑素瘤、乳头状甲状腺肿瘤、胆管癌、结肠癌、卵巢癌、肺癌、恶性淋巴肿瘤，肝、肾、膀胱、前列腺、乳腺和胰腺的癌和肉瘤，以及皮肤、结肠、甲状腺、肺和卵巢的原发和复发性实体瘤或者白血病等。在具体的实施方案中，待治疗的癌症是成胶质细胞瘤(神经胶质瘤)、骨髓增生异常综合征(MDS)、骨髓组织增殖性赘生物(MPN)、急性骨髓性白血病(AML)、肉瘤、黑色素瘤、非小细胞肺癌、软骨肉瘤、胆管癌或血管免疫母细胞性淋巴瘤。在更具体的实施方案中，待治疗的癌症是成胶质细胞瘤(神经胶质瘤)、骨髓增生异常综合征(MDS)、骨髓组织增殖性赘生物(MPN)、急性骨髓性白血病(AML)、黑色素瘤、软骨肉瘤、或血管免疫母细胞性非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)。

在这里需要特别说明的是，X-射线粉末衍射图谱对于特定的晶型具有特征性。判断是否与已知晶型相同时，应该注意的是峰的相对位置(即2θ)而不是它们的相对强度。这是由于谱图(尤其在低角度)的相对强度会因为晶体条件、粒径或其它测定条件的差异产生的优势取向效果而变化，衍射峰的相对强度对于晶型的确定并非是特征性的。另外，同一个晶型的2θ值可能存在轻微误差，约为±0.2°。因此，在确定每种结晶结构时，应该将此误差考虑在内。在XRPD图谱中通常用2θ角或晶面距d值表示峰位置，两者之间具有简单的换算关系：d＝λ/2sinθ，其中d值代表晶面间距，λ代表X射线的波长，θ为衍射角。还应特别指出的是，在混合物的鉴定中，由于含量下降等因素会造成部分衍射线缺失，此时，无需依赖高纯试样中观察到的全部谱带，一条谱带也可能对给定的晶体是特征性的。

DSC测定当晶体由于其晶体结构发生变化或晶体熔融而吸收或释放热时的转变温度。对于同种化合物的同种晶型，在连续的分析中，热转变温度和熔点误差典型的在约5℃之内。当我们说一个化合物具有一给定的DSC峰或熔点时，这是指该DSC峰或熔点±5℃。需要指出的是对于混合物而言，其DSC峰或熔点可能会在更大的范围内变动。此外，由于在物质熔化的过程中伴有分解，因此熔化温度与升温速率相关。

除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。

本发明化合物中的“氢”、“碳”、“氧”包括其所有同位素。同位素应理解为包括具有相同原子数但具有不同质量数的那些原子。举例来说，氢的同位素包括氕、氚和氘，碳的同位素包括¹³C和¹⁴C，氧的同位素包括¹⁶O和¹⁸O等。

本发明所述的“甲磺酸盐晶型”是指(S)-3-(三氟甲基)-1-(4-(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-6-(2-(三氟甲基)吡啶-4-氨基)-1,3,5-三嗪-2-基)吡咯烷-3-醇的甲磺酸盐晶型。

附图说明

图1为式(I)化合物甲磺酸盐晶型A的X-射线衍射谱图；

图2为式(I)化合物甲磺酸盐晶型A的TGA/DSC图谱；

图3为式(I)化合物甲磺酸盐晶型G的X-射线衍射谱图；

图4为式(I)化合物甲磺酸盐歧化产物晶型B的X-射线衍射谱图；

图5为式(I)化合物甲磺酸盐歧化产物晶型C的X-射线衍射谱图；

图6为式(I)化合物甲磺酸盐歧化产物晶型C的TGA/DSC图谱；

图7为式(I)化合物甲磺酸盐歧化产物晶型C的TGA/DSC图谱；

图8为式(I)化合物甲磺酸盐歧化产物晶型D的X-射线衍射谱图；

图9为式(I)化合物甲磺酸盐歧化产物晶型E的X-射线衍射谱图；

图10为式(I)化合物甲磺酸盐歧化产物晶型F的X-射线衍射谱图；

图11为式(I)化合物甲磺酸盐歧化产物晶型F的TGA/DSC图谱；

图12为式(I)化合物甲磺酸盐晶型A的DVS图谱；

图13为式(I)化合物甲磺酸盐晶型G、甲磺酸盐晶型G室温放置两周后、甲磺酸盐晶型A的X-射线衍射谱图。

具体实施方式

下面代表性的实施例是为了更好地说明本发明，而非用于限制本发明的保护范围。以下实施例中使用的材料如无特殊说明均为商购获得。

一、实验所用的测试仪器

1.X-射线粉末衍射谱(XRPD)

XRPD图谱在PAN alytacal Empyrean X射线粉末衍射分析仪上通过反射模式采集，XRPD测试参数如表1所示。

表1：XRPD测试参数

2.热重分析(TGA)和差示扫描量热(DSC)

TGA和DSC图谱分别在TA Q500/5000热重分析仪和TAQ200/2000差示扫描量热仪上采集，表2列出了测试参数。

表2：TGA和DSC测试参数

3.高效液相色谱(HPLC)

高效液相色谱在Agilent 1260HPLC上采集，具体仪器和测试参数见表3和表4。

表3：HPLC纯度测试参数

表4：HPLC溶解度测试参数

4.动态水分吸附(DVS)

动态水分吸附(DVS)曲线在SMS(Surface Measurement Systems)的DVSIntrinsic上采集。在25℃时的相对湿度用氯化锂,硝酸镁和氯化钾的潮解点校正。DVS测试参数列于表5。

表5：DVS测试参数

二、化合物(I)及其甲磺酸盐的制备实施例1(S)-3-(三氟甲基)-1-(4-(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-6-(2-(三氟甲基)吡啶-4-氨基)-1,3,5-三嗪-2-基)吡咯烷-3-醇的制备

步骤1 6-(三氟甲基)-吡啶甲酸甲酯的制备

将6-三氟甲基吡啶-2-甲酸(25g,130.8mmol)溶入300mL甲醇中，滴加氯化亚砜(23.3g,196.2mmol)，滴毕加热回流反应12h。反应液浓缩干，加入饱和碳酸氢钠溶液调节pH，乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，浓缩得标题化合物。

步骤2 6-(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-1,3,5-三嗪-2,4-(1H,3H)-二酮的制备

将缩二脲(13g,126.3mmol)溶入300mL乙二醇二甲醚中，分批加入氢化钠(42g,1053mmol)，加热50℃搅拌1h。加入6-(三氟甲基)-吡啶甲酸甲酯(21.6g,105.3mmol)，加热85℃反应16h。反应液倒入水中，用浓盐酸调节pH，过滤，滤饼烘干，得标题化合物。

步骤3 2,4-二氯-6-(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-1,3,5-三嗪的制备

将6-(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-1,3,5-三嗪-2,4-(1H,3H)-二酮(35g,135.6mmol)溶入200mL三氯氧磷中，加入五氯化磷(100g,542.3mmol)，加热105℃反应12h。反应液倒入水中，二氯甲烷萃取，无水硫酸钠干燥，浓缩得标题化合物。

步骤4 4-氯-6-(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-N-(2-(三氟甲基)吡啶-4-基)-1,3,5-三嗪-2-胺的制备

将2,4-二氯-6-(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-1,3,5-三嗪(7g,23.72mmol)溶入50mL四氢呋喃中，加入2-(三氟甲基)-吡啶-4-胺(4.2g,26.1mmol)，碳酸钠(3.8g,35.6mmol)，加热回流72h。反应液过滤，滤液柱层析纯化得标题化合物。

步骤5 4-(3-三氟甲基-3-羟基吡咯-1-基)-6-(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-N-(2-(三氟甲基)吡啶-4-基)-1,3,5-三嗪-2-胺的制备

将4-氯-6-(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-N-(2-(三氟甲基)吡啶-4-基)-1,3,5-三嗪-2-胺(43mg,0.10mmol)溶入5mL四氢呋喃中，加入3-三氟甲基吡咯-3-醇(19mg，0.12mmol)，碳酸钠(16mg，0.15mmol)，加热回流16h。反应液过滤，滤液柱层析纯化得标题化合物。

步骤6(S)-3-(三氟甲基)-1-(4-(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-6-(2-(三氟甲基)吡啶-4-氨基)-1,3,5-三嗪-2-基)吡咯烷-3-醇的制备

将步骤5中制得的产物4-(3-三氟甲基-3-羟基吡咯-1-基)-6-(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-N-(2-(三氟甲基)吡啶-4-基)-1,3,5-三嗪-2-胺(260mg)溶解在30mL甲醇中进行制备性分离，制备性分离方法为：仪器：MGⅡpreparative SFC(SFC-1)，制备柱：ChiralCelOD,250×30mm I.D.,5μm.，流动相：A：CO₂、B：异丙醇(0.1％NH₃H₂O)，梯度：B 30％，流速：60mL/min,，压力：100bar，柱温：38℃，检测波长：220nm。经制备性分离后，将后流出物经过40℃水浴真空旋干，得到标题化合物(135.0mg，保留时间为5.09min)，ee＝99.7％，¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆):δ10.81(s,1H),8.55-8.81(m,3H),8.27-8.32(m,1H),8.08-8.11(m,1H),7.81-8.00(m,1H),6.67(s,1H),3.73-4.11(m,4H),2.18-2.38(m,2H),ES:m/z 540.2[M+H]⁺。

实施例2：(S)-3-(三氟甲基)-1-(4-(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-6-(2-(三氟甲基)吡啶-4-氨基)-1,3,5-三嗪-2-基)吡咯烷-3-醇甲磺酸盐的合成

在50L立式夹套反应釜中加入丙酮(14.2kg)、(S)-3-(三氟甲基)-1-(4-(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-6-(2-(三氟甲基)吡啶-4-氨基)-1,3,5-三嗪-2-基)吡咯烷-3-醇(2.110kg,3.91mol)，开启搅拌，加入金属清除剂

Thiol(0.147kg,0.20mol)，室温搅拌1h。过滤，丙酮(4.74kg)洗涤，将滤液倒入50L反应釜中，补加丙酮(4.74kg)。将0.011kg甲磺酸(总甲磺酸质量的3％)于-20℃下缓慢滴入60mL丙酮中，将以上甲磺酸丙酮溶液缓慢滴入反应釜中，滴完加入(S)-3-(三氟甲基)-1-(4-(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-6-(2-(三氟甲基)吡啶-4-氨基)-1,3,5-三嗪-2-基)吡咯烷-3-醇甲磺酸盐晶种，室温搅拌1h。将剩余甲磺酸(0.365kg)分成4份，于-20℃下缓慢滴入丙酮(0.39kg)中，于低温下滴入反应釜中，滴完室温搅拌3h。抽滤，丙酮洗涤，滤饼60℃真空干燥12h以上，得标题化合物粗品共2.370kg，收率95.4％。

将(S)-3-(三氟甲基)-1-(4-(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-6-(2-(三氟甲基)吡啶-4-氨基)-1,3,5-三嗪-2-基)吡咯烷-3-醇甲磺酸盐粗品(2.360kg)加入20L四口烧瓶中，依次加入乙醇(5.06kg)、水(0.70kg)，剧烈搅拌，升温至回流6h，关闭加热自然冷却析晶，抽滤，乙醇与水混合液洗涤滤饼，滤饼60℃真空干燥50h以上，得标题化合物精制品2.177kg，精制收率92.2％，纯度99.7％，比旋度为+35.3°。ESI-Ms m/z:540.1[M-CH₃SO₃H+H]⁺.¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆):δ10.80(s,1H,重水交换后消失),9.24(br,2H,重水交换后消失),8.54-8.72(m,2H),8.46-8.47(d,1H),8.17-8.20(t,1H),7.97-7.99(d,1H),7.66-7.82(dd,1H),3.78-4.08(m,4H),2.56(s,3H),2.18-2.37(m,2H).

实施例3：式(I)化合物甲磺酸盐晶型A的制备

1：各取约15mg实施例2制备的式(I)化合物甲磺酸盐于3mL小瓶中，另取20mL小瓶并向其中加入约2mL相应溶剂(甲醇、4-甲基-2-戊酮、乙酸乙酯、甲基叔丁基醚、2-甲基四氢呋喃、乙腈、三氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、乙酸、四氢呋喃、丙酮、甲苯、水)，将3mL小瓶敞口置于20mL小瓶中，密封后室温下静置7天。收集固体进行XRPD表征，表征结果显示本次14种溶剂的实验晶型均为晶型A。

2：室温悬浮搅拌试验。各称量约15毫克实施例2制备的式(I)化合物甲磺酸盐至1.5毫升玻璃小瓶中，加入0.3毫升甲醇、异丙醇、丙酮、乙酸乙酯、甲基叔丁基醚、2-甲基四氢呋喃、四氢呋喃、二氯甲烷、甲苯、1,4-二氧六环、正庚烷、苯甲醚、乙酸、乙腈、丙酮/水(9:1,v:v)、二甲亚砜/甲苯(1:9,v:v)、甲醇/水(935:65,v:v,a_w＝0.2)，得到的悬浮液于室温下以750rpm的转速搅拌7天后，离心收集固体并进行XRPD测试，表征结果显示本次各溶剂的实验晶型均为晶型A。

式(I)化合物甲磺酸盐晶型A的X-射线衍射谱图(参见图1)，使用Cu-Ka辐射，以2θ角度表示X-射线粉末衍射图，在约7.725、8.934、13.193、15.444、16.836、17.436、17.885、18.633、20.015、20.678、21.020、21.279、22.119、22.898、24.413、25.672、28.288、31.482、32.581、33.871处有特征峰。将图1中的2θ、晶面间距d值以及峰的相对强度列于表6。

式(I)化合物甲磺酸盐晶型A的TGA和DSC表征结果示于图2中。样品在200℃前失重为1.1％，在285.9℃(起点温度)有一尖锐的吸热峰，结合TGA中250℃以上的快速大量失重，推测该吸热信号由甲磺酸盐晶型A样品的熔融并伴随分解引起。

¹H NMR结果表明式(I)化合物甲磺酸盐晶型A中甲磺酸与游离碱的摩尔比为0.99。

样品的HPLC纯度为99.67％(面积归一化法)。综合上述结果，推测甲磺酸盐晶型A为单甲磺酸盐的无水晶型。

表6：式(I)化合物甲磺酸盐晶型A的XRPD图谱详情

实施例4：式(I)化合物甲磺酸盐晶型G的制备

称取约15毫克实施例2制备的式(I)化合物甲磺酸盐溶于DMSO/THF(1:5,v/v)的混合溶剂中，在室温下挥发。收集析出的固体并进行XRPD测试，XRPD表征结果(参见图3)显示该晶型为新晶型，命名为晶型G。

实施例5：式(I)化合物甲磺酸盐歧化产物晶型B的制备

称取约15毫克实施例2制备的式(I)化合物甲磺酸盐溶于一定量的二甲亚砜中，过滤取滤液于3毫升小瓶中，另取20毫升的小瓶并向其中加入约3毫升的反溶剂四氢呋喃，将3毫升小瓶敞口置于20毫升小瓶中，密封并于室温下静置10天后未见固体析出，将澄清溶液转移至5℃，进一步转移至室温下挥发。收集析出的固体并进行XRPD测试，表征结果显示本次实验晶型为歧化产物晶型B(XRPD表征结果参见图4)。

实施例6：式(I)化合物甲磺酸盐歧化产物晶型C的制备

各称量约15毫克不同批次的式(I)化合物甲磺酸盐至3毫升小瓶中，加入1.0～2.0毫升甲醇，使用聚四氟乙烯滤膜(孔径0.45μm)过滤后得到澄清溶液。澄清溶液置于3毫升小瓶中，室温下用封口膜密封，刺3～5个小孔后放置自然挥发。收集所得固体并进行XRPD测试。试验结果如表7所示。

表7

实施例7：式(I)化合物甲磺酸盐歧化产物晶型D的制备

方法1：称取约20毫克实施例2制备的式(I)化合物甲磺酸盐于3毫升小瓶中，加入1.2毫升乙酸，在50℃下搅拌2小时后取上清液过滤，将所得滤液以0.1℃/min速度从50℃降温至5℃并在5℃恒温，转至室温挥发。收集析出的固体并进行XRPD测试，表征结果显示本次各溶剂的实验晶型均为歧化产物晶型D(XRPD表征结果参见图8)。

实施例8：式(I)化合物甲磺酸盐歧化产物晶型E的制备

称取一定量的实施例2制备的式(I)化合物甲磺酸盐溶于四氢呋喃/水(9:1,v:v)中，配置成浓度为56.6mg/mL的储备液。

量取合适体积的储备液于20毫升小瓶内(等效样品质量约15毫克)，逐滴加入乙酸，边滴加边搅拌，加入约15毫升乙酸后仍无固体析出。将澄清溶液转至5℃搅拌过夜诱导固体析出，仍澄清，转至-20℃静置过夜，-20℃下凝固后，转移至室温挥发得到固体。收集析出的固体并进行XRPD测试，表征结果显示本次各溶剂的实验晶型均为歧化产物晶型E(XRPD表征结果参见图9)。

实施例9：式(I)化合物甲磺酸盐歧化产物晶型F的制备

各称量约15毫克实施例2制备的式(I)化合物甲磺酸盐至1.5毫升玻璃小瓶中，加入0.3毫升甲醇/水(69:31,v:v,a_w＝0.6)、甲醇/水(42:58,v:v,a_w＝0.8)，得到的悬浮液于室温下以750rpm的转速搅拌7天后，离心收集固体并进行XRPD测试，表征结果显示本次各溶剂的实验晶型均为歧化产物晶型F(XRPD表征结果参见图10，TGA/DSC图谱参见图11)。

三、式(I)化合物甲磺酸盐各晶型的相关性质研究

实验例1、式(I)化合物甲磺酸盐晶型A的相关性质评估

对式(I)化合物甲磺酸盐晶型A进行评估，包括引湿性、水中室温溶解度、歧化风险及固态稳定性的评估。

1.1引湿性

在25℃恒温条件下对式(I)化合物甲磺酸盐晶型A进行DVS测试。将样品预先在0％RH条件下平衡，去除吸附的溶剂或水分后开始测试。测试结果如图12所示。当湿度增加时，样品的水分吸附量逐渐增加，当湿度达到80％RH时，吸水量为0.16％，表明晶型A几乎无引湿性，且在DVS测试前后未观察到晶型变化。

1.2水中溶解度

在室温条件下将式(I)化合物甲磺酸盐晶型A悬浮于水中搅拌24小时后测试其溶解度。结果表明，在水中室温条件下悬浮搅拌24小时后未观察到晶型转变，且上清液中游离碱的浓度低于检测限(0.11微克/毫升)。

1.3固态稳定性

将式(I)化合物甲磺酸盐晶型A放置于80℃条件下24小时、25℃/60％RH和40℃/75％RH条件下1周通过XRPD和HPLC表征以测试其物理化学稳定性。结果显示，样品在稳定性测试前后未观察到晶型转变。25℃/60％RH和40℃/75％RH条件下敞口放置1周后，样品的HPLC纯度未发生明显变化；80℃条件下密闭放置24小时后，样品的HPLC纯度有轻微降低(见表8)。

表8

结果表明：1)甲磺酸盐晶型A几乎无引湿性，且测试前后晶型未发生转变；2)甲磺酸盐晶型A在水中溶解度较低(小于0.11微克/毫升)，溶解度试验前后晶型未发生转变；3)甲磺酸盐晶型A在25℃/60％RH和40℃/75％RH条件下1周内显示出较好的物理化学稳定性；在80℃条件下24小时内显示出较好的物理稳定性。

实验例2、式(I)化合物甲磺酸盐晶型G的相关性质评估

将实施例4制得的晶型G样品在室温条件下敞口放置两周后，晶型G样品仍为湿样，但只观察到甲磺酸盐晶型A的衍射峰，且结晶度较弱，室温条件下放置后逐渐转变为甲磺酸盐晶型A(见图13)。

实验例3、U87-MG(IDH2-R140Q)突变细胞皮下移植瘤体内药效评价

1.实验材料

1.1受试化合物：以上实施例制备的式(I)化合物或其甲磺酸盐用溶媒(2％无水乙醇:10％

:88％生理盐水(v/v/v))配制为相应浓度溶液。

对照化合物为WO2013/102431中公开的化合物409(参见说明书第134页)，化学名为2-methyl-l-(4-(6-(trifluoromethyl)pyridin-2-yl)-6-(2-(trifluoromethyl)pyridin-4-ylamino)-1,3,5-triazin-2yla mino)propan-2-ol(AG-221)，参照WO2013/102431中描述的方法制备并通过氢谱和质谱鉴定。

1.2细胞：人胶质母细胞瘤细胞株U87-MG，购于美国典型培养物保藏中心(ATCC)；

过表达突变型IDH2(R140Q)的U87-MG细胞株[U87-MG(IDH2-R140Q)]，由南京金斯瑞生物科技有限公司使用常规的分子生物学技术构建，所述方法包括以下简要步骤：

(1)将野生型IDH2亚克隆入Lenti-Puro载体(购自GenScript’s MGC library，Slot:IRAU-112-d-10；IRAT-17-b-7)，通过点突变获得IDH2(R140Q)突变体，制备转染级携带有IDH2(R140Q)的重组慢病毒载体；

(2)检测病毒的滴度；

(3)使用构建的重组慢病毒载体转导U87-MG宿主细胞，使用嘌呤霉素筛选稳定细胞，并通过qPCR和蛋白印迹确证IDH2(R140Q)的表达；

(4)通过有限稀释获得单克隆，并通过qPCR和蛋白印迹以及使用LC-MS检测2-羟基戊二酸(2-HG)含量来确认。

1.3试剂：MEM培养基，购自于美国Invitrogen公司；

胎牛血清(FBS)，购自于美国Invitrogen公司；

胰蛋白酶，购自于美国Invitrogen公司；

2-羟基戊二酸(D-α-Hydroxyglutaric acid disodium salt,2-HG)标准品，购自于Sigma公司，Cat.No.SLBD 8946V，纯度≥95％；

非那西汀标准品(内标/IS)：购自于Sigma公司，纯度≥98％；

乙腈/甲醇(色谱纯)购自Merck公司；

其余试剂均为市售分析纯。

1.4动物：

BALB/c nude mice，6-7周龄，雌性，18-22g，购自南京金莱畅公司。

1.5仪器：AB SCIEX API4500液质联用仪(LC-MS/MS)，配有日本岛津超高效液相色谱系统(LC-30A)、美国AB质谱系统(API4500)、电喷雾离子源及Analyst 1.6.2工作站；

Milli-Q超纯水机(Millipore Inc)；

TARGIN VX-II振荡器；

HITACHICF16RXII台式高速冷冻离心机；

Thermo电动移液器。

2.实验方法

2.1动物接种：

扩增U87-MG(IDH2-R140Q)和U87-MG细胞(野生型)，将处于对数生长期的肿瘤细胞用于体内肿瘤接种。按2×10⁶细胞量/小鼠(细胞悬液体积与Matrigel体积比为1：0.8)，分别接种至每组3只小鼠身体右侧腰背部皮下。

2.2分组及给药：

无突变对照组使用U87-MG细胞株接种的裸鼠，化合物组和溶媒对照组使用U87-MG(IDH2-R140Q)接种的裸鼠。

各组分别灌胃给予相应浓度的化合物溶液，给药体积为100μL/10g体重，对照组均给予相同体积的空白溶媒。

给药10天后，处死小鼠，剥离肿瘤，匀浆，检测肿瘤中2-HG含量。

2.3 LC-MS/MS分析条件

2.3.1色谱条件

色谱柱：Shim-pack XR-ODS 30L*2.0；流动相：乙腈-0.2％氨水，5mM乙酸铵水溶液；柱温：30℃；流速：0.4mL/min；梯度洗脱条件如下表9：

表9色谱洗脱条件

保留时间：t R,2-HG≈0.21min；t R,IS≈1.41min。

2.3.2质谱条件

选用大气压电离离子源(APCI)，设定源参数分别为：喷雾电压(IonSprayVoltage/IS)-4500V，辅助气1(Ion Source Gas 1/GS1，N2)55Arb，辅助气2(Ion SourceGas 2/GS 2，N2)55Arb，辅助气加热温度(Temperature/TEM)500℃，气帘气(Curtain Gas/CUR)25Arb，碰撞气(Collision Gas/CAD，N2)8Pa。

选用负离子模式(Negative)下多重离子反应监测(MRM)。2-HG的MRM参数为：母离子(Q 1Mass)为146.9Da，子离子(Q 3Mass)为129.0Da，去簇电压(DeclusteringPotential/DP)为-15.3V，碰撞电压(Collision Energy/CE)为-14.5eV。内标(IS)的MRM参数为：母离子(Q 1Mass)为178.0Da，子离子(Q3Mass)为149.0Da，去簇电压(DeclusteringPotential/DP)为-51V，碰撞电压(Collision Energy/CE)为-17eV。

2.4数据处理

经LC-MS/MS测得每组中各只动物肿瘤匀浆液2-HG浓度，计算百分比(2-HG％)，计算公式如下，

2-HG％＝(给药组瘤内2-HG浓度-U87-MG对照组瘤内2-HG浓度)/(U87-MG(IDH2-R140Q)对照组瘤内2-HG浓度-U87-MG对照组瘤内2-HG浓度)×100％

本发明的化合物给药后小鼠肿瘤内2-HG的相对百分含量(均值)如表10所示。

表10：给药10天后瘤内2-HG％

组别	剂量(mg/kg)	2-HG％
			U87-MG对照组		0
U87-MG(IDH2-R140Q)对照组		100
			AG-221	25	-4
AG-221	12.5	9
			AG-221	6.25	58
式(I)化合物	6.25	-2

实验结果表明，在U87-MG(IDH2-R140Q)突变型细胞皮下移植瘤模型中，本发明的化合物具有非常好的抑制肿瘤内因IDH2突变导致的高水平2-HG的能力，式(I)化合物以低剂量6.25mg/kg的剂量给药能够完全抑制2-HG至野生型对照组水平，而阳性化合物AG-221在高剂量25mg/kg才能达到相同的功效，两者剂量相差4倍。预计本发明的化合物具有好的抑制IDH2突变导致的促成肿瘤的生成和进展的作用。

实验例4、人急性髓性白血病NOD/SCID动物模型

1.实验材料

1.1受试化合物：实施例制备的本发明的化合物，每个化合物用溶媒(2％无水乙醇:10％

:88％生理盐水(v/v/v))配制为相应浓度溶液。

1.2细胞：人急性髓性白血病细胞AM7577，由中美冠科生物技术(北京)有限公司提供；

1.3试剂：FITC anti-human CD45，货号304038，克隆号HI30，购自Biolegend；

1.4动物：

NOD/SCID小鼠，3-4周龄，雌性，购自北京华阜康生物科技股份有限公司；

1.5仪器：流式细胞仪FACSCalibur，BD；

2.实验方法

2.1动物接种：

每只小鼠按照100uL PBS中重悬2×10⁶个细胞的量通过尾静脉接种。

2.2分组及给药：

每周取动物眼眶血，标记人CD45，检测阳性百分比，当外周血CD45+细胞比例达到5％后分组。在接种后第40天外周血CD45+细胞比例达到5％。分组后，每日一次灌胃给药，给药时间为14天。分组及给药情况如表11所示。

表11

*注：动物的给药体积按照10μL/g体重进行调整。

2.3存活率和生存期的观察：

观察给药后动物的死亡率以及存活动物的生存期。给药14天后各组动物存活数量如表12所示。

表12

实验结果表明，给药14天后，对照组动物仅有1只存活，阳性化合物AG-221高剂量(45mg/kg)组4只动物中有3只存活，阳性化合物AG-221低剂量(15mg/kg)组8只动物中有6只存活，而本发明式(I)化合物的低高剂量组均有7只动物存活。与溶媒对照组相比，使用本发明的式(I)化合物治疗的小鼠生存率明显增加，式(I)化合物45mg/kg以及15mg/kg剂量组动物存活率均略高与AG-221。本发明式(I)化合物可显著提高荷瘤小鼠的生存率。

实验例5、化合物口服暴露量评价

受试化合物：以上实施例制备的本发明的式(I)化合物及式(I)化合物的甲磺酸盐，每个化合物用0.5％的CMCNa配制为混悬溶液，口服给药剂量以游离碱计为15mg/kg。

雄性SD大鼠，SPF级，购自上海西普尔必凯实验动物有限公司；体重190-220g。

口服给药后于15,30min,1,2,6,10,24h自眼眶静脉丛采血于肝素化EP管中，暂置于碎冰上，离心取血浆处理后，使用LC-MS/MS进行检测，将测得的各时间点的血药浓度绘制成药物浓度-时间曲线，并计算药代动力学参数。实验结果见表13。

表13

受试化合物	T<sub>1/2</sub>(h)	Cmax(ng/ml)	AUC(h*ng/ml)
				式(I)化合物(实施例1)	13.3	683.3	11873.1
式(I)化合物的甲磺酸盐(实施例2)	23.1	1376.7	25816.8

结果以平均值表示(n＝3)

以上实验结果表明式(I)化合物的甲磺酸盐的Cmax及AUC均明显优于式(I)化合物。

尽管以上已经对本发明作了详细描述，但是本领域技术人员理解，在不偏离本发明的精神和范围的前提下可以对本发明进行各种修改和改变。本发明的权利范围并不限于上文所作的详细描述，而应归属于权利要求书。

Claims

1.一种(S)-3-(三氟甲基)-1-(4-(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-6-(2-(三氟甲基)吡啶-4-氨基)-1,3,5-三嗪-2-基)吡咯烷-3-醇的甲磺酸盐晶型A，其特征是X-射线粉末衍射光谱用2θ角度表示在7.725±0.2、8.934±0.2、13.193±0.2、17.885±0.2、24.413±0.2处有特征峰。

2.根据权利要求1所述的晶型A，其特征是X-射线粉末衍射光谱用2θ角度表示在7.725±0.2、8.934±0.2、13.193±0.2、17.885±0.2、24.413±0.2、25.672±0.2处有特征峰。

3.根据权利要求2所述的晶型A，其特征是X-射线粉末衍射光谱用2θ角度表示在7.725±0.2、8.934±0.2、13.193±0.2、17.885±0.2、20.015±0.2、21.020±0.2、22.119±0.2、22.898±0.2、24.413±0.2、25.672±0.2处有特征峰。

4.根据权利要求2所述的晶型A，其特征是X-射线粉末衍射光谱用2θ角度表示在7.725±0.2、8.934±0.2、13.193±0.2、15.444±0.2、16.836±0.2、17.436±0.2、17.885±0.2、18.633±0.2、20.015±0.2、20.678±0.2、21.020±0.2、21.279±0.2、22.119±0.2、22.898±0.2、24.413±0.2、25.672±0.2、28.288±0.2、31.482±0.2、32.581±0.2、33.871±0.2处有特征峰。

5.根据权利要求1-4任意一项所述的晶型A，其中(S)-3-(三氟甲基)-1-(4-(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-6-(2-(三氟甲基)吡啶-4-氨基)-1,3,5-三嗪-2-基)吡咯烷-3-醇与甲磺酸的化学配比为1:0.99。

6.一种制备如权利要求1-5任意一项所述晶型A的方法，所述方法包括将(S)-3-(三氟甲基)-1-(4-(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-6-(2-(三氟甲基)吡啶-4-氨基)-1,3,5-三嗪-2-基)吡咯烷-3-醇与甲磺酸溶于有机溶剂中反应，析出结晶的步骤。

7.一种(S)-3-(三氟甲基)-1-(4-(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-6-(2-(三氟甲基)吡啶-4-氨基)-1,3,5-三嗪-2-基)吡咯烷-3-醇的甲磺酸盐晶型A，其具有基本上如图1所示的X-射线粉末衍射光谱。

8.一种(S)-3-(三氟甲基)-1-(4-(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-6-(2-(三氟甲基)吡啶-4-氨基)-1,3,5-三嗪-2-基)吡咯烷-3-醇的甲磺酸盐晶型G，其具有基本上如图3所示的X-射线粉末衍射光谱。

9.一种药物组合物，其包含权利要求1-5之任一项所述的(S)-3-(三氟甲基)-1-(4-(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-6-(2-(三氟甲基)吡啶-4-氨基)-1,3,5-三嗪-2-基)吡咯烷-3-醇的甲磺酸盐晶型A、权利要求7所述的甲磺酸盐晶型A或权利要求8所述的甲磺酸盐晶型G和可药用载体。

10.如权利要求1-5之任一项所述的(S)-3-(三氟甲基)-1-(4-(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-6-(2-(三氟甲基)吡啶-4-氨基)-1,3,5-三嗪-2-基)吡咯烷-3-醇的甲磺酸盐晶型A、权利要求7所述的甲磺酸盐晶型A或权利要求8所述的甲磺酸盐晶型G或如权利要求9所述的组合物在制备治疗癌症的药物中的用途。